Spectrofotometrie

1.1 Prezentare generală a metodei de analiză chimică prin

spectrofotometrie

Spectrofotometria este o metodă optică de determinarea a concentraţiilor constituenţilor

existenţi într-o probă dată.

Spectrofotometria reprezintă măsurarea cantitativă a spectrelor de absorbţie / emisie ale unei

substanţe. Substanţele care absorb radiaţii aparţinând domeniului vizibil se vor colora în culori

complementare. Acest fapt face posibilă determinarea cantităţii de lumină absorbită de către soluţie,

intensitatea radiaţiei transmise fiind proporţională cu concentraţia speciilor absorbante din soluţia

analizată.

Această metodă se bazează pe iradierea probei de analizat cu un fascicol de radiaţii

electromagnetice, a cărui putere radiantă se micşorează la ieşirea din sistem în funcţie de natura şi

concentraţia speciilor absorbante.

Spectroscopia este o denumire generică dată unei clase de procedee şi tehnici experimentale prin care

se urmăreşte şi se cuantifică efectul absorbţiei sau emisiei de energie de către o probă supusă analizei

chimice calitative şi/sau cantitative. La folosirea spectroscopiei în analiza chimică calitativă scopul

spectroscopiei este acela ca dintr-un spectru să se obţină informaţii despre proba analizată precum:

structura internă, compoziţie, dinamică.

Spectrofotometria este o ramură a spectroscopiei moleculare ce se ocupă cu analiza

calitativă şi cantitativă a spectrelor de absorbţie în domeniul UV-VIS a substanţelor organice sau

anorganice în stare lichidă. Din cauză că în domeniul UV-VIS nu toate substanţele sau elementele

chimice au spectre de absorbţie cu maxime clare analiza calitativă nu este atât de reprezentativă ca cea

cantitativă. Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizează transmiterea luminii printr-o soluţie

pentru determinarea concentraţiei unui solut în soluţia respectivă. Radiaţia ectromagnetică emisă într-

un spectru electromagnetic este desfăcută prin refracţie pe o prismă sau pe o reţea de difracţie Tn în

scopul evidenţierii precise a lungimilor de undă specifice diferitelor elemente, ioni, radicali sau

molecule. La folosirea spectroscopiei în analiza chimică calitativă se realizează corelarea lungimilor de

undă a spectrelor obţinute cu spectre etalon. La analiza chimică cantitativă se foloseşte dependenţa

dintre intensitatea emisiilor spectrale specifice şi concentraţia elementelor sau substanţelor din compuşi

sau amestecuri de compuşi.

Un fascicol de radiaţii de intensitate I0,ce străbate sub o incidenţă normală un strat absorbant,

pierde o parte din energia sa radiantă prin reflexie Ir iar o parte din aceasta este absorbită de către sistem

Ia.

Metoda de analiză chimică a alimentelor prin spectrofotometrie este o metodă care are la bază legea

LAMBERT-BEER.

Deci din intensitatea iniţială numai o parte din radiaţie este transmisă şi ea se notează cu It.

Gradul de diminuare al intensităţii radiaţiei incidente este (conform legii lui Beer-Lambert)

proporţional cu grosimea stratului traversat şi cu concentraţia speciei absorbante:

EkcbI

I

T t

=== 0lg1

lg

Legea Beer-Lambert - exprimă legătura între intensitatea luminii care traversează o soluţie şi

concentraţia soluţiei respective.

2

În spectrofotometrie se folosesc uzual doi parametri pentru a cuantifica absorbţia:

T - este transmisia; E - este extincţia .

Cd

oI

IT ∈−== 10 T

TE log

1log −=

=

În fenomenele de propagare, lumina prezintă, după cum se ştie, un aspect ondulatoriu, de undă

electromagnetică. În fenomenele de emisie, respectiv absorbţie, lumina prezintă un aspect corpuscular,

adică se comportă ca fiind formată din cantităţi bine determinate de energie, indivizibile, numite cuante

sau fotoni.

Explicaţia existenţei fotonilor rezidă în aceea că fiecare unitate de energie radiantă este emisă

de câte o microparticulă: atom,ion sau moleculă.

3

Absorbţia sau emisia unui foton este legată de trecerea prin salturi a unei asemenea

microparticule de la o stare energetică posibilă la alta.Pentru un astfel de salt este necesar ca energia

cunatei, să fie egală cu diferenţa de energie dintre cele două stări. Aceste tranziţii, legate de

interacţiunea foton-microparticulă urmează anumite reguli de selecţie care determină ce fel de salturi

de la un nivel la altul sunt permise. Pe de altă parte, o tranziţie are loc numai dacă sunt îndeplinite

anumite condiţii de interacţiune cuantă – particulă.

În chimie şi fizică, diferite tipuri de spectrofotometre acoperă game largi ale spectrului

electromagnetic: ultraviolet (UV), lumina vizibilă, infraroşu (IR), sau cu microunde.

Spectrofotometria UV este deosebit de utilă în detectarea şi cuantificarea substanţelor incolore, în

soluţie.

1. Principiul metodei

Spectrofotometrul - instrument care serveşte la obţinerea spectrelor de emisie sau de absorbţie

ale substanţelor, cu ajutorul căruia se determină atât lungimile de undă ale liniilor, cât şi intensităţile

acestorlinii.

Principiul spectrofotometrului constă în determinarea frecvenţelor la care au loc tranziţii: coeficientul

de extincţie prezintă un salt brusc pentru frecvenţele cuantelor care provoacă tranziţii în probă. Pentru

aflarea acestor frecvenţe se fac deci determinări de coeficienţi de extincţie în funcţie de frecvenţă. În

principiu se foloseşte un calorimetru, dar în loc să se lucreze în lumină albă,se fac determinări în

lumină monocromatică a cărei frecvenţă se poate varia continuu. Se utilizează o sursă de lumină albă,

de exemplu un bec cu filament, şi se selectează pe rând radiaţiile de diferite frecvenţe cu ajutorul unui

dispozitiv numit monocromator.

Schema de principiu a obţinerii luminii monocromatice pentru un spectrofotometru cu monocromator

cu reţea:

4

Schema de principiu a unui spectrofotometru

1- sursă de lumină, 2-lentile colimatoare, 3-sistem de fante, 4- sistem monocromator cu prismă,

5- spaţiu pentru cuvele cu soluţie de analizat, 6- detector de radiaţie luminoasă, 7- amplificator, 8-

sistem de afişare.

Un astfel de ansamblu format dintr-o sursă albă, un monocromator şi un colorimetru cu citire

directă, constituie cel mai simplu tip de spectrofotometru.

Spectrofotometrul este un aparat optoelectronic care măsoară raportul a două valori ale

unei mărimi radiometrice la aceeaşi lungime de undă şi în acelaşi interval îngust de lungime de undă .

Cu ajutorul unor oglinzi mobile din monocromator se schimbă în salturi foarte mici frecvenţa

luminii selectate din radiaţia totală a sursei. De fiecare dată se măsoară absorbţia, transmisia sau

extinţia şi se calculează valoarea coeficientului de extinţie E. Reprezentând grafic variaţia lui E în

funcţie de frecvenţă sau lungimea de undă se obţine o spectrogramă (un spectru).

Corespondenţa tranziţiilor posibile (a) cu liniile spectrale ideale

(b) respectiv benzile reale(c) dintr-o spectrogramă.

În figură se redă o astfel de spectrogramă pentru cazul în care proba prezintă în domeniul

cercetat trei nivele de energie permise, sunt îndeplinite condiţiile de interacţiune şi nici una din tranziţii

nu este interzisă.

Valorile ε nu pot fi trasate direct de aparatele înregistratoare, aflarea lor necesitând un calcul în

funcţie de concentraţie şi grosimea de strat.

5

Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizează transmiterea luminii printr-o soluţie

pentru determinarea concentraţiei unui solut în soluţia respectivă. Spectrofotometrul diferă de

colorimetru prin modul în care lumina este separată în lungimile de undă componente.

Spectrofotometrul utilizează o prismă pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizează filtre.

Ambele se bazează pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de undă cunoscută printr-o

proba şi măsurarea cantităţii de energie luminoasă care este transmisă. Aceasta se realizează prin

plasarea unei fotocelule în partea opusă a probei respective. O rază de lumină este formată din fotoni;

când un foton întâlneşte o moleculă de analit, există şanse ca analitul să absoarbă fotonul. Această

absorbţie reduce numărul de fotoni din raza de lumină, astfel reducând intensitatea luminoasă.Toate

moleculele absorb energie radiantă la anumite lungimi de undă. Cele care absorb energie în spectrul

vizibil sunt cunoscute ca pigmenţi. Proteinele şi acizii nucleici absorb lumina în domeniul ultraviolet.

Un spectrofotometru implică o sursă de lumină, o prismă, un suport pentru probe şi o fotocelulă.

Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controlează intensitatea luminii, lungimea

de undă şi conversia energiei primite la nivelul fotocelulei în fluctuaţii voltmetrice. Fluctuaţiile

voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scală metrică/digitală şi valorile sunt înregistrate într-un computer.

Intensitatea culorii dintr-o probă depinde de cantitatea de solut din proba respectivă. Transmisia luminii

nu este o funcţie liniară, ci mai degrabă exponenţială. Transmitanţa este procentul relativ de lumină

care a trecut prin probă.

Transmitanţa procentuală este transformată într-o funcţie logaritmică inversă cunoscută ca

absorbantă(sau densitate optică).

Legea Beer-Lambert: absorbanţa este minus log10 din transmitanţa (A = - log10T). Această valoare

este mai utilă decât transmitanţa deoarece proiecţia absorbantei versus concentraţie determină o linie

dreaptă, absorbanţa crescând odată cu creşterea concentraţiei (transmitanţa scade odată cu creşterea

concentraţiei de analit).

Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesară stabilirea unei serii cunoscute de diluţii a unor

cantităţi cunoscute de solut. Una din acestea nu conţine solut şi este cunoscută ca “blank”. Este utilizată

pentru ajustarea instrumentului să citească 100% transmitanţa pentru absorbanta 0. O valoare a

transmitanţei de 0% (absorbanta infinită) este stabilită prin plasarea unei bariere între sursa de lumină şi

fotocelulă. Toate celelalte măsurători sunt apoi efectuate prin simpla plasare a probelor în calea luminii.

Dupa înregistrarea absorbanţei pentru o serie de probe standard este efectuată o dreaptă absorbantă

versus concentraţie. Panta dreptei reprezintă coeficientul de extincţie. Această valoare este o constantă

şi este utilizată pentru conversia oricărei absorbante măsurate în concentraţia corespunzătoare (C =

A/ε).

Un spectrofotometru poate utiliza atât lumina vizibilă (de obicei având ca sursă de lumină o lampă cu

6

tugsten/halogen), cât şi lumina UV. Singura modificare necesară este înlocuirea tuburilor de sticlă cu

cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV şi nu este potrivită pentru un spectrofotometru UV).

2. Avantajele metodei de analiză prin spectrofotometrie

Spectrofotometria are numeroase şi variate domenii de aplicabilitate:

• în analiza în urme

• în analizele tehnice metalurgice se aplică pentru determinarea

elementelor de aliere din oţeluri, fonte, aliaje,

• aplicaţii biologice,

• medicale, clinice,

• de mediu,

• industria alimentară .

Avantajele propriu-zise ale acestei metode de analiză constă în:

permite obţinerea de date certe;

pot fi cercetare probe complexe;

permite automatizare şi determinare foarte rapidă;

prezintă o sensibilitate ridicată;

dau un grad mare de siguranţă a rezultatelor măsurătorilor.

precizie mare de determinare;

pot fi utilizate probe mici;

sunt metode rapide, prin măsurarea directă, fără a fi necesară adăugarea de soluţie

titrată. În multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin folosirea unor reactivi

specifici şi prin controlul strict al reacţiei se poate elimina interferenţa ionilor străini (controlul pH-ului,

lungime de undă convenabil aleasă, utilizarea solvenţilor organici pentru extragerea complecşilor

coloraţi, utilizarea unor reacţii redox etc.).

folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de determinare a

urmelor de substanţă,

se poate aplica pentru dozarea majorităţii substanţelor. În cazul în care compusul nu

absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacţie chimică adecvată într-un compus colorat ce

absoarbe lumina.;

7

metodele spectrofotometrice pun în evidenţă punctul de echivalenţă într-o metodă

titrimetrică (titrare spectrofotometrică).

3. Dezavantajele metodei de analiză prin spectrofotometrie

precizia finală se află adesea în domeniul ±5%;

costul iniţial şi pentru întreţinerea echipamentului este ridicat;

intervalul de concentraţie este limitat (măsurători relative);

în mod obişnuit, necesită spaţiu destul de mare;

implică un personal cu o pregătire specială;

timp mai îndelungat pentru obţinerea rezultatelor;

necesită un număr mre de determinări pentru o interpretare statistică;

dă indicaţii asupra unei singure caracteristici.

Analizează doar un element pe rând - echipamentul care este disponibil în prezent este

construit pentru a determina doar un element pe rând. Acest lucru nu ar constitui o problemă, dacă un

număr de probe trebuie să fie analizate pentru un singur element. Dar, în cazul în care o probă trebuie

să fie analizată de o serie de elemente, ar putea apărea o dificultate. Fiecare element trebuie să fie

determinat separat;

Nu determină nemetalele - în prezent, această metodă nu a fost găsită utilă pentru

determinarea directă de elemente nemetalice, cum ar fi halogenurile, oxigenul şi azotul;

Nu analizează direct probele solide şi gazoase - o altă problemă în absorbţia atomică,

este faptul că este foarte utilă pentru analiza probelor de lichid, dar nu a fost utilizată cu succes pentru

analiza directă de solide sau gaze;

4. Aparatură utilizată

:

8

Spectro(foto)metrele se clasifică în:

I) spectrofotometre de absorbţie:a) spectrofotometre cu absorbţie moleculară în UV-VIZ-IR;b) fotocolorimetre;c) spectrometre cu transformată Fourier;d) spectrofotometre cu absorbţie atomică

II) de emisiea) spectrometre de emisie optică în plasmă cuplată inductiv;b) fotometre cu flacără;

c) spectrometre de emisie cu fluorescenţă de raze X.

În laboratoare se întâlnesc diverse tipuri de spectrofotometre în funcţie de domeniul de utilizare:

* spectrofotometrul de fluorescenţă atomică

* spectrofotometrul cu vizibilitate în infraroşu IR

* spectrofotometrul pentru analiza de apă

* spectrofotometrul UV VIS

* spectrofotometrul de rezonanţă electronică de spin

* spectrofotometrul cu monofascicol

* spectrofotometrul cu dublu fascicol

* spectrofotometrul cu şir de diode, etc.

Spectrofotometrele se compun, în principiu, din următoarele dispozitive esenţiale:

*o sursă luminoasă,

* un monocromator,

* un recipient cu pereţi transparenţi, numită celulă de absorbţie,

* un detector şi

* un dispozitiv pentru măsurat şi înregistrat efectele detectate.

Schema unui spectrometru de absorbţie

9

Schema unui spectrofotometru

În molecule biatomice, ca HCl, HBr, etc., este posibilă o vibraţie de un singur fel, aceea prin care

atomii se apropie şi se îndepărtează unul de altul, oscilând în jurul unei poziţii de echilibru.

10

Spectrofotometrele pot fi cu două fascicule sau cu un singur fascicul.

Spectrofotometrul cu un singur fascicul – aceste spectrofotometre au un singur fascicul

luminos care trece pe rând prin cuva cu soluţie de referinţă şi prin cuva cu soluţie de analizat.

Spectrofotometrul VSU-2G lucrează în domeniul 200-1600 nm, de la ultravioletul apropiat la

infraroşu.

Schema aparatului este reprezentată astfel:

Radiaţia care vine de la sursa 1 (un filament care emite radiaţie prin încălzire) ajunge, după

reflexiile pe oglinzile 2, 3, 4, pe fanta de intrare 5, care poate fi reglată din exteriorul aparatului.

Fascicolul divergent este transformat în fascicul paralel prin reflexie pe oglinda concava 6 şi

ajunge apoi la reţeaua de difracţie prin reflexie 7. Fasciculul, care este acum separat după lungimile de

11

undă, este din nou reflectat de oglinda concava 6 care îl transformă într-un fascicul convergent care

ajunge la fanta de ieşire (nereglabilă) 8 şi de acolo, cu ajutorul lentilei 9, la cuvele cu soluţii 10. După

care fasciculul emergent ajunge pe un fotodetector 11 legat direct la calculator. Se citeşte o tensiune

care este proporţionala cu fluxul fasciculului.

O caracteristică importantă a unui spectrofotometru este lărgimea benzii pasante. Ea se

defineşte ca lărgimea domeniului spectral care iese din monocromator la o lungime de unda dată.

Datorită lărgimii finite a fantei de ieşire, aceasta este traversată de o bandă de lungimi de undă.

Distribuţia energiei luminii, în funcţie de lungimea de unda prezintă aproximativ forma unui triunghi al

cărui vârf se situează la lungimea de undă marcată pe scală.

Spectrofotometrul cu dublu fascicul – este un aparat automat construit după principiul

monofascicul, care să înregistreze zeci de puncte pe secundă, ar fi nevoit să alterneze foarte repede

cuva de dizolvant cu cea de soluţie, operaţie greu de rezolvat din punct de vedere mecanic şi care ar

necesita cuve perfect etanşe. De aceea este mult mai raţional să se menţină cuvele pe loc şi să se treacă,

simultan sau succesiv, câte un fascicul de lumină prein fiecare cuvă, realizând astfel aparate cu dublu

fascicul .

Acestea sunt componentele unui spectrofotometru cu dublu fascicul si pricipiul de bază:

S – sursă; M – monocromatro; E1, E2, E01, E04- motoare electrice; O1, O4 – oglinzi mobile; O2, O3

– oglinzi fixe; C1, C2 – cuve; R – receptor; A – amplificator; K – compensator; Er – motor reversibil; Di

– dispozitiv de înregistrare .

12

Sursa S trimite un fascicul de lumină albă pe fanta de intrare a monocromatorului M. Motoraşul

E1 schimbă continuu elementele mobile ale monocromatorului, astfel încât din monocromator iese o

radiaţie monocromatică a cărei frecvenţă se schimbă uniform în timp.La un moment dat radiaţia cade

pe oglinda mobilă O1, rotită de electromotorul E01 cu circa 10 rot/sec. Oglinda fixă O2 schimbă direcţia

razei cu 900 şi o trece în cuva cu soluţia de cercetat.

Întrucât în cuva C2 se găseşte dizolvată şi substanţa de cercetat, aceasta va introduce o absorbţie

suplimentară, iar ca urmare pe receptor vor cădea alternativ un fascicul mai intens şi unul mai slab.De

la receptor semnalele sunt trecute la amplificatorul A, care este informat printr-un sistem de

sincronizare de poziţiile celor două oglinzi în fiecare moment. Impulsurile amplificate sunt trecute la

motorul reversibil Er, care împinge în drumul fasciculului mai intens o pană de compensaţie K, în

formă de pieptene. Cu ajutorul penei compensatoare se reduce intensitatea radiaţiilor de comparaţie

până la valoarea celor care au trecut prin cuva cu soluţie, moment în care motorul E r se opreţte.

Ajungându-se apoi într-un domeniu spectral în care substanţa absoarbe şi mai intens,pana este împinsă

şi mai adânc în drumul radiaţiilor de comparaţie de către motorul Er. În acest moment faza impulsurilor

de radiaţie de la receptorul R se inversează, motoraşul Er porneşte în sens invers, trăgând pana în afară

până la restabilirea echilibrului.

Solidar cu compensatorul K se mişcă şi o penişă înregistratoare care înscrie pe un tambur cu

hârtie o diagramă.

Spectrofotometrul cu şir de fotodiode – una din realizările cele mai importante în domeniul

spectrofotometriei o reprezintă folosirea detectoarelor şir de fotodiode, în locul detectoarelor clasice.

Aceste tip de detector permite preluarea spectrului UV-VIS-NIR în acelaşi timp nefiind necesară

scanarea secvenţială în timp a tuturor lungimilor de undă.

13

Mai sus este prezentat un spectrofotometru UV-VIS cu şir de fotodiode. Se remarcă în principal

faptul că acest spectrofotometru nu are nici un element mecanic sau electromecanic în mişcare aşa cum

au spectrofotometrele clasice cu scanare.

La acest tip de spectrofotometre lumina se desparte în lungimile de undă individuale abia după

ce trece prin cuvă. Pentru fiecare lungime de undă individuală dorită există ca detector al intensităţii

luminoase absorbite câte o fotodiodă individuală.

BIBLIOGRAFIE

1.Lorentz Jäntschi -Chimie Fizică. Analize Chimice şi Instrumentale , Editura

AcademicDirect, 2004 (http://ph.academicdirect.ro);

2.Lorentz Jäntschi ,Sorana Bolboacă - Analiză Chimică şi Instrumentală Aplicată,

Editura AcademicDirect (http://ph.academicdirect.ro), ( pag. 40-42);

3.Horea Iustin Naşcu, Lorentz Jäntschi -Chimie analitică şi instrumentală , Editura

AcademicPres&AcademicDirect 2006

4.http://www.katalin-nohse.ro/aparatura_laborator.php#4

14

5.http://www.brml.ro/downloadNML/NML_etapa7/NML028-05/NML%20028-05.doc

6.http://ph.academicdirect.org/CAI_2006.pdf

7.http://www.umfiasi.ro/ScoalaDoctorala/StudiiAprofundate/Suport%20Cursuri/

Validarea%20metodelor%20spectrofotometrice.doc

15