SINTEZA PROTEINELOR

Abilitatea celulelor de a menţine un înalt nivel de ordine într-un univers haotic depinde de informaţia genetică, informaţie care este exprimată, menţinută, replicată şi ocazional ameliorată printr-o serie de procese specifice cum ar fi: sinteza ARN şi a proteinelor, repararea ADN, replicarea ADN şi recombinarea genică. În cadrul acestor procese, informaţia dintr-o secvenţă lineară de nucleotide este transpusă fie într-un alt lanţ de nucleotide (ADN sau ARN) fie într-un lanţ de aminoacizi (peptid).

Proteinele constituie mai mult de 50% din masa uscată a unei celule iar sinteza lor este esenţială pentru menţinerea statusului celular ca şi pentru creştere şi dezvoltare. Sinteza proteinelor reprezintă cel mai complex proces biosintetic descris până la momentul de faţă; aceasta deoarece, la eucariote, procesul de sinteză a proteinelor implică activitatea a 70 proteine ribozomale diferite, a peste 20 de enzime necesare activării aminoacizilor precursori, a zeci de proteine auxiliare alături de factori de iniţiere, elongare şi terminalizare, a aproximativ 100 enzime adiţionale pentru procesare finală a diferitelor proteine, a peste 40 de tipuri de ARNt. Circa 300 de macromolecule sunt implicate în cooperarea necesară sintezei proteinelor.

NECESAR DE „MATERIALE”Sinteza proteinelor necesită, ca şi construcţia unei clădiri, - “cărămizi” care în acest caz sunt reprezentate de aminoacizi- “transportorii” – ARNt specifici- “constructori” – ribozomii- “un plan”, aici reprezentat de informaţia cuprinsă în ARNm, copiat pe baza codului

genetic cuprins în ADN

ARNt, transportorii aminoacizilor care vor constitui viitorul lanţ peptidic, acţionează ca şi adaptori ce vor transla secvenţa nucleotidică în secvenţă proteică.Molecula de ARNt este o moleculă mică, având circa 70-90 nucleotide. Are o structură specifică, o extremitate posedând sistemul de conectare la secvenţa codonului de pe ARNm (deci un anticodon) şi alta care cuprinde sistemul de conectare la un aminoacid specific. O a doua funcţie a ARNt este aceea de a activa un aminoacid (AA) specific, cuplându-l la capătul carboxi–terminal printr-o legătură de înaltă energie; astfel, capătul carboxi-terminal “încărcat” din punct de vedere energetic va putea să se cupleze cu regiunea amino-terminală a următorului aminoacid adus de un alt ARNt. Activarea este necesară, deoarece un AA neactivat nu va putea fi adăugat unui lanţ polipeptidic în creştere.Activarea AA necesită energia furnizată de hidroliza ATP.

1

Structura ARNt (forma desfăşurată) Structura ARNt (structura tridimensională)

RibozomiiStructură. Ribozomii nu pot fi observaţi în microscopia fotonică. Ultrastructură. În microscopia electronică au fost descrişi ca şi corpusculi elipsoidali cu diametrul mare de 20-25 nm iar cel mic de 15-17 nm. Din punct de vedere ultrastructural cuprind 2 subunităţi:

Subunitatea mică la eucariote au un coeficient de sedimentare 40S (30S la procariote)

Subunitatea mare la eucariote au un coeficient de sedimentare 60S (50S la procariote)

Subunitatea mică prezintă o proeminenţă numită cap, o platformă şi o bază sau corp (platforma şi baza reprezintă 2/3 din unitate). Între cap şi bază se găseşte o strangulaţie.Subunitatea mare prezintă 3 proeminenţe din care una centrală numită protuberanţă centrală iar celelalte – tulpină şi creastă. Între protuberanţa centrală şi creastă există o depresiune şi un canal prin care se scurge lanţul polipeptidic în reticulul endoplasmatic rugos. La începutul şi finalul sintezei unui peptid, subunităţile sunt separate.

2

Ribozomii, structură tridimensională pe subunităţi Subunităţile ribozomale şi componentele lor moleculareScuze, n-am mai avut timp să traduc

Structura moleculară a ribozomilorStructura chimică a ribozomilor cuprinde molecule de ARN ribozomal (ARNr), proteine bazice, acide şi ioni (Mg, K, Ca).Subunitatea mare este formată din ARNr 5S, ARNr 28S (responsabil de formarea legăturii peptidice; la procariote are 23S) şi 49 de proteine.Subunitatea mică este formată din ARNr 18S şi 33 proteine.Structura tridimensională a ribozomilor a fost descrisă complet pentru E. coli în august 2000. Astfel s-a constatat că proteinele din compoziţie sunt structuri de asigurare a unităţii şi mobilităţii ribozomale, fiind situate mai mult la suprafaţa ribozomului de unde trimit extensii sinuoase spre interior, unde sunt locaţiile de cuplare a ARNt.. Sinteza propriuzisă a peptidului şi mai ales formarea legăturii peptidice reprezintă opera aproape exclusivă a ARNr 23S (28S la eucariote). Astfel ribozomul poate fi privit ca o uriaşă riboenzimă. (asta e de actualitate !)

3

ARNm, planul construcţiei proteinelor.ARN este sintetizat pe baza ADN sub influenţa unor enzime denumite ARN-polimeraze; procesul poartă numele de transcripţie. Toate cele 3 tipuri de ARN (transfer, mesager sau ribozomal) reprezintă copii ale unor secvenţe de ADN. ARNm este deci o moleculă monocatenară, cu lungimea cuprinsă între 70 şi 10.000 de nucleotide. Deşi, în principiu, orice parte a moleculei de ADN poate fi transcrisă, numai anumite zone sunt utilizate în acest scop, în funcţie de anumite secvenţe nucleotidice, denumite promotori. Sunt definite trei tipuri de ARN şi anume ARNm, ARNt şi ARNr.

Codul genetic este degenerat.În timpul sintezei proteice, maşinăria translaţională se mişcă dinspre capătul 5’ spre capătul 3’ al moleculei de ARNm. Secvenţa ARNm este citită cu câte 3 nucleotide odată (3 nucleotide succesive = codon). Fiecare aminoacid este specificat în secvenţa ARNm de către un triplet de nucleotide, denumit codon, care corespunde unei secvenţe similare de nucleotide la nivelul ARNt, anticodon.

a. Alinierea ARNm şi ARNt este antiparalelă. ARNt este reprezentat în configuraţia caracteristică de

frunză de trifoi.

b. Trei tipuri de relaţii posibile codon anticodon atunci când anticodonul ARNt conţine inozinat.

Deoarece numai un anumit ARNt poate fi complementar unui anumit codon de pe ARNm, acesta din urmă va determina aminoacidul specific ce va fi adăugat.Având în vedere că ARN este compus din 4 tipuri de nucleotide, există 64 de posibilităţi de a aranja câte 3 nucleotide într-un codon (4x4x4). Trei secvenţe din aceste 64 nu codifică pentru aminoacizi, reprezentând codonii stop. Rămân deci, 61 de codoni care vor codifica pentru 20 de aminoacizi. De aceea majoritatea AA sunt reprezentaţi de mai mult de 1 codon, motiv pentru care codul genetic este denumit degenerat. Doi AA, Met şi Trp sunt reprezentaţi de un singur codon şi în acelaşi timp sunt cei mai puţin abundenţi AA dintr-o celulă.

4

Degenerarea codului genetic constă fie în faptul că există mai mulţi ARNt specifici pentru acelaşi aminoacid fie în acela că un ARNt poate cupla mai mulţi codoni diferiţi. De fapt, ambele situaţii sunt valabile. Pentru unii aminoacizi există mai mult de un ARNt, iar unele molecule de ARNt sunt astfel construite încât necesită o omologie numai la nivelul primelor 2 nucleotide din codon, tolerând o nepotrivire la cel de-al treilea – ipoteza wobble – şovăială.De exemplu, alanina (Ala) este codată de tripletele GCU, GCC, GCA sau GCG. Primele 2 perechi de baze (GC şi AT) la nivelul cuplului codon-anticodon formează legături puternice de hidrogen (numite legături Watson-Crick); în schimb, a treia bază azotată din codon (A, U sau C) formează punţi de hidrogen slabe cu reziduul inosinat, localizat în prima poziţie a anticodonului (vezi figura de mai sus).

REZUMAT - ! FAZE DE REŢINUT O secvenţă de AA dintr-o proteină este construită pe baza translării informaţiei

codificate în ARNm, reprezentând copia unei catene din ADN. Acest proces este realizat de către ribozomi.

Aminoacizii sunt specificaţi de codonii ARNm care reprezintă triplete de nucleotide. Procesul de translaţie necesită molecule adaptor care sunt ARNt. Aceste molecule conţin triplete de nucleotide – anticodoni – care corespund codonilor din ARNm. ARNt vor insera aminoacizi în poziţiile lor specifice din lanţul polipeptidic.

Codonul AUG semnalizează începutul translaţiei. Tripletele UAA, UAG şi UGA reprezintă codoni stop.

Codul genetic standard este degenerat: prezintă multiple cuvinte cod pentru aproape fiecare aminoacid.

Cuvintele de cod sunt universale la toate speciile cunoscute, cu mici excepţii la mitocondrii şi unele unicelulare.

A treia poziţie din fiecare codon este mai puţin specifică decât primele două.

SINTEZA PROTEINELOR - ETAPEEtapele sintezei proteice sunt divizate în 3 etape principale şi 2 accesorii, una care precede sinteza propriu-zisă – activarea presintetică a precursorilor şi una postsintetică – procesarea lanţului de aminoacizi.

Pe scurtETAPA I – ACTIVAREA PRESINTETICĂ A PRECURSORILORPentru sinteza unui polipeptid cu o secvenţă definită sunt necesare 2 condiţii biochimice: - grupul carboxil al fiecărui aminoacid trebuie să fie activat pentru a facilita formarea

legăturii peptidice- trebuie stabilită o legătură între fiecare nou AA şi informaţia din ARNm-ul care îl

codează. Ambele necesităţi sunt îndeplinite de ataşarea unui AA la un ARNt specific în prima etapă a sintezei proteice. Ataşarea AA corect este esenţială. Această reacţie are loc în citoplasmă şi nu în ribozom. Fiecare din cei 20 de aminoacizi este cuplat covalent la ARNt specific prin energia furnizată de hidroliza ATP, în prezenţa unor enzime de activare dependente de Mg,

5

numite ARS (amioacil ARNt-sintetaze). Odată ce AA este ataşat la ARNt, se formează un aminoacil-ARNt (AA-ARNt) iar AA este numit „activat”.

ETAPA II - INIŢIEREAARNm care transportă codul pentru polipetidul de sintetizat se cuplează la subunitatea ribozomală mică şi la AA-ARNt. Apoi are loc cuplarea subunităţii mari pentru a forma complexul de iniţiere. AA-ARNt de iniţiere şi codonul AUG de pe ARNm semnalizează debutul sintezei polipeptidului. Acest proces necesită GTP şi este indus de o serie de factori numiţi factori de iniţiere. ETAPA III-a – ELONGAREAPolipeptidul nascent este alungit prin legarea covalentă succesivă a unităţilor AA, fiecare fiind transportat la ribozom în poziţia corectă de către ARNt specific. Elongarea necesită proteine citoplasmatice numite factori de elongare. Ataşarea fiecărui AA-ARNt şi mişcarea ribozomului de-a lungul ARNm este determinată de hidroliza GTP (1 GTP la fiecare reziduu AA adăugat la polipeptid).ETAPA IV-a – TERMINALIZAREA ŞI ELIBERAREACompletarea lanţului polipeptidic este semnalizată de codonii stop din ARNm. Polipeptidul este eliberat din ribozom cu ajutorul factorilor de eliberare. ETAPA V – PLIERE ŞI PROCESARE POSTTRANSLAŢIONALĂPentru determinarea formei active biologic, polipeptidul trebuie pliat pentru determinarea conformaţiei tridimensionale. Înainte sau după pliere, polipeptidele suferă procesare enzimatică care include înlăturarea unor aminoacizi (de obicei de la capătul amino-terminal), adiţia grupărilor acetil, fosforil, metil, carboxil etc.), ataşarea unor grupări carboxilice sau prostetice.

ETAPA I – ACTIVAREA PRESINTETICĂ A PRECURSORILORAminoacil-ARNt-sintetazele activează ARNt.Am văzut modul în care un anumit ARNt recunoaşte codonul care specifică un anumit aminoacid. Să vedem modul în care ARNt cuplează AA devenind activat. Acest proces crucial este catalizat de 20 aminoacil-ARNt sintetaze (ARSs), fiecare fiind capabilă de a recunoaşte un anumit AA şi ARNt-ul său corespunzător. Aceste enzime de cuplare leagă un AA la hidroxilii 2’ sau 3’ care sunt liberi la nivelul ribozei din adenozină, înspre capătul terminal al moleculei de ARNt. Reacţia de cuplare a AA este o reacţie în doi paşi, dependentă de hidroliza ATP.

Enzimă + AA + ATP Mg Enzimă(aminoacil-AMP) + PPi

ARNt + Enzimă(aminoacil-AMP) aminoacil-ARNt + AMP + Enzimă

În prima etapă, enzima, aminoacidul şi ATP formează un complex şi eliberează PPi

În a doua etapă, grupul aminoacil este transferat din complexul enzimatic pe ARNt, care va elibera AMP.Aproape jumătate din ARSs transferă grupul aminoacil la hidroxilul 2’ al adenozinei, constituind sintetaze de clasa I, iar celelalte, care transferă aminoacilul la hidroxilul 3’ al adenozinei reprezintă sintetaze de clasa II. AA-ARNt rezultat păstrează energia rezultată din hidroliza ATP, reziduul de aminoacid fiind astfel activat. Echilibrul reacţiei este dirijat

6

înspre activarea aminoacidului datorită pirofosfatazei care desface legăturile fosfoanhidridice înalt energetice din pirofosfat.Întreaga reacţie se poate scrie:

AA + ATP + ARNt enzimă aminoacil-ARNt + AMP + 2Pi

Recent, s-a determinat structura ARSs din E.Coli şi din multe eucariote, observându-se că fiecare tip de enzimă are un anumit model (secvenţă de AA) caracteristic fiecărei clase. Determinarea structurii tridimensionale a celor 2 tipuri de ARSs a arătat diferenţe în ceea ce priveşte contactarea ARNt.

Fiecare moleculă de ARNt este recunoscută de o aminoacil-ARNt-sintetază specifică.Identificarea ARNt de către ARS specifică este la fel de importantă pentru translaţie ca şi împerecherea corectă codon-anticodon. Odată ARNt încărcat cu un AA, împerecherea codon-anticodon va direcţiona ARNt pe locul corect din ribosom. Dacă este ataşat un alt AA se produce o eroare în sinteza lanţului.Un experiment clasic demonstrează acest fapt. Un reziduu de cisteină deja ataşat la ARNt a fost înlocuit cu un rest de alanină astfel încât cisteinil-ARNtCys a devenit alanil-ARNtAla. Adăugat în sinteza unei lanţ polipeptidic în creştere în dreptul codonilor pentru Cys a apărut Ala. S-a demonstrat astfel că numai anticodonul ARNt este implicat în recunoaşterea ce va duce la ataşarea unui anumit AA în polipeptid.Nu se ştie încă precis modul în care ARS identifică ARNt specific. Se ştie totuşi că o ARS poate adăuga acelaşi AA la 2 (sau mai mulţi) ARNt, cu anticodoni diferiţi care codează acelaşi AA. Astfel, fiecare din aceşti ARNt diferiţi au situsuri de cuplare similare care vor fi recunoscute de sintetaze. În vederea identificării unui anumit AA de către ARNt, un rol important îl joacă structura braţului acceptor al ARNt. Inserţia unei singure perechi de baze la nivelul braţului acceptor pentru AA la ARNtPhe poate comuta identitatea acestuia de la Phe la Ala.

7

8

INIŢIEREASemnalul de iniţiere la nivelul ARNm este codonul AUG.Primul eveniment al etapei de iniţiere este ataşarea unei molecule libere de Met la ARNtMet

(specific) sub acţiunea unei aminoacil-ARNt-sintetaze specifice. Există cel puţin 2 tipuri de ARNtMet. Primul tip, desemnat sub sigla ARNti

Met, poate iniţia sinteza proteică în timp ce al doilea poate incorpora Met dar nu participă la creşterea lanţului polipeptidic. Aceeaşi enzimă, metionil-ARNt-sintetaza poate ataşa Met la ambele tipuri de ARNt dar numai complexul metionil-ARNti

Met poate cupla subunitatea ribosomală mică în vederea iniţierii sintezei proteice. (la bacterii, grupul amino al Met este formilat). Complexul Met-ARNt i

Met

(asistat de un complex proteină-GTP) împreună cu subunitatea ribosomală mică se leagă la ARNm, pe un situs specific, localizat adesea în imediata vecinătate a codonului de iniţiere AUG.La majoritatea bacteriilor, subunitatea ribosomală mică identifică situsul de iniţiere prin interacţiunea dintre anumite secvenţe din ARNr16s şi ARNm. La nivelul ARNm există aşa numita secvenţă Shine-Delgarno chiar lângă situsul de start al sintezei proteice, secvenţă care este complementară cu o secvenţă la sau imediat lângă capătul 3’ al moleculei de ARNr16s. Astfel:

mRNA 5’-UAAGGAGG-(5-10 nucleotide)-AUG HO-AUUCCUCC-(aprox.1400 nucleotide)-5’ rRNA

Semnalele start pentru sinteza proteică nu se potrivesc exact cu secvenţa din ARNr dar în general există o corespondenţă la 6 din 8 nucleotide. Astfel, ARNr bacterian joacă un rol esenţial în selectarea unui situs de start al sintezei proteice la nivelul ARNm. Astfel, ribosomii bacterieni pot iniţia sinteza proteică la nivelul acestor situsuri chiar dacă acestea sunt situate in mijlocul unor molecule de ARNm foarte lungi. La eucariote, mecanismul prin care subunitatea ribosomală mică recunoaşte situsul de iniţiere nu este precizat. Primul semnal recunoscut este capătul 5’, prezent la toate moleculele ARNm la eucariote. Totuşi, unele molecule de ARNm viral care sunt translate prin mecanismul celulă gazdă în eucariotele infectate, nu posedă capăt 5’. În acest caz, recunoaşterea are loc cu ajutorul unor factori proteici adiţionali. De obicei, după recunoaşterea capului 5’, are loc o glisare a subunităţii mici de-a lungul moleculei de ARNm în vederea localizării AUG. De obicei este utilizat primul codon AUG dar eficienţa iniţierii este accentuată considerabil de prezenţa unor anumite nucleotide în preajma AUG. Această secvenţă, esenţială pentru iniţiere, situată la capătul 5’ al ARNm se numeşte secvenţă Kozak (Marilyn Kozak).

mRNA 5’-ACCAUGG-

Ca şi suport al acestei ipoteze, menţionăm că un ARNm circular artificial care nu are capete nu va fi translat. De asemenea, ARNm fără capătul 5’ sunt slab translate iar mutaţii survenite la nivelul secvenţei Kozak duc la o scădere a iniţierii sintezei proteice. Totuşi, chiar dacă în cazul virusului poliomielitei, lipseşte capătul 5’, ribosomul găseşte situsul de iniţiere la 600 de nucleotide de acest capăt. Se pare că, la eucariote, translaţia ARNm are loc după recunoaşterea capului 5’ fie prin utilizarea primului AUG fie prin recunoaşterea unui AUG proximal datorită secvenţei Kozak specifice.

9

Factorii de iniţiere, ARNt, ARNm şi subunitatea ribozomală mică formează un complex de iniţiere.Subunitatea ribosomală mică poate găsi situsul de iniţiere datorită unui grup de proteine, denumite factori de iniţiere (IF). Fără aceste proteine nu se poate forma complexul de iniţiere (cu ARNm, ARNtMet şi subunitatea mică). S-au caracterizat 3 IF la procariote şi cel puţin 5 la eucariote.La procariote, IF3 este esenţial pentru găsirea AUG.La eucariote, complexul eIF4 asigură faptul că ARNm este monocatenar (astfel asigurând atât fixarea capului 5’ cât şi eliminarea unor structuri secundare nedorite); de asemenea, eIF4

asigură faptul că 5’ este pregătit pentru ca subunitatea mică să localizeze AUG. Numai după ce subunitatea mică găseşte şi leagă AUG, subunitatea mare poate fi adăugată.

Iniţierea lanţului polipeptidic.Ar cuprinde câteva subetape: eIF2 care aduce cuplată o moleculă de GTP se va lega de Met-ARNt i

Met. (la procariote, Met de la ARNtMet este formilată).

eIF2+ Met-ARNtiMet leagă eIF3 şi complexul eIF4 alături de ARNm şi R40, formând

complexul de iniţiere de 40S. Are loc poziţionarea corectă a Met-ARNti

Met la AUG, cu consum energetic (ATP şi GTP). Este eliberat eIF3.

Este cuplată R60, cu intervenţia eIF1 şi eIF5. Se consumă o moleculă de GTP. Se formează R80, deci ribozomul funcţional, gata de sinteză şi care va cuprinde locurile E şi P (spre capătul 5’) şi locul A (spre capătul 3’). Sunt eliberaţi factorii de iniţiere care-şi reiau funcţia.

Capetele 3’ şi 5’ ale ARNm sunt cuplate cu un complex proteic care cuprinde unii factori de iniţiere şi proteina de cuplare PAB. eIF4E şi

eIF4G sunt parte a unui complex mai mare numit eIF4F, complex care cuplează subunitatea

ribosomală mică (40S)

Elongarea lanţului polipeptidic.Presupune intervenţia unor factori de elongare (EFTu, EFTs şi EF-G la eucariote).În acest moment, Met-ARNti

Met ocupă locul P în ribosom. Inserţia. Sub influenţa unui complex EFTu-GTP, are loc poziţionarea corectă a unui

AA-ARNt în locul A al ribozomului. GTP este hidrolizat iar EFTu-GDP este regenerat sub influenţa EFTs fiind retransformat în EFTu-GTP.

10

Locul A este liber pentru al doilea AA-ARNt care va fi cuplat la lanţ

Al doilea AA-ARNt este adus de către EFTu-GTP, eliberat şi fixat pe locul A. GTP din

complex este hidrolizat iar EFTu-GDP este eliberat în citoplasmă unde va regenera EFTu-

GTP sub influenţa EFTs-GTP

Al doilea AA-ARNt este inserat în locul A

11

Transferul. Aici, lanţul peptidic de pe locul P (în acest caz, doar Met) este desprins de ARNt de pe locul P şi cuplează AA de pe locul A printr-o legătură peptidică. Locul P va fi ocupat de un ARNt deacilat iar locul A de un dipeptidil ARNt.

12

Translocarea. Prin hidroliza unei molecule de GTP, ribosomul se deplasează către capătul 3’ cu un codon. Astfel, ARNt de pe fostul loc P este eliberat în citoplasmă, locul P devine acum locul A şi va fi ocupat de acelaşi dipeptidil ARNt. Locul A este acum liber şi gata de a primi un nou AA-ARNt. Acest proces este mediat de EF-G, proteină care aduce cuplată molecula de GTP necesară translocării.

Prin acelaşi mecanism se adaugă, pas cu pas câte un nou aminoacid, conform codonilor respectivi, la lanţul polipeptidic în creştere.

13

Să urmărim un film serial cu elongarea

14

15

Terminalizarea.Are loc în momentul când citirea ARNm întâlneşte pe acesta unul din cei 3 codoni stop, UAA, UAG, UGA. Aceştia nu fixează nici un ARNt ci unul din cei 2 factori specifici, RF 1

sau RF2. Aceştia, induc hidroliza legăturii lanţului peptidic cu ultimul ARNt, cu regenerarea COOH terminal. Sinteza a luat sfârşit.

16

COSTURI ENERGETICE ALE SINTEZEIFormarea fiecărui complex AA-ARNt necesită 2 grupări fosfat (ATP → AMP). 1 moleculă GTP suplimentară este consumată la fiecare activare incorectă a unui AA.Primul pas al elongării consumă 1 GTP.Translocarea consumă 1 GTP.Echivalentul energetic este 4x30,5 kJ/mol = 122 kJ/mol de legături fosfodiesterice consumaţi per legătură peptidică în timp ce energia liberă rezultată din hidroliza legăturii peptidice este de numai -21 kJ/mol. Energia liberă netă în timpul sintezei unei legături peptidice este de -101kJ/mol.

POLIRIBOSOMIIReprezintă complexe mari de 10-100 ribozomi care se formează mai ales în celulele cu capacitate crescută de sinteză a proteinelor. Aceste complexe care pot transla simultan regiuni dintr-o singură moleculă de ARNm reprezintă un poliribozom sau polizom. Astfel, citirea ARNm este mult mai eficientă făcând posibilă sinteza simultană a unor copii multiple din polipeptidul specificat.

DE CE NE INTERESEAZĂ SINTEZA PROTEINELOR ?Sinteza proteinelor este un proces fundamental al fiziologiei celulare şi ţinta principală pentru unele antibiotice sau toxine. Datorită diferenţelor dintre mecanismele sintezei proteice la procariote şi eucariote, antibioticele toxice pentru unele bacterii sunt relativ inofensive pentru eucariote. Evoluţia naturală a permis exploatarea unor diferenţe minore pentru a afecta selectiv sistemele bacteriene. Astfel, unele arme biologice sintetizate de unele microorganisme sunt toxice pentru altele. Exemple:

Puromicina. Sintetizată de fungii Streptomyces alboniger este unul din cele mai bine studiate antibiotice. Structura sa este asemănătoare cu capătul 3’ al unui AA-ARNt, ceea ce îi permite cuplarea pe locul A şi participarea la formarea legăturii peptidice cu formarea unui peptidil-puromicin. Deoarece puromicina seamănă numai cu terminaţia 3’ a ARNt, ea nu se angajează în translocare şi se disociază de ribozom scurt timp după cuplarea cu capătul caroxi-terminal al peptidului. Acest eveniment opreşte sinteza proteică.Tetraciclinele inhibă sinteza prin blocarea locului A, prevenind cuplarea AA-ARNtCloramfenicolul inhibă sinteza proteică prin blocarea peptidil transferazei, cea care mediază formarea legăturii peptidice. Nu afectează sinteza citoplasmică la eucariote. Cicloheximida blochează peptidil-transferaza la ribozomii eucariotici dar nu şi la cei bacterieni. Streptomicina, un trizaharid, determină erori de citire a codului la concentraţii scăzute; la concentraţii crescute inhibă iniţierea.Unii inhibitori sunt toxici pentru organismul uman şi pentru eucariote în general.Toxina difterică catalizează ADP-ribozilarea unei diftamide (histidină modificată) de la nivelul factorului de elongare eEF2 pe care îl inactivează. Ricinul, o proteină extrem de toxică, inactivează subunitatea S60 a ribozomilor eucariotici prin depurinarea unei adenozine specifice din ARNr de 23S.

17

RETICULUL ENDOPLASMATIC (RE)RE este un organit celular membranar reprezentat de un sac ale cărui membrane se continuă, din loc în loc cu membrana nucleară externă. RE este abundent în celulele cu procese intense de sinteză şi secreţie. RE se prezintă în celulă sub două forme: RER, cu ribosomi ataşaţi la suprafaţă şi REN, fără ribosomi. Cele două tipuri de RE diferă şi ca funcţii şi structură chimică.

RERRER este format din saci (cisterne) şi tuburi care au un lumen comun, având la suprafaţă ataşaţi ribosomi.

În microscopia fotonică, RER se poate observa ca o formaţiune bazofilă perinucleară. În celulă poate ocupa diverse poziţii: în celulele pancreasului exocrin sau în celulele parotidei, RER ocupă o poziţie bazală. În hepatocite RER este dispus concentric în jurul nucleului formând corpii Berg. În neuroni este bine dezvoltat la nivelul corpului neuronal formând corpii Nissl. Membranele RER se continuă cu membrana nucleară externă iar lumenul RER se continuă cu spaţiul perinuclear (vezi pozele de la nucleu).

RENEste reprezentat de o reţea de canalicule (canale mai mici) care comunică cu sacii care formează RER. Nu prezintă ribozomi la suprafaţă. Se poate găsi în toate tipurile celulare, dar este mai bine dezvoltat în:

- celule care sintetizează hormoni steroizi: suprarenală, celule interstiţiale din testicul şi ovar;

- celule care sintetizează mari cantităţi de glicogen: hepatocite, miocite;- celule care sintetizează pigmenţi: melanocite.

Structura chimică a RE- 60% proteine- 40% lipide – fosfolipide şi colesterol

Enzimele cele mai frecvent întâlnite la RE sunt: NADH citocromul b5, ATPaza, şi enzima marker – glucozo-6-fosfatază.Originea RE nu este clară: este posibil să provină prin înmugurirea membranei nucleare externe.

18

Funcţiile REPutem descrie trei tipuri de funcţii:

Funcţii specifice RER- Sinteza şi sortarea proteinelor prin prezenţa ribozomilor ataşaţi. Proteinele sintetizate

pot fi proteine de export sau proteine de structură;Ilustrăm aici modul de sinteză a proteinelor la nivelul RER

19

Sortarea intracelulară a proteinelor

Sinteza polipeptidelor începe în citoplasmă. În momentul în care polipeptidul are circa 30 de aminoacizi, sinteza poate urma două căi:

IMPORT CO-TRANSLAŢIONALDacă este destinat oricărui dintre compartimentele sistemului endomembranar, polipeptidul devine asociat cu membranele RER şi este transferat prin aceste membrane în lumen (cisternele RER) în timp ce sinteza continuă. Ulterior, polipeptidul complet rămâne în RER sau este transportat prin vezicule la complexul Golgi sau către alte destinaţii. Proteinele membranare integrale sunt inserate în membranele RER pe măsură ce sunt sintetizate şi nu sunt eliberate în lumen.

IMPORT POST-TRANSLAŢIONALDacă polipeptidele sunt destinate citoplasmei sau importului nuclear, mitocondriilor, cloroplastelor sau peroxizomilor, sinteza lor continuă în citoplasmă. Atunci când polipeptidul este complet, este eliberat din ribozom şi fie rămâne în citoplasmă, fie este transportat în organitele ţintă prin transport posttranslaţional. Mecanismele de transport sunt specifice pentru fiecare organit.

20

- glicozilarea lanţului polipeptidic, prin ataşarea de grupări glucidice în timpul etapei de elongare; astfel proteinele sintetizate în RER diferă de cele sintetizate direct în citoplasmă pe ribosomi liberi;

Mecanismul de glicozilare a proteinelor în RER

- modificări ale lanţurilor laterale de aminoacizi prin formarea de punţi disulfidice;

Funcţii specifice REN- sinteza lipidelor, mai ales în celulele gonadelor, celulele mucoasei intestinale;

caracteristică este sinteza trigliceridelor care se pot evidenţia sub formă de picături de grăsime;

- funcţie de detoxifiere, prin enzime care participă la reacţii de oxidare, hidroliză, reducere sau conjugare. Produşii toxici pentru celulă devin solubili şi care se pot elimina prin rinichi;

- eliberarea glucozei din glicogen în special la nivelul hepatocitelor: enzima implicată este chiar enzima marker glucozo-6-fosfataza.

Funcţii comune RER şi REN- RE este un sistem circulator intracitoplasmatic care induce o compartimentare

funcţională a citoplasmei;- RE sintetizează fosfolipide: procesul are loc în membranele RE iar precursorii sunt

preluaţi din citoplasmă;- RE joacă rol de suport mecanic pentru citoplasmă;- RE este o fabrică de membrane pentru care sintetizează lipide şi proteine. Aceste

elemente determină creşterea şi înmugurirea membranelor RE care vor forma vezicule care conţin parte din conţinutul lumenului RE. Aceste vezicule sunt exportate prin exocitoză sau fuzionează cu membranele altor organite.

21

COMPLEXUL GOLGI (CG)CG este un organit celular membranar format dintr-un grup heterogen de compartimente delimitate de membrane – un grup de cisterne.

Structura în microscopia fotonicăÎn microscopia fotonică, CG este vizibil doar datorită unor coloraţii speciale, cum ar fi impregnaţia argentică. Este un organit polimorf, cu variate aspecte morfologice: vacuole, trabecule anastomozate etc. Poziţia CG în celulă variază în funcţie de tipul şi funcţia celulei. În celulele nervoase (neuroni) CG este dispus perinuclear. În celulele glandelor cu secreţie exocrină CG este situat între nucleu şi polul apical, aproape de zona de sinteză a produşilor de secreţie. În celulele endocrine este situat între nucleu şi polul bazal. Este o structură în permanentă transformare (dinamică) şi mişcare, situându-se în zonele din celulă unde activitatea metabolică este mai accentuată.

Structura în microscopia electronică (ultrastructura)Prezintă două componente delimitate de membrane:

- un grup de saci aplatizaţi (cisterne) care prezintă dilataţii la extremităţi. Mai multe cisterne formează un dichtiozom. Fiecare dichtiozom are două feţe:

faţă de formare, denumită cis, care este convexă şi orientată spre nucleu; faţă de maturare, denumită trans, orientată spre plasmalemă;

- microvezicule care vin dinspre RER către faţa cis cu care pot fuziona;- macrovezicule care se desprind de pe faţa trans.

22

Funcţiile CG

Funcţii în secreţia celulară- formarea de granule de secreţie: compuşii sintetizaţi în RE sunt înglobaţi în

microvezicule şi trimişi la dichtiozomi. Aici, microveziculele fuzionează cu aceştia iar conţinutul se varsă în lumenul sacilor CG. Enzimele din CG acţionează asupra acestor produşi în variate moduri;

- glicozilarea terminală a proteinelor: produşii de secreţie proveniţi din RE sunt glicozilaţi terminal în prezenţa glicozil-transferazei şi -manozidazei;

- glicozilarea gangliozidelor şi cerebrozidelor are loc în celulele din creier şi rinichi şi este asistată de glicoziltransferază;

- sulfatarea produşilor proveniţi din RE, în prezenţa sulfotransferazelor: CG are un rol important în secreţia mucopolizaharidelor;

- concentrarea produşilor de secreţie: are loc în sacii CG. Produşii de secreţie interacţionează cu unele complexe protein-polizaharidice cu sarcină electrică opusă şi îşi reduc presiunea osmotică, având ca rezultat eliminarea apei şi concentrarea;

- maturarea produşilor de secreţie: de exemplu, proinsulina este transformată în insulină

- biogeneza lizozomilor: enzimele lizozomale prezintă un marker, manoză-6-fosfat, pentru care există receptori la nivelul zonelor dilatate din coarnele CG. Aici enzimele sunt împachetate în vezicule care se desprind ca lizozomi primari.

- traficul de membrane şi reciclarea membranelor: traficul de membrane presupune transferul de vezicule de la RE la CG urmat de formarea de macrovezicule pe faţa de maturare cu exocitoza acestora. Circuitul endocitoză-sinteză-exocitoză face ca suprafaţa totală a plasmalemei să rămână constantă.

23

Metodologii de reciclare a membranelor

24