proteină metode de -...

27.03.2011

1

Metode de

analiză a genelor

Expresia genelor

ADN ARNm Proteină Caracter

5’-ATTGCAAGATTACCATGT-3’ Catena codogenă (netranscrisă)

3’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Catena anticodogenă (transcrisă)

Transcripţie

5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ ARNm

Translaţie

Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid

Maturizare

Caracter fenotipic normal

Expresia genelor

ADNmut ARNmmut Proteinăan Caracteran

5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ mutaţie G4→A

3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’

Transcripţie

5’-AUUACAAGAUUACCAUGU-3’ ARNmmut

Translaţie

Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

Analiza genelor

Secvenţiere

PCR

Southern-blot

Hibridare in situ

ADN Proteine ARN

Northern-blot

RT–PCR

Hibridare in situ

Western-blot

Secvenţiere

Analiza funcţiei

Analiza

histochimică

Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor nucleici în medicină

Analiza ADN:

• depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);

• identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei);

• depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul bolilor infecţioase şi gradului de infectare.

Analiza ARNm:

• analiza expresiei genice ţesut-specifică;

• evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice.

Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin

acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)

27.03.2011

2

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z M

-

+

10 kb

8 kb

6 kb

4 kb

2 kb

12 kb

10 kb

6 kb

5 kb

2,5 kb

2,5 kb

10 kb

6 kb

5 kb

PCR – reacția de polimerizare în lanț

Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare

• Replicare semiconservativă, repetată

• Specificitatea primerilor sintetici pentru gena–ţintă

• Hibridizarea ADN-ţintă – primer ← complementar:

• Denaturare termică a ADN - de cercetat

Modificarea ciclică a temperaturii:

• Denaturare

• Renaturare

• Sinteză

Componentele necesare pentru clonarea in vitro (PCR):

• ADN de cercetat

• Primeri specifici secvenţei de clonat –

• Complimentari secvenţelor flancante

• Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă

• Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)

• Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:

• - tº de denaturare ADN

• - tº de renaturare (ADN+primer)

• - tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de ADN)

Etapele tehnicii PCR

•Denaturarea ADN la 96oC

A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante

•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor

•Elongarea catenelor ADN la 72oC

B. Repetarea automată a procedurilor de denaturare-

renaturare-elongare de 30-35 ori

C. Analiza produşilor PCR

- electroforeza

- colorarea

- interpretarea rezultatelor

27.03.2011

3

Extragerea ADN Pregătirea

componentelor pentru

PCR

Amplificarea

ADN-ţintă

Electroforeza

produşilor PCR

Colorarea şi

vizualizarea produşilor

PCR

Interpretarea

rezultatelor

Avantajele PCR

• Metodă rapidă

• Metodă ieftină

• Utilizarea cantităţilor mici de material analizat

• Nu necesită izotopi radioactivi

• Interpretarea uşoară a rezultatelor

Dezavantajele PCR

• Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice amplificate

• Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenţei analizate

Utilizarea PCR • Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice

• Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile nucleotidice)

• Identificarea expresiei genice (RT-PCR)

• Dactiloscopia genomică (filiaţie)

• Identificarea agenţilor infecţioşi

• Identificarea gradului de infecţie (quantitative PCR)

• Identificarea produselor PCR în timp real (Real-Time PCR)

Identificarea inserţiilor / deleţiilor Identificarea mutaţiilor punctiforme

27.03.2011

4

Identificarea agenţilor infecţioşi

Stabilirea paternităţii (filiaţiei) Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR

Dependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia ADN genomic utilizată în PCR. S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 – 0,5 μg, 2 – 0,25 μg, 3 – 0,1 μg, 4 – 0,02 μg

Concentraţiile critice ale substanţelor pentru inhibarea activităţii Taq-polimerazei

Substanţa Concentraţia critică

SDS >0.005% (m/v)

Fenol >0.2% (v/v)

Etanol >1% (v/v)

Isopropanol >1% (v/v)

CH3COONa >5 mM

NaCl >25 mM

EDTA >0.5 mM

Optimizarea condiţiilor de

desfăşurare a PCR Caracteristica primerilor utilizaţi în PCR

Gena Secvenţa Lungimea, baze % G+C Tm, oC

ACE 5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ 24 54 59

5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’ 25 48 58

AT1 R 5’-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3’ 20 65 58

5’-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3’ 23 48 55

NOS 5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57

5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59

Dependenţa cantităţii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor. În condiţiile PCR s-a utilizat: 1 – toC optimală -5oC; 2 – toC optimală; 3 – toC optimală +5oC.

Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR

Dependenţa cantităţii produselor PCR de concentraţia ionilor Mg2+. Concentraţia utilizată de MgCl2: 1 – 2,5mM; 2 – 5mM.

Dependenţa cantităţii de ADN amplificat de numărul de cicluri PCR.

1 – 30 cicluri; 2 – 35 cicluri; 3 – 40 cicluri.

27.03.2011

5

Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE

Analiza electroforetică în gel de agaroză de 2% a produselor PCR rezultate din amplificarea ADN uman cu primeri corespunzători genei ACE.

M – marcher al lungimii; 1 – genotip I/D; 2 – genotip D/D; 3 – genotip I/I.

I

D

Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M 1 2 3

Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei NOS. M – marcher al lungimii; 1 – genotip G/G; 2 – genotip T/T; 3 – genotip G/T.

G

T

Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R

Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători

genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.

M – marcher al lungimii; 1 – genotip A/A; 2 – genotip A/C

A

C

Tehnica Real-time-PCR

ARMS-PCR Utilizarea tehnicii microarray

• Izolarea ARN din diferite ţesuturi

• Izolarea ARNm

• Amplificarea prin intermediul RT-PCR

• Marcarea cu agenţi fluorescenţi

• Hibridarea cu ADN fixat în micocipuri

• Analiza rezultatelor

27.03.2011

6

Tehnica Southern-blot

• Bazată pe RFLPs

• Hibridizare cu sonde marcate

• Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un suport solid (pe membrane de nitroceluloză)

Hibridarea acizilor nucleici

• Unirea complementară a fragmentelor (moleculelor) de acizi nucleici:

• ADN de cercetat cu

• sonda oligonucleotidică

• În reacţie participă molecule monocatenare

• Moleculele ADN-ţintă sunt fixate

• Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv sau fluorescent

• Identificarea complexelor hibride se realizează prin intermediul autoradiografiei

Tehnica Southern-blot

Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN

Denaturarea şi

transferul ADN

pe membrane

Autoradiografia Hibridare cu sonda

Vizualizarea şi

interpretarea

rezultatelor

Utilizarea tehnicii Southern-blot

• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari

• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce afectează SR

• Dactiloscopia genomică RFLPs

RFLPs şi analiza genotipului

Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C

Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2

B (Nm)

C (mm)

A (NN)

27.03.2011

7

Dezavantajele Southern-blot

• Necesită cunoaşterea hărţii de restricţie a genei ţintă

• Necesită cantităţi mari de material biologic

• Metodă îndelungată, cu multe etape

• Necesită izotopi radioactivi

• Necesită materiale costisitoare

Avantajele Southern-blot

• Este metodă foarte precisă

• Nu necesită cunoaşterea secvenţei nucleotidice analizate

• Nu necesită primeri sintetici

Tehnica Northern-blot

• Extragerea ARN din ţesutul ţintă

• Electroforeza ARN în condiţii de denaturare

• Transfer pe membrană de nailon

• Hibridarea cu sonda marcată

• Autoradiografia

Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN Electroforeza ARN

Transferul ARN

pe membrane

Autoradiografia Hibridare cu sonda

Vizualizarea şi

interpretarea

rezultatelor

Utilizarea tehnicii

Northern-blot

• Identificarea expresiei genice în anumite ţesuturi, anumite condiţii

• Identificarea variantei de splicing a proARNm

• Identificarea nivelului de expresie

• Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)

Identificarea nivelului

de expresie şi a variantei

de splicing

27.03.2011

8

Secvenţierea ADN

Stabilirea secvenţei de nucleotide

• Metoda chimică (tehnica Maxam-Gilbert, 1973)

• Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)

• Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)

Tehnica dideoxi

• Sinteza enzimatică a ADN

• Utilizarea în paralel a nucleotidelor ce conţin deoxiriboză şi dideoxiriboză

• Stoparea sintezei în cazul incorporării ddNTP

5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ catena codogenă

3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ catena anticodogenă (matriţă)


5’-ATTAC-3’


5’-ATTACAA-3’


5’-ATTACAAG-3’


5’-ATTACAAGA-3’


5’-ATTACAAGATT-3’


5’-ATTACA-3’


5’-ATTACAAGAT-3’

A, T, C, T – ddNTP (2’,3’-ddNTP)

pentru stoparea sintezei

5’-ATTA -- primer marcat P32

pentru ADN-polimerază

A, T, C, T – dNTP (2’-dNTP)

pentru sinteza noilor catene

5’-ATTACAA-3’

5’-ATTACAAG-3’

5’-ATTACAAGA-3’

5’-ATTACAAGATT-3’

5’-ATTACA-3’

5’-ATTACAAGAT-3’

5’-ATTACAAGATTA-3’

5’-ATTACAAGATTACCA-3’

5’-ATTACAAGATTACCAT-3’

5’-ATTACAAGATTACCATG-3’

5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’

+

- A T C G

5’-ATTAC-3’

5’-ATTACAAGATTAC-3’

5’-ATTACAAGATTACC-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’

A

T

G

C

Tehnica dideoxi

Extragerea ADN

Denaturarea ADN

Sinteza catenelor complementare utilizând primeri marcaţi cu 32P în prezenţa dNTP şi ddNTP

Electroforeza în condiţii de denaturare

Vizualizarea fragmentelor marcate prin autoradiografie

+

-

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

27.03.2011

9

Metoda automată Hibridarea

in situ

• Pregătirea preparatelor de cromozomi

• Denaturarea ADN

• Hibridarea cu sonda marcată

• Vizualizarea la microscopul optic

Hibridarea in situ cu

utilizarea preparatelor

de cromozomi metafazici


utilizarea preparatelor

cu nuclei interfazici

Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ADN


utilizarea probei sens (stânga)

şi antisens (dreapta)

Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ARN

Analiza

histochimică –

identificarea

proteinelor în ţesut

27.03.2011

10

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici:

Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.

Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor patologii severe.

Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.).

Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor infecţioase.

Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în criminalistică.

proteină metode de -...

Documents