Raport ştiinţific şi tehnic în extenso

Rezumatul etapei:

În cadrul acestei etape a fost realizat un studiu amplu de literatură în domeniul băuturilor

probiotice funcţionale al compuşilor biologic activi din reziduuri de industrie alimentară, urmat

de extracţia compuşilor bioactivi specifici fiecărei matrici reziduale şi metodei de investigare

utilizate în cadrul proiectului Food-Profit. Pentru cuantificarea acizilor organici prin metoda

HPLC, s-a realizat optimizarea protocolului si ulterior cuantificarea acizilor pe matricile

reziduale de mere, struguri albi, struguri roşii, morcovi, sfeclă roşie, pulpă reziduală de

portocale. Caracterizarea UV-Vis s-a realizat pe extractele efectuate astfel încât să fie

cuantificate următoarele clase de compuşi: antociani, carotenoide, polifenoli totali, flavonoide.

Mai mult, pentru a avea un spectu larg al activităţii compuşilor bioactivi a fost determinată şi

activitatea antioxidantă a acestor extrcate prin metoda DPPH. În vederea evaluării rapide a

acizilor organici care pot să provină de la o prefermentaţie nedorită în masa de reziduuri, s-a

reuşit realizarea amprenetelor şi identificarea benzilor specific pentru acizi organici ca: acidul

lactic şi acidul acetic. Monitorizarea microbiologică a dezvoltării bacteriene a împlicat realizara

acestor fermentaţii în bioreactor si realizarea de modele matematice în vederea stabilirii

condiţiilor optime de dezvoltare a celor două specii de Lactobacillus. Caracterizarea GC-MS a

acizilor graşi, s-a realizat pe extractele effectuate împreună cu cuantificarea lipidelor totale.

Practic, fiecare activitate precizată în planul de realizare al proiectului Food-Profit a fost

îndeplinită iar inducatorii minim stabiliţi au fost depăşiti prin activităţile de diseminare efectuate.

Activitatea 1.1. Studiu de literatură în domeniul băuturilor probiotice funcţionale, al

compuşilor bioctivi din reziduuri de mere, sfeclă zahăr, portocale, struguri.

Probioticele furnizează o serie de beneficii asupra sănătăţii prin menţinerea unei

microflore intestinale normale, prin protejarea împotriva patogenilor gastrointestinali (D’Aimmo

şi colab., 2007) prin creşterea imunităţii (Gilliland, 1990) prin reducerea nivelului de cholesterol

şi a tensiunii sangvine (Rasic, 2003) prin activitatea anti-carcinogenică (Rasic, 2003) mărind

utilizarea de nutrienţi şi crescând valoarea nutritive a alimentelor (Lourens-Hattingh şi Viljoen,

2001; Tripathi şi Giri, 2014).

1

Consumul de probiotice prin ingerarea produselor alimentare este cea mai populară

modalitate de consum, în prezent, a probioticelor. Majoritatea produselor alimentare probiotice

sunt considerate ca alimente funcţionale şi reprezintă o însemnată parte din ele. Cerinţa globală

pentru produsele funcţionale creşte rapid ca urmare a gradului de conştientizare mare a

consumatorilor. Piaţa globală a alimentelor şi băuturilor funcţionale a crescut de la 33 bilioane $

în 2000 la 176.7 bilioane de $ în 2013 ceea ce reprezintă un procent de 5% din întreaga piaţă

alimentară fiind cea mai continua creştere din întreag segmental alimentar (Granato şi colab.,

2013; Tripathi şi Giri, 2014). Mai mult de 500 de produse alimentare probiotice au fost introduse

pe piaţă în ultimele decade (Sveje, 2007), iar lista se află în continua expansiune. Produsele

alimentare probiotice realizate prin fermentarea cerealelor, fructelor şi legumelor (sucuri, snack-

uri, fructe porţionate) dar şi produse din carne (suncă, cârnaţi) primesc în acest moment atenţie

atât din partea consumatorilor cât şi din partea cercetătorilor (Gupta şi Abu-Ghannam, 2012;

Rouhi şi colab .,2013).

Microincapuslarea este procesul care concentrează celulele bacteriene prin

invelirea/acoperirea lor cu o substanţă propice printr-o metodă optimă, care să permită eliberarea

lor controlată în mediul intestinal (Mortazavian şi colab., 2008). Matricele utilizate pentru

încapsularea celulelor probiotice include diferite tipuri de polizaharide cum sunt: alginat, gume

din plante/microbiene, chitosan, amidon, k-caragenan, gelatină, protein din lapte şi grăsimi

(Burgain şi colab., 2010). Multe studii de literatură arată potenţialul microîncapsulării ca tehnică

de îmbunătăţire a viabilitatii bacteriene pe perioada procesării, a depozitării alimentelor şi pe

durata expunerii lor condiţiilor gastrointestinale (Anal şi Singh, 2007; Vodnar şi Socaciu 2014).

Studiile de literatura existente prezintă diferite tehnici de microîncapsulare precum şi diferite

variante de microcapsule.

În prezent, există dovezi de utilizare a pre, pro și simbioticelor in profilaxia multor

afecţiuni. În domeniul gastroenterologiei, acestea sunt utilizate în sindromul intestinului iritabil,

în boli inflamatorii intestinale, boala diverticulară, și in eradicarea infecției cu Helicobacter

pylori. Sindromul de colon iritabi (SCI) este o tulburare funcţional gastrointestinală care

afectează 10-15% din populaţia adultă din țările industrializate. În scopul de a produce beneficii

terapeutice, probioticele ingerate trebuie să supraviețuiască expunerii mediul gastrointestinal

ajungând în colon în cantități mari, asfel încat să faciliteze colonizarea și să exercite efectul

2

benefic asupra gazdei. A fost recomandat ca alimentele probiotice să conțină cel puțin 107 UFC /

ml, în momentul consumului (Kim și colab, 2008).

O problemă majoră cu care se confruntă industria agro-alimentară, în ţările dezvoltate şi

în curs de dezvoltare este reprezentată de gestionarea deșeurilor. Cantități mari de deșeuri,

lichide și solide sunt produse anual de industria de prelucrare a produselor alimentare.

Reziduurile solide provenite din industria vinului, includ, resturi de fructe, chiorchini, și

reprezintă, în medie, aproape 30% (g/g) din strugurii utilizați la producerea vinului. Toate aceste

subproduse conţin componenţi fenolici (Gonzalez-Paramas şi colab., 2004). Recent, nu numai

subprodusele de la vinificatie, ci si o serie de alte deșeuri agricole de origine vegetală au atras

atenția considerabilă ca surse care conţin compuşi fenolici şi care pot fi utilizaţi în diverse

scopuri. Cu toate acestea, în multe cazuri există o carenţă semnificativă de studii de fezabilitate

corespunzătoare cu privire la exploatarea unor astfel de reziduuri, și, ca rezultat utilizarea lor

este încă în fază incipientă. Fructele si legumele sunt surse bogate in fibre. Subprodusele din

industria fructelor și legumelor, sunt de interes, deoarece acestea sunt ieftine și disponibile în

cantități mari. Unele dintre subprodusele agricole, cum ar fi mere, citrice, într-adevăr au fost deja

utilizate în producerea de fibre alimentare (Figuerola şi colab, 2005;. Grigelmo-Miguel și

Martin-Belloso, 1999). În consecință, datorită compușilor lor chimici, reziduurile de mere,

morcovi, sfeclă de zahăr, portocale stoarse și struguri sunt utilizate în acest studiu. Această

activitate a fost realizată in totalitate şi reprezintă o activitate continuă pe întreaga durată a

proiectului.

Activitatea 1.2. Extracţia componentelor bioactive din reziduuri de mere, sfeclă zahar,

portocale, struguri

Extracţia compuşilor bioactive s-a realizat specific pentru fiecare metodă în parte. Astfel,

pentru determinarea carotenoidelor totale; reziduurile de portocală şi morcov, s-au supus

extracţiei repetate cu un amestec de solvenţi acetat etil/metanol/eter petrol în proporţie de 1/1/1

(v/v/v); pentru determinarea antocianilor totali : reziduurile de struguri negri şi sfecală roşie, s-

au supus extracţiei repetate cu metanol acidulat cu 1% HCl concentrat. Pentru determinarea

acizilor ogranici pentru HPLC acizii organici din probe s-au extras cu apa bidistilată prin

vortexare 30secunde, sonicare 15 minunte şi centrigugare 10 min la 2000 rot/min. Lipidele totale

3

pentru analiza GC-MS s-au extras prin metoda Folch (metanol/chloroform, 1/2) descrisă detaliat

de Dulf şi colab., 2013.

Pentru identificarea/dozarea polifenolilor totali, flavonoidelor totale şi a activităţii

antioxidante s-a utilizat următorul protocol de extracţie: s-a cântărit la balanţa analitică 1g probă

peste care s-a adăugat 10 ml solvent de extracţie, 1 % HCl în metanol. Probele au fost, sonicate

30 minute, centrifugate 15 minute cu 3000 rot/min si filtrate. Extractele obtinute s-au pastrat la

congelator până la momentul utilizării. Această activitate a fost realizată in totalitate conform

planului de realizare.

Activitatea 1.3. Optimizarea protocoalelor HPLC in vederea separării acizilor organici din

extractele rezultate

Soluţia stoc de standarde a acizi organici s-a preparat prin amestecarea a 20 µl soluţie

acid oxalic 300 mg/l, acid tartaric 1000 mg/l, acid malic 2000 mg/l, acid ascorbic 300 mg/l, acid

citric 2000 mg/l şi acid fumaric 100 mg/l. S-au utilizat acizi organici standard de provenienţă

Merck. Pentru separarea acizilor organici s-a utilizat coloana cromatografică cu faza inversă

Acclaim OA 5 µm, 4x150 mm Dionex, care a fost eluată, timp de 10 min, cu faza mobilă

NaH2PO4 50mM adusă la pH=2,8 cu H3PO4. Separarea HPLC s-a efectuat in sistem isocratic la

100 C iar cromatogramele s-au inregistrat la λ=210 nm. Conform cu figura 1, au fost separaţi

următorii acizi organici: 1-oxalic tR =2,37 min; 2-tartaric tR=2,59 min; 3-malic tR =2,90 min; 4-

ascorbic tR =3,17 min; 5-citric tR =4,12 min; 6-fumaric tR =5,65 min.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Abso

rbanta

(mAU

)

Timp de retentie (min)

1

23

4

5

6

Fig.1. 1-acid oxalic tR =2,37 min; 2- acid tartaric tR=2,59 min; 3- acid malic tR =2,90 min; 4- acid

ascorbic tR =3,17 min; 5- acid citric tR =4,12 min; 6- acid fumaric tR =5,65 min

4

Activitatea 1.4 Caracterizarea UV-Vis a clorofilelor, carotenoidelor şi antocianilor

Determinare carotenoide totale: Carotenoidele totale s-au determinat prin metoda spectrofoto-

metrică, s-a utilizat Spectrofotometru UV-Vis cu dublu fascicol, model Jasco V 530. S-au

înregistrat spectrele de absorbţie UV-Vis pe domeniul de lungimi de undă 600-300 nm (Figura

2,3) şi s-a calculat cantitatea de carotenoide totale pe baza relaţiei de calcul :

X = (A x V x 1000 x Fd)/(m x 2500 x 100)

X= cantitatea de carotenoide din probă (mg); A= absorbanţa probei citită la λmax = 450 nm; V=

volumul final al extractului (ml); Fd=factorul de diluţie; m=masa probei (g); 2500= coeficient de

absorbţie molar (E1%) pentru carotenoide.

Fig.2. Spectrul de absorbţie UV-Vis la reziduul de portocală A438 =0,5686

Fig.3. Spectrul de absorbţie UV-Vis la reziduul morcov A448 =0,7711

Tabel 1. Carotenoide totale

Nr. crt. Denumire Reziduu mg/100g 1. Portocală 3,42 ±0.2 2. Morcov 14,19 ±0.6

Determinare antociani totali Antocianii totali s-au determinat prin metoda spectrofotometrică , cu ajutorul Spectrofotometru-

lui UV-Vis cu dublu fascicol, model Jasco V 530.S-au înregistrat spectrele de absorbţie UV-Vis

pe domeniul de lungimi de undă 700-220 nm şi s-a calculat (Fig 4,5) cantitatea de antociani totali

pe baza relaţiei de calcul :

-0.1

1

0

0.5

350 600400 500

Abs

Wavelength [nm]

-0.1

0.8

0

0.2

0.4

0.6

300 600400 500

Abs

Wavelength [nm]

5

Y = (A x V x Fd)/(m x 850)

Y= cantitatea de antociani din probă (mg); A= absorbanţa probei cititită la λmax = 535 nm; V=

volumul final al extractului (ml); Fd=factorul de diluţie; m=masa probei (g); 850= coeficient de

absorbţie molar (E1%) pentru antociani

Fig.4. Spectrul de absorbţie UV-Vis la reziduul de struguri negri. A536 =0,5415

Fig.5. Spectrul de absorbţie UV-Vis la reziduul

de Sfecla roşie. A535 =0,4564; A480 =0,3981

Tabel 3. Antociani totali

Nr. crt. Denumire proba Antociani totali (mg/100g) 1. Struguri negri 22,30 ± 1.5 2. Sfeclă roşie 3,66 ± 0.3

Identificarea compuşilor fenolici din spectrul Uv-Vis. S-au înregistrat spectrele Uv-Vis (fig 6-

11) pe domeniul 400 nm-220nm, faţă de metanol acidulat cu HCl ca martor, compuşii fenolici

prezentând un maxim de absorbţie în regiunea 270-280 nm (Tabel 2). S-a utilizat

Spectofotometrul UV-Vis cu dublu fascicol, Jasco V 530. Pentru probele reziduale: de măr,

morcov, portocală, sfeclă roşie, struguri albi s-a efectuat diluţia de 1:10, pentru proba de struguri

negrii s-au efectuat măsurătorile pe diluţie de 1:100. Diluţiile s-au realizat cu metanol acidulat

cu HCl.

-0.1

0.8

0

0.2

0.4

0.6

260 700400 500 600

Abs

Wavelength [nm]-0.1

0.5

0

0.2

0.4

220 700300 400 500 600

Abs

Wavelength [nm]

6

Fig.6 Spectrul Uv-Vis pentru proba reziduală de Măr

Fig.7 Spectrul Uv-Vis pentru proba reziduală de Morcov

Fig.8 Spectrul Uv-Vis pentru proba reziduală de Portocală

Fig.9 Spectrul Uv-Vis pentru proba reziduală de Struguri albi

Fig.10. Spectrul Uv-Vis pentru proba reziduală de Struguri negrii

Fig.11. Spectrul Uv-Vis pentru proba reziduală de Sfeclă roşie

0

1

0.2

0.4

0.6

0.8

220 400250 300 350

Abs

Wavelength [nm]

0

1

0.2

0.4

0.6

0.8

220 400250 300 350

Abs

Wavelength [nm]

0

1

0.2

0.4

0.6

0.8

220 400250 300 350

Abs

Wavelength [nm]

0

1

0.2

0.4

0.6

0.8

220 400250 300 350

Abs

Wavelength [nm]

0

1

0.2

0.4

0.6

0.8

220 400250 300 350

Abs

Wavelength [nm]

0

1

0.2

0.4

0.6

0.8

220 400250 300 350

Abs

Wavelength [nm]

7

Tabel 4. DO 280 nm măsurate pentru determinarea compuşilor fenolici din probele reziduale

Denumire probă reziduală Dilutia folosită DO 280 nm Măr 1:10 0,36529 Morcov 1:10 0,38468 Portocale 1:10 0,92752 Struguri albi 1:10 0,7607 Struguri negrii 1:100 0,32907 Sfeclă roşie 1:10 0,53575

Dozarea polifenolilor totali ( Metoda Folin-Ciocalteu). Cantitatea totală de polifenoli s-a

exprimat în raport cu o curbă de etalonare cu acid galic de diferite concentraţii : 1mg/100 ml; 0,5

mg/100 ml; 0,25 mg/100 ml; 0,125 mg/ml şi 0,0625 mg/ml. Pentru trasarea curbei de etalonare

se reprezintă grafic absorbanţele citite în funcţie de concentraţia de acid galic. Protocolul de

lucru pentru placute cu 24 locuri, cu un volum de 3 ml 2,350 ml apă distilată, 0,05 ml probă,

0,150 ml reactiv Folin-Ciocîlteu şi 0,450 ml Na2CO3 au fost adăugaţi pe placuţa de lucru; pentru

proba martor cei 0,05 ml de probă au fost inlocuiţi cu 0,05 ml etanol 80%; dupa 2 ore la intuneric

s-au citit placuşele de lucru la spectrometrul multidetectie Biotek.

Determinarea Activitaţii Antioxidante ( Metoda DPPH). Reacţia dintre DPPH şi antioxidanţii

din extracte a fost monitorizată cu ajutorul unui spectrometru BIOTEK la 515 nm. Soluţia de

metanol a fost folosită ca şi blank, apoi 2,8 ml DPPH şi 400 µl probă au fost utilizate pentru

fiecare determinare, absorbanţa fiind înregistrată la T30 (dupa 30 minute). Curba de calibrare a

fost realizată cu Trolox, utilizând diferite diluţii (500µM, 250µM, 125 µM pina la 3,95µM) şi

apoi s-a înregistrat absorbanţa pentru probele aflate în studiu. Protocolul de lucru pentru placuţe

cu 24 godeuri. 80 µM DPPH au fost dizolvaţi in metanol 98%. Soluţia stoc de DPPH a fost

preparată proaspat , sonicată 15 minute şi pastrată la intuneric la temperatura camerei; 250 µl

probă şi 1750 µl soluţia DPPH au fost adăugate pe placuţa de lucru; proba martor conţine 1750

µl DPPH şi 250µl metanol; după 30 minute se citeşte aborbanţa la 515 nm faţă de metanol.

Soluţia DPPH se decolorează de la violet la galben în prezenţa unui donor de hidrogen,

stabilindu-se gradul de inhibare a radicalilor liberi (I%).

8

Tabel 5. Rezultatele determinării activităţii antioxidante şi determinării flavonoidelor totale

Denumire probă

reziduală

Mg Gallic Acid

Eq/100 g probă

Mg QUE Eq/100g probă

F (mM Trolox/ 100 g probă)

% Inhibiţie

Măr 82,817 33,395 6,673 37

Morcov 18,442 5,974 6,643 37

Portocală 100,033 7,372 6,992 37

Struguri Albi 318,217 173,590 5,859 34

Struguri Negrii 681,754 54,579 7,008 94

Sfeclă roşie 113,497 53,265 6,652 41

Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare.

Activitatea 1.5 Cuantificarea acizilor organici prin HPLC, FTIR şi monitorizarea

microbiologică a cultivării bacteriilor în bioreactor

Determinarea HPLC a acizilor organici s-a realizat conform cu protocolul prezentat în cadrul

activităţii 1.3. Conform figurilor 12-17, au fost identificaţi acizii organici şi cunatificaţi pentru

fiecare material residual utilizat (Tabel 6)

Tabel 6. Cantitatea de acizi organici, exprimată in mg/100g

Acid organic

Proba reziduală (mg%) Măr Morcov Portocală Sfeclă

roşie Struguri

albi Struguri

negri Oxalic 12,58 26,30 30,05 63,02 46,13 68,10 Tartaric 21,05 149,82 121,76 5105,61 239,24 611,50 Malic 218,02 141,17 277,49 0,00 313,70 221,40

Ascorbic 0,00 3,34 23,63 0,00 5,87 12,43 Citric 25,60 19,61 509,55 0,00 28,35 60,44

Fumaric 0,01 4,58 0,96 0,00 0,49 1,06

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

50

100

150

200

250Ab

sorb

anta

(mAU

)

Timp de retentie (min)

1

2

3

5 6

Fig.12. Cromatogramă Măr: peak 1- ac. oxalic; 2- ac. tartaric; 3- ac. malic; 5- ac. citric; 6- ac. fumaric

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

50

100

150

200

250

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)

1 2

3

4 5

6

Fig.13. Cromatogramă Morcov: peak 1- ac. oxalic; 2- ac. tartaric; 3- ac. malic; 4- ac. ascorbic; 5- ac. citric; 6- ac. fumaric

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)

1

2 3

4

5

6

Fig.14. Cromatogramă Portocală: peak 1- ac. oxalic; 2- ac. tartaric; 3 ac. -malic; 4- ac. ascorbic; 5- ac. citric; 6- ac. fumaric

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

200

400

600

800

1000

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)

1

2

Fig.15. Cromatogramă Sfeclă roşie: peak 1- ac. oxalic; 2- ac. tartaric

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

100

200

300

400

500

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)

12

3

45 6

Fig.16. Cromatogramă Struguri albi: peak 1- ac. oxalic; 2- ac. tartaric; 3- ac. malic; 4- ac. ascorbic; 5- ac. citric; 6- ac. fumaric

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)

1

2

345 6

Fig.17. Cromatogramă Struguri negri: peak 1- ac. oxalic; 2- ac. tartaric; 3- ac. malic; 4- ac. ascorbic; 5- ac. citric; 6- ac. fumaric

10

Inregistrări FTIR. Spectrele FTIR au fost înregistrate cu ajutorul echipamentului Schimatzu IR

Prestige- 21 spectrometru. Fiecare spectru a fost înregistrat în intervalul 4000 to 500 cm-1.

Spectrele FTIR au fost înregistrate pentru cuantificarea acizilor lactic si a acidului acetic. Pentru

fiecare probă s-au realizat 3 citiri la temperature camerei. Fiecare spectru este compus din 128 de

scanări separate. Timpul de măsurare a fost aproximativ 9 minute/probă (n = 3). Spectroscopia

FTIR reprezintă o metodă non-distructivă, uşor de utilizat şi care este utilizată în prezentul

proiect ca metodă rapidă de amprentare a acizilor organici de interes. Pentru aceasta au fost

realizate măsurători pentru acidul lactic si acidul acetic. Figura 18 si 19 prezintă spectrele

înregistrate. Banda specifică pentru acidul lactic este la 1112 cm-1; in timp ce acidul acetic

prezintă o bandă specifică la 1709 cm-1.

Fig 18. Spectrele FTIR ale acidului acetic

Fig 19. Spectrele FTIR ale acidului lactic

11

În vederea cultivării bacteriilor probiotice Lactobacillus casei şi Lactobacillus plantarum in

bioreactor (Electrolab, Fermac 310) s-au utilizat urmatorul protocol:

Prepararea inoculului. Lactobacillus plantarum ATTC 8014 şi Lactobacillus casei ATCC 393,

au fost utilizaţi în acest studiu. Bateria a fost păstrată pe mediu agar înclinat cu compoziţia: 10 gl-

1 extract de drojdie, 20 gl-1 peptonă, 20 gl-1 agar şi 20 gl-1 glucoză. În vederea cultivării

inoculului bacteria fost cultivată 20 de ore într-un vas Erlenmeyer de 400ml cu volum de lucru

de 180ml, cu agitare continuă 100 rpm, la 30ºC. Mediul de cultură utilizat a fost MRS (creat de

Man, Rogosa şi Sharpe) bulion (Sifin, Germania).

Condiţii de fermentaţie. Fermentaţiile au rulat la temperatura de 37°C, cu agitare de 180 rpm, în

condiţii anaerobe, în bioreactor (volum de 2.9 L) Fermac 360 (bioreactor) echipat cu unitate

digitală de control. Valoarea pH (5-7) a fost ajustată cu ajutorul soluţiei de NaOH (20%) ca agent

de corecţie. A fost monitorizată dinamica de creştere optima pentru cele două bacterii în spectrul

de pH de 5-7. Vasul bioreactorului a fost sterilizat la 121ºC pentru 30 minute.

Monitorizarea microbiologică: Din vasul de fermentaţie s-au prelevat probe (aseptic) cu ajutorul

instrumentelor specific bioreactorului. 1mL din proba prelevată a fost utilizat la inglobarea in

mediu MRS agar, care a fost incubat la 37 ºC pentru 24 de ore. După această perioadă coloniile

au fost numerate.

Monitorizarea bimasei formate. 5 mL din proba de analizat au fost centrifugati, peletul spălat si

apoi descărcat în fiole specific pentru determinarea gravimetrică a biomasei.

Cantitate de biomasă formată pe perioada fermentaţiei lui L.plantarum este prezentată în figura

2. La pH 6 se înregistrează o cantitate de biomasă cuprinsă între 7.5-8 g/L. Rezultatele obţinute

în cazul lui L.casei sunt apropiate de cele prezentate în figura 3. Prin urmare, L.casei a acumulat

la pH 6 o cantitate de 7.4-7.6 g/L de biomasă.

După cum se observă în figura 20 L. plantarum s-a dezvoltat in concentraţiile cele mai mari de

20*109 ufc/ml la pH 6. Rezultate asemănătoare au fost obţinute şi pentru L.casei; prezentând la

pH6 o concentraţie bacteriană de 19*109 ufc/ml (figura 21). Această activitate a fost realizată in

totalitate conform planului de realizare.

12

Fig 20. Monitorizarea viabilităţii L.plantarum la variaţii de pH

Fig. 21. Concentraţia de biomasă produsă de L. plantarum in mediu model MRS

5

6

7

0

3

6

9

12

15

18

21

30 35 40 45

pH Num

arul

tota

l de

celu

le [N

*109

/ml]

Temperatura [°C]

18-21 15-18 12-15 9-12 6-9 3-6 0-3

55.5

66.5

7

44.5

55.5

66.5

77.5

88.5

30 35 40 45

pH Con

cent

ratia

de

biom

asa

[g/l]

Temperatura [°C] 8-8.5 7.5-8 7-7.5 6.5-7 6-6.5 5.5-6 5-5.5 4.5-5 4-4.5

13

Activitatea 1.6. Diseminarea rezultatelor

Diseminare ştiinţifică:

Participări la Conferinţe: 13th International Symposium PROSPECTS FOR 3rd MILLENNIUM

AGRICULTURE, Cluj Napoca, 2014 Romania,2014.

Prezentare orală: Molecular cocktails fortified with bioactive compounds and microencapsulated

probiotic bacteria, Mihaela Ancuţa Moldovan, Dan Cristian Vodnar*, Oana Lelia Pop, Carmen

Socaciu; http://symposium.usamvcluj.ro/Symposium%20program.pdf

Poster: Food with role in increasing serotonin levels. Lucia Andrada Toma, Dan Cristian Vodnar,

Oana Lelia Pop,Carmen Socaciu. http://symposium.usamvcluj.ro/Symposium%20program.pdf

Publicaţii:

Fruits bioactive compounds characterization from a new functional food product. Valentina

Mariana Rus, Francisc Vasile Dulf, Carmen Socaciu, Oana Lelia Pop, Floricuţa Ranga,Dan

Cristian Vodnar*. trimis spre publicare la Notulae Scientia Biologicae.

Diseminare media:

Sucuri din resturi alimentare- Digi TV

O bautura revolutionara se fabrica in laboratoarele Clujului: sucul din coji de fructe si legume, cu

bacterii probiotice- Ziar de Cluj

Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare.

Activitatea 1.7. Caracterizarea GC-MS a lipidelor (omega-3, omega-6, omega-9, fitosteroli)

Lipidele totale s-au extras prin metoda Folch (metanol/chloroform, 1/2) descrisă detaliat de Dulf

şi colab., 2013. Lipidele toatale au fost exprimate pe 100 g reziduu conform cu figura 22.

Analiza acizilor graşi. Esterii metilici (FAMEs) ai acizilor graşi obţinuţi în urma

transesterificarii (folosind metanol în prezenţă de acid sulfuric, cataliză acidă), au fost analizaţi

cu ajutorul gaz comatografului (GC) cuplat cu spectrometru de masa (MS), PerkinElmer Clarus

600 T GC-MS (PerkinElmer, Inc., Shelton, CT, USA), folosind un protocol bine stabilit şi

descrisă detaliat de Dulf şi colab., 2013. Coloana folosită: Supelcowax 10 (60 m × 0.25 mm i.d.,

0.25 μm film thickness; Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA). Programul de temperatura:

temperatură iniţială, 140 °C; apoi cu 7 °C/min se ajunge la 220 °C, temperatură care în final

rămâne constantă timp de 23 min. Temperatura injectorului: 210°C; splitare 1:24. Volum

injectat: 0.5 μL. Eluent: He, 0.8 mL/min. Condiţii MS: energia de ionizare 70 eV; trap current

14

100 μA; temperatura sursei 150 °C. Intervalul de scanare a maselor m/z: 22–395, cu 0.14 scan/s

(0.02 s între scanări). Identificarea acizilor grasi: 1) pe baza timpilor de retenţie- comparare cu

timpii de retenţie ale acizilor graşi dintr-un amestec de standarde (37component FAME Mix,

SUPELCO # 47885-U); (Figura.23) 2) compararea spectrelor de masă cu cele din baza de date

MS (NIST MS Search 2.0). Concentraţiile de acizi grasi au fost exprimate in % din totalul de

acizi graşi conform cu Tabelul 7.

0.0

0.5

1.0

1.5MorcoviMarStruguri albiStruguri negri

Probe

Lipi

de to

tale

(g/1

00g

rezi

duu)

0.57

1.00

Fig. 22. Lipide totale în probele reziduale analizate

15

Morcov

Măr

Struguri albi

Struguri roşii

Fig. 23. Cromatograme GC-MS pentru identificarea acizilor graşi din reziduuri de morcov, măr,

struguri albi şi struguri roşii

12.59 17.59 22.59 27.59 32.59 37.59 42.59Time8

100

%

18:2n-6

16:0

15:0

18:1n-9

18:016:1n-7

18:3n-3

20:0 22:0 23:0

8.82 13.82 18.82 23.82 28.82 33.82 38.82 43.82 48.82Time6

100

%

18:2n-6

16:0

14:012:0

18:1n-9

18:0

16:1n-7

18:3n-3

20:022:0

21:0 24:0

8.29 13.29 18.29 23.29 28.29 33.29 38.29 43.29 48.29Time4

100

%

18:2n-6

16:0 18:1n-9

18:0

16:1n-718:3n-3 20:0

22:0 24:0

14.90 19.90 24.90 29.90 34.90 39.90 44.90Time3

100

%

18:2n-6

18:1n-9

16:0

14:0

18:0

17:0

18:3n-3

20:0 22:020:1n-9 24:0

16

Tabel 7. Cantitatea de acizi graşi identificată în reziduuri de morcov, măr, struguri albi şi struguri

roşii

Acizi grasi (%) Acizi grasi Morcov Măr Struguri albi Struguri roşii 12:0 - 0.17 - - 14:0 - 0.42 - 0.09 15:0 0.41 - - - 16:0 19.98 19.67 10.16 10.75 16:1n-9 - 0.20 0.07 0.08 16:1n-7 0.80 0.39 0.16 0.15 17:0 0.57 0.35 - 0.04 18:0 1.21 4.76 3.89 3.28 18:1n-9 3.26 9.70 12.07 19.32 18:1n-7 1.12 0.83 0.59 0.73 18:2n-6 63.89 49.46 66.30 61.87 18:3n-3 6.62 6.83 2.97 2.15 20:0 0.68 2.95 1.77 0.49 20:1n-9 - 0.26 0.14 0.22 21:0 - 0.38 - - 22:0 0.88 2.16 1.24 0.63 22:1n-9 - 0.34 - - 23:0 0.58 - - - 24:0 - 1.13 0.63 0.22 AGS 24.32 32.00 17.69 15.49 AGMN 5.18 11.72 13.04 20.49 AGPN 70.51 56.28 69.27 64.02 n-3 AGPN 6.62 6.83 2.97 2.15 n-6 AGPN 63.89 49.46 66.30 61.87 n-6/n-3 9.66 7.24 22.34 28.82 AGPN / AGS 2.90 1.76 3.92 4.13

AGS-acizi graşi saturaţi; AGMN- acizi graşi mononesaturaţi AGPN- ac gr. polinesaturaţi

(12:0); Miristic (14:0); Pentadecanoic (15:0); Palmitic (16:0); Z-7 hexadecenoic [C16:1(n-9)];

Palmitoleic [16:1(n-7)];Margaric (C17:0); Stearic acid (18:0); Oleic acid [18:1 (n-9)];Vaccenic

[18:1(n-7)]; Linoleic acid [18:2 (Z,Z) (n-6)];Linoelaidicic [18:2 (E,E) (n-6)]; α- Linolenic [18:3

(n-3)]; Arachidic (20:0); 11-Eicosenoic acid [20:1(n-9)];Heneicosanoic (21:0); Behenic (22:0);

Erucic [22:1(n-9)];Tricosanoic (23:0);Lignoceric (24:0); Nervonic [24:1(n-9)]

Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare.

17

Referinţe:

• Anal, A.K., Singh, H. (2007). Recent advances in microencapsulation of probiotics for

industrial applications and targeted delivery. Trends in Food Science Technology, 18(5), 240–

251.

• Burgain, J.J., Gaiani, C.C., Linder, M.R., Scher, J.J. (2011). Encapsulation of probiotic living

cells: From laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering, 104(4),

467–483.

• D’Aimmo, M.R., Modesto, M., Biavati, B. (2007). Antibiotic resistance of lactic acid bacteria

and Bifidobacterium spp. Isolated from dairy and pharmaceutical products. International

Journal of Food Microbiology, 115(1), 35–42.

• Dulf F.V., Oroian, I, Vodnar, D.C., Socaciu, C., Pintea, A. (2013). Lipid Classes and Fatty

Acid Regiodistribution in Triacylglycerols of Seed Oils of Two Sambucus Species (S. nigra

L. and S. ebulus L.), Molecules, 18(10), 11768-11782.

• Figuerola, F., Hurtado, M.L., Estevez, A.M., Choffelle, I., Asenjo, F. (2005). Fiber

concentrates from apple pomace and citrus peels as potential fiber sources for food

enrichment. Food Chemistry, 91, 39.

• Gilliland, S.E. (1990). Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria. FEMS

Microbiology Letters, 87(1–2), 175–188.

• Gonzalez-Paramas, A.M., Esteban-Ruano, S., Santos-Buelga, C., de Pascual-Teresa, S.,

Rivas-Gonzalo, J.C. (2004). Flavanol content and antioxidant activity in winery byproducts.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 234–238.

• Granato, D., Branco, G.F., Cruz, A.G., Faria, J.A.F., & Nazzaro, F. (2010). Functional foods

and nondairy probiotic food development: Trends, concepts and products. Comprehensive

Reviews in Food Science and Food Safety, 9, 292–302.

• Grigelmo-Miguel, N., Martın-Belloso, O. (1999). Comparison of dietary fiber from by

products of processing fruits and greens and from cereals. Lebensmittel-Wissenschaft und-

Technologie, 32, 503-508.5- 401.

• Gupta, S., Abu-Ghannam, N. (2012). Probiotic fermentation of plant based products:

Possibilities and opportunities. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 52(2), 183–

199.

18

• Kim, S.J., Cho, S.Y., Kim, S.H., Song, O.J., Shin, I.S., Cha, D.S., et al. (2008). Effect of

microencapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC

43121. LWT-Food Sci. Technol. 41, 493–500.

• Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. C. (2001). Yogurt as probiotic carrier food. International

Dairy Journal, 11(1–2), 1–17.

• Mortazavian, A. M., Ehsani, M. R., Azizi, A., Razavi, S. H., Mousavi, S. M., Sohrabvandi, S.,

& Reinheimer, J. A. (2008). Viability of calcium-alginate-microencapsulated probiotic

bacteria in Iranian yogurt drink (Doogh) during refrigerated storage and under simulated

gastrointestinal conditions. Australian Journal of Dairy Technology, 63, 24–29.

• Rasic, J. L. (2003). Microflora of the intestine probiotics. In B. Caballero, L. Trugo, & P.

Finglas (Eds.), Encyclopedia of food sciences and nutrition (pp. 3911–3916). Oxford:

Academic Press.

• Rouhi, M., Sohrabvandi, S., Mortazavian, A.M. (2013). Probiotic fermented sausage:

Viability of probiotic microorganisms and sensory characteristics. Critical Reviews in Food

Science and Nutrition, 53(4), 331–348.

• Sveje, M. (2007). Probiotic and prebiotics – improving consumer health through food

consumption. Nutracoss, Sept/Oct, 28–31.

• Tripathi, M.K., Giri, S.K. (2014). Probiotic functional foods: Survival of probiotics during

processing and storage, Journal of Functional Foods, 9: 225-241.

• Vodnar, D.C., Socaciu, C. (2014). Selenium enriched green tea increase stability of L.

casei and L. plantarum in chitosan coated alginate microcapsules during exposure to

simulated gastrointestinal and refrigerated conditions. LWT – Food Science and Technology,

57 (406–411).

19