Efectuarea preparatelor microscopice

Tehnica efectuarii frotiului 1 ) Etalarea

din cultura bacterian n mediu lichid se prelev cu ansa o pictur i se etaleaz n centrul lamei, n strat ct mai subire, prin micri circulare excentrice pe suprafat de 1-2 cm2 fr a atinge marginile lamei; din cultur pe mediu solid se prelev o cantitate numai prin atingerea unei colonii ( doar varful coloniei ! ) cu ansa i se depune n centru lamei lnga o pictur de ap distilat steril. Se1

omogenizeaz

progresiv

cultura

n

pictura de ap i se etaleaz;

prelevatele patologice fluide se etaleaz procednd ca pentru cultura n mediu lichid. pentru produsele patologice fibrinoase se evit micrile de du-te vino ale ansei pe aceeai suprafa. Se depune n centrul lamei un mic flocon fibrino- purulent care se ntinde n strat ct mai subire prin micri radiare i excentrice;

2) Uscarea frotiurile se usuc la temp.camerei 3) Fixarea fixarea se face prin cldur: se trece lama cu frotiul n sus, cteva secunde2

prin flacra unui bec de gaz. Dosul minii trebuie s suporte atingerea lamei astfel nclzite. O nclzire mai puternic poate carboniza frotiul.

1. Place one needle of solid bacterial growth or two loopsof liquid bacterial growth in the center of a clean slide.

3

2. If working from a solid medium, add one drop (and only onedrop) of water to your specimen with a water bottle. If using a broth medium, do not add the water.

3. Now, with your inoculating loop, mix the specimen with the watercompletely and spread the mixture out to cover about half of the total slide area

.

4

4. Place the slide on a slide warmer and wait for it to dry. The smear is now ready for the staining procedure.

Colorarea frotiurilor 1) Coloratia Gram se pune lama cu frotiul n sus pe stativul de colorare;

5

STAINING

se coloreaz frotiul 30 sec 1 min cu soluie de violet de gentiana ( colorare)

se vars colorantul, se spala lama cu apa de robinet

se acoper lama cu soluie Lugol ( fixare) proaspt i se menine 30 sec1 min;6

se scurge soluia Lugol i se acoper lama cu soluia de decolorare (alcoolaceton) imprimndu- i micri alternative de nclinare pn cnd preparatul nu mai elibereaz colorant: cca 5- 10 sec pentru frotiurile subiri, cca 10 sec pentru cele mai groase. Se stopeaz decolorarea prin splare ngrijit cu ap.

7

se recoloreaz cu soluie de fucsin bazic timp de 30 sec. Pentru hemofili se prelungete la 1- 2 min.

2 ) Coloratia cu Albastru de metilen Se acopera frotiul cu albastru de metilen, timp de 1 min, se spala. Frotiurile colorate se pun in pozitie verticala, in stativ si se lasa la uscat, apoi se examineaza la microscop, initial cu obiectivul de 40, apoi cu imersie .

8

Examinarea cu imersie se pun 1-2 picaturi de ulei de cedru si se examineaza la microscop. Datorita violet, rosu Ce se vede la microscop ?

structurii iar cele

peretelui Gram

abcterian, pierd

bacteriile Gram poztive se coloreaza in negative colorantul si se recoloreaza cu fuxina, in

Forma bacteriilor

1) forma sferic (coci) - Diametre egale: stafilococ, streptococ - Reniformi: neiserii - Lanceolai: pneumococi - Ovalari: enterococi dispoziie - Ciorchine: stafilococi - Diplococi: neiserii, pneumococi - Tetrade: Micrococcus tetragenus - Cte opt: Sarcina9

- Izolai - Lanuri: streptococci 2) forma cilindric (bacili) - drepi cu capete drepte: Bacillus - drepi cu capete rotunjite: entrobacterii - drepi cu capete ascuite - ncurbai: bacil difteric - deformai de spor: clostridia dispoziie - neregulat: entrobacterii - diplobacili - n lanuri (streptobacili): Bacillus - sub aspect de litere, bee de chibrituri: bacili difterici forma spiralat (ncurbat) - vibrioni - spirili spire rigide - spirochete spire flexibile Dimensiunile bacteriilor Coci: 0,5 2 m Bacili: lungime 0,5 10 m / lime 0,3 2 m10

Vibrioni: lungime 1,5 3 m / grosime 0,5 m Spirochete: lungime 6 20 m / grosime 0,15 0,5 m

11

12

In

cazul

frotiului

din

cultura-

cocobacili, coci, bacili Gram pozitivi (colorati in violet), Gram negativi (colorati in rosu), albastru (coloratia cu albastru de metilen)

In cazul frotiului din produs patologicbacterii ( coci, bacili, cocobacili), Gram albastru pozitivi, de Gram metilen; negativicelule coloratia Gram si albastru coloratia inflamatorii care predomina fata de celulele epiteliale, raportul bacterii

13

/celule

inflamatorii

(intra,

perileucocitar, extraleucocitar) Importanta examenului microscopic

direct (frotiu din produs patologic) Criteriu de respingere a probei ( proba incorect recoltata) Corelatie frotiu-colonii dezvoltate pe mediile de cultura

Evolutia sub tratament a infectiei

Microscopia optic pe cmp luminos se aeaz pe masa port obiect preparatul microscopic i se fixeaz ntre suporii reglabili; se rotete capul revolverului pentru a aduce n axul optic obiectivul selectat. 14

privind micrii

lateral, grosiere

manipuleaz pn cnd

butonul lentila

obiectivului ajunge ct mai aproape de preparat; se privete prin oculare i se ajusteaz pentru propria distan interpupilar pn cnd se obine viziunea binocular perfect a cmpului microscopic; se focalizeaz preparatul acionnd tubul microscopului numai de jos n sus prin butonul micrii grosiere, apoi dac se lucreaz cu un obiectiv puternic, prin butonul micrii fine; se selecteaz o suprafat din preparat cu elemente bine etalate. Pentru aceasta se acioneaz cu butoanele

15

care controleaz micrile transversal i longitudinal ale mesei port obiect; se acioneaz butonul de focalizare a condensorului pn se obine imaginea diafragmei de cmp cu cel mai clar contur. La examinri cu obiectivele 10x se reduce apertura numeric a condensorului prin deurubarea monturii cu lentila superioar se regleaz deschiderea diafragmei de apertur. Pentru aceasta se scoate ocularul, diafragmei pupilei de se de privete apertur a prin pn tubul ce microscopului i se acioneaz prghia imaginea ei ocup - 1/3 din diametrul ieire obiectivului. Deschiderea spre maxim a diafragmei16

de apertur crete puterea de separare, dar scade contrastul imaginii; invers, micorarea ei scade puterea de separare, dar crete contrastul imaginii; Odat stabilite aceste reglaje, este contraindicat reglarea fluxului luminos prin modificarea diafragmei de cmp sau poziiei condensorului. Acum fluxul luminos mai poate fi crescut prin rabatarea filtrului mat, sau sczut prin filtrului fumuriu NG 5/2 n lcaul filtrelor. Filtrul verde VG 6/2 ofer un contrast mai bun imaginii i crete puterea separatoare, dar altereaz interpretarea culorilor preparatului; n final se focalizeaz imaginea prin ajustarea ocularul17

dioptriilor:

se

obtureaz

stng, se privete cu ochiul drept prin ocularul drept i se focalizeaz imaginea prin butonul micrii fine. Se obtureaz ocularul drept, se privete apoi cu ochiul stng i se focalizeaz imaginea numai prin rotirea inelului de ajustare a dioptriilor fr a atinge butoanele micrii grosiere sau fine a tubului. ntreinerea microscopului

18

microscopul se ine la adpost de praf: sub hus sau n cutie; ocularele i obiectivele nefolosite se in n cutia lor; dup fiecare examinare se cur uleiul de cedru de pe lentila obiectivului IU cu o hrtie moale, care nu las scame; nu se ating cu mna suprafeele optice;

nu se apropie exagerat ochii de oculare;19

stapylococcus spp.

S.aureus

20

streptococcus spp.

21

Group A, Streptococcus pyogenes

Sputum smear Staphylococcus & Streptococcus pneumoniae

22

Neisseria gonorrhoeae

23

streptococcus pneumoniae

Bacillus24

Salmonella typhi, the agent of typhoid. Gram stain. (CDC)

25

vibrio cholerae

26

Stained pus from a mixed anaerobic infection. At least three different clostridia are apparent.

27

Clostridium perfringens, Gram Stain. Most clostridia are renowned for staining "Gramvariable".

corynebacterium diphtheriae

28

Haemophilus influenzae

Pseudomonas aeruginosa

29

Escherichia coli/PMN

Peritoneal fluid Mixed anaerobic infection

30

Urethral smear, Neisseria gonorrhoeae

31

Modul de desfasurare a lucrarii practice-

studentii primesc manuscrisul cu Efectuarea preparatelor microscopice, Examinarea la micoscop

- Lp se desfasoara interactiv - Fiecare student efectueaza un frotiu din cultura - Fiecare student coloreaza frotiul efectut - Fiecare student prinde imaginea la microscop si examineaza frotiul colorat - Fiecare student examineaza frotiuri din produse patologice

32

Bibliografie

Bacteriologie

Medicala,

Olga

Dorobat, editura UTM, 2006

Clinical Microbiology Procedures Handbook, Henry D. Isenberg, editata American Color of Society Atlas for and Microbiology, 2004

Koneman's Textbook

Diagnostic

Microbiology , Washington C Winn, Stephen D. Allen, Gail L. Woods, William M. Janda, Paul C. Schreckenberger , editura Lippincott Williams & Wilkins, 2005 Manual of Clinical Microbiology , Patrick R. Murray , Ellen Jo Baron ,33

Michael A. Pfaller , Fred C. Tenover , Robert H. Yolken, editura ASM, 2007

34