REACTIA ASLO

REACTIA ASLOEchipamente si materiale necesare

1. Echipamente

incubator / baie 370C

centrifuga 3000 tur. / min.

balanta tehnica

cilindru gradat

pipete semiautomate de 200 (l si 1000 (l

pipete gradate de 2 ml si 25 ml

2. Materiale

serul de testat

solutie rivanol 0,4% solutie salina izotona (S - 014 - Prepararea solutiei saline izotone)

hematii de iepure solutie 5%

tuburi 12 / 120 mm

tuburi 16 / 160 mm

varfuri pipete automate

baloane Erlenmayer de 50 ml si 100 ml

Streptolizina O activata si liofilizata pentru a obtine 1 u combinanta in 0,5 ml reactiv rehidratat, conform indicatiilor producatorului (Institutul CantacuzinoProcedura propriu-zisa

1. Indepartarea inhibitorilor nespecifici ai SLO (( - si (- globuline) din serul de testat

Se realizeaza prin tratatrea serului de testat cu solutie de rivanol 0,4 %, prin care se realizeaza precipitarea ( - si (- globulinelor 1.1.Prepararea solutiei de rivanol 0,4% :1. Cantariti cu ajutorul balantei tehnice 400 mg rivanol si puneti-l intr-un flacon Erlenmeyer

2. Adaugati peste rivanol 100 ml apa distilata si agitati pana la dizolvare

3. Cand solutia s-a clarificat, turnati-o intr-un flacon de sticla bruna cu dop rodat

4. Pastrati solutia la temperatura camerei, ferita de lumina.

1.2.Intr-un tub 12 / 120 mm pune in contact 0,2 ml ser de testat cu 0,7 ml solutie rivanol 0,4%

1.3.Agita tubul si pastreaza la temperatura camerei 10 min, agitand din cand in cand

1.4.Dupa formarea precipitatului, adauga 1,1 ml solutie salina izotona

1.5. Centrifugheaza 10 min. la 3000 rot. / min

1.6. Supernatantul reprezinta dilutia 1 / 10 a serului de testat

2. Realizarea dilutiilor serului de testat

2.1. Obtinerea dilutiilor 1 / 100 si 1 / 500

aseaza intr-un stativ 2 tuburi 16 / 160 mm repartizeaza solutie salina izotona : 4,5 ml in primul tub si 4 ml in al 2-lea tub pentru a obtine dilutia 1 / 100 : din dilutia 1/10 a serului de testat pune 0,5 ml in tubul cu 4,5 ml solutie salina izotona pentru a obtine dilutia 1 / 500 : din dilutia 1/100 obtinuta, pune 1 ml in tubul cu 4 ml solutie salina izotona

2.2. Obtinerea dilutiilor serului de testat pentru realizarea reactiei ASLO ( schema redusa vezi Anexa 1)

aseaza intr-un stativ 5 tuburi 12 / 120 mm si numeroteazale de la 1 la 5 repartizeaza solutie salina izotona dupa cum urmeaza : - 0,6 ml in tuburile 2 si 5

- 0,4 ml in tubul 4

repartizeaza din dilutia 1 / 100: - 1 ml in tubul 1

- 0,4 ml in tubul 2

repartizeaza din dilutia 1 / 500 : - 1 ml in tubul 3

- 0,6 ml in tubul 4

- 0,4 ml in tubul 5

3. Pregatirea solutiei SLO

Rehidrateaza SLO activata si liofilizata cu solutie salina izotona sau apa distilata, conform titrului si indicatiilor de pe eticheta fiolei . Prin rehidratare 0,5 ml din acest produs contine 1 unitate combinanta

4. Repartizeaza in fiecare tub de reactie cate 0,5 ml solutie SLO, agita bine fiecare tub.5. Incubeaza tuburile la 370C pentru 15 min.

6. Prepararea suspensiei de hematii de iepure 5%

6.1. Spalarea hematiilor de iepure

Masoara, intr-o eprubeta sterila, cu pipeta gradata o cantitate de sange defibrinat de iepure

Marcheaza pe peretele eprubetei nivelul sangelui

Adauga peste sange solutie salina izotona ( la 1 vol. sange / 2 3 vol. solutie salina), noteaza nivelul de lichid obtinut si agita usor Centrifugheaza 10 min la 3000 turatii/min. Indeparteaza supernatantul (care are o culoare rosie) Adauga din nou solutie salina izotona pana la nivelul marcat Centrifugheaza 10 min la 3000 turatii/min. Indeparteaza supernatantul (care are o culoare roz) Continua in acest fel spalarea hematiilor pana cand supernatantul devine incolor (daca dupa a 4-a spalare supernatatntul nu este incolor, arunca sangele pentru ca exista riscul reactiilor fals negative) Indeparteaza supernatantul Adauga solutie salina izotona pana la nivelul initial al sangelui de iepure. Aceasta reprezinta hematiile de iepure spalate6.2.Realizarea solutiei de hematii 5%

La 1 ml de hematii de iepure spalate adauga 19 ml solutie salina izotona Pentru o cantitate mai mare - multiplica proportional hematiile de iepure si solutia salina izotona

7.Repartizeaza in fiecare tub de reactie cate 0,5 ml hematii de iepure 5% si agita bine fiecare tub.8.Incubeaza tuburile la 370C pentru 45 min.

Citirea si interpretarea rezultatelor se realizeaza dupa citirea si interpretarea martorilor ( vezi Criterii de acceptare / respingere) : prima citire imediat dupa scoaterea tuburilor de la 370C, iar citirea definitiva dupa pastrarea peste noapte la +2 ..+ 80 C a tuburilor de reactie.

Titrul, exprimat in u.i. / ml, este dat de ultimul tub in care hemoliza lipseste complet.

Titrul normal ( 200 ui / ml

6. CRITERII DE ACCEPTARE / RESPINGERE

Pentru controlul de calitate al reactiei ASLO se utilizeaza urmatorii martori :

martor SLO } vezi Anexa 1 martor hematii } vezi Anexa 1 martor ser pozitiv }

martor ser negativ } martori obtinuti in house din serurile umane testate

Se accepta reactia ASLO numai daca avem la:

martorul SLO hemoliza completa

martorul hematii absenta hemolizei

martorul ser pozitiv trebuie sa prezinte titrul pozitiv cunoscut

martorul ser negativ trebuie sa prezinte titrul negativ cunoscut

Se respinge reactia ASLO chiar daca numai unul din martori nu prezinta conditiile mai sus mentionate.REACTIA ASLO

Dilutia 1 / 100Dilutia 1 / 500Martor hematiiMartor

SLOMartor

pozitiv *Martor

Negativ*

Ser de testat

(ml)10,410,60,4--

Sol. salina

(ml)-0,6-0,40,61,51

SLO

1 u.c.

(ml)0,50,50,50,50,5-0,5

Agitare . Incubare 15 min. la 370C

Hematii

Iepure 5%(ml)0,50,50,50,50,50,50,5

Agitare . Incubare 45 min. la 370C

Titru

u.i./ml1002505008331250Absenta

hemolizaHemoliza

completaTitru cunoscut

pozitivTitru cunoscut

negativ

* Se realizeaza reactia ASLO ca la serurile de testat