UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

Farmacist LAVINIA-MIRELA CR ĂCIUN (REDEŞ)

Studii privind m ărirea disponibilit ăţii in vitro a

lupeolului cu transportori hidrofili

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător ştiin ţific: Prof. univ. Dr. IULIANA POPOVICI

Iaşi, 2011

Teza de doctorat cuprinde:

• 204 pagini, din care:

− 48 pagini: PARTEA GENERALĂ

− 156 pagini: CONTRIBUŢII PERSONALE

care includ:

• 115 figuri;

• 49 tabele;

• 211 referinţe bibliografice;

• anexe, cu:

− lista şi 7 lucrări publicate;

− CV.

CUPRINS

Introducere

PARTEA GENERAL Ă

Capitolul I TRITERPENE PENTACICLICE CU UTILIZARE TE RAPEUTICĂ – LUPEOL

1.1. Proprietăţi fizico-chimice

1.2. Obţinere şi surse de lupeol

1.3. Stadiul aplicaţiilor practice ale acţiunii terapeutice a unor triterpene pentaciclice

Capitolul II UTILIZ ĂRILE CICLODEXTRINELOR ÎN DOMENIUL FARMACEUTIC

2.1. Structura ciclodextrinelor

2.2. Tipuri de ciclodextrine 2.3. Scurt istoric 2.4. Procedee de obţinere a complecşilor de incluziune 2.5. Metode de analiză a complecşilor de incluziune 2.6. Utilizările ciclodextrinelor în domeniul farmaceutic

CONTRIBUŢII PERSONALE

Capitolul III METODOLOGIA CERCET ĂRII

3.1. Motivaţia alegerii temei

3.2. Scopul şi obiectivele studiului 3.3. Metodologia de lucru 3.4. Metoda statistică

Capitolul IV CORELA ŢII QSAR ÎNTRE STRUCTURA TRITERPENELOR ŞI CAPACITATEA DE LEGARE DE CICLODEXTRINE

4.1. Date introductive 4.2. Rezultate şi discuţii 4.3. Concluzii

Capitolul V PREPARAREA UNOR COMPLEC ŞI DE INCLUZIUNE A LUPEOLULUI CU CICLODEXTRINE – TRANSPORTORI HIDROFILI

5.1. Studii in vitro de solubilitate a complecşilor de incluziune 5.2. Analiza morfologică a complecşilor de incluziune 5.3. Caracterizarea complecşilor de incluziune prin calorimetrie diferenţială dinamică

(cu scanare sau baleiaj)

5.4. Analiza prin spectroscopie IR (FT-IR)

5.5. Analiza microstructurală prin difracţie cu raze X Capitolul VI FORMULAREA ŞI PREPARAREA DE UNGUENTE CU LUPEOL ŞI

COMPLECŞII DE INCLUZIUNE LUPEOL-CICLODEXTRINE

6.1. Formularea unguentelor

6.2. Prepararea unguentelor

6.3. Concluzii Capitolul VII CONDI ŢIILE DE CALITATE ŞI CONTROLUL FIZICO-CHIMIC AL

UNGUENTELOR CU LUPEOL ŞI COMPLEC ŞII DE INCLUZIUNE LUPEOL-CICLODEXTRINE

7.1. Metode fizico-chimice 7.2. Analiza caracterelor reologice

7.3. Analiza calităţilor senzoriale

Capitolul VIII STUDII PRIVIND DETERMINAREA DISPONIB ILIT ĂŢII IN VITRO DIN UNGUENTE A LUPEOLULUI ŞI A COMPLEC ŞILOR DE INCLUZIUNE CU TRANSPORTORI HIDROFILI

8.1. Studiul cedării in vitro din unguente a lupeolului şi a complecşilor de incluziune 8.2. Studiul cineticii de cedare in vitro din unguente a lupeolului şi a complecşilor de

incluziune Capitolul IX TESTAREA AC ŢIUNII ANTITUMORALE A LUPEOLULUI ŞI A

COMPLECŞILOR DE INCLUZIUNE

Capitolul X EVALUAREA CITOTOXICIT ĂŢII ŞI A ACŢIUNII ANTIANGIOGENICE A LUPEOLULUI COMPARATIV CU UNELE TRITERPENE PENTACICLICE

10.1. Introducere 10.2. Materiale şi metode 10.3. Rezultate şi discuţii 10.4. Concluzii

Capitolul XI PREPARAREA DE NANOCAPSULE POLI(ETER)UR ETANICE UTILIZATE CA TRANSPORTORI TRANSDERMICI PENTRU LUPEO L

11.1. Poliuretani cu aplicaţii biomedicale 11.2. Metode de preparare

11.3 Rezultate şi discuţii Capitolul XII METODE NEINVAZIVE FOLOSITE PENTRU TES TAREA

NANOCAPSULELOR LA NIVEL CUTANAT

12.1. Generalităţi 12.2. Condiţii de experimentare pe model animal

12.3. Determinări tewametrice 12.4. Determinări pH-metrice 12.5. Determinări sebumetrice 12.6. Determinări mexametrice 12.7. Determinări corneometrice 12.8. Concluzii generale

Capitolul XIII STUDIUL AC ŢIUNII ANTIINFLAMATOARE A LUPEOLULUI CA ATARE ŞI DIN COMPLEC ŞI CU CICLODEXTRINE PE MODEL DIN URECHE DE ŞOARECE

13.2. Metoda de lucru 13.3. Rezultate şi discuţii 13.4. Concluzii

Capitolul XIV CONCLUZII GENERALE

ELEMENTE DE ORIGINALITATE

PROPUNERI ŞI RECOMAND ĂRI

BIBLIOGRAFIE

ANEXE

LISTA LUCR ĂRILOR PUBLICATE DIN TEZA DE DOCTORAT

LUCRĂRI PUBLICATE IN EXTENSO

5

LISTĂ DE ABREVIERI Acetil Co-A acetil-coenzimă A ADI diizocianat alifatic ADN acid dezoxiribonucleic AMPc adenozin monofosfat ciclic ARNm acid ribonucleic mesager BA acid betulinic BCC cancer al celulelor bazale CAM membrana corioalantoidă CD ciclodextrină CDL ciclodextrină cu lupeol CFC cloro-fluoro-carburi CI complex de incluziune COX ciclooxigenaza CSS cromatografie în strat subţire DGK Societatea ştiinţifică germană de cosmetice aplicabile DIMEB 2,6-di-O-metil-β ciclodextrina DL doza letală DMAPP dimetil alil pirofosfat DMBA 7,12-dimetilbenz-α-antracen DMF dimetilformamidă DMSO dimetilsulfoxid DSC calorimetrie de scanare diferenţială EDTA acid etilen-diamino-tetraacetic ERK Extracellular Regulation Kinase ERα estrogen receptor α FIK fosfatidil-inozitol kinaza FPP farnesil-pirofosfat FSP farnesil-pirofosfat sintetaza GDP produs intern brut GSH glutation redus HDL lipoproteine cu densitate înaltă HEBCD β-ciclodextrina hidroxietilată HIV virusul imunodeficienţei umane HPB CD hidroxipropil-β-ciclodextrina HPLC cromatografie lichidă de înaltă performanţă IFN γ interferon gama IPP izopentenil pirofosfat IR infra-roşu KP produşi de malaxare L/H lipofil / hidrofil LDL lipoproteine cu densitate scăzută (Low density lipoproteins) L-DOPA L-drihidroxifenilalanina LT leucotriene LUS lupeol sintetaza MAPK Mitogen-activated protein kinase pMDI 4,4’-difenil-metan-diizocianat MEL Mannosylerythrol lipids MITF factor transcripţional al tirozinazei

6

MO moleculă oaspete Mr masa moleculară relativă MSH Melanostimulation hormone MTT test de proliferare celulară MVA acid mevalonic NT nanotub ODC ornitin decarboxilaza OSCs oxido-squalenciclaza PAH hidrocarburi poliaromatice genotoxice PARP enzima poly-(ADP)ribos-polimerase PEU poli(eter)uretan PGE2 prostaglandina E2 PKA Protein-kinaza A PKC proteinkinaza C PM produşi de amestecare fizică pMDI 4,4’-difenil-metan-diizocianat polimeric PU poliuretan PVP polivinilpirolidonă QSAR relaţie cantitativă structură-activitate RAID Rapid Acces to Intervention Development, SUA RAMEB Random metil-β-ciclodextrina RES rezonanţă electronică de spin RMN rezonanţă magnetică nucleară ROS Reactive oxygen species RP-HPLC Reversed Phase – High Performance Liquid Chromatography SCC cancer al celulelor scuamoase SEM Scanning Electron Microscopy SM spectroscopie de masă SQE scualen epoxidaza SQS scualen sintetaza SUMEB monosuccinil DIMEB TAS metodă termofractografică TDI toluilen-diizocianat TEA analiză de evoluţie termică TEM Transmission Electron Microscopy TEWL pierderea de apă transdermică TNF Tumor Necrotic Factor TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat TRIMEB 2,3,6-tri-O-metil-β-ciclodextrina UV ultraviolet

7

Introducere

În ultimii 40 de ani a crescut mult incidenţa tumorilor cutanate, ceea ce a determinat studierea intensă a unor compuşi de sinteză şi mai ales a unor compuşi naturali, de origine vegetală, de tip triterpenic, care prezintă proprietăţi anticanceroase importante.

Se diferenţiază două tipuri de cancer al pielii. Melanomul, neoplasmul malign al melanocitelor, este recunoscut ca unul din cele

mai agresive cancere ale pielii, cu formarea relativ mare de metastaze şi care reprezintă astăzi 1% din cazurile de cancer din lume. Incidenţa melanomului continuă să crească cu o viteză de 3-8% pe an, cu toate iniţiativele luate în domeniul sănătăţii publice [80, 81].

Atât melanomul, cât şi epiteliomul, sunt legate direct de expunerea intensivă la soare, în principal între orele 10–16 ale zilei [67, 89, 108, 191].

Tumorile cutanate non-melanomice (epiteliomul) pot fi mai ales de tip cancer al celulelor bazale (engl. Basal Cells Cancer, abrev. BCC), în proporţie de 70%, cu malignitate localizată, care nu dezvoltă metastaze şi cancer al celulelor scuamoase (engl. Squamous Cells Cancer, abrev. SCC), care se dezvoltă rapid şi poate conduce la metastaze [84].

Pentru melanom, o boală întâlnită la est-europeni, este foarte important timpul intervenţiei şi tipul tumorii; aceea în profunzime conduce la o durată de supravieţuire mai mare decât tumora subţire, mai uşor de răspândit pe suprafaţa mai întinsă a pielii [62, 104].

Motiva ţia cercetării

În cadrul afecţiunilor pielii, cancerul cutanat, alături de alte tipuri de cancer, ocupă ca importanţă unul din primele locuri, fiind considerat o problemă de sănătate publică, prin patologia sa, care impune o abordare medicală multidisciplinară cât şi prin consecinţele negative asupra sănătăţii pacientului [50].

Astfel, tema de studiu a tezei de doctorat se înscrie în direcţiile prioritare de cercetare trasate de Uniunea Europeană, care include tratamentul cancerului printre bolile cu incidenţă majoră [62].

Ştiinţa europeană şi naţională pune accentul pe prevenţie, surse naturale de tratament şi terapii în boli cu incidenţă majoră: cancer, melanom, SIDA etc. Cercetarea tinde să participe la soluţionarea primelor două dintre patologiile amintite, iar studiul lupeolului şi acidului betulinic se află într-o serie variată de testări preclinice, astfel încât prin cercetarea întreprinsă în teza de doctorat se vor completa ariile de lucru care se derulează în Europa şi în lume. Îmbogăţirea ariei de formulări topice ca şi terapii adjuvante în diverse patologii importante de tipul cancerului cutanat sau nevilor este de asemenea un aspect prioritar pentru cercetările moderne. Asocierea unei terapii antiinflamatoare poate ajuta în terapia antitumorală la nivel cutanat.

Pe plan european şi internaţional, în stadiul actual lupeolul, acidul betulinic şi celelalte triterpene pentaciclice sunt evaluate doar la nivel experimental, aplicaţiile terapeutice în forme finite fiind prea puţin exploatate şi propuse [33–35, 43]. Aşadar, este necesară valorificarea eficacităţii terapeutice a unor forme farmaceutice cu aceşti compuşi. Literatura citează încercări în acest sens şi mai puţin soluţii terapeutice concrete. Lupeolul se remarcă tot mai mult prin activitatea sa antitumorală şi antiinflamatoare. Acestor idei li se mai adaugă şi faptul că inclusiv testările experimentale în melanomul malign, dar şi carcinoame, ale acidului betulinic şi lupeolului necesită reevaluare [85, 88].

Dar lupeolul este o triterpenă, substanţă practic insolubilă în apă şi care cedează lent şi nu total din formele farmaceutice. Din aceste considerente, este necesară creşterea solubilităţii şi a vitezei de dizolvare a lupeolului, care vor conduce la mărirea biodisponibilităţii substanţei.

8

Unul din cele mai moderne procedee de creştere a solubilităţii îl constituie includerea substanţei greu solubile în moleculele diferitelor ciclodextrine, procedeu selectat în cercetările efectuate în teza de doctorat. Dimensiunea moleculară a lupeolului indică faptul că molecula sa poate fi inclusă în cavitatea beta- şi gama-ciclodextrinelor, cu formare de complecşi de incluziune stabili.

Obiectivele cercetării

Obiectivul principal al tezei de doctorat l-a constituit prepararea şi studierea unor noi forme farmaceutice moderne topice cu lupeol pentru uz uman şi animal, destinate tratamentului melanomului pielii.

Cercetările efectuate au avut ca scop următoarele obiective: 1 – mărirea disponibilităţii lupeolului cu transportori hidrofili, prin prepararea şi

caracterizarea unor complecşi de incluziune cu beta- şi gama-ciclodextrine; 2 – evaluarea toxicităţii şi acţiunii antitumorale a acestor complecşi pe animale de

laborator; 3 – dezvoltarea a două forme farmaceutice moderne topice, cu aplicare pe piele, cu

aceşti complecşi de incluziune: unguente tip L/H şi suspensii de nanocapsule; 4 – utilizarea de metode de testare neinvazive a suspensiei de nanocapsule la nivel

cutanat; 5 – teste privind reducerea leziunilor şi iritabilitatea la nivelul epidermului

murinelor. 6 – studiul acţiunii antiinflamatoare a lupeolului ca atare şi din complecşii cu

ciclodextrinele pe model de ureche de şoarece. Studiul întreprins în teza de doctorat va avea un înalt grad de multidisciplinaritate,

cuplând discipline de tipul: farmacognozie, tehnologie farmaceutică, chimie farmaceutică, histologie, toxicologie, farmacologie, imunologie şi fiziologie, spectroscopie moleculară. Toate aceste domenii au un rol esenţial pentru finalizarea unui deziderat: formulări farmaceutice topice moderne cu lupeol pentru terapia carcinomului cutanat, a melanomului şi a inflamaţiei.

PARTEA GENERAL Ă Această parte de generalităţi este structurată în două capitole. Primul capitol sistematizează datele din literatura farmaceutică privind triterpenele

pentaciclice şi utilizările sale în terapeutică, cu o prezentare detaliată a lupeolului, compus cu structură lupanică (fig. 1), cu spectru larg de proprietăţi care incud în principal: acţiunea antioxidantă puternică, antitumorală, antimutagenică, antiinflamatoare şi antiaterogenă, atât in vitro cât şi in vivo [121, 131, 138, 139, 144, 145, 153, 158, 174, 183–190].

Fig. 1. Structura chimică a lupeolului

9

Capitolul II include o prezentare succintă a ciclodextrinelor utilizate în domeniul farmaceutic: tipuri de ciclodextrine şi caracteristicile acestora, formarea complecşilor de incluziune şi procedee de obţinere şi analiză, utilizările ciclodextrinelor (tabelul VII) [51, 106, 107, 112, 132, 167-169, 171, 172].

Tabelul VII. Utilizările ciclodextrinelor în domeniul farmaceutic

UTILIZARILE CICLODEXTRINELOR

EXEMPLE

1. Controlul solubilităţii a. HPBCD a crescut solubilitatea următoarelor substanţe: - itraconazol (Sporanox), complexarea previne precipitarea în stomac, rezultă forme orale de administrare; - tolnaftat, solubilitatea a crescut de peste 30 ori; - miconazol; - furosemid.

b. Triacetil-β-CD a redus solubilitatea acidului flufenamic, cu realizarea unui preparat retard, fără efecte adverse.

2. Optimizarea biodisponibilităţii

a. Dacă complexul de incluziune cu ciclodextrina este caracterizat printr-o constantă de stabilitate ridicată sau ciclodextrina este luată în exces foarte mare se va obţine un efect retard;

b. Dacă viteza procesului global de absorbţie este dată de procesul de dizolvare, formarea complexului va duce la creşterea absorbţiei şi implicit la creşterea biodisponibilităţii.

3. Stabilizarea substanţelor medicamentoase

a. stabilizarea penicilinei G în soluţie apoasă cu HPBCD; viteza degradării este de 9 ori mai mică decât pentru compusul liber;

b. stabilizarea eritropoetinei cu HPBCD; activitatea s-a păstrat timp de 10 zile în proporţie de 100 % în comparaţie cu doar 50 % în absenţa ciclodextrinei;

c. protejarea nifedipinei şi a derivaţilor săi faţă de fotodegradare;

d. reducerea instabilităţii prostaglandinelor cu ajutorul beta- ciclodextrinei.

4. Mascarea efectelor adverse ale moleculei-oaspete

a. intensitatea iritaţiei provocate de pilocarpină a scăzut în urma complexării cu beta-ciclodextrină; eliberarea oculară a substanţei a fost semnificativ îmbunătăţită;

b. Impiedicarea fenomenului de liză celulară produsă de diclofenac, prin complexarea cu ciclodextrină; este necesară o cantitate de patru ori mai mare de complex pentru a provoca aceeaşi proporţie de celule lizate ca şi diclofenacul liber;

c. Evitarea iritaţiei gastrice produse de indometacin sau meloxicam prin complexare cu β- ciclodextrină.

5. Reducerea volatilităţii MO

Prin complexarea mentolului cu beta-CD se formează un compus inodor, mentolul încorporat fiind protejat faţă de volatilizare

6. Conversia substanţelor medicamentoase lichide în forme cristaline

Obţinerea complecşilor nitraţilor organici folosiţi în tratamentul anginei pectorale cu beta-ciclodextrină

7. Dirijarea reacţiilor chimice

Hidroliza alcalină a esterilor acizilor aminobenzoici şi a acidului acetilsalicilic: dacă funcţiunea ester se găseşte la

10

interiorul cavităţii, viteza reacţiei de hidroliză este mai mică; dacă incluziunea este incompletă, viteza reacţiei creşte, grupările -OH secundare ale ciclodextrinei exercitând un efect catalitic.

8. Controlul fluorescenţei Unii compuşi prezintă o creştere sau descreştere a intensităţii fluorescenţei după includerea lor într-un complex cu ciclodextrină; acest proces prezintă avantaj în domeniul chimiei analitice.

9. Utilizarea ciclodextrinelor ca selectori chirali

a. Electroforeza capilară (EC) a fost folosită pentru separarea racemicelor a două simpatomimetice: adrenalina şi noradrenalina, separarea completă fiind realizată în mai puţin de şase minute;

b. EC a fost utilizată pentru testarea eficienţei sintezei chirale a unor derivaţi de dihidropiridină blocanţi de calciu;

c. S-a realizat separarea cromatografică a unor aminoacizi, folosind beta-ciclodextrina ca selector chiral;

d. ciclodextrinele au fost folosite ca selectori chirali în spectroscopia RMN pentru separarea enantiomerilor norgestrelului.

10. Utilizarea ciclodextrinelor ca molecule „carrier”

a. derivaţii ciclodextrinelor, cum sunt: HPBCD, 6-O-maltozil-beta-CD şi sulfobutil-beta-CD pot fi utilizaţi ca molecule carrier în administrarea parenterală;

b. ciclodextrinele peracilate pot fi utilizate ca transportori hidrofobi care controlează eliberarea unor substanţe hidrofile (peptide, proteine);

c. ciclodextrinele amfifile sau ionizabile pot adera la suprafaţa membranelor celulare, crescând absorbţia substanţelor medicamentoase.

CONTRIBUŢII PERSONALE Cercetările personale au fost structurate în 12 capitole. Capitolul III . Metodologia cercetării , include date referitoare la scopul şi

obiectivele generale, concrete şi potenţiale, ale studiilor efectuate în cadrul tezei de doctorat, metodologia de lucru şi statistica aplicată pentru efectuarea cercetărilor.

Capitolul IV. Corelaţii QSAR între structura triterpenelor pentaciclice

şi capacitatea de legare de ciclodextrine. Modelarea structurii unor molecule bioactive precum acid betulinic, betulină, lupeol

şi a unor compuşi înrudiţi structural: loganină, morroniside, acid oleanolic, acid ursolic s-a realizat prin utilizarea de descriptori moleculari van der Waals cu ajutorul cărora se stabilesc relaţii cantitative liniare între activitatea biologică (benefică sau nocivă) a unor compuşi organici pe organisme vii şi structura lor moleculară. Aceşti descriptori moleculari au fost calculaţi printr-un algoritm Monte Carlo implementat în programul de computer IRS.

11

Pentru a obţine o serie de descriptori van der Waals, au fost calculate structurile moleculare 3D cu ajutorul programului de mecanică moleculară MM+ şi celui de mecanică cuantică AM1 din pachetul de programe HyperChem.

În fig. 5 sunt prezentate structurile moleculare 3D optimizate pentru o serie de compuşi bioactivi de tip triterpenic:

betulină acid betulinic

lupeol

Fig. 5. Structurile moleculare 3D optimizate ale unor compuşi triterpenic. Comparaţie între substanţele etalon betulină, acid betulinic şi lupeol

În tabelul IX este redată afinitatea de legare cu γ-ciclodextrine a unor triterpene.

Tabelul IX. Afinitatea de legare cu γ-CD a unor triterpene

Steric Acc/Metal Donor Aromatic Total Score Molecule –52.14 –50.91 –48.21 –47.48 –45.43

–0.72 –0.36 –0.15 –0.28 –0.13

–0.14 0.00

–0.18 –0.34 0.00

0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

–53.00 –51.27 –48.54 –48.10 –45.55

betulinic acid ursolic acid lupeol betulin oleanolic acid

Moleculele au fost aranjate în ordinea descrescătoare a scorului total care este o

măsură a afinităţii de legare. Conform rezultatelor cu funcţia scor chemgauss2 cea mai mare afinitate faţă de γ-CD o au triterpenele pentaciclice.

Capitolul V. Prepararea unor complecşi de incluziune a lupeolului

cu ciclodextrine – transportori hidrofili Incluziunea în ciclodextrine este o tehnică modernă de creştere a biodisponibilităţii

agentului activ. Se urmăreşte obţinerea unor formulări semisolide, care conţin ca agent activ complecşi de incluziune cu ciclodextrine, respectiv compuşi ternari, principalele metode de

obţinere a acestora fiind malaxarea (detaliată compuşii obţinuţi prin metoda selectat raportul molar de 1:2ciclodextrinelor.

Tabelul X. Formulă

Cod probă LUP LupeolCOM1 Complex de incluziune MBCD cu lupeolCOM1a Complex de incluziune MBCD cu lupeolCOM2 Complex de incluziune HPGCD cu lupeolCOM2a Complex de incluziune HPGCD cu lupeolCOM3 Amestec ternar

5.1. Studii in vitro

S-a utilizat aparatul USP cu paletCurbele de solubilitate a lupeolului, comparativ cu cele ale complecredate în figurile 9–11.

Fig. 9. Curbe de solubilitate comparativ

Fig. 10. Curbele de solubilitate comparativ

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 10 20 30

Ab

sorb

an

ţa (

21

0 n

m)

-0,1

6E-16

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 10 20

Ab

sorb

an

ţa (

21

0 n

m)

12

malaxarea (kneading) şi amestecarea fizică. S-i prin metoda de malaxare, iar în cazul produ

de 1:2, raport calculat pe baza maselor moleculare ale lupeolului

Formulările cu lupeol, complecşi de incluziune şi amestecul ternar

Agent activ Raport molarLupeol Complex de incluziune MBCD cu lupeol Complex de incluziune MBCD cu lupeol Complex de incluziune HPGCD cu lupeol Complex de incluziune HPGCD cu lupeol Amestec ternar HPGCD cu lupeol şi PVP

in vitro de solubilitate a complecşilor de incluziune

a utilizat aparatul USP cu paletă (DT 706 HH, Erweka, Hausenstamm, GermanyCurbele de solubilitate a lupeolului, comparativ cu cele ale complecşilor de incl

Curbe de solubilitate comparativă lupeol vs. COM

Curbele de solubilitate comparativă lupeol vs. COM2

40 50 60 70 80 90 100 110 120

timp, min

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

timp, min

-au ales pentru analiza de malaxare, iar în cazul produşilor binari, a fost

alculat pe baza maselor moleculare ale lupeolului şi

i amestecul ternar

Raport molar -

1:2 1:1 1:2 1:1

1:1:1

ilor de incluziune

H, Erweka, Hausenstamm, Germany). şilor de incluziune, sunt

lupeol vs. COM1

lupeol vs. COM2

120 130

LUP

COM1a

COM1

120 130

LUP

COM2a

COM2

Fig. 11. Curbele de solubilitate comparativ

Urmărind curbele de solubilitate din figurile anterioare, se pot eviden

caracteristici: − în toate cazurile, forma

lupeol creşte gradul de solubilitate;− cea mai bună solubilitate o au formul

(HPGCD) şi 6-COM2;

− cele mai mic grad de solubilitate a fost înregistrat în cazul lupeolului, notat cu codul LUP, utilizatcomparativă;

− urmărind influenmai bune în cazul complec

5.2. Analiza morfologic

Complecşii de incluziune obscanare [61, 68, 73, 86, 124, 142],(JEOL Ltd., Japan) care utilizeazde 6 kV. Imaginile au fost m

În urma evaluării morfologiei complecciclodextrine, s-a evidenţiat o modificare semnificativde incluziune a substanţei medicamentoase în cavitatea ciclodextrinelor a avut loc.

5.3. Caracterizarea complec

Am supus analizei atât substanpreparaţi. Cu ajutorul calorimetriei diferenidentificarea complecşilor, al complecşilor.

Diagrama DSC a probei cu lupeol prezinttemperaturii de 150°C, care corespunde punctului de topire al substanpic în jurul valorii de 212°C, care corespunde descompunerii termice a lupeolului. Pentru

-0,1

6E-16

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 10 20

Ab

sorb

an

ţa (

21

0 n

m)

13

Curbele de solubilitate comparativă lupeol vs. COM3

rind curbele de solubilitate din figurile anterioare, se pot eviden

în toate cazurile, formarea complecşilor de incluziune de tip ciclodextrine cu te gradul de solubilitate; ă solubilitate o au formulările binare cu hidroxipropil

-O-maltozil-β-ciclodextrină (MBCD), notate cu codurile COM1

cele mai mic grad de solubilitate a fost înregistrat în cazul lupeolului, notat cu codul LUP, utilizată în figurile 9–11, ca etalon pentru curbele de solubilitate

rind influenţa raportului molar ciclodextrină : lupeol, smai bune în cazul complecşilor de incluziune cu raport molar de 1:2

5.2. Analiza morfologică a complecşilor de incluziune

ii de incluziune obţinuţi au fost analizaţi prin spectroscopie electronicscanare [61, 68, 73, 86, 124, 142], utilizându-se un microscop electronic model (JEOL Ltd., Japan) care utilizează ca tehnică de scanare JEM-ASID la un voltaj de accelerare

mărite între 200-10.000 de ori. ării morfologiei complecşilor de incluziune ai lupeolului cu ţiat o modificare semnificativă care duce la concluzia cţei medicamentoase în cavitatea ciclodextrinelor a avut loc.

5.3. Caracterizarea complecşilor de incluziune prin calorimetrie diferen(cu scanare sau baleiaj)

Am supus analizei atât substanţele ca atare, cât şi complecşi. Cu ajutorul calorimetriei diferenţiale cu baleiaj, am reu

puritatea probelor, precum şi conţinutul în componentul principal

Diagrama DSC a probei cu lupeol prezintă două picuri endotermice: unul în jurul temperaturii de 150°C, care corespunde punctului de topire al substanţpic în jurul valorii de 212°C, care corespunde descompunerii termice a lupeolului. Pentru

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

timp, min

lupeol vs. COM3

rind curbele de solubilitate din figurile anterioare, se pot evidenţia următoarele

ilor de incluziune de tip ciclodextrine cu

hidroxipropil-γ-ciclodextrina , notate cu codurile COM1 şi

cele mai mic grad de solubilitate a fost înregistrat în cazul lupeolului, notat cu 11, ca etalon pentru curbele de solubilitate

: lupeol, s-au constatat rezultate ilor de incluziune cu raport molar de 1:2 [30].

ilor de incluziune

spectroscopie electronică de se un microscop electronic model JEM 100B

ASID la un voltaj de accelerare

incluziune ai lupeolului cu care duce la concluzia că fenomenul

ei medicamentoase în cavitatea ciclodextrinelor a avut loc.

n calorimetrie diferenţială dinamică

i complecşii lor de incluziune iale cu baleiaj, am reuşit să determinăm

inutul în componentul principal

picuri endotermice: unul în jurul temperaturii de 150°C, care corespunde punctului de topire al substanţei, respectiv al doilea pic în jurul valorii de 212°C, care corespunde descompunerii termice a lupeolului. Pentru

120 130

LUP

COM3

14

complecşii de incluziune ai ciclodextrinelor cu lupeol se observă faptul că temperatura la care picul corespunzător punctului de topire este puţin mai mare, probabil din cauza unei complexări parţiale a substanţei active în cavitatea ciclodextrinei. Valoarea temperaturii celui de-al doilea pic rămâne neschimbată, ceea ce conduce la ideea că procesul de descompunere a lupeolului nu poate fi stopat de prezenţa CD sau a polivinilpirolidonei, chiar şi în cazul unei complexări parţiale a substanţei active.

Prin analiza termică s-a stabilit domeniul de temperatură în care are loc

descompunerea complecşilor cu lupeol. Din curbele DTG se pot distinge două procese globale:

a) în prima parte are loc pierderea apei de cristalizare până la aproximativ 130°C; b) în partea a doua, în intervalul de temperatură 140-180°C, are loc arderea

(descompunerea) matricei complexului de incluziune cu eliminarea produşilor gazoşi CO şi CO2 cu efect puternic exoterm, ce poate fi înregistrat sau vizualizat uşor doar pe curbe DTA.

Picurile de pe cele 3 curbe, de la 214-215°C, sunt caracteristice tenperaturii de topire a lupeolului. Se observă în cazul acestora o uşoară deplasare spre dreapta a punctului de topire a lupeolului, ceea ce indică o stabilizare a acestuia în interiorul complecşilor de incluziune sintetizaţi.

5.4. Analiza prin spectroscopie IR (FT-IR)

Compuşii de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrinele (conform tabelului X) au fost încapsulaţi în KBr de puritate corespunzătoare. Peletele de KBr au fost preparate prin amestecarea a 3 mg probă cu 500 mg KBr.

Pe spectrul FTIR al probelor analizate se pot observa cu uşurinţă frecvenţele specifice câtorva grupări funcţionale, din care amintim: 2960-2850 cm–1 (puternică, caracteristică întinderii CH saturat), 1470-1350 cm–1 (o dovadă în plus, caracteristică forfecării, îndoirii CH saturat), 1260-1000 cm–1 (puternică, caracteristică alcoolilor şi eterilor) şi 870-675 (puternică, caracteristică CH din inelele aromatice substituite).

Există foarte puţine deosebiri între spectrele celor patru probe studiate, de cea mai mare importanţă fiind picul de la 480 cm–1 care lipseşte doar în proba COM2. Domeniul 500-10 cm–1, infraroşu îndepărtat, domeniu adiacent cu regiunea microundelor, de joasă energie ce poate fi utilizat pentru spectroscopie rotaţională. În acest domeniu de frecvenţă, se determină cu uşurinţă molecule biatomice (O2, CO, H2) sau triatomice (HCN sau HNC). Astfel picul care apare la 480 cm–1 este caracteristic unei impurităţi din probă.

O altă diferenţiere între cele patru probe este estomparea picului de la 930 cm–1 în cazul probelor COM2 şi respectiv COM3, ceea ce indică blocarea grupării hidroxil a lupeolului în timpul formării complecşilor de incluziune cu ciclodextrine.

Frecvenţele de 2960, 2870 cm–1 sunt caracteristice grupelor metil saturate, iar 2920 şi 2850 cm–1 pentru grupele metilen saturate (toate cele patru semnale fiind puternice).

La 1500 cm–1 apare un pic mediu caracteristic dublei legături C=C din inele aromatice, iar între 1140-1120 cm–1 se întâlnesc vibraţii ale grupării metilen. La 820 cm–1 este picul corespunzător dublei legături C=C.

Aceeaşi diferenţă ca la spectrul FTIR, proba COM2 nu are picul de la 480 cm–1.

5.5. Analiza microstructurală prin difrac ţie cu raze X

Difractometria cu raze X este o metodă utilă în detectarea complexării ciclo-dextrinelor în pulbere sau în stări microcristaline.

15

Spectrele de difracţie cu raze X pentru cele patru probe au fost înregistrate cu un difractometru de raze X DRONUM-1 (Rusia), sistem cu radiaţie CuKα1 (λ = 1.54178 Å) pe intervalul 2-44° / 2θ. Condiţiile de măsurare au fost, după cum urmează:

− ţintă, Cu, filtru, Ni; − tensiune, 35 kV; − curent, 20 mA; − constantă de timp, 1S; − unghi angular 2° < 2θ < 44°.

Fig. 25. Spectrul de raze X pentru probele studiate

Analiza de difracţie cu raze X confirmă rezultatele anterioare. După cum se poate

vedea în Fig. 25, lupeolul prezintă câteva picuri, caracteristice pentru compuşii cristalini, întrucât ele sunt practic absente în complecşii de incluziune ciclodextrină cu lupeol analizaţi în acest studiu. Faptul că nu are loc dispariţia tuturor vârfurilor cristaline duce la concluzia că un fenomen de tip amorfizare nu are loc, pentru că altfel se poate presupune că aceşti complecşi de incluziune dintre substanţe triterpenice (lupeolul) şi ciclodextrine ar avea un spectru mult diferit faţă de spectrul de bază al lupeolului (proba LUP).

Capitolul VI. Formularea şi prepararea de unguente cu lupeol şi complecşii de incluziune lupeol-ciclodextrine

În cercetarea întreprinsă în teza de doctorat având în vedere proprietăţile terapeutice

potenţiale ale lupeolului şi complecşilor săi de incluziune, am selectat o bază de unguent pe bază de polietilenglicol (PEG) pentru a prepara 4 (patru) variante de unguente.

În scopul realizării unor formule topice cu aplicare epicutanată, am selectat o bază de unguent tip emulsie L/H, cu polietilenglicol 4000, transcutolR, labrasol®, 2-propanol, izopropil miristat, în care s-a inclus 5% lupeol, respectiv complecşii de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrinele (tabelul XI).

16

Prepararea unguentelor s-a efectuat în condiţii de laborator. Toate formulările au fost caracterizate conform prevederilor FR X şi suplimente, cât şi Ph. Eur. 7th 2010 [210, 211]. S-au urmărit: aspectul, omogenitatea, pH-ul, comportarea reologică, capacitatea de adeziune şi cedarea in vitro a lupeolului, comparativ cu complecşii de incluziune.

Tabelul XI. Compoziţia bazei de unguent emulsie L/H

Substanţa Cantitate (g) Agent activ 5,00 2-propanol 37,30 TranscutolR 9,30 Miristat de izopropil 9,30 Labrasol® 0,30 PEG 4000 38,80

Total 100,00 S-au formulat 4 (patru) variante de unguente tip emulsie L/H (conform tabelului

XII), care conţin 5% lupeol, respectiv complexul de incluziune al lupeolului cu ciclodextrinele, în cantitate echivalentă cu lupeolul.

Tabelul XII. Formulări de unguente cu lupeol şi complecşii de incluziune cu ciclodextrine

Ingrediente (g) Formula

I (LUP)

II (COM1)

III (COM2)

IV (COM3)

Lupeol 5 – – – COM1 (conf. tabelul X) – echiv. 5 – – COM2 (conf. tabelul X) – – echiv. 5 – COM3 (conf. tabelul X) – – – echiv. 5 2-propanol 37,30 37,30 37,30 37,30 TranscutolR 9,30 9,30 9,30 9,30 Miristat de izopropil 9,30 9,30 9,30 9,30 Labrasol® 0,30 0,30 0,30 0,30 PEG 4000 38,80 38,80 38,80 38,80

Total 100 100 100 100 Prepararea unguentelor impune condiţii specifice pentru a realiza unguente omogene. S-au realizat unguente-emulsii tip L/H, în care faza lipofilă: lupeol, miristat de

izopropil, au fost emulsionate cu transcutolR şi labrasol® în PEG 4000.

Capitolul VII. Condi ţiile de calitate şi controlul fizico-chimic al unguentelor cu lupeol şi complecşii de incluziune lupeol-ciclodextrine

Aprecierea calităţii unguentelor a avut în vedere condiţiile pe care trebuie să le

îndeplinească aceste preparate topice, semisolide, care sunt oficializate de FR X şi suplimente şi de Ph. Eur. 7th, în monografia de generalităţi: Preparate semisolide pentru aplicaţii cutanate.

Am efectuat un control macroscopic, fizico-chimic şi farmacotehnic. Controlul fizico-chimic se referă la studiile de aspect, omogenitate, culoare, gust,

miros, comportare reologică, viscozitate şi o serie de teste specifice pentru produsele topice aplicate pe piele, ca: evaluarea senzorială, capacitatea hidratantă, pH-ul unguentelor.

17

Unguentele sunt omogene, de culoare albă, fără gust şi fără miros. Formularea I, cu lupeol, nu se dizolvă total în apă la temperatura camerei, iar formulele II–IV, care conţin complecşii de incluziune, au un grad de lavabilitate corespunzător, respectiv se spală uşor fără săpun.

pH-ul unguentelor se încadrează în valorile cuprinse între 6,3–6,9, un pH uşor acid, adecvat pH-ului pielii (tabelul XIII).

Tabelul XIII. Caracteristicile unguentelor formulate (conform Tabelul XII)

Formula Aspect Culoare Gust, miros Solubilitate pH

I omogen albă fără nu se dizolvă total în apă la t°C camerei

6,3

II omogen albă fără se dizolvă în apă la t°C camerei

6,9

III omogen albă fără se dizolvă în apă la t°C camerei

6,8

IV omogen albă fără se dizolvă în apă la t°C camerei

6,8

Formula de unguent cu lupeol a prezentat o consistenţă intermediară (grad maxim de penetrare de 36 ± 4,02 mm), iar formulele de unguent cu complecşi de incluziune au prezentat consistenţa cea mai crescută (25 ± 2,8 mm).

Formula de unguent cu lupeol a prezentat o capacitate de întindere intermediară (7010 ± 596 mm2), iar formulele cu complecşi de incluziune au prezentat cea mai redusă capacitate de întindere, deci consistenţa cea mai crescută.

Capacitatea de întindere şi aspectele reologice au fost în toate cele patru cazuri corespunzătoare pentru o formulă topică, aplicată pe piele.

Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu prevederile FR X şi Ph. Eur. 7th [210, 211]; unguentele îndeplinesc condiţiile de calitate impuse de aceste normative, sunt fiziologice, au valori de pH apropiate de pH-ul pielii (4,2–6,5).

7.2. Analiza caracterelor reologice

Comportarea reologică a gelurilor permite caracterizarea fizico-mecanică a acestora. Figurile 26–33 redau curbele de curgere şi viscozitate pentru cele patru unguente

studiate. Comportarea reologică a unguentelor formulate permite caracterizarea fizico-mecanică a acestora.

Din analiza comparativă a reogramelor, respectiv a curbelor de viscozitate ale unguentului cu lupeol şi a unguentelor cu complecşii de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrine (formulele II, III şi IV), se constată următoarele:

− toate formulele de unguente, inclusiv baza de unguent, imediat după preparare prezintă un comportament reologic dilatant, iar după un timp de depozitare se formează o reţea continuă cu structură de gel, specifică polietilenglicolului, care conferă sistemului o comportare reologică plastică;

− toate formulările prezintă prag de curgere; − viteza de curgere creşte cu creşterea forţei de forfecare; − toate unguentele prezintă o buclă de histereză care are valori foarte apropiate la

toate formulările; − viscozitatea unguentelor scade progresiv cu creşterea vitezei de forfecare; − viscozitatea formulei I (unguentul cu lupeol) a fost cu foarte puţin mai redusă

decât aceea a formulărilor II, III, IV în care s-au introdus cei trei complecşi de incluziune lupeol-ciclodextrine;

− în toate formulările se observă că valorile viscozităţii sunt mai mari decât în cazul bazei de unguent.

Fig. 26. Curba de curgere a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent

Fig. 27. Curba de curgere a formulei II comparativ cu baza de unguent

Fig. 28. Curba de curgere a formulei III comparativ cu baza de unguent

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 20

ten

siu

ne

de

fo

rfe

care

, P

a

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 20

ten

siu

ne

de

fo

rfe

care

, P

a

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 20

ten

siu

ne

de

fo

rfe

care

, P

a

18

Curba de curgere a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent

Curba de curgere a formulei II comparativ cu baza de unguent

Curba de curgere a formulei III comparativ cu baza de unguent

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

Curba de curgere a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent

Curba de curgere a formulei II comparativ cu baza de unguent

Curba de curgere a formulei III comparativ cu baza de unguent

120

LUP

baza

120

COM1

baza

120

COM2

baza

Fig. 29. Curba de curgere a formulei IV comparativ cu baza de unguent

Fig. 30. Curba de viscozitate a formulei I

Fig. 31. Curba de viscozitate a fo

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 20

ten

siu

ne

de

fo

rfe

care

, P

a

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20

vâ

sco

zita

te,

Pa

s

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20

vâ

sco

zita

te,

Pa

s

19

Curba de curgere a formulei IV comparativ cu baza de unguent

Curba de viscozitate a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent

Curba de viscozitate a formulei II comparativ cu baza de unguent

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

Curba de curgere a formulei IV comparativ cu baza de unguent

comparativ cu baza de unguent

rmulei II comparativ cu baza de unguent

120

COM3

baza

120

LUP

baza

120

COM1

baza

Fig. 32. Curba de viscozitate a formulei

Fig. 33. Curba de viscozitate a formulei IV comparativ cu baza de unguent

Analiza reologică indiccare se aplică pe piele cât transport.

Capitolul VIII . Studii privind determinarea disponibilit

lupeolului şi a complec

În teza de doctorat pentru studierea disponibilitformulările propuse, am ales o metod

Cercetările privind cedarea substanmembrane de dializă:

− metoda in vitro− metoda ex vivo

U.V.; − metoda ex vivo

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20

vâ

sco

zita

te,

Pa

s

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20

vâ

sco

zita

te,

Pa

s

20

Curba de viscozitate a formulei III comparativ cu baza de unguent

Curba de viscozitate a formulei IV comparativ cu baza de unguent

ă indică o comportare la curgere de tip plastic, adecvat pe piele cât şi comportării în timpul procesului de fabrica

. Studii privind determinarea disponibilit ăţii in vitroşi a complecşilor de incluziune cu transportori hidrofili

În teza de doctorat pentru studierea disponibilităţii in vitrorile propuse, am ales o metodă de cedare care utilizează celula Franz.

rile privind cedarea substanţei au fost efectuate concomi

– pe membrană filtrantă artificială poroasă (POROFIL);ex vivo – pe membrană naturală, piele de şobolan neexpus

– pe membrană naturală, piele de şobolan expus

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

40 60 80 100

viteza de forfecare, 1/s

III comparativ cu baza de unguent

Curba de viscozitate a formulei IV comparativ cu baza de unguent

plastic, adecvată formulărilor rii în timpul procesului de fabricaţie, depozitare şi

in vitro din unguente a luziune cu transportori hidrofili

in vitro a lupeolului din celula Franz.

ei au fost efectuate concomitent pe trei tipuri de

ă (POROFIL); obolan neexpusă la radiaţii

obolan expusă la radiaţii U.V.

120

COM2

baza

120

COM3

baza

Pentru studiile de penetrabilitate vertical celulă de difuzie Franz (Hanson Microette TM Topical System, Hanson Research Corporation,

Din fiecare formulare farmaceuticXII) câte 0,5 grame de prob(in vitro), respectiv pe piele de (expUV), respectiv piele neexpus

Măsurătorile cantitative de agent activ au fost realizate cu un spectrofotometru UVVIS tip Hewlett Packard 8453DAD).

Pentru determinarea lungimii de undîn UV pentru lupeol (fig. 35

Fig.

Curba de calibrare (etalonare) a lupeolului este redat

Fig. 36. Curba de calibrare a lupeolului în tampon fosfat cu pH=6,8

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0

Ab

sorb

anta

21

8.1.2.Material şi metodă

Pentru studiile de penetrabilitate şi de difuzie prin membrană a fost utilizat un sistem de difuzie Franz (Hanson Microette TM Topical & Transdermal

System, Hanson Research Corporation, S.U.A.). Din fiecare formulare farmaceutică semisolidă obţinută (notat

II) câte 0,5 grame de probă ca fază donoare au fost plasate pe o membranv pe piele de şobolan (rasa Spraque dawley) expus

(expUV), respectiv piele neexpusă la radiaţie UVB (nexUV) (ex vivo). torile cantitative de agent activ au fost realizate cu un spectrofotometru UV

tip Hewlett Packard 8453, prevăzut cu detector cu multidiode (Diode Array Detector

Pentru determinarea lungimii de undă de detecţie, s-a înregistrat spectrul de absorbfig. 35). Maximul de absorbţie se obţine la lungimea de und

35. Spectrul de absorbţie a lupeolului în UV

Curba de calibrare (etalonare) a lupeolului este redată în fig. 36.

Curba de calibrare a lupeolului în tampon fosfat cu pH=6,8

y = 0.0177x + 0.0164

R2 = 0.9966

5 10 15 20 25 30

Concentraţie (µg/mL)

a fost utilizat un sistem & Transdermal Diffusion Cell

(notată conform tabelului pe o membrană filtrantă Porafil

) expusă la lampă UVB

torile cantitative de agent activ au fost realizate cu un spectrofotometru UV-cu detector cu multidiode (Diode Array Detector –

a înregistrat spectrul de absorbţie ine la lungimea de undă de 211 nm.

ie a lupeolului în UV

Curba de calibrare a lupeolului în tampon fosfat cu pH=6,8

30 35

În tabelul XXIV şprivind procentul de lupeol cedat din formulsemipermeabile.

Tabelul XXIV.

Timp

(ore)

F I (LUP)

mem.art nexUV exUV

0,5 35 41 32

1 40 48 38

2 45 53 45

3 51 60 50

4 59 68 56

5 62 71 61

6 67 75 64

Fig. 41. Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I

Din analiza fig. 41 cazul formulei IV (COM3), urmatcomparativ cu lupeolul neinclus în transportori, unde cedarea este de 67% (formula I).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1

Lup

eo

l ce

da

t %

22

În tabelul XXIV şi fig. 41–43 sunt prezentate datele experimentale, cumulative privind procentul de lupeol cedat din formulările studiate, prin cele tre

Cantitate % cedată de lupeol din formulările semisolide

F II (COM1) F III (COM2)

exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV

37 38 35 32 35 30

53 55 49 50 55 48

58 65 52 59 66 53

63 71 54 65 70 54

67 76 56 70 77 57

71 79 59 72 79 59

73 84 61 73 83 60

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele Iprin membrană artificială

fig. 41 se constată că cea mai mare cedare de lupeol, de 85%, se obcazul formulei IV (COM3), urmată de formulele II şi III (COM1 comparativ cu lupeolul neinclus în transportori, unde cedarea este de 67% (formula I).

2 3 4 5 6

43 sunt prezentate datele experimentale, cumulative rile studiate, prin cele trei tipuri de membrane

rile semisolide

F IV (COM3)

exUV mem.art nexUV exUV

40 42 37

55 59 45

67 71 52

75 81 59

79 88 62

83 90 63

85 92 65

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I–IV)

cea mai mare cedare de lupeol, de 85%, se obţine în III (COM1 şi COM2) cu 73%,

comparativ cu lupeolul neinclus în transportori, unde cedarea este de 67% (formula I).

6Timp (ore)

F1

F2

F3

F4

Fig. 42. Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele Iprin membran

Analizând datele experimentalcedare, de 92%, se obţine tot în cazul formulei IV (COM3), urmat84%, formula III (COM2) cu 83%

Fig. 43. Cedarea in vitro a lupeolului dprin membran

În acest caz se constaturmată de formula I (LUP) de 64% (COM2) de 60%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1

Lup

eo

l ce

da

t %

0

10

20

30

40

50

60

70

1

Lup

eo

l ce

da

t %

23

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele Iprin membrană de şobolan neexpunsă la UV

Analizând datele experimentale reprezentate în fig. 42, se constatine tot în cazul formulei IV (COM3), urmată de formula II (COM1) cu

84%, formula III (COM2) cu 83% şi pe ultimul loc formula I, cu 75%.

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele Iprin membrană de şobolan expunsă la UV

În acest caz se constată o cedare de 65% a lupeolului din formula IV (COM3), de formula I (LUP) de 64% şi apoi de formula II (COM1) cu 61%

2 3 4 5 6

2 3 4 5 6

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I–IV)

, se constată că cea mai mare ă de formula II (COM1) cu

in unguente (formulele I–IV)

o cedare de 65% a lupeolului din formula IV (COM3), i apoi de formula II (COM1) cu 61% şi formula III

Timp (ore)

F1

F2

F3

F4

Timp (ore)

F1

F2

F3

F4

24

8.1.4. Concluzii

− în toate cazurile, formarea complecşilor de incluziune cu ciclodextrine şi lupeol creşte cantitatea de agent activ, lupeol, care difuzează prin membrană, indiferent de ce tip de membrană se utilizează;

− cantităţile cele mai mari de agent activ difuzat se înregistrează în cazul pielii de şobolan neexpus la radiaţie UVB, iar cele mai mici cantităţi de agent activ difuzat se înregistrează în cazul pielii de şobolan expus la UV;

− cea mai bună difuzie s-a înregistrat în cazul formulării semisolide ternare cu poli-vinilpirolidonă (peste 90% lupeol difuzat), cantităţi similare au fost înregistrate în cazul unguentelor care conţin complecşi ciclodextrină cu lupeol, notate COM1, respectiv COM2 (aproximativ 85% lupeol difuzat în cazul utilizării pielii de şobolan neexpus la radiaţie UV), iar cele mai mici valori au fost obţinute pentru unguentul cu lupeol neinclus în transportori hidrofili.

În concluzie, asocierea lupeolului cu ciclodextrine prin formarea de complecşi de incluziune binari sau ternari alături de polivinilpirolidonă, creşte cantitatea de agent activ, lupeol, care difuzează prin piele.

8.2. Studiul cineticii de cedare in vitro din unguente a lupeolului

şi a complecşilor de incluziune

Studiul cineticii de cedare a substanţei medicamentoase din forma farmaceutică prezintă o importanţă deosebită în caracterizarea formei farmaceutice din punctul de vedere al profilului de cedare. De asemenea, prin numărul mare de date şi constante caracteristice modelului obţinut, cercetătorul intră în posesia unor informaţii definitorii pentru procesul de optimizare a formulării.

Din literatură au fost selectate în vederea fitării 4 (patru) modele matematice, corespunzătoare unor mecanisme de cedare diferite: 1. modelul liniar (cedare de ordinul zero); 2. modelul exponenţial (cedare de ordinul unu); 3. modelul Higuchi; 4. modelul Korsmeyer-Peppas. Datele obţinute pe cele 4 modele matematice sunt redate în tabelele XXVII-XXX.

Tabelul XXVII. Parametrii ecuațiilor modelului liniar de cedare a lupeolului și a complecșilor de incluziune din formulele I – IV.

Var. F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)

mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV

K 0 0.1368 0.1569 0.1323 0.1575 0.1775 0.1334 0.1597 0.1770 0.1330 0.1836 0.1993 0.1422

R2 0.7622 0.7247 0.7696 0.6692 0.7221 0.5756 0.7056 0.7221 0.5982 0.7200 0.7334 0.6550

Tabelul XXVIII. Parametrii ecuațiilor modelului exponenţial de cedare a lupeolului și a complecșilor de incluziune din formulele I – IV.

Var. F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)

mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV

K 0.25 0.4 0.2 0.4 0.45 0.3 0.4 0.45 0.3 0.5 0.6 0.4

R2 0.8501 0.8665 0.8494 0.8514 0.9101 0.7294 0.8974 0.9165 0.7630 0.9287 0.9569 0.8453

25

Tabelul XXIX. Parametrii ecuațiilor modelului Higuci de cedare a lupeolului și a complecșilor de incluziune din formulele I – IV.

Var. F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)

mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV

K H 29.6500 34.1554 28.6529 34.5061 38.6594 29.4961 34.8120 38.5250 29.3300 39.9879 43.3490 31.2085

R2 0.9346 0.9167 0.9450 0.8890 0.9246 0.8188 0.9150 0.9235 0.8377 0.9256 0.9331 0.8821

Tabelul XXX. Parametrii ecuațiilor modelului Korsmeyer Peppas de cedare a lupeolului și a complecșilor de incluziune din formulele I – IV.

Var. F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)

mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV

n 0.28 0.28 0.3 0.26 0.28 0.26 0.28 0.28 0.22 0.28 0.28 0.24

K P 39.442 45.5481 37.1994 47.2181 51.4734 40.6148 46.3478 51.2475 42.1516 53.2417 51.6472 43.7628

R2 0.9917 0.9936 0.9974 0.9887 0.9921 0.9663 0.9825 0.9844 0.9679 0.9932 0.9917 0.9960

În fig. 56–59 redăm parametrii ecuaţiilor modelului Korsmeyer-Peppas de cedare a

lupeolului şi a complecşilor de incluziune COM1, COM2, COM3 din formulările I–IV.

Fig. 56. Fitarea profilului de cedare a lupeolului din F I (LUP)

conform modelului Korsmeyer Peppas

26

Fig. 57. Fitarea profilului de cedare a complexului din F II (COM1)

conform modelului Korsmeyer Peppas

Fig. 58. Fitarea profilului de cedare a complexului din F III (COM2)

conform modelului Korsmeyer Peppas

27

Fig. 59. Fitarea profilului de cedare a complexului din F IV (COM3)

conform modelului Korsmeyer Peppas

8.2.4. Concluzii

Rezultatele obținute în cadrul acestor studii au evidențiat faptul că lupeolul este cedat din formula studiată printr-un proces de difuzie indiferent de membrana folosită în cadrul testului de dizolvare. În cazul complecșilor de incluziune, rezultate optime s-au obținut doar în cazul fitării pe modelul de cedare Korsmeyer Peppas, pentru n = 0,3. Astfel, apreciem că în cazul acestor complecși, prin procesul de incluziune au fost modificate caracteristicile de penetrație și solubilitatea lupeolului.

Capitolul IX. Testarea acţiunii antitumorale a lupeolului şi a complecşilor de incluziune

Studiul unguentelor formulate (unguentul cu lupeol, respectiv unguentele cu complecşii de incluziune ai ciclodextrinelor cu lupeol) cuprinde şi o parte de testare pe animal de laborator [22, 180, 196, 198, 199, 200, 208].

Obiectivul acestui studiu a fost compararea activităţii anticanceroase a produselor topice pe bază de lupeol sau complecşi ciclodextrină-lupeol.

S-au utilizat şoricei, la care s-a aplicat DMBA (7,12-dimetil-benzantracen, iniţiator de cancer) şi TPA (12-O-tetradecanoilphorbol-13-acetat) ca promotor de tumori). Pe zonele afectate s-au aplicat unguentele I–IV. Pentru o evaluare detaliată a refacerii pielii s-a utilizat un mexametru model Courage-Khazaka (fig. 63).

Fig. 63. Valorile melaninei de aplicare a unguentelor (formulele I

Nu au fost constatate modifica eritemului (nivelului de hemoglobindiscutat faptul că cele mai bune valori în privinînregistrat în cazul unguentului formulatCOM3 (formula IV).

Capitolul X . Evaluarea citotoxicit

comparativ cu unele triterpene pentaciclice

Prezentul studiu constinduse de compuşii analizaţproduse la nivelul plexului vascular, incitotoxicitatea lor pe linii celulare specifice: A431 (cancer de piele), A2058 (melanom uman), B16 (melanom de şoarece) Conform unor studii recente BA anticanceroase care acţioneazdiferenţiatori keratinocitari ş

Testul MTT Efectul antiproliferativ al compu

celulare umane: HeLa (adenocarcinomul de colul uterin) utilizarea testului MTT (bromurcitat frecvent prin Mosmann [

Metoda evaluării pe membrana corioalantoidMetoda aleasă pentru evaluarea celor doi fitocompu

lor în modelarea procesului angiogenic a fost testarepuiului de gaină (Gallus gallus domesticus

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450V

alo

are

arb

itra

ră

28

Valorile melaninei şi eritemului la finalul experimentuluide aplicare a unguentelor (formulele I-IV)

Nu au fost constatate modificări majore ale valorilor melaninei (pigmenta eritemului (nivelului de hemoglobină) între startul şi finalul experimentului. Totu

cele mai bune valori în privinţa unei creşteri reduseunguentului formulat pe bază de complex de incluziune ternar, notat

. Evaluarea citotoxicităţii şi a acţiunii antiangiogenice a lupeolului comparativ cu unele triterpene pentaciclice

ezentul studiu constă într-o evaluare preliminară a modificii analizaţi la nivelul ţesutului mezenchimal, al epiteliului corionic

produse la nivelul plexului vascular, interpretate la nivel macro şi analiza comcitotoxicitatea lor pe linii celulare specifice: A431 (cancer de piele), A2058 (melanom uman),

oarece) şi HuMsc (celule stem mezenchimale ca indice de toxicitate). Conform unor studii recente BA şi derivaţi ai săi sunt menţionaţi ca o nou

ţionează la nivelul factorilor de transcripţie, cât iatori keratinocitari şi agenţi citotoxici importanţi [115, 120, 122, 182

10.2. Materiale şi metode

Efectul antiproliferativ al compuşilor testaţi a fost evaluat in vitrocelulare umane: HeLa (adenocarcinomul de colul uterin) şi A431 (cancer cutanat), prin utilizarea testului MTT (bromură de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolicitat frecvent prin Mosmann [115].

ării pe membrana corioalantoidă aviană (CAM)ă pentru evaluarea celor doi fitocompuşi în ceea ce prive

lor în modelarea procesului angiogenic a fost testarea lor pe membrana corioalantoidGallus gallus domesticus).

melanina și eritemul

i eritemului la finalul experimentului

ri majore ale valorilor melaninei (pigmentării pielii) şi i finalul experimentului. Totuşi trebuie

teri reduse a eritemului s-au de complex de incluziune ternar, notat

iunii antiangiogenice a lupeolului

a modificărilor morfologice esutului mezenchimal, al epiteliului corionic şi la cele

şi analiza comparativă cu citotoxicitatea lor pe linii celulare specifice: A431 (cancer de piele), A2058 (melanom uman),

i HuMsc (celule stem mezenchimale ca indice de toxicitate). i ca o nouă clasă de molecule

la nivelul factorilor de transcripţie, cât şi ca agenţi i [115, 120, 122, 182].

in vitro, pe două linii i A431 (cancer cutanat), prin

difeniltetrazolin) indicat şi

(CAM) i în ceea ce priveşte implicaţiile

mbrana corioalantoidă a

LUP

COM1

COM2

COM3

Evaluarea procesului angiogenicPreparatele au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Nikon Eclipse E600,

imaginile fiind achiziţionate în sistem JPEG Fotografiile membranei corioalantoide

probelor au fost efectuate cu aparat fotografic Sony Cybershot 7,2 megapixeli.Evoluţia reţelei vasculare a membranei corioalantoide a fost studiat

semi-cantitative. Metoda „hot spot” a servit la identificarea ariilor de pe secremarcat prin prezenţa unei reanormal ca formă de vase de sânge. În esenmetodă de observare a angiogenezei. Orice compus care reduce sau modificvasculară a embrionului este un compus cu poten

În fig. 65 redăm activitatea antiproliferativ

Fig. 65. Activitatea antiproliferativ

Acţiunea lupeoluluibetulina este în cele mai multe cazuri dep

Testul MTT a fost utilizat lupeolului comparativ cu complexul de incluziune lupeolHeLa (adenocarcinomul de col uterin)

Fig. 76. Activitatea in vitro lupeolpe celule HeLA (0,2 mg/mL solu

% L

upeo

l

29

Evaluarea procesului angiogenic Preparatele au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Nikon Eclipse E600,

ionate în sistem JPEG şi prelucrate statistic. tografiile membranei corioalantoide in ovo, efectuate zilnic dup

probelor au fost efectuate cu aparat fotografic Sony Cybershot 7,2 megapixeli.elei vasculare a membranei corioalantoide a fost studiat

ative. Metoda „hot spot” a servit la identificarea ariilor de pe seca unei reţele vasculare mai slab dezvoltate, cu un num

de vase de sânge. În esenţă studiul constă în aplicarea evalu de observare a angiogenezei. Orice compus care reduce sau modific

a embrionului este un compus cu potenţial antiangiogenic. m activitatea antiproliferativă a triterpenelor pe linia celular

Activitatea antiproliferativă a triterpenelor studiatepe linia celulară A431 diluţia ×300

lupeolului deşi nu este atât de remarcabilă comparativ cu este în cele mai multe cazuri depăşeşte media. Toicitatea compusului este redusTestul MTT a fost utilizat şi pentru evaluarea efectului antiproliferativ

lupeolului comparativ cu complexul de incluziune lupeol-γ-CD, pe douăHeLa (adenocarcinomul de col uterin) şi A 431 (cancer cutanat) (fig. 76 ş

Activitatea in vitro lupeol-γ-ciclodextrină comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)pe celule HeLA (0,2 mg/mL soluţie stoc)

Preparatele au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Nikon Eclipse E600,

, efectuate zilnic după administrarea probelor au fost efectuate cu aparat fotografic Sony Cybershot 7,2 megapixeli.

elei vasculare a membranei corioalantoide a fost studiată folosind metode ative. Metoda „hot spot” a servit la identificarea ariilor de pe secţiuni care au s-au

ele vasculare mai slab dezvoltate, cu un număr redus sau în aplicarea evaluării vasculare ca

de observare a angiogenezei. Orice compus care reduce sau modifică reţeaua

a triterpenelor pe linia celulară A 431.

a triterpenelor studiate

comparativ cu acidul betulinic şi compusului este redusă.

i pentru evaluarea efectului antiproliferativ in vitro, al CD, pe două linii celulare umane:

cutanat) (fig. 76 şi 77).

comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)

Timp

Fig. 77. Activitatea in vitro lupeolpe celule HeLA (0,5 mg/mL solu

1. Triterpenele pentaciclice prezintacţiune pe linii celulare spec

2. Dintre triterpenele pentaciclice acidul betulinic betulina citotoxică cea mai intens

Capitolul XI . Prepararea de nanocapsule poli(

Înglobarea de substanla dimensiune ajustabilă prin simpla modificare a masei moleculare a precursorilor este o noutate absolută pe plan internaunor medicamente sau preparate dermfarmaceutice şi cosmetice justific

Pentru prepararea nanochidroxilică (diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o componentsemiprepolimer izocianic pe baz

Nanocapsulele sunt analizate prin calorimetrie de scanare diferendetectării unei modificări ale propriet

Morfologia particulelor a fost examinatHitachi 2400S (Hitachi Scientific Ltd, Japonia).

Ex. în fig. 93 este redat

% L

upeo

l

30

Activitatea in vitro lupeol-γ-ciclodextrină comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)pe celule HeLA (0,5 mg/mL soluţie stoc)

10.4. Concluzii

Triterpenele pentaciclice prezintă o activitate antitumorală importantiune pe linii celulare specifice dar şi pe oul embrionat.

Dintre triterpenele pentaciclice acidul betulinic betulina şi acidul ursolic au activitatea cea mai intensă dar nu trebuie neglijat nici lupeolul şi acidul oleanolic.

. Prepararea de nanocapsule poli(eter)uretanice utilizate ca transportori transdermici pentru lupeol

Înglobarea de substanţe biologic active în nanocapsule polieterprin simpla modificare a masei moleculare a precursorilor este o

pe plan internaţional. Interesul pentru acest mijloc de transport transdermic a unor medicamente sau preparate dermato-cosmetice din partea produc

i cosmetice justifică studiul în acest domeniu. Pentru prepararea nanocapsulelor poli(eter)uretanice se utilizeaz

(diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o componentsemiprepolimer izocianic pe bază de lizin-diizocianat), solvent şi surfactan

sunt analizate prin calorimetrie de scanare diferenri ale proprietăţilor termice comparativ cu substan

Morfologia particulelor a fost examinată utilizând microscopul de scanare electronicHitachi 2400S (Hitachi Scientific Ltd, Japonia).

Ex. în fig. 93 este redată imaginea SEM a probei COM2.

comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)

importantă. Ele pot dovedi

i acidul ursolic au activitatea i acidul oleanolic.

eter)uretanice utilizate ca transportori

e biologic active în nanocapsule polieter-uretanice sintetizate prin simpla modificare a masei moleculare a precursorilor este o

ional. Interesul pentru acest mijloc de transport transdermic a cosmetice din partea producătorilor de produse

uretanice se utilizează o componentă (diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o componentă izocianică (un

i surfactanţi. sunt analizate prin calorimetrie de scanare diferenţială în scopul

ilor termice comparativ cu substanţele pure. utilizând microscopul de scanare electronică

Timp

31

Fig. 93. Imaginea SEM a probei COM2 la scara 2 µm

Valorile dimensiunilor, potenţialului zeta, solubilitatea în apă şi respectiv acetonă şi pH-ul soluţiilor apoase de nanocapsule (obţinute prin redizolvare) sunt prezentate în tabelele XXXII–XXXIV.

Tabelul XXXII. Valorile dimensiunilor şi potenţialul zeta pentru nanocapsulele preparate

Diametru (nm)

Medie, deviaţie standard Potenţial zeta (mV)

Medie, deviaţie standard

MART 601 ± 142 28,4 ± 6,2

LUP1 623 ± 122 31,2 ± 5,2

Tabelul XXXIII. Solubilitatea nanocapsulelor în apă distilată şi acetonă (g/100 g, 25°C)

Apă Acetonă MART 8 · 10-2 4 · 10-2 LUP1 10-1 4 · 10-2 LUP2 7 · 10-2 3 · 10-2 LUP3 8 · 10-2 4 · 10-2 COM1 7 · 10-2 5 · 10-2 COM2 8 · 10-2 4 · 10-2 COM3 9 · 10-2 5 · 10-2

32

Tabelul XXXIV. pH-ul soluţiilor apoase de nanocapsule (7 ⋅ 10–2 g / 100 g, 25°C)

pH MART 7,2 LUP1 7,4 LUP2 7,1 LUP3 6,9 COM1 6,9 COM2 7,0 COM3 6,8

Din datele cuprinse în tabele, se desprinde faptul că introducerea substanţei active în

cadrul preparării nanocapsulelor, nu afectează diametrul particulelor, stabilitatea acestora faţă de tendinţa de aglomerare, solubilitatea lor, respectiv pH-ul soluţiilor obţinute prin redizolvare. Putem observa că există diferenţe între valorile din aceste tabele, dar că variaţia acestor valori este mică, neliniară şi nu poate fi corelată cu structura substanţei active.

Capitolul XII. Metode neinvazive folosite pentru testarea nanocapsulelor la nivel cutanat

Nanocapsulele cu lupeol şi respectiv complecşii de incluziune a lupeolului cu ciclodextrine au fost analizaţi prin următoarele metode: mexametrie, sebumetrie, corneometrie, skin-pH-metru, TEWA-metrie cât şi în condiţii de experimentare pe model animal (tabelul XXXVI).

Tabelul XXXVI. Loturile de şoareci notate în funcţie de substanţa activă inclusă în nanocapsule

Lotul Descriere

MART Se aplică doar acetonă

LUP1 Se aplică nanocapsule cu lupeol (conc. 30 mg/3 mL)

LUP2 Se aplică nanocapsule cu lupeol (conc. 100 mg/3 mL)

LUP3 Se aplică nanocapsule cu lupeol (conc. 200 mg/3 mL)

COM1 Se aplică nanocapsule cu complex ciclodextrină-lupeol (conc. 30 mg/3 mL)

COM2 Se aplică nanocapsule cu complex ciclodextrină-lupeol (conc. 100 mg/3 mL)

COM3 Se aplică nanocapsule cu complex ciclodextrină-lupeol (conc. 200 mg/3 mL) Pierderea de apă transdermică (TEWL = TransEpidermal WaterLoss) constituie

un parametru de analiză a condiţiei pielii studiate. Astfel valori cuprinse între 0-10 g/h/m2 corespund unei pieli aflate într-o condiţie foarte bună, 10-15 g/h/m2 în condiţie bună, 15-25 g/h/m2 în condiţie normală, 25-30 g/h/m2 în stare proastă, respectiv peste 30 g/h/m2 în stare foarte proastă. Valorile respective sunt valabile pentru pielea sănătoasă în condiţii ambientale normale (20oC şi 40-60% umiditate).

Cele mai bune evoluţii se înregistrează în cazul lotului LUP1, respectiv COM1 unde valorile se menţin aproape constante.

Fig. 99.

Valorile de pH înregistrate experimental se reg

pentru testele efectuate (6,1valorilor într-un interval strâns pentru lotul martor (între 6,8

În general, se poate afirma ccorelată cu concentraţia substan

Fig. 100

Evoluţia valorilor medii de sebum

în fig. 101, indică o creştere sinuoas

33

. Variaţia valorilor TEWL în cazul celor 7 loturi

înregistrate experimental se regăsesc într-un interval relativ larg pentru testele efectuate (6,1-7,5). Se observă uşor pe fig. 100 o tendinţă

un interval strâns pentru lotul martor (între 6,8-7,1). eneral, se poate afirma că variaţia valorilor de pH este haotic

ia substanţei active sau tipul acesteia.

100. Variaţia valorilor de pH în cazul celor 7 loturi

ia valorilor medii de sebum înregistrate în cazul celor şştere sinuoasă a valorilor în cazul fiecărui lot.

ia valorilor TEWL în cazul celor 7 loturi

un interval relativ larg o tendinţă firească de păstrare a

ia valorilor de pH este haotică şi nu poate fi

ia valorilor de pH în cazul celor 7 loturi

înregistrate în cazul celor şapte loturi, prezentată

34

Fig. 101. Variaţia valorilor de sebum în cazul celor 7 loturi

Valorile determinate se află într-un interval relativ strâns (între 4-16 unităţi) având în vedere faptul că scala aparatului cuprinde 100 unităţi. O tendinţă accentuată de păstrare a valorilor se regăseşte în cazul lotului LUP3, care păstrează aspectul pielii în intervalul 7-9, aplicările asigurând o menţinere a nivelului de sebum al pielii de şoarece chiar mai bună decât în cazul lotului MART. Acelaşi aspect poate fi subliniat şi în cazul lotului COM3 (variaţia valorilor are loc în intervalul 5-7 unităţi de sebum).

Ca o concluzie referitoare la determinarea valorilor de sebum prin metode neinvazive, utilizarea unor concentraţii mari de substanţă activă (lupeol sau complex de incluziune a γ-ciclodextrină cu lupeol) asigură o bună păstrare a nivelului de sebum al pielii de şoarece pe o perioadă de 12 săptămâni de experimentare (aplicare / determinare).

Determinările mexametrice cuprind evaluarea indicelui de melanină, care exprimă nivelul de pigmentare a pielii. Acest indice este situat într-un interval îngust de valori: 85-165 unităţi de melanină (fig. 102).

Fig. 102. Variaţia valorilor melaninei în cazul celor 7 loturi

35

Se observă o tendinţă firească de nemodificare a pigmentării pielii în timpul experimentului în cazul lotului MART (se păstrează la aprox. 90 unităţi), în timp ce o pigmentare accentuată se regăseşte în cazul lotului LUP2.

Loturile pe care s-au aplicat concentraţii mari de substanţă activă (LUP3 şi respectiv COM3) prezintă o creştere uşoară, aproape insesizabilă a nivelului de melanină.

Variaţia valorilor eritemului este redată în fig. 103.

Fig. 103. Variaţia valorilor eritemului în cazul celor 7 loturi

În general, modificări ale eritemului cuprinse între 0-30 unităţi, aşa cum se regăsesc în cazurile loturilor studiate, sunt justificate de condiţiile de experimentare (aplicare / determinare) şi nu este cazul unei inflamări datorate nocivităţii compuşilor studiaţi.

Alături de evoluţia aproape staţionară a lotului MART, similitudini pot fi găsite în evoluţiile loturilor LUP3 şi respectiv COM3, unde diferenţele dintre valorile de start şi cele din săptămâna 12 sunt maxim 25 unităţi.

Determinările corneometrice sunt redate în fig. 104.

Fig. 104. Variaţia valorilor stratului cornos în cazul celor 7 loturi

36

În cazul valorilor determinate pe loturile de şoareci supuse acestui experiment, s-a observat că aplicarea de suspensii care conţin nanocapsule cu lupeol, respectiv cu complecşi de incluziune γ-ciclodextrină cu lupeol scade într-o foarte mică măsură umiditatea stratului cornos.

Scăderea cea mai importantă, observată şi prin creşterea exagerată a melaninei şi eitemului, se regăseşte în cazul lotului LUP2. Cea mai constantă evoluţie fără modificare semnificativă se prezintă în cazul lotului LUP1, respectiv COM1.

Ca o concluzie, se poate afirma că cele mai bune suspensii aplicate, din punct de vedere al umidităţii stratului cornos trebuie să conţină cantităţi foarte reduse de substanţă activă.

Capitolul XIII. Studiul ac ţiunii antiinflamatoare a lupeolului ca atare şi din

complecşi cu ciclodextrine pe model din ureche de şoarece

În studiile publicate în literatura de specialitate, rezultatele pe animale sunt de multe ori diferite de cele ale studiilor clinice, pe oameni. Însă modelele experimentale, pe animale, nu pot fi evitate, pentru că sunt, în acest moment, cea mai relevantă şi cea mai sigură metodă de testare.

Inflamaţia a fost indusă în ambele urechi pentru fiecare şoarece prin aplicare topică de TPA (12-O-tetradecanoilphorbol-13-acetat), după care s-a aplicat lupeol, respectiv COM1, COM2 şi COM3 şi martor – indometacin. S-a măsurat grosimea urechii pentru a se calcula edemul şi apoi procesul de inhibiţie (tabelul XLIX şi fig. 108).

Tabelul XLIX. Edemul şi procentul de inhibiţie pentru grupurile luate în studiu

Grupul de şşşşoareci Edem indus ± SEM, mm procent de inhibițțțție (PI), %

A 0,17 ± 0,03 40,15

B 0,31 ± 0,06 0,00

C 0,19 ± 0,03 38,71

D 0,14 ± 0,04 54,83

E 0,13 ± 0,06 58,06

F 0,14 ± 0,05 54,81

G 0,08 ± 0.04 74,19

Admițând faptul că lupeolul are o acțiune anti-inflamatoare demonstrată în studiile

anterioare publicate în literatura de specialitate [184a], rezultatele acestui studiu demonstrează că acţiunea anti-inflamatoare este mai puternică în cazul complecşilor de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrine, chiar dacă valorile obținute sunt mai mici decât în cazul controlului pozitiv (indometacin), (fig. 108).

Analize morfo-patologice După experiment, urechile au fost cântărite şi s-au efectuat analize morfo-patologice. Rezultatele arată că lupeolul este un compus activ care reduce masiv inflamaţia

epitelială la o inflamație discretă, dar prezintă o acțiune anti-inflamatoare uşoară în comparaţie cu indometacinul unde, de asemenea, rezultatele au arătat țesuturi epiteliale şi cartilaj cu o inflamație subepitelială foarte discretă.

37

Fig. 108. Inhibiţia procentuală comparativă între grupurile de şoareci

Un rezultat mai bun pentru tratament a fost în cazul grupurilor D, E şi F, atunci când au fost utilizați complecşii de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrine (COM1, COM2 şi respectiv COM3). Analiza morfo-patologică a arătat că ţesutul epitelial şi cartilaginos în cazul celor trei complecşi au prezentat edeme subepiteliale minore. În aceste cazuri, edemele sunt prezente doar în faza iniţială a inflamaţiei acute când are loc o permeabilitate crescută a vaselor de sânge din care rezultă o “transpiraţie” a proteinelor şi lichidului plasmatic în ţesutul care prezintă edem, dar nu este prezentă o inflamaţie subepitelială. Deşi cei trei complecşi lupoel-ciclodextrine au prezentat o acţiune anti-inflamatoare mai bună, împotriva inflamației, acest efect este mai uşor decât cel înregistrat în cazul indometacinului.

13.4. Concluzii

Lupeolul este un fitocompus biologic activ a cărui activitate anti-inflamatoare poate fi demonstrată pe modelul experimental al urechii de şoarece. Complexarea acestui fitocompus biologic activ cu ciclodextrine conduce la o acțiune anti-inflamatoare crescută şi reprezintă o metodă bună de a creşte solubilitatea lupeolului în soluții apoase cu scopul obținerii unui răspuns terapeutic mai bun. Rezultatele acestui studiu experimental sunt importante pentru stabilirea celei mai bune formulări a acestui compus biologic activ, lupeolul.

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

blank TPA lup COM1 COM2 COM3 indom

Inh

ibiţ

ia p

roce

ntu

ală

a e

de

mu

lui,

%

38

Capitolul XIV. CONCLUZII GENERALE

Teza de doctorat „Studii privind m ărirea disponibilit ăţii in vitro a lupeolului cu

transportori hidrofili ” reprezintă o cercetare ştiinţifică de vârf şi cu mare originalitate, prin tema abordată şi obiectivele de cercetare propuse, din domeniul terapiei antitumorale şi antiinflamatoare. Aceasta a fost concepută după următoarea structură: Introducere, Partea generală, Contribuţii personale, Concluzii generale şi Bibliografie.

Partea generală este structurată în două capitole şi sistematizează datele din literatura farmaceutică privind triterpenele pentaciclice, cu referire la lupeol şi utilizările sale în terapeutică, datorate proprietăţilor sale: acţiune antioxidantă puternică, antitumorală, antimutagenică, antiinflamatoare şi antiaterogenă.

Al doilea capitol include o prezentare succintă a ciclodextrinelor utilizate în domeniul farmaceutic şi formarea complecşilor de incluziune ca transportori hidrofili cu substanţe insolubile în scopul măririi solubilităţii şi deci a biodisponibilităţii substanţei active.

Contribu ţiile personale au fost structurate în 12 capitole, din care se desprind următoarele concluzii:

1. O primă direcţie a cercetărilor a reprezentat-o prepararea unor complecşi de incluziune a lupeolului cu unele ciclodextrine: β şi γ.

În acest scop mai întâi au fost stabilite corelaţiile QSAR între structura triterpenelor pentaciclice şi capacitatea de legare de ciclodextrine. S-au obţinut o serie de descriptori moleculari tip Van der Waals şi s-a determinat afinitatea de legare de CD, care a fost în ordinea: acid betulinic, acid ursolic, lupeol, betulină şi acid oleanolic.

S-au preparat 5 complecşi de incluziune ai lupeolului cu β, respectiv γ-CD în raport molar 1:1, 1:2 şi respectiv un complex ternar: γ-CD, lupeol şi povidonă 1:1:1.

S-a determinat solubilitatea în apă a acestor complecşi de incluziune, din care se remarcă o creştere a solubilităţii comparativ cu lupeolul, şi în funcţie de raportul molar CD; rezultate mai bune au prezentat complecşii cu raportul molar 1:2 şi complexul ternar (COM1, COM2, COM3).

De asemenea s-a efectuat analiza morfologică a complecşilor de incluziune prin spectroscopie electronică de scanare (SEM), care sunt compuşi amorfi; s-au caracterizat prin calorimetrie diferenţială dinamică (DSC), prin spectroscopie IR (FT-IR) şi difracţie de raze X.

2. Cei trei complecşi de incluziune (COM1, COM2, COM3) şi lupeolul au fost formulaţi în 4 variante de unguente pe bază de polietilenglicol (PEG). În condiţii de laborator, s-au realizat unguente-emulsie tip L/H, prin asociere de emulgatori ca Transcutol® şi Labrasol®.

Aprecierea calităţii unguentelor a avut în vedere condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească aceste forme, conform FR X şi supl. şi Ph. Eur. 7th.

3. Am efectuat un control macroscopic, fizico-chimic şi farmacotehnic. Astfel, am urmărit: aspectul, omogenitatea, culoarea, mirosul, pH-ul; rezultatele fiind în concordanţă cu normele de calitate.

Comportarea reologică a unguentelor permite caracterizarea fizico-mecanică a acestora. Toate formulele de unguente, inclusiv baza de unguent, prezintă, imediat după preparare, un comportament reologic dilatant, iar în timp, formează o reţea gelică, specifică PEG-ului, care conferă o comportare reologică plastică, cu prag de curgere şi buclă de histereză.

Viscozitatea unguentelor scade progresiv cu creşterea vitezei de forfecare. Capacitatea de întindere şi penetraţia este adecvată formulărilor, care pledează

pentru o etalare facilă, cu o bună adeziune pe piele.

39

4. Rezultatele obţinute în urma studiilor de cedare in vitro a lupeolului ca atare şi a celor 3 complecşi de incluziune (COM1, COM2 şi COM3), efectuate pe celula Franz, concomitent pe trei tipuri de membrane de dializă (1. membrana artificială poroasă – Porofil; 2. membrană naturală, piele de şobolan neexpusă la radiaţii UV şi 3. membrană naturală, piele de şobolan expusă la radiaţii UV) au evidenţiat o creştere a cantităţii de lupeol cedată din unguentele ce conţin complecşii de incluziune (F II–IV).

Cantităţile cele mai mari de lupeol cedat se înregistrează în cazul pielii de şobolan neexpusă la UV; iar cele mai mici cantităţi difuzate au fost obţinute pentru unguentul cu lupeol neinclus în transportori hidrofili.

5. Pentru determinarea cantitativă a lupeolului din unguentele studiate s-a pus la punct o metodă spectrofotometrică, în UV, la λ = 211 nm. Metoda a fost validată şi utilizată pentru studiile de cedare in vitro.

6. De asemenea, s-a studiat cinetica de cedare in vitro a lupeolului şi a complecşilor de incluziune, prin aplicarea a 4 (patru) modele matematice: de ordinul zero, de ordinul unu, Higuchi şi Korsmayer-Peppas. Rezultatele obţinute au evidenţiat faptul că lupeolul este cedat din formele studiate printr-un proces de difuziune, indiferent de membrana folosită în cadrul testului de dizolvare. În cazul complecşilor de incluziune, rezultate optime s-au obţinut doar în cazul fitării pe modelul de cedare Korsmayer-Peppas, pentru n = 0,3. Astfel apreciem că în cazul acestor 3 (trei) complecşi, prin procesul de incluziune au fost modificate caracteristicile de penetraţie şi solubilitatea lupeolului.

7. În premieră naţională s-a efectuat testarea acţiunii antitumorale a lupeolului şi a celor trei complecşi de incluziune din unguentele formulate, pe animale de laborator – şoricei; s-a pus la punct o metodă de lucru de determinare a melaninei şi a eritemului; cele mai bune rezultate le-a prezentat formularea IV, care conţine amestecul ternar (COM3).

8. Tot ca originalitate, s-a evaluat citotoxicitatea şi acţiunea antiangiogenică a lupeolului, comparativ cu unele triterpene pentaciclice prin utilizarea de diferite metode: testul MTT (pe bromură de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolin), testul CAM (membrana corioalantoidă aviană). Efectul antiproliferativ a fost evaluat in vitro pe două linii celulare umane: HeLa (adenocarcinomul de col uterin) şi A 431 (cancer cutanat).

S-au studiat: acidul betulinic, betulina, lupeolul, acidul ursolic şi acidul oleanolic. Se remarcă cea mai mare acţiune citotoxică asupra celulelor tumorale în ordinea:

acid betulinic, betulină, lupeol. Referitor la acţiunea antiangiogenică se observă că tot acidul betulinic şi betulina

prezintă o acţiune inhibitorie intensă asupra dezvoltării vaselor sanguine, comparativ cu restul triterpenelor pentaciclice studiate; lupeolul se clasează tot pe locul trei.

9. O altă direcţie originală a cercetărilor din teza de doctorat a constituit-o prepararea de nanocapsule poli(eter)uretanice, utilizate ca transportori transdermici pentru lupeol şi reprezintă o noutate absolută, pe plan internaţional. S-au preparat şase variante de formulări – trei cu lupeol şi trei cu complexul de incluziune lupeol-CD.

Aceste nanocapsule au fost analizate prin calorimetrie de scanare diferenţială (DSC), morfologia nanoparticulelor a fost examinată cu microscopul de scanare electronică (SEM), s-a determinat dimensiunea nanocapsulelor (diametrul), potenţialul zeta şi stabilitatea lor în apă distilată, respectiv în acetonă, pH-ul suspensiilor apoase de nanocapsule.

10. Pentru testarea nanocapsulelor la nivel cutanat au fost utilizate o serie de metode moderne, neinvazive, ca: mexametria, sebumetria, corneometria, skin-pH-metria, TEWA-metria, în condiţii de experimentare pe model animal (şoareci). Determinările efectuate relevă buna compatibilitate a nanocapsulelor cu ţesutul cutanat şi capacitatea acestora de a fi transportori transepidermici pentru lupeol.

40

11. O ultimă direcţie originală a cercetărilor din teza de doctorat a constituit-o studiul acţiunii antiinflamatoare a lupeolului şi respectiv a celor trei complecşi de incluziune cu ciclodextrine pe model experimental animal – ureche de şoarece.

Rezultatele experimentale arată că lupeolul este un compus activ care reduce masiv inflamaţia epitelială la o inflamaţie discretă, dar, comparativ cu indometacinul (luat ca martor), acţiunea sa este mai mică. Un rezultat mai bun îl prezintă complecşii de incluziune a lupeolului cu CD; dar şi în acest caz sub acţiunea antiinflamatoare a indometacinului.

12. Analiza morfo-patologică a arătat că ţesutul epitelial şi cartilaginos în cazul celor trei complecşi de incluziune a lupeolului cu CD au prezentat edeme subepiteliale minore, comparativ cu indometacinul.

Complexarea lupeolului cu CD conduce deci la o acţiune antiinflamatoare crescută şi reprezintă o metodă bună de a creşte solubilitatea sa în soluţii apoase, în scopul obţinerii unui răspuns terapeutic mai bun.

Studiile realizate în premieră în ţara noastră în cadrul cercetărilor din teza de doctorat au permis evaluarea acţiunii antitumorale, antiinflamatoare şi antiangiogenice a unui compus triterpenic pentaciclic – lupeolul, ca atare şi sub forma unor complecşi de incluziune a acestuia cu ciclodextrine şi formularea a două forme farmaceutice.

De asemenea, cercetările efectuate au demonstrat creşterea solubilităţii în apă şi deci implicit a biodisponibilităţii lupeolului din complecşii de incluziune cu ciclodextrinele, ca transportori hidrofili ai substanţelor insolubile.

Rezultatele obţinute relevă eficienţa celor două forme farmaceutice, cu posibilitatea de aplicare în terapeutică.

ELEMENTE DE ORIGINALITATE

Prin cercetările efectuate în teza de doctorat se reliefează elemente de originalitate care pot fi după cum urmează:

1. Se prezintă studii de toxicitate corelate pe pielea umană şi studii implementate pe animale de experienţă care apelează la tehnici moderne de analiză şi investigare.

2. Formularea şi prepararea a două forme farmaceutice: unguente-emulsie tip L/H şi nanocapsule, cu lupeol şi respectiv cei trei compuşi de incluziune a lupeolului cu CD.

3. Studii de cedare in vitro a lupeolului ca atare şi sub formă de complecşi de incluziune cu CD, din unguente-emulsie tip L/H pe celula Franz, prin trei tipuri de membrane de dializă (una artificială şi două naturale) cât şi studiul cineticii de cedare.

4. În premieră naţională s-a efectuat testarea acţiunii antitumorale a lupeolului şi a celor trei complecşi de incluziune cu CD, din unguentele studiate, pe animale de laborator (şoricei).

5. Determinarea citotoxicităţii şi a acţiunii antiangiogenice a lupeolului, comparativ cu unele triterpene pentaciclice prin teste moderne: CAM, MTT, cât şi a efectului antiproliferativ.

6. Teza subliniază implementarea tehnicilor non-invazive moderne ca metode de studiu al calităţii organului cutanat.

7. Prepararea de nanocapsulele care au fost investigate prin metode moderne de analiză pe animale de experienţă.

8. Studiul acţiunii antiinflamatoare pe model experimental animal – urechea de şoarece, a lupeolului şi respectiv a celor trei complecşi de incluziune lupeol–CD.

41

PROPUNERI ŞI RECOMAND ĂRI

1. Folosirea complecşilor de incluziune a γ-ciclodextrinelor cu lupeol în formulări farmaceutice trebuie realizată echilibrat. Se va avea în calcul ideea de folosire a unor doze eficiente farmacologic, dar reduse pentru a preveni nocivitatea dată de supra-dozaj.

2. Aplicaţiile complecşilor de incluziune a γ-ciclodextrinelor cu lupeol pot fi extinse pe domenii variate, inclusiv în ceea ce priveşte formularea de nanocapsule. Aceste formulări se pot executa cu doze mici de substanţă activă şi sunt lipsite de efecte nocive marcante.

3. Aplicarea testelor CAM sau pe animale de laborator prezintă o soluţie modernă şi detaliată a determinării nocivităţii unui complex de incluziune a γ-ciclodextrinelor cu lupeol.

4. Testele se pot corela între ele şi apoi cu altele de altă natură pentru a aprecia detaliat toxicitatea complecşilor de incluziune a γ-ciclodextrinelor cu lupeol chiar şi la doze reduse.

5. Pentru evaluarea complecşilor de incluziune a γ-ciclodextrinelor cu lupeol şi formulărilor acestora este indicată folosirea de metode neinvazive (Mexametrie, TEWAmetrie etc.) care vor reda rapid şi exact degradarea cutanată.

6. Se recomandă folosirea unor tipuri de complecşi de incluziune a γ-ciclodextrinelor cu lupeol care conferă putere de penetrare similară atunci când se testează cedarea principiului activ prin membrană celulozică sau piele de animal.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

22. Căpitănescu AA, Kyritsis G (2007) Cercetarea pe animale - intre necesitate si abuz. Revista Română de bioetică 3(2). Disponibil la adresa: http://www.bioetica.ro/ bioetica/ie2/info.jsp?item=9830&node=1475. Accesat în 02.X.2011.

24. Chatterjee P, Kouzi SA, Pezzuto JM, Hamann MT (2000) Biotransformation of the antimelanoma agent betulinic acid by Bacillus megaterium ATCC 13368. Applied and Environmental Microbiology 66(9), 3850-3855.

26. Cichewicz RH, Kouzi SA (2004) Chemistry, biological activity and chemoterapeutic potential of betulinic acid for the prevention of treatment of cancer and HIV infection. Medicinal Research Reviews 24(1), 90-114.

51. Fromming HK, Szejtli J (1993) Cyclodextrins in Pharmacy, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.

106. Loftsson T, Hreinsdottir D, Masson M (2005) Evaluation Of Cyclodextrin Solubilization Of Drugs. Int. J. Pharm. 302(1-2), 18-28.

107. Loftsson T (2010) What are cyclodextrins? Disponibil la adresa: http://www. eurocdsoc.com. Accesat în 02.X.2011.

112. Martin Del Valle EM (2004) Cyclodextrins And Their Uses: A Review, Process Biochemistry 39(9), 1033-1046.

115. Mosman T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63.

120. Nihal M, Ahmad N, Mukhtar H, Wood GS (2005) Anti-proliferative and proapoptotic effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on human melanoma: possible implications for the chemoprevention of melanoma. Int. J. Cancer 114, 513-521.

42

121. Niham N, Prasad S, Shukla Y (2007) Preventive effects of lupeol on DMBA induced DNA alkylation damage in mouse skin. ScienceDirect 45, 2331-2335.

122. Nikiema JB, Vanhaelen-Fastre R, Vanhaelen M, Fontaine J, De Graef C, Heenen M (2001) Effects of anti-inflammatory triterpenes isolated from. Leptadenia hastata latex on keratinocyte proliferation. Phytother Res. 15, 131-134.

131. Poon KaH (2004) Betulinic acid enhances 1α,25-dihydroxyvitamin D3-induced differentiation in human HL-60 promyelocytic leukemia cells. Anti-Cancer Drugs 15, 619-624.

132. Popovici I, Lupuleasa D (2011) Tehnologie farmaceutică. Vol. 1. Ed. Polirom, Iaşi.

138. Ramadoss S, Jaggi M, Siddiqui MJA, Khanna AB (1999) Use of betulinic acid derivatives for inhibiting cancer growth, US Patent 6214814.

139. Raughuvar Gopal DV, Narkar AA, Badrinath Y, Mishra KP, Joshi DS (2005) Betulinic acid induces apoptosis in human chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K-562 without altering the levels of Bcr-Abl. Toxicology Letters 155, 343-351.

140. Recio MC, Giner RM, Manez S (1995) Investigations on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas. Planta Med. 61, 9-12.

141. Ribatti D, Djonov V (2011) Angiogenesis in development and cancer today. Int J Dev Biol. 55(4-5), 343-344.

144. Ryu SY, Oak MH, Yoon SK (2000) Anti-allergic and antiinflammatory triterpenes from herb of Prunella vulgaris. Planta Med. 66, 358-360.

145. Saeed MA, Sabir AW (2002) Irritant potential of triterpenoids from Ficus carica leaves. Fitoterapia 73, 417-420.

153. Salti GI (2001) Betulinic acid reduces ultraviolet-C-induced DNA breakage in congenital melanocytic naeval cells:evidence for a potential role as a chemopreventive agent. Melanoma Research 11, 99-104.

158. Selzer E (2000) Effects of Betulinic Acid alone and in combination with irradiation in human melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 114, 935-940.

167. Szejtli J (1982) Cyclodextrins And Their Inclusion Complexes, Akademiai Kiado, Budapesta.

168. Szejtli J (1992) The Properties And Potential Uses Of Cyclodextrin Derivatives. J. Incl. Phenom. 14(1) 25-36.

169. Szejtli J (1998) Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry. Chem. Rev. 98(5): 1743-1754.

171. Şoica CM, Dehelean CA, Ordodi V, Antal D, Vlaia V (2008b) Complexation with hydroxipropilgamma cyclodextrin of birch tree extract. Physico-chemical characterisation of their binary products. Revista de Chimie 59(6), 678-681.

172. Şoica CM, Peev CI, Ciurlea S, Ambrus R, Dehelean CA (2010) Physico-chemical and toxicological evaluations of betulin and betulinic acid interactions with hydrophilic cyclodextrins. Farmacia 58(5), 611-619.

174. Takada Y şi Aggarwal BB (2003) Betulinic acid suppressed carcinogen-induced NF-kB activation through inhibition of IkBαkinase and p65 phosphorylation: abrogation of cyclooxygenase-2 and matrix mettaloprotease-9. The Journal of Immunology 171, 3278-3286.

43

180. Valanzano A (2004) Rules of good practice in the care of laboratory animals used in biomedical research. Ann Ist Super Sanità 40(2), 201-203.

182. Yafan Li Y, Wheeler DL, Ananthaswamy HN, Verma AK, Oberley TD (2007) Differential Tumor Biology Effects of Double-Initiation in a Mouse Skin Chemical Carcinogenesis Model Comparing Wild Type versus Protein Kinase Cepsilon Overexpression Mice. Toxicol Pathol 35(7), 942-951.

183. Yamashita K (2002) Effect of three triterpenoids, lupeol, betulin, betulinic acid on the stimulus-induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in human neutrophils. Clinica Chimica Acta 325, 91-96.

184. Yanamandra N (2003) Triterpenoids from Glycine max decrease invasiveness and induce caspase-mediated cell death in human SNB19 glioma cells. Clinical and Experimental Metastasis 20, 375-383.

185. YingMeei T, Rong Y, Pezzuto JM (2003) Betulinic acid-induced programmed cell death in human melanoma cells involves mitogen-activated protein kinase activation. Clinical Cancer Research 9, 2866-2875.

186. Yu Z, Cui M, Yan C, Song F, Liu Z, Liu S, Zhang H (2010) Gas phase isomeric differentiation of oleanolic and ursolic acids associated with heptakis-(2,6-di-O-methyl)-beta-cyclodextrin by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, J. Mass Spectrom. 45(4), 444-450.

187. Yuspa SH (1994) The pathogenesis of squamous cell cancer: lessons learned from studies of skin carcinogenes. Cancer Res. 54, 1178–1189.

188. Zdzisinska B (2003) Differential effect of betulin an dbetulinic acid on cytokine production in human whole blood cell cultures. Pol. J. Pharmacol. 55, 235-238.

189. Zuco V (2002) Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Lett. 175(1), 17-25.

190. Wada S, Iida A, Tanaka R (2001) Triterpene constituents from the stem barks of Pinus luchuensis and their DNA topoisomerase II inhibitory effect. Planta Med 67, 659-664.

196. *** Animal Welfare Act - produced by Ministry of Agriculture 2009, Government Offices of Sweden.

198. *** Information, regulation and instruction - Wenner-Gren Insitute, Animal House. Disponibil la adresa: http://www.wgi.su.se/pub/jsp/polopoly.jsp?d=11885. Accesat în 02.X.2011.

199. *** Legea 276/33. DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes, Official Journal of the European Union.

200. *** Legea 305/685/2006. Lege privind ratificarea Convenţiei europene pentru protecţia animalelor vertebrate utilizate în experimente şi alte scopuri ştiinţifice, adoptate la Strasbourg la 18 martie 1986, şi a Protocolului de amendare a Convenţiei europene pentru protecţia animalelor vertebrate utilizate în experimente şi alte scopuri ştiinţifice, adoptată la Strasbourg la 22 iunie 1998, semnate de România la 15.II.2006. Monitorul Oficial Nr. 168-169 , art. Nr : 762.

208. ***, Wistar rat. Disponibil la adresa: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Wistar_rat.jpg. Accesat în 02.X.2011.

44

LISTA LUCR ĂRILOR PUBLICATE

DIN TEZA DE DOCTORAT

1. Crăciun (Redeş) Lavinia, Dehelean C, Şoica CM, Ciurlea S, Peev C, Aigner Z (2008) Preliminary studies regarding lupeol hydrosolubility and interventions on it’s in vitro efficacy/ noxious activity. Timişoara Medical Journal (TMJ) 58(2), 379-383.

2. Dehelean CA, Muresan A, Ciurlea S, Ionescu D, Peev CI, Soica CM, Crăciun (Redeş) Lavinia (2009) Evaluări toxicologice pentru 7,12-dimetilbenzantracen ca promotor tumoral in melanomul experimental. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. 113(2), 99-103.

3. Ciurlea S, Ionescu D, Crăciun (Redeş) Lavinia, Soica CM, Peev CI, Popovici I (2010) Lupeol, a pentacylcic triterpene that reduces the lesions and irritability on murine skin and is effective on in vitro tumor models. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 16(4), 427-432.

4. Feflea S, Peev CI, Tiulea C, Ambrus R, Ionescu D, Crăciun (Redeş) Lavinia, Dehelean CA (2010) The antiinflammatory activity of lupeol applied in a topical formulation on an experimental model (poster), International Workshop: Drugs from Nature Targeting Inflammation, April 8-10, Innsbruck, Austria.

5. Crăciun (Redeş) Lavinia, Munteanu M, Ionescu D, Şoica C, Peev C, Ambrus R, Kása jr. P, Popovici I (2010) New types of cyclodextrin complexes with lupeol and their in vitro behaviour. Conferinţa doctoranzilor, Tg. Mureş, iulie 2010.

6. Crăciun (Redeş) Lavinia, Ionescu D, Kaycsa A, Ciurlea S, Borcan F, Rădoi B, Popovici I (2011) Lupeol as anti-inflammatory compound tested on Balb/c - TPA Model. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 17(2), 157-162.

7. Crăciun (Redeş) Lavinia, Borcan F, Ionescu D, Ambrus R, Galuşcan A, Popovici I (2011) Synthesis and characterization of a polyurethane transdermal carrier for lupeol. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies (JAPT) 3.

CURRICULUM VITAE

Nume: REDEŞ (căsătorită CRĂCIUN ) Prenume: LAVINIA – MIRELA Data şi locul naşterii: 24 Septembrie 1973, Arad Domiciliul: B-dul Revoluţiei, bl. 1, et. 7, ap. 25, Arad, România

Tel. 0722.688.273

I. FUNCŢII ŞI SPECIALIZ ĂRI

1. 1992 – am absolvit cursurile liceale ale Liceului „Moise Nicoară” din Arad, secţia Filologie.

2. 1996 – absolventă a Facultăţii de Farmacie din cadrul Universităţii de Vest „Vasile Goldiş” din Arad, licenţiată la Universitatea de Medicină şi Farmacie din Târgu-Mureş.

3. În prezent lucrez ca farmacist diriginte la S.C. „OLIMPIA FARM” din Lipova, jud. Arad, şi am o vechime de 15 ani.

4. Sunt membră a Colegiului Farmaciştilor din Arad şi deţin dreptul de liberă practică şi avizul socio-profesional.

5. Masterat în „Farmacognozie, fitoterapie şi fitochimie” (2006–2007, U.M.F. Oradea). 6. 2007 – am obţinut Certificat de competenţă lingvistică de limba franceză, la Univ. „A.

Vlaicu” Arad. 7. 1995 – am obţinut o adeverinţă de operator calculator. 8. Permis de conducere categoria B. 9. Limbi străine: franceză, engleză, spaniolă – nivel mediu.

II. CURSURI DE PERFECŢIONARE

� la Universitatea „Victor Babeş” Timi şoara: - „Tendinţe în dezvoltarea tehnologiei farmaceutice” (05.2001); - „Medicina Mileniului III – TimMedica ediţia a III-a” (21-23 Nov. 2002); - „Norme GMP în industria farmaceutică” (21-24 Feb. 2003);

� la Universitatea „Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca: - „Farmacia Mileniului III – Locul şi rolul farmacistului” (17-23 Mar. 2003); - „Noile formulări farmaceutice” (04.2004, Timişoara); - „Cum tratăm riscul bolilor cardiovasculare” (04.2004, Arad); - „Necesitatea standardelor calitative în medicaţia generică” (03.2005, Arad); - Atestat ce conferă avizul socio-profesional (03.2005, Oradea); - În perioada 2005-2006 am lucrat cu 4 ore la Farmacia Spitalului de boli cronice din

Lipova; - l’Ecole d’Ete „Pathologie et Pharmacologie moleculaires. Biotechnologies” (4-16 iulie

2005, Univ. „V. Goldiş” Arad); - „Noi strategii terapeutice. Forme moderne oftalmologice” (05.2007); - Curs de formare profesională din cadrul Târgului AR MEDICA, organizat la Expo

International Arad – noiembrie 2008;

- Obţinerea Certificatului de Membru al Colegiului Farmaciştilor din România (28.11.2005);

- Înscrierea la Doctorat la U.M.F. Iaşi, în 2007, având drept coordonator pe doamna Prof. Dr. Iuliana Popovici;

- Curs postuniversitar de perfecţionare „Cardioactive Naturale”, desfăşurat la Catedra Farmacognozie-Fitoterapie a U.M.F. Cluj-Napoca, 2009;

- Cursul „Plante medicinale – recunoaştere, recoltare şi utilizare”, desfăşurat la Catedra de Botanică farmaceutică a U.M.F. Cluj-Napoca, aprilie 2010;

- Obţinerea Certificatului RBPF pentru farmacia pe care o conduc S.C. „Olimpia Farm” S.R.L.;

- Atestat de formare profesională – curs intitulat „Autentic Pharma Conference”, Timişoara, 2011;

- Evaluări toxicologice ale compuşilor terapeutici utilizând modele animale experimentale – Timişoara, 2011;

III. PARTICIP ĂRI LA MANIFEST ĂRI ŞTIIN ŢIFICE - Al 5-lea Congres de farmacologie, terapeutică şi toxicologie clinică (05.2004,

Călimăneşti - Căciulata); - Simpozion „Farmacia astăzi între promovare şi cercetare” (05.2005, Timişoara); - Al 6-lea Congres Naţional de farmacologie, terapeutică şi toxicologie clinică (06.2005,

Cluj-Napoca); - „Farmacia României în 2005” din cadrul Târgului AR MEDICA (3-5 Noi. 2005); - Simpozionul Naţional de Farmacie „Farmacia astăzi, între promovare şi cercetare” –

Timişoara, 2008; - 2nd International Conference on Gerontology – Arad, 2008; - Simpozionul „Medicamentul – de la concepere până la utilizare” – Iaşi, 2009; - Pharma Forum, Timişoara, 2010; - A 3-a Conferinţă a doctoranzilor – Târgu-Mureş, iulie 2010; - „Aprecieri toxicologice asupra unor compuşi terapeutici cu potenţial nociv la nivel

cutanat” – Timişoara, 2010; - „Produse naturale cu acţiune la nivel cutanat” – U.M.F. Cluj-Napoca, ianuarie 2011; - Congresul Internaţional Timmedica, iunie 2011; - Cosmeceuticele active în era peptidelor de mici dimensiuni – Timişoara, 2011.

IV. LUCR ĂRI PUBLICATE

1. Crăciun (Redeş) Lavinia, Dehelean C, Şoica CM, Ciurlea S, Peev C, Aigner Z (2008) Preliminary studies regarding lupeol hydrosolubility and interventions on it’s in vitro efficacy/ noxious activity. Timişoara Medical Journal (TMJ) 58(2), 379-383.

2. Dehelean CA, Muresan A, Ciurlea S, Ionescu D, Peev CI, Soica CM, Crăciun (Redeş) Lavinia (2009) Evaluări toxicologice pentru 7,12-dimetilbenzantracen ca promotor tumoral in melanomul experimental. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. 113(2), 99-103.

3. Ciurlea S, Ionescu D, Crăciun (Redeş) Lavinia, Soica CM, Peev CI, Popovici I (2010) Lupeol, a pentacylcic triterpene that reduces the lesions and irritability on murine skin and is effective on in vitro tumor models. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 16(4), 427-432.

4. Feflea S, Peev CI, Tiulea C, Ambrus R, Ionescu D, Crăciun (Redeş) Lavinia, Dehelean CA (2010) The antiinflammatory activity of lupeol applied in a topical formulation on an experimental model (poster), International Workshop: Drugs from Nature Targeting Inflammation, April 8-10, Innsbruck, Austria.

5. Crăciun (Redeş) Lavinia, Munteanu M, Ionescu D, Şoica C, Peev C, Ambrus R, Kása jr. P, Popovici I (2010) New types of cyclodextrin complexes with lupeol and their in vitro behaviour. Conferinţa doctoranzilor, Tg. Mureş, iulie 2010.

6. Crăciun (Redeş) Lavinia, Ionescu D, Kaycsa A, Ciurlea S, Borcan F, Rădoi B, Popovici I (2011) Lupeol as anti-inflammatory compound tested on Balb/c - TPA Model. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 17(2), 157-162.

7. Crăciun (Redeş) Lavinia, Borcan F, Ionescu D, Ambrus R, Galuşcan A, Popovici I (2011) Synthesis and characterization of a polyurethane transdermal carrier for lupeol. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies (JAPT) 3.

Farm. Lavinia-Mirela Redeş (căs. Crăciun)

Semnătura