Lucrare practică numărul 13

Tipuri celulare întâlnite în organismul uman. Proliferare şi diferenţiere celulară, culturile celulare

Toate ţesuturile sunt constituite din celule si substanţă intercelulară.

Substanţa intercelulară poate fi reprezentată într-o cantitate ce diferă în funcţie

de ţesut: foarte redusă cum întâlnim în ţesutul epitelial sau abundentă în ţesutul

conjunctiv. La ţesutul conjunctiv în această substanţă se găsesc şi elemente

fibrilare. Atât substanţa intercelulară cât şi fibrele sunt produse de elaborare ale

celulelor tisulare locale. Astfel devine clar că elementul constitutiv de bază al

fiecărui ţesut este celula, care reprezintă unitatea morfologică şi funcţională a

oricărui ţesut.

Dimensiunile celulei sunt particulare fiecărei localizari tisulare în diferite

organe:

-4-5 microni (celulele granulare din cerebel),

-7-8 microni (limfocite, eritrocite),

-30-40 microni (neuronii din coarnele anterioare ale măduvei spinării),

-180-200 microni (ovulul).

Forma celulelor

Este dependentă de funcţia lor şi de modul de agregare, din care cauză

celulele în preparatele histologice se prezintă sub forme variate:

-celula sferică: ( ovocit, leucocit, adipocit, condrocit,

etc),

Figura 1. Celula sferică. Adipocitul (celula grasă). Are un contur sferoidal, conţinând un

nucleu turtit şi situat spre periferie, sub plasmalemă şi puţină citoplasmă.

-celula poliedrică (celulele spinoase din epiteliul malpighian –epiderm,

epiteliul bucal),

Figura 2. Celule poliedrice. Celulele stratului spinos epidermic sunt

prevăzute cu multe laturi, au nucleul sferic şi situat central, 1, iar între ele lasă

spaţii intercelulare. Celulele nu sunt lipite una de alta şi se leagă între ele prin

spini intercelulari, 2, (desmozomi).

-celula turtită, pavimentoasă (celulele endoteliale, celulele mezoteliale),

Figura 3. Celula turtită (pavimentoasă) cu citoplasmă puţină şi întinsă iar nucleul discoidal

proemină în zona centrală. Limitele celulare se evidenţiază prin impregnare argentică , se colorează în

negru.

-celula stelată (neuronul – celulele nervoase),

Figura 4. Celulă stelată (neuron). Corpul celulei prezintă prelungiri periferice care sunt

mai intens impregnate la origine dând celulei aspect stelet. Nucleul este rotund, slab colorat, cu

nucleol situat central.

-celula fuziformă (fibra musculara netedă –miocitul),

Figura 5. Celulă fuziformă. Celula musculară netedă. Celula are

formă alungită, (de aici şi numele de fibra) şi ascuţită la cele două capete,

(formă de fus). Nucleul alungit este situat central.

-celula flagelată (spermatozoidul),

Figura 6. Celulă flagelată. Spermatozoidul. Se remarcă la o extremitate a celulei capul spermatozoidului ovalar, intens colorat

(conţine nucleul) şi o prelungire subţire şi uşor flexuoasă-coada (flagelul) spermatozoidului.

-celula piriformă (celula Purkinje,din scoarţa

cerebeloasă)

Figura 7. Celulă piriformă

-celula cubică ( celulele epiteliului tiroidian, celulele plexurilor coroide,

celulele din epiteliul canaliculului biliar din spaţiul Kiernan),

Figura 8. Celule cubice. Celula are formă cubica, nucleu sferic situat central.

-celula cilindrică (celula epiteliului mucoasei gastrice, celula epiteliului

mucoasei intestinale, celula epiteliului mucoasei uterine),

Figura 9. Celule cilindrice, înalte, ce prezintă doi poli (pol bazal şi pol apical). La polul

apical apar fine striaţii, platoul striat. Nucleul este ovalar situat în treimea inferioară.

-celula caliciformă (celula mucoasă din epiteliul mucoasei intestinale şi din

epiteliul mucoasei respiratorii),

Figura 10. Celulă caliciformă ( are forma unui caliciu de floare sau a unei cupe de şampanie)

-celula piramidală (neuronii piramidali din scoarţa

cerebrală, celula secretorie din acinii serosi),

Figura 11. Celulă piramidală

-celula cu prelungiri mult ramificate dându-i un aspect neregulat (Ex: celula

pigmentară, melanocitul). Pigmentul secretat de melanocit este melanina, ce

conferă citoplasmei aspectul brun închis.

Figura 12. Celulă pigmentară ce prezintă prelungiri mult ramificate dându-i celulei un

aspect ce nu-i permite încadrarea în nici o formă bine precizată, din care cauză i se spune că este de

formă neregulată. Este colorată prin pigmentul său.

-celula discoidală (hematia), sau echivalente celulare

Fig. 13 Hematie. Este anucleată, văzută din faţă este rotundă şi mai slab colorată la mijloc,

văzută din lateral apare ca un disc biconcav.

Plasmodiul este o formaţiune citoplasmatică

multinucleată rezultată dintr-o singură celulă prin

creşterea citoplasmei şi înmulţirea nucleilor. Ex: Fibra

musculară striată.

Figura 14. Fibră musculară striată. Se remarcă forma de panglică a fibrei

musculare striate în a cărei citoplasmă bogată şi eozinofilă se găsesc numeroşi nuclei

ovalari, dispuşi în periferie. Sub sarcolemă, aspectul striat al citoplasmei, este dat de

structura specifică a miofibrilelor fibrei musculare.

Sinciţiul este o formaţiune citoplasmatică multinucleată rezultată prin

contopirea mai multor celule. Ex. Osteoclastul, sinciţiul trofoblastic, etc.

Figura 15. Osteoclast. Apare ca o celulă voluminoasă cu citoplasma bogată, cu contur neregulat conţinând mulţi nuclei

sferoidali.

Metode de studiu ale biologiei celulare

Culturile de celule

Dezvoltarea organismului uman este rezultatul unor procese de diviziune,

creştere, înmulţire şi diferenţiere celulară care duce la dobândirea unor funcţii şi

structuri morfologice specifice tipurilor de celule. Mecanismele creşterii şi

proliferării celulelor au fost urmărite experimental prin cultivarea de celule « in

vitro ».

Definiţie: termenul general de "culturi de celule" desemnează totalitatea

tehnicilor prin care un organ, un ţesut sau celule dispersate (natural sau prin

tehnici de laborator) sunt menţinute în viaţă sau multiplicate în afara

organismului ("in vitro").

Prin culturile de celule, se poate studia comportamentul celulelor în condiţii

strict definite:

-se adaugă sau se extrag molecule specifice (de exemplu factori de creştere)

şi se determină efectele asupra comportamentului celular;

-se obţin populaţii omogene de celule pentru analize biochimice; pe culturi

mixte, se studiază interacţiunile între tipurile celulare.

Pe lângă scopurile de cercetare, culturile de celule sunt folosite şi pentru

producerea vaccinurilor virale.

A. Clasificarea culturilor de celule :

După felul substratului, pot fi:

- pe suport organic nutritiv;

- pe suport organic nenutritiv;

- pe suport anorganic;

- în suspensie în mediu lichid.

După tipul de material biologic cultivat se disting două mari categorii de

culturi:

1. Culturi de organe (organocultură) - reprezintă întreţinerea, de obicei fără

multiplicare, în medii nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin,

trahee, rinichi).

În general, cultura de organe "in vitro" este dificilă şi necesită medii nutritive

complexe şi condiţii tehnice speciale.

2. Culturi de celule - reprezintă multiplicarea "in vitro" a celulelor din:

-fragmente de ţesut (explante); in jurul explantului se formează o coroană de

celule care se multiplică;

-suspensii de celule naturale sau obţinute prin dispersarea în laborator.

În prezent, se pot obţine culturi celulare în linie continuă, menţinute de-a

lungul a 15-20 de pasaje fără a se transforma sau degenera, precum şi linii

celulare stabilizate, care îşi menţin nealteraţi parametrii morfologici şi fiziologiei

iniţiali după multiple diviziuni.

Clonarea reprezintă separarea unei singure celule şi multiplicare a ei

separată rezultând o linie celulară uniformă din punct de vedere genetic.

În organism, celulele se găsesc sub influenţa mecanismelor de conservare şi

control. Odată scoasă din mediul natural de viaţă, celula are nevoie, pentru a

supravieţui şi a se multiplica "in vitro", de o serie de condiţii de ordin fizic, chimic,

bioenergetic care să mimeze cât mai mult situaţia "in vivo".

Reuşita culturilor de celule "in vitro", depinde în mare măsură de:

-folosirea instrumentarului steril;

-aplicarea unor tehnici aseptice;

-utilizarea unor medii de cultură care să asigure celulelor cultivate "in vitro"

condiţii apropiate de acelea pe care le oferă organismul viu.

Deosebirile esenţiale dintre aceste două modalităţi de viaţă şi de multiplicare

celulară sunt:

- "in vivo", celulele sunt supuse controlului neuroendocrin şi influenţei

ţesuturilor din vecinătate; aportul de substanţe nutritive şi eliminarea produselor

de metabolism se face continuu prin sânge şi limfă;

- "in vitro", celulele nu sunt supuse acestui control; aportul şi eliminarea sunt

periodice.

B. Mediile de cultură

Se pot clasifica după mai multe criterii:

după consistenţă - sunt medii lichide şi semilichide;

după compoziţie - există medii naturale, semisintetice şi sintetice;

după valoarea nutritivă şi scopul urmărit - se cunosc medii de creştere, care

asigură proliferarea celulelor din cultură, medii de menţinere utilizate pentru

întreţinerea culturilor ajunse la dezvoltare maximă şi care păstrează toate

activităţile celulare şi medii defective, testarea celulelor în condiţii speciale de

creştere.

Mediile de cultură celulară trebuie să asigure:

-echilibrul ionic obţinut cu soluţii izotone (pentru păstrarea continuă a

presiunii osmotice); pH-ul optim (pH 7.2 - 7.4) menţinut cu substanţe tampon

(tampon fosfat sau bicarbonat de sodiu – CO2); în mediu există şi un indicator de

pH;

-temperatura optimă, conţinutul de 02 şi de CO2 favorabil;

-elemente nutritive, indispensabile metabolismului: hidraţi de carbon

(glucoză), proteine animale (din lichide biologice - plasmă, ser, lichid amniotic) şi

aminoacizi esenţiali, grăsimi, vitamine, hormoni, substanţe stimulatoare ale

creşterii;

-evitarea contaminării cu germeni patogeni prin adăugarea de antibiotice

(penicilină, streptomicină) şi antifungice (stamicin, micostatin);

-stimularea multiplicării şi creşterii celulelor prin adăugarea de extracte

embrionare.

Mediile nutritive conţin:

-o soluţie salină (soluţie tampon şi indicator);

-elemente proteice (ser sau plasmă sau lichid amniotic, aminoacizi);

-elemente stimulatoare ale creşterii (extracte tisulare de origine embrionară

sau adultă);

-vitamine;

-antibiotice.

C. Tehnica culturii celulare

Se desfăşoară în mai multe etape, în toate etapele se respectă riguros

regulile de asepsie.

a. Reeditarea - se face din cele mai varitate ţesuturi provenite de la om,

animal sau plante. După provenienţa lor ţesuturile ce urmează a fi cultivate se

împart în:

- ţesuturi normale: - embrionare (se cultivă uşor, creştere rapidă);

- adulte (medii complexe, creştere lentă, precedate de un

timp de latenţă de câteva zile);

-ţesuturi tumorale.

b. Dispersarea mecanică (mărunţirea embrionului) se realizează într-un

mediu steril, cu ajutorul unui foarfece special. Dacă nu se obţin rezultate

satisfăcătoare, fragmentele rezultate sunt supuse dispersării chimice cu tripsină

la 37°C, pe suprafaţa unui agitator magnetic.

Acţiunea tripsinei se opreşte prin răcirea soluţiei şi apoi celulele se separă de

soluţia de tripsină prin centrifugare şi se înlătură supenatantul reprezentat de

tripsină.

Se resuspendă sedimentul celular într-un mediu nutritiv, apoi se prepară o

diluţie 1:10 a suspensiei celulare în mediu nutritiv pentru efectuarea numărării.

c. Numărarea cu camera de numărare (hemocitometru).

Din diluţia preparată (9 ml de mediu nutritiv, 1 ml din suspensia de celule) se

pune o picătură pe suprafaţa unei camere de numărare, pentru a stabili

densitatea celulelor din suspensie.

După determinarea densităţii suspensiei celulare, se adaugă un anumit

volum de mediu nutritiv astfel încât sa se ajungă la numărul optim de celule pe

mililitru, şi anume 106 celule /ml.

d. Determinarea viabilităţii celulelor din suspensie cu ajutorul soluţiei de

albastru de triptan 0.5%;

-se adaugă 0.1 mI soluţie în 0.9 ml de suspensie celulară.

-o picătură din acest amestec se examinează la micro scopul fotonic

- celulele vii rămân necolorate, cele moarte apărând albastru-violet.

Mortalitatea nu trebuie să depăşească 10%.

e. O cantitate din suspensia de celule pentru care s-a determinat

viabilitatea şi densitatea optimă se repartizează pe suprafaţa

recipientului de cultură, cât mai uniform, cu ajutorul unei pipete

Pasteur; se ţine la termostat la 37°C, timp de 30 - 60 min. apoi se introduce

mediul de cultură, astfel ca el să nu antreneze fragmentele fixate pe pereţii

recipientului. Vasul se închide şi se incubează la 37°C, fără a se agita timp de 3-4

zile.

Metoda este analogă şi în cazul utilizării ţesturilor solide umane, embrionare

sau adulte.

f. Controlul culturilor

Controlul mediului de cultură se efectuează la 12-24 de ore pentru:

- contaminare (bacterii, fungi, viruşi);

- constantele fizico-chimice (pH, proteine totale);

-aprecierea eficienţei culturii (densitatea celulară pe suport, eficienţa de

formare a coloniilor).

Controlul morfologic al celulelor din culturi se face prin:

- microscopie fotonică pe preparate proaspete se examinează celulele vii la

microscopul cu contrast de fază sau pe preparate permanente fixate şi colorate;

- histoautoradiografie;

- microscopie electronică.

Activitate practică

Cultura de limfociţi din sângele periferic

Reeditarea – Se ia 3ml sânge, prin puncţie venoasă la plica cotu1ui, cu

ajutorul unei seringi sterile, heparinată anterior recoltării. Se poate recolta sânge

şi din puncţie în pulpa degetului, însă această metodă comportă risc de infecţie a

culturii mai frecvent, motiv pentru care are aplicaţie limitată.

Însămânţarea mediului - constă în repartizarea mediului de cultură special

în flacoane de sticlă sterile de 20 - 30 ml, în care se va pune 10 ml de mediu de

cultură în condiţii sterile. Se lasă să ajungă la temperatura camerei, după care se

plasează în fiecare flacon 12 - 20 picături din sângele recoltat (numărul

picăturilor fiind în funcţie de leucograma persoanei investigate).

Se închide flaconul cu un dop steril şi se agită uşor pentru omogenizare.

Cultura este ţinută la termostat la 37C° timp de 72 - 96 ore, interval în care

la fiecare 24 ore se verifică ph-ul şi aspectul.

Acidifierea mediului este tamponată cu fosfat - tampon.

Culturile care îşi schimbă culoarea sau devin tulburi, vor fi întrerupte,

deoarece cultura este compromisă.