Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)43. 1. Definiie. ncadrareFamilia Pseudomonodaceae are patru genuri, dintre care numai genul Pseudomonas include specii importante din punct de vedere medical. Genul Pseudomonas cuprinde pe baza omologiei ARNr cinci grupuri, o parte din speciile incluse anterior n acest gen aparinnd actualmente genului Burkholderia (B. mallei, B. pseudomallei etc). Pseudomonas maltophilia a fost redenumit Xanthomonas maltophilia i a devenit actualmente Stenotrophomonas maltophilia. Cea mai important specie a genului este Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru), specie implicat relativ frecvent n infecii la persoane cu reactivitate sczut, precum i n infecii nosocomiale (infecii de spital). Pseudomonas aeruginosa reprezint una din principalele bacterii oportuniste.n anul 1981 se considera c exist circa 800 de specii de Pseudomonas, contaminnd n special plantele.Genul cuprinde bacili aerobi, facultativ anaerobi, nesporulai, Gram-negativi, cu dimensiuni de 1-5 / 0,5-1mm, mobili datorit prezenei unuia sau mai multor flageli (polari).43. 2. Caractere generale43. 2. 1. HabitatMicroorganism foarte rspndit n natur (agent de putrefacie a materiei organice animale i vegetale), poate fi pus n eviden la circa 15% dintre persoanele sntoase, la nivel intestinal, axilar, perineal etc, prefernd zonele cu un grad de umiditate. Poate contamina obiectele din grupurile sanitare, camera de baie, chiuvetele (n special sifonul de scurgere) etc. Elaboreaz o piocin (bacteriocin), cu efect inhibitor asupra unor tulpini din aceeai specie.43. 2. 2. Caractere morfotinctorialeEste un bacil Gram-negativ subire, cu dimensiuni ntre 1-5mm / 0,5-1mm, mobil, cu 1-3 cili polari (exist i tulpini neciliate), nesporulat. Uneori prezint capsul.43. 2. 3. Caractere de culturDin punct de vedere nutriional sunt germeni puin pretenioi. Se pot cultiva uor pe medii simple n condiii aerobe. Unele specii din genul Pseudomonas se pot multiplica la 4C, dar cele mai multe au temperatura optim de multiplicare cuprins ntre 30 i 37C (Pseudomonas aeruginosa se poate multiplica i la 42C). Posibilitatea cultivrii la 42C permite diferenierea de celelalte specii.Pe medii solide formeaz colonii care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde). De menionat c pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente de bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei. Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa recoltate de la pacieni cu fibroz chistic formeaz colonii mucoide.n bulion tulbur mediul, formnd i o pelicul la suprafa, sub care se evideniaz pigmentul.43. 2. 4. Caractere biochimiceProduce diferii pigmeni, dintre care mai importani sunt piocianina (albastru) i pioverdina (galben-verzui fluorescent). Este un germen catalaz-pozitiv, degradeaz oxidativ glucoza, nu fermenteaz lactoza i este oxidaz-pozitiv.43. 2. 5. Rezistena fa de factori chimici i fiziciEste sensibil la cldur, fenol, alcool de 80, dar rezistent la aciunea compuilor cuaternari de amoniu.n spital se selecteaz tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini care pot fi implicate n infecii de spital.43. 2. 6. Structur antigenicPseudomonas aeruginosa posed antigenul flagelar H (proteic) i antigenul somatic O (lipopolizaharidic). Pe baza existenei mai multor factori antigenici O i H, s-au descris mai multe serotipuri n cadrul speciei, utile n special n investigaii epidemiologice.43. 2. 7. Rspuns imunExist un rspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi (opsonine, aglutinine), ns cu titruri nesemnificative i fr eficacitate protectiv.43. 2. 8. Caractere de patogenitateSpeciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (ntlnite n ap, pe sol, pe plante etc, sau fac parte din flora microbian uman). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat n diferite soluii apoase, inclusiv soluii dezinfectante sau chiar soluii de antibiotice, avnd o deosebit capacitate de a supravieui n medii umede. Pseudomonas aeruginosa este un microorganism oportunist, condiionat patogen.Dintre factorii de virulen ai bacilului piocianic am putea aminti prezena pililor (care mediaz ataarea bacterian la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte histotoxice), a unei lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa 20.000 de ori mai toxic dect endotoxina), precum i existena endotoxinei (lipopolizaharidul din structura peretelui).Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacieni cu fibroz chistic dein un glicocalix foarte dezvoltat care mediaz aderena la nivelul mucoaselor respiratorii i mpiedic opsonizarea. n infeciile cronice, la aceti pacieni, a fost demonstrat trecerea tulpinilor din forme S n forme de tip M, datorit unor mutaii care au fost identificate recent (2008).43. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produseDatorit capacitii de adaptare i supravieuire n diferite medii, precum i datorit factorilor de virulen enumerai, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii foarte variate, de la infecii tegumentare superficiale pn la septicemii fulminante. La persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecii oculare etc), urmnd contaminrii cu diferite soluii apoase sau dup not n piscin. Prezena piocianicului ar putea fi semnalat de culoarea albastr verzuie a pansamentelor. La nivel dermic, procesul infecios poate avea i o evoluie grav, cu apariia de vezicule care se sparg i se refac pe o baz necrotic. Procesul poate progresa n profunzime (ecthyma gangrenosum), asemntor cu patologia ntlnit la pacienii neutropenici la care infecia poate fi produs i de alte microorganisme.La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuat i supuse unor manevre medico-chirurgicale invazive (intubaii, cateterizri etc), precum i la persoanele cu arsuri, P. aeruginosa poate produce infecii localizate, dar potenialul diseminrii i apariiei unor complicaii grave (bacteriemie, osteomielit, meningit, endocardit, septicemie) este foarte important. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la antibiotice), evoluia procesului infecios poate fi grav sau deosebit de grav (80% din septicemiile cu piocianic au evoluie letal). Infecia pulmonar cronic la pacienii cu fibroz chistic (mucoviscidoz) este produs de un fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa.35. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul PseudomonasGenul Pseudomonas face parte din familia Pseudomonodaceae i include mai multe specii. Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru) reprezint specia cea mai important a genului, relativ frecvent implicat n infecii la persoane cu reactivitate sczut, precum i n infecii nosocomiale (infecii de spital). Aceti germeni sunt bacili gram-negativi aerobi,oxidazo pozitivi, nesporulai, cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, mobili datorit prezenei unuia sau mai multor flageli (polari).Datorit capacitii de adaptare i supravieuire n diferite medii, precum i datorit factorilor de virulen pe care i deine, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii foarte variate, de la infecii tegumentare superficiale pn la stri de sepsis cu evoluie fulminant. Prezena piocianicului ar putea fi semnalat de culoarea albastr verzuie a pansamentelor. La persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecii oculare etc). La nivel dermic, procesul infecios poate avea i o evoluie grav, cu apariia de vezicule care se sparg i se refac pe o baz necrotic; procesul poate progresa n profunzime (ecthyma gangrenosum).La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuat i supuse unor manevre medico-chirurgicale invazive (intubaii, cateterizri etc) precum i la persoanele cu arsuri, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii localizate, dar potenialul diseminrii i apariiei unor complicaii grave (bacteriemie, osteomielit, meningit, endocardit, sepsis) este foarte important. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la antibiotice), evoluia procesului infecios poate fi grav sau deosebit de grav. Un fenotip particularal speciei Pseudomonasaeruginosa produce o infecie pulmonar cronic la pacienii cu fibroz chistic (mucoviscidoz). Dintre entitile clinice menionate mai sus, din punct de vedere al diagnosticului de laborator vom discuta infeciile supurative ale tegumentelor i mucoaselor.Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape.1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6). Puroiul trebuie examinat macroscopic, deoarece poate avea un aspect sugestiv (culoare albastr sau galben-verzui fluorescent).2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena bacililor gram-negativi cu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai.3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Pseudomonas aeruginosa se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 5-42 C, cu dezvoltare optim la 30-37C. Se prefer utilizarea unor medii de cultur selective. Uneori cultivarea se realizeaz pe agar-snge. Pe mediile solide Pseudomonas aeruginosa formeaz colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). De menionat c pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie. Pe agar-snge produce hemoliz. n medii lichide, Pseudomonas aeruginosa tulbur mediul ns n timp duce la apariia unei membrane aderent, cenuie, la suprafaa acestuia. Dup 18-24 de ore, sub membran se poate evidenia prezena pigmentului produs.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai, relativ polimorfi. n culturi mai vechi pot aprea diferite forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspt, ntre lam i lamel. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). Pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii diferite. Coloniile pot prezenta o suprafa iridescent, cu luciu metalic i plaje de autoliz, degajnd o arom ptrunztoare particular. Pentru stimularea sintezei pigmenilor se poate folosi repicare pe medii speciale, King F (stimuleaz producerea de fluorescein) i King P (stimuleaz producerea de piocianin). Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie. Pe mediile cu snge produc hemoliz. Multiplicarea la 42 C poate fi util pentru identificare. Caractere biochimice: Produce diferii pigmeni, dintre care mai importani sunt piocianina (albastru) i pioverdina sau fluoresceina (galben-verzui fluorescent). Este un germen catalazo pozitiv care degradeaz oxidativ glucoza i nu fermenteaz lactoza (att coloana ct i panta mediului TSI au culoare roie). Se poate realiza testul de oxidare-fermentare a glucozei. Bacilul piocianic este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12). Pentru studii mai aprofundate, n momentul actual anumite laboratoare utilizeaz sisteme comerciale care verific n acelai timp numeroase caractere biochimice permind nu numai ncadrarea n genul Pseudomonas, dar i identificarea precis a speciei (de exemplu Rapid NTF, cu identificarea speciei n 4-48 de ore). Caractere de patogenitate: Se pot studia n anumite situaii (inoculm 4 oareci cu cantiti fixe de germeni cultivai pe geloz nclinat 2 % i urmrim supravieuirea acestora timp de patru zile). Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor: Testarea caracterelor antigenice Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) i respectiv piocinopia se pot utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervate laboratoarelor de referin Teste de biologie molecular (sonde nucleotidice, analiza ADN dup utilizarea de endonucleaze de restricie, PCR).5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Pseudomonas aeruginosa reprezint unul dintre microorganismele care pot crea dificulti deosebit de mari n alegerea tratamentului etiologic, datorit rezistenei la foarte multe dintre antibioticele uzuale. Cu toate c anumii autori indic faptul ca bacilul piocianic ar fi sensibil la mezlocilin, ticarcilin, ticarcilin-acid clavulanic, piperacilin, piperacilin-tazobactam, imipenem, aztreonam, anumite aminoglicozide, fluorochinolone sau cefalosporine de generaia a III-a, considerm c principiul care trebuie reinut este c n orice infecie cu Pseudomonas aeruginosa (atunci cnd s-a dovedit c acest microorganism este agentul etiologic al infeciei) antibiograma este obligatorie. n cazul unor infecii grave antibiograma difuzimetric trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14). Genul Vibrio (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)44. 1. Definiie. ncadrareSpeciile din genurile Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Campylobacter, Helicobacter sunt larg rspndite n natur i fceau iniial parte din aceeai familie. Vibrionii se gsesc n apele marine i de suprafa. Aeromonas se gsete predominant n apa proaspt i ocazional contamineaz animalele cu snge rece. Plesiomonas se gsete la animalele cu snge cald, dar i la cele cu snge rece. Aeromonas i Plesiomonas au fost asociate cu boli diareice la om. Helicobacter pylori se asociaz cu gastrit i ulcer gastroduodenal.Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (1965), alturi de Aeromonas, Photobacterium i Plesiomonas. Genul Vibrio include mai mult de 48 de specii (12 dintre acestea fiind potenial patogene pentru om). Vibrionul holerei produce o enterotoxin care determin holera. Vibrionii sunt bacili Gram-negativi, drepi sau uor ncurbai, foarte mobili, necapsulai, nesporulai.44. 2. Caractere generale44. 2. 1. HabitatHabitatul natural al vibrionilor include sursele de ap dulce i srat, unde exist liberi sau n asociaie cu diferite vieti acvatice. Vibrio cholerae se gsete n intestinul i n materiile fecale ale omului bolnav de holer. Prezena vibrionului holeric n mediul extern este explicat prin contaminarea fecal i supravieuirea vibrionilor, existnd i posibilitatea unui ciclu de via extraintestinal.44. 2. 2. Caractere morfotinctorialeLa izolarea primar, V. cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de virgul a devenit mai mult o reprezentare istoric), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui flagel polar.44. 2. 3. Caractere de culturSunt germeni puin pretenioi i se pot dezvolta pe medii de cultur simple, inclusiv n apa peptonat, ceea ce este util n izolarea primar (formeaz un vl la suprafaa mediului). V. cholerae se dezvolt bine la un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de pH avnd rolul de medii de mbogire.V. cholerae produce pe mediile de cultur solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu un aspect opac. Se dezvolt foarte bine la 37C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii ce conin sruri minerale i asparagin ca surse de carbon i azot. Crete bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bil-sucroz-agar), pe care produce colonii galbene.44. 2. 4. Caractere biochimiceV. cholerae fermenteaz de obicei sucroza i manoza. Fermenteaz glucoza. n funcie de fermentarea zaharurilor vibrionii se pot submpri n grupe. Au metabolism respirator i fermentativ. Sunt aerobi, facultativ anaerobi.Testul oxidazei (pozitiv n cazul vibrionului holeric) este un test cheie n identificarea preliminar. Majoritateavibrionilor sunt halotolerani i adesea prezena NaCl le stimuleaz creterea prin alcalinizarea mediului.44. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimiciVibrionii holerici sunt foarte sensibili la lumina solar i la aciunea cldurii (la 100 sunt distrui aproape instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. n alimente triesc (cu unele excepii) pn la 7 zile. n ap supravieuiesc un numr de zile, n funcie de eficacitatea tratamentului aplicat apelor uzate. n intestinul bolnavilor netratai se pot menine cteva sptmni.44. 2. 6. Structur antigenicVibrionul holeric prezint la nivel parietal antigenul O (lipopolizaharid). n funcie de structura antigenului somatic de grup O, vibrionii holerici au fost mprii n 6 serogrupe; vibrionul holeric clasic i biotipul El Tor fac parte din grupul O:1, ceilali vibrioni fiind non-O:1NAG (non-aglutinabili cu seruri anti-O:1); aceste microorganisme nu pot fi distinse biochimic de vibrionul holeric O:1. Abordri taxonomice au demonstrat c Vibrio cholerae O:1 i non-O:1 reprezint de fapt aceleai specii. Antigenul serogrupului O:1 are determinani care fac posibil diferenierea serotipurilor. mprirea vibrionului holeric n serotipuri i biotipuri este util n studii epidemiologice, dar testele se fac numai n laboratoare specializate.Exist antigene la nivelul pililor.Fiind mobil, vibrionul prezint antigenul H la nivel ciliar.Vibrionul holeric i vibrionii nrudii produc o enterotoxin labil fa de cldur, cu masa molecular de 84.000 Da, alctuit din dou subuniti A i B (activ i de legare).44. 2. 7. Rspuns imunAciditatea gastric furnizeaz o oarecare protecie n cazul ingerrii unui numr mic de vibrioni.Dup holer apare imunitate fa de reinfecie, dar durata i gradul acesteia nu sunt cunoscute. La animalele de experien apar anticorpi specifici de tip IgA n lumenul intestinal. Anticorpii fa de antigenul O protejeaz animalele de laborator fa de infectare. Anticorpi similari apar n serul uman dup infecie i se consider c sunt asociai (ntr-o oarecare msur) cu protecia fa de colonizarea cu vibrioni patogeni. Prezena anticorpilor antitoxin nu se asociaz cu protecia.44. 2. 8. Caractere de patogenitateMicrobiologia medical este interesat n cunoaterea urmtorilor vibrioni patogeni sau cu patogenitate condiionat, potenial periculoi pentru sntatea omului: Vibrio cholerae O:1, cu biotipurile cholerae i El Tor (fiecare din aceste biotipuri putnd fi clasificat n serotipurile Inaba, Ogawa, Hikojima); Vibrio cholerae grup non O:1; Vibrio mimicus; Vibrio parahemolyticus; V. damsela; V. furnissii; Vibrio vulnificus; V. fluvialis.Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae const n aderarea la epiteliul celular (adezine/pili), urmeaz colonizarea i apoi invadarea mucoasei, care permit infiltrarea germenilor cu producerea unor variate substane biologic active, incluznd enzime extracelulare, enterotoxine, citotoxine, hemolizine, factori asociai cu virulena bacterian.Capacitatea chemotactic fa de epiteliile mucoase este mai evident la formele monotriche, depinznd i de cantitatea i calitatea mucusului.Majoritatea germenilor ce colonizeaz esutul uman posed pe suprafa componente proteice numite adezine care se leag stereochimic de structurile moleculare complementare tisulare. Aceti factori de adezivitate par a fi asociai cu fimbriile sau pilii. Factorii de virulen implicai n colonizare sunt sintetizai n paralel cu producerea enterotoxinei n cazul Vibrio cholerae (toxina holeric) i sunt sub coordonarea aceleiai gene. Se presupune c pilii (proprietate important asociat virulenei germenilor din mediu) se pierd o dat cu instituirea infeciei.Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existena unui strat adiional S extern fa de peretele celular, care ofer protecie fa de agenii litici (bacteriofagi, proteine serice).Enterotoxina holeric este principala cauz a diareei secretorii din holer. De exemplu, la voluntarii care au ingerat mai puin de 10g de toxin purificat, n 2 zile a aprut diareea, cu un volum de peste 20 l, cu caracter exploziv.Toxina holeric (la fel ca i enterotoxina produs de E. coli) este compus dintr-o subunitate A i 5 subuniti B, totaliznd aproximativ 84.000 daltoni. Subunitile B au o mare afinitate pentru receptorii gangliozidici GM de pe suprafaa celulelor int. Dup legare, subunitile A intr n citoplasm i catalizeaz transferul ADP-ribozei la NAD, fiind astfel activat o protein reglatoare asociat membranei, numit Gs. Rezultatul este un nivel crescut al AMPc n celulele mucoase ale intestinului subire, urmat de hipersecreia clorurilor i bicarbonatului care va determina un eflux important de ap.Fiind germeni Gram-negativi, dup distrugerea acestora din peretele celular se elibereaz endotoxina.44. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produsen condiii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru oameni. S-a dovedit c pentru realizarea infeciei i bolii este necesar ingerarea a 1081010 microorganisme.Holera nu este o boal invaziv. Germenii nu ajung n torentul circulator, ci rmn cantonai la nivelul tractului intestinal. Vibrionii colonizeaz marginea n perie a celulelor epiteliale, apoi se multiplic i elibereaz toxina holeric (iar atunci cnd sunt distrui elibereaz i endotoxina).Dup o perioad de incubaie de 1-4 zile apar brusc grea, vrsturi, diaree abundent (20-30 litri / zi) i crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme (ap de orez) conin mucus, celule epiteliale i un mare numr de vibrioni. Exist o pierdere rapid de fluide i electrolii care duce la deshidratare, colaps circulator i anurie. Rata mortalitii n lipsa tratamentului este 25-50%.Infeciile cu Vibrio cholerae grup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterit i cu infecii extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la aduli cu imunitate deficitar). Totui, a fost raportat un caz de sepsis cu Vibrio cholerae grup non O:1 plus gastroenterit la un copil de 8 ani, pacientul prezentnd diaree cu snge, febr i deshidratare sever; vibrionii non O:1 au fost izolai din snge i din materiile fecale. (1)36. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul VibrioGenul Vibrio include mai multe specii dintre care 12 sunt potenial patogene pentru om. Vibrionii sunt bacili gram-negativi, drepi sau uor ncurbai, foarte mobili, necapsulai, nesporulai. Specia principal este reprezentat de Vibrio cholerae (vibrionul holeric), aerob facultativ anaerob, oxidazo pozitiv, rezistent la pH alcalin i sruri biliare. Vibrionul holeric produce o enterotoxin i determin holera.n condiii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru om. Doza infectant este de 1081010 microorganisme. Holera nu este o boal invaziv. Germenii nu ajung n torentul circulator ci rmn cantonai la nivelul tractului intestinal; colonizeaz marginea n perie a celulelor epiteliale, se multiplic i elibereaz toxina holeric. Dup o perioad de incubaie de 14 zile apar brusc grea, vrsturi, diaree abundent (20-30 litri / zi) i crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme (ap de orez) conin mucus, celule epiteliale i un mare numr de vibrioni. Exist o pierdere rapid de fluide i electrolii care duce la deshidratare, colaps circulator i anurie. Rata mortalitii n lipsa tratamentului este 25-50%.Diagnosticul de laborator n holer este bacteriologic, direct, trebuie realizat ct mai rapid posibil (urgen din punct de vedere epidemiologic) i include etapele cunoscute.Diagnosticul unui caz grav de holer este uor de realizat, n special n contextul unei epidemii. Cu toate acestea, cazurile uoare sau cazurile izolate sunt relativ dificil de difereniat de alte boli diareice acute.1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de materii fecale, dar s-ar putea recolta i lichid de vrstur. Din punct de vedere macroscopic materiile fecale sunt apoase, riziforme (ap de orez), de culoare verzuie, cu miros fetid, conin flocoane de mucus. Transportul trebuie s fie realizat rapid, n maxim 1-3 ore. Se poate folosi ca mediu de transport mediul bacteriostatic Cary-Blair. Mediul ap peptonat alcalin (pH 9-9,5) poate fi utilizat att n calitate de mediu de transport ct i de mediu de mbogire.2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel (nu se efectueaz frotiuri din produsul patologic). Preparatul se examineaz la microscopul optic cu obiectivul 40. Esenial este faptul c nu se evideniaz prezena leucocitelor. Vibrionii sunt n numr mare i prezint micri active, de rostogolire sau micri haotice. Suplimentar, p.p. ar putea fi tratat cu Ac specifici; dac mobilitatea este stopat, se confirm diagnosticul.3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Abordarea diagnosticului de holer se realizeaz n mod difereniat, respectiv prezumtiv (la nivelul unui laborator periferic) i de certitudine (la nivelul laboratorului de referin). Este recomandat utilizarea att a unui mediu moderat selectiv (ex. Bile Salts Agar / BSA) ct i a unui mediu nalt selectiv (ex. Thiosulphate-Citrate-Bile salts-Sucrose / TCBS).Lund n considerare situaia n care se ridic suspiciunea unei infecii cu V. cholerae se recomand nsmnarea p.p., direct sau dup transportul n mediul Cary Blair, n ap peptonat alcalin (APA). Dup incubare pentru o durat de 6-8 ore la 35-37, facem trecerea pe mediul selectiv (TCBS i / sau BSA) lund 2 anse de la suprafaa APA (n acest interval, la suprafaa APA poate s apar un vl, respectiv cultura de vibrioni).Examenul microscopic al vlului (preparat proaspt, ntre lam i lamel: vibrioni foarte mobili, cu micri de rostogolire sau haotice) precum i utilizarea unor anticorpi specifici (reacie antigen-anticorp) pot grbi diagnosticul.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-3m / 0,5-0,8m Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, galbene, mari, cu diametrul de 2-4 mm (pe TCBS) Pe mediul BSA, V. cholerae produce colonii de tip S rotunde, strlucitoare, transparente ca picturile de rou (spre deosebire de coloniile de E. coli care suntmate). Caractere biochimice: V. cholerae este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12) Testul uviei de ADN se poate utiliza pentru a diferenia tulpini care sunt oxidazo-pozitive i formeaz colonii cu aspect asemntor (V. cholerae i Aeromonas spp.); n acest scop suspensionm o colonie suspect ntr-o pictur de soluie 0,5% dezoxicolat de sodiu, pe o lam de microscop. n cazul n care este vorba de o colonie de vibrioni, acetia sunt lizai i elibereaz ADN-ul care poate fi tras cu ansa ca o uvi alte teste biochimice, prin metode clasice sau utiliznd galeriile manuale sau automate (ex. API 20E, ID 32E), se efectueaz la nivelul unui laborator de nivel superior sau la nivelul centrului naional de referin; testele biochimice pot diferenia biotipul clasic de biotipul El Tor (se apreciaz c V. cholerae O:139 este un mutant al biotipului El Tor) Caractere antigenice: Se utilizeaz ser anti-holeric O:1 i se practic reacia de aglutinare pe lam. La nivelul centrului de referin se confirm reacia pozitiv i se identific serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima) iar n cazul unei reacii negative se realizeaz o reacie de aglutinare pe lam folosind ser anti-holeric O:139 Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin. Exist sisteme de lizotipare care definesc peste 140 de lizotipuri diferite. Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: testul sensibilitii la agentul vibriostatic cu O/129 (10 g i 50 g) determinarea toxinogenezei tulpinilor de V. cholerae prin reacia VET-RPLA (latex aglutinare pasiv inversat) tehnici de tip ELISA pentru identificarea unor structuri caracteristice V. cholerae tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, PCR etc).5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat, n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene.