Câmpul electric pulsatoriu pentru permeabilitatea membranelor celulare folosit în aplicații precum bioprocesarea

alimentelor,designul echipamentului și analiza costurilor

Profesor Coordonator: Studenti:

Nedeliță Victor Ghinoiu Denisa

Serban Alina

Moloiu Maria

Constandin Codruța

1

Cuprins

1.Mecanisme si efecte fundamentale ale electropermeabilitatii..............................2

1.1.Mecanisme de actiune...............................................................................................................................................3

1.2.Modele propuse pentru a descrie inactivarea microbiana.........................................................................................6

2.Parametrii de procesare...........................................................................................7

2.1.Rezistenta campului electric.......................................................................................................................................7

2.2.Timpul de tratare,energie specifica si geometria pulsatorie......................................................................................8

2.3. Temperatura de tratament..................................................................................10

2.4.Tratamentul factorilor de mediu.........................................................................10

2.4.1 Conductivitatea.....................................................................................................................................................10

2.4.2 Efectele particulelor si a bulelor de aer.................................................................................................................11

2.4.3. Caracteristicile celulelor microbiene....................................................................................................................12

2.5 CEP ca tehnica de dezintegrare..........................................................................12

2.6. Designul echipamentului CEP...........................................................................14

2.6.1.Generearea campului electric pulsatoriu..............................................................................................................14

2.6.2 Designul camerei de tratament.............................................................................................................................16

Intrebari si raspunsuri despre CEP..............................................................................18

1.Mecanisme si efecte fundamentale ale electropermeabilitatii

2

1.1.Mecanisme de actiune

Conform primelor descrieri ale lui Gossling(1960) si ale lui Doevenspeck(1960,1961), in anii ‘80 a aparut interesul pentru folosirea unei electroporatii in stiinta medicala si in ingineria genetica.Intrucat accentele empirice ale efectelor devastatoare ale campurilor electrice asupra celulelor biologice au fost decoperite déjà in 1960, teoria rupturii dielectrice a fost introdusa in paralel de Zimmermann (1974) si de Neumann si Rosenheck (1972).Ulterior, ruperea electrica a membranelor celulare a fost explorata bazandu-se pe sisteme model ca vezicule fosfolipidice si bistraturi planare precum si pe microorganisme, dar pana acum nu exista nicio dovada clara cara sta la baza mecanismelor la nivel celular.

Permeabilitatea unei membrane celulare se realizeaza in doi pasi:in primul rand formarea unui por trebuie sa fie Indusa de campul electric aplicat si in al doilea rand acest por trebuie sa fie suficient de stabil pentru a permite interactiunea mediului intra si extracelular.Foarte putine informatii sunt disponibile cu privire la secventa de timp si dinamica procesului de electroporatie cat si despre modificarile structurale ireversibile sau reversibile ale celulelor in timpul si dupa tratamentul cu CEP.Doua efecte au fost declansate de catre campul electric: efectul de perforare ionica si ruperea dielectrica a membranei.In prezent este cunoscut faptul ca primul efect al CEP asupra celulelor biologice este legat de modificarile structurale si de ruperea membranei celulare.Aceasta este o componenta importanta a celulei biologice pentru ca actioneaza ca bariera semipermeabila fiind responsabila de transferul de masa si joaca un rol important in sinteza ADN si ARN, a proteinelor si a constituentilor peretelui celular.

Membrana celulara a celulelor biologice poate fi considerata un condensator umplut cu material dielectric cu o conductivitate electrica scazuta, si o constanta dielectrica de ordinul 2.Acumularea de sarcini cu polaritate opusa pe ambele parti ale membranei duce la un potential transmembranar natural si perpendicular de aproximativ 10 Mv.Intr-un mediu cu conductivitate electrica pus intre un voltaj mare si un electrod cu impamantare , campul electric rezultat poate fi dedus din ecuatia lui Laplace ²∇ ϕ=0,unde ϕ este potentialul electric.

Prin expunerea la un camp electric extern un potential aditional este Indus de miscarea sarcinilor de-a lungul liniilor campului electric. Un desen schematic al impactului campului electric asupra asupra membranelor celulare este aratat in figura 1.

3

In figura 1 este prezentat schematic mecanismul permeabilitatii membranei prin forte electro-compresive induse de un camp electric extern.Cresterea intensitatii tratamentului va duce la formarea ireversibila a unor pori membranari.

Diferenta de potential ΔϕM a membranei unei celule biologice de forma sferica cu raza R indusa de campul electric extern E poate fi aproximata prin ecuatia 1:

Δ ϕ = −f (A)*AFE

Aceasta formula calculeaza diferenta de potential locala a membrane celulare la distanta Af de centru in directia campului electric extern.f(A)este o functie a celor 3 semi-axe (A1,A2,A3) a celulelor eliptice (ecuatia2):

Cand potentialul global atinge o valoare critica de aproximativ 1V, depinzand de compresibilitate, permitivitate si grosimea initiala a membranei,forta electro-compresiva cauzeaza o ruptura dielectrica locala a membranei inducand formarea unui por, actionand ca un canal conducator.Luand in considerare grosimea membranei de 5 nm aceasta se transpune intr-o rezistenta dielectrica de 2000kV/cm.O crestere drastica a permeabilitatii restabileste echilibrul diferentei de potential electric si electrochimic al plasmei celulare si al mediului extracelular formand un echilibru Donnan.Acest fenomen a fost numit rupere dielectrica, imprumutand expresia din fizica corpului solid.

4

Un model electro-mecanic a fost dezvoltat,descoperindu-se ca un camp electric de-a lungul membranei formeaza o compresiune mecanica.Membrana celulara a fost considerata ca un condensator.Fortele compressive sunt echilibrate de restabilirea fortei mecanice, crescand compresiunea prin cresterea potentialului transmembranar poate aparea o instabilitate mecanica.Ruperea electrica a fost descoperita pentru celulele algelor, pentru bacterii si pentru celulele rosii din sangele uman masurand distributia lor cu un calculator Coulter.Probabil cea mai importanta aplicatie va fi ca celulele sa fie umplute cu substante pe care membrane lor celulara in mod normal le-ar considera impermeabile.

Pana acum instabilitatea electro-mecanica este folosita in continuare pentru a explica efectul campurilor electrice externe asupra celulelor biologice si este una dintre cele mai acceptate teorii.Ruperea electrica este reversibila daca porii sunt mici in comparatie cu suprafata membranei.Cresterea rezistentei campului electric si intensitatea tratamentului prin cresterea latimii pulsului va facilita formarea unor pori mari si deteriorarea reversibila se va transforma intr-o rupere ireversibila.Acest model de compresiune electromecanica este sustinut de dovezi experimentale,o rezistenta critica a campului electric a fost gasita fiind dependenta de marimea si geometria unei celule de ordinul 1-2kV/cm pentru celulele plantelor si 10-14kV/cm pentru celulele microbiene ca E.Coli.Totusi, asa cum comportamentul ulterior de inchiderea porilor, cursul conductantei membranei si fenomenul de transport nu sunt luate in considerare,multe alte modele sunt propuse pentru a explica mecanismele la nivel molecular cum ar fi modelul mozaicului fluid al unui bistrat lipidic cu molecule de proteine incorporate. In contrast cu fortele electrice compresive,alte teorii includ aparitia unei deteriorari a membranei si a unei reorientari pe bistratul lipidic si canalele proteice ca o cauza a cresterii permeabilitatii.

Dimitrov(1984) a prezentat o extensie a modelului electromecanic luand in considerare proprietatile vascoelastice ale membranei,tensiunea de la suprafata membranei si rearanjamentele moleculare cum ar fi extinderea porilor pentru a descrie unitatea de timp in care campul distruge membrana celulara.Alte concepte alternative se bazeaza pe reorientarea moleculara si pe defectele localizate din interiorul membranei celulare care sunt extinse si destabilizate prin expunerea la un camp electric.Prezenta unor mici pori hidrofobi in matricea lipidica este baza structurala initiala a electroporatiei.Prin stresul electric extern acestia pot fi transformati in pori hidrofilici, prin reorientare, daca raza porului este marita deasupra valorii unde energiile porului la ambele orientari coincid.Energia porului este schimbata cu energia libera rezultata din formarea porului in interiorul bistratului lipidic. Cat timp raza porului este mica formarea unor pori hidrofobici este mai favorabila, dar cand atinge 0.5 nm energiile porilor hidrofilici si hidrofobici devin egale si poate aparea inversarea porilor.Reorientarea dipolara si tranzitia porilor de la hidrofobici la hidrofilici a fost descrisa de Tsong(1991),presupunand o schimbare in structura membranei celulare.Porii pot cauza pierderea abilitatii de a regla pH-ul intracelular si un circuit scurt al proteinelor-pompe.Ruptura membranei a fost asociata cu dezechilibrele osmotice si cu umflarea celulelor dupa deschiderea porilor, si a fost definita printr-un mecanism in doi pasi: o perforare a membranei celulare dupa o ruptura dielectrica care este urmata de o expansiune a porului.

Electroporatia poate avea loc atat in domeniu lipidic cat si in canalele proteice,mai ales daca functionalitatea ei este influentata de potentialul transmembranar.Potentialul pentru canalele proteice este de 50mV,fiind considerat mai mic decat rezistenta dielectrica a bistratului fosfolipidic.Desi

5

deschiderea canalelor proteice este indusa, este posibil ca aceasta sa nu fie suficienta pentru a preveni dezvoltarea unui potential transmembranar.Bazat pe experimentele cu sisteme model ca lipozomii sau protoplastele celulelor eucariote mari si microbii au fost dezvoltate cateva teorii care si-au propus sa explice mecanismele care stau la baza formarii porilor si inchiderii lor.Formarea porilor poate aparea si ca urmare a defectelor structurale din interiorul membranei celulare.Un volum fara precedent de munca de cercetare a fost publicata in domeniul geneticii si al bioingineriei,iar o recenzie cuprinzatoate asupra cunoasterii mecanismului de permeabilitate celulara a fost publicata de catre Teissie et al. Recent a fost publicata o recenzie, comparand dispozitivele micro-fluidice care sunt disponibile pentru electroporatie.Chiar daca mecanismele de actiune sunt la fel si unitatile micro-fluidice sunt de mare ajutor pentru elucidarea mecanismului,in comparatie cu intensitatea tratamentului aplicat alimentelor, este mult mai scazut si in majoritatea cazurilor este tratat doar un mic volum de la micro la mili litri pe minut.

1.2.Modele propuse pentru a descrie inactivarea microbiana

Au fost propuse cateva modele empirice si fenomenologice pentru a descrie relatia dintre inactivarea microbiana si rezistenta campului electric.Numarul mare de parametrii de procesare si productie, diferentele in sistemele de tratament,conditiile experimentelor si limitele definitiilor au dus la gasirea relatiilor generale.Lipsa cunoasterii in ceea ce priveste mecanismele de actiune si dependenta de parametrii de procesare si de prodctie impiedica dezvoltarea modelelor de inactivare bazate pe semnificatia psihologica a parametrilor obtinuti.Modelele propuse s-au bazat pe observatii empirice,dar trebuiau luate precautii pentru a evita limitari specifice de design experimental al echipamentului CEP utilizat. Intrucat aplicatiile camerelor statice par sa fie preferate pentru studiul inactivarii kinetice, eficienta inactivarii cu CEP este diferita.

Modelul descris de Hülsheger (1981) se bazeaza pe presupunerea unei relatii liniare intre restul fractiei logaritmice si ezistenta campului electric la fel ca relatia liniara dintre restul fractiei si timpul de tratament(ecuatia 3):

Ecuatia 3

unde s este numarul de supravietuitori ,t este perioada de tratament si E este forta campului, Ec si tc denota valorile pragului E si t, k este un factor independent specific penru fiecare organism.Din punctual nstru de vedere acest model supraestimeaza impactul fortzei campului electric in comparatie cu perioada de tratament.Am aflat ca depasirea unui anumit nivel a fortei campului nu mai creste in eficacitate , poate fi gasit cand energia impusa este pastrata constanta.Din punct de vedere al unui inginer folosirea energiei in locul perioadei de tratament pare a fi mai adecvata pentru a descrie intensitatea procesului.Modelul propus de PELEG (1995) se bazeaza pe ecuatia

6

Fermi’s ,reprezentand procentajul de supravietuitori ca o functie a fortei campului electric si oscilatia numarului aplicat ecuatiei 4.

Ecuatia 4

Unde E si Mc sunt forta campului si respectiv forta critica a campului , n este numarul oscilant si a este un factor care caracterizeaza caracterul abrubt al curbei de inactivare in intensitatea campului gama aproape de Ec.Inactivarea microbiana a fost descrisa ca fiind cinetica de baza de prim ordin(Martin-Belloso 1997 ;Reina 1998) de asemenea curbe neliniare Peleg 1995;Peleg si Cole 1998;Barbosa- Kanovas 1999; Rodrigo 2003. Inactivarea neliniara a ost data spre distributie a fost asociata la distributii de sensibilitate impotriva electroporatiei, efecte protectoare a constituentiilor mancarii , prezenta bulelor de aer ,particule izolante sau neomogenitatilor in distributia campului electric asemenea distributiei in marimea geometria si orientarea aleatoare a celulelor in camp electric .

Prezenta ranii subletale provocata de bacteria expusa campurilor electrice, tratamentului CEP a fost descris de Garcia in 2005 ,intrucat folosind viabiliate fluorescenta nici o deteriorare subletala nu a fost gasita de Yaqub(2004). De asemenea Wuytack nu a observat nici o deteriorare subletala semnificativa din investigarea cresterii salmonelei Enterica din diferite medii selective dupa tratamentul CEP.Inactivarea microorganismelor de CEP a fost considerata ca un proces totul sau nimic,un mecanism mobil unic bazat pe permeabilitatea membranei ireversibile.

2.Parametrii de procesare

2.1.Rezistenta campului electric

Aplicand un camp electric extern cu suficienta putere pentru celulele suspendate intr-un mediu electric conductiv, o acumulare de incarcaturi la membranele microbiane neconductive vor fi induse. Formarea porilor vor avea loc atunci cand o anumita valoare prag a potentialului postmembranar format este depasita, care sa dovedit a fi in intervalul de 1 V (Zimmermann 1996).

A fost demonstrat ca concentratia critica externa a caldurii este in mare parte dependenta de marimea celulelor precum si de orientarea acestora in camp(Heinz 2002) .

Cu o dimenisune a celulei in scadere forta campului ceruta creste brusc, si variataia in forme a celulelor poate cauza cresteri considerabile a lui E. Cresterea intensitatii campului electric a fost raportat sa duca la o crestere suplimentara a eficientei tratamentului( Hülsheger 1983, Boyko 1998, Heinz 1999, Heinz si Knorr 2000, McDonald 2000, Alvarez 2003 si Heinz 2003), dar se limiteaza la rigiditatea dielectrica a materialelor produselor alimentare(Ho si Mittal 2000) in domeniul 60-80 KV/cm. Breakdown and associatedarcing vor determina fluxul de curent intr-un canal ingust si vor

7

incuraja reactii electrochimice nedorite, formare de bule si risipire de electrozi. Acestea pot fi prevenite prin optimizarea distributiei campului electric in camera cu exceptia punctelor fierbinti precum si evitarea prezentei bulelor de aer prin degazare sub presiune sau exploatare inapoi.

2.2.Timpul de tratare,energie specifica si geometria pulsatorie

In afara de puterea de varf a campului electric produs de latimea impulsului si numarul mediu de impulsuri aplicate a fost adesea folosit pentru a evalua intensitatea tratamentului.Cresterea topului de tratament rezulta in inactivariile microbiane inalte(Sale si Hamilton 1967).Latimea impulsului este definita ca fiind timpul unde varful campului este mentzinut pentru square wave pulses sau timpul pana la decaderea de 37% pentru decaderea impulsurilor exponentiale. Tipic cresterea numarului de impulsuri cauzeaza cestere in timpul de tratament ,latimea impulsurilor este fixate de configuratia impulsurilor generate. In general cresterea inactivarii a fost gasita cand timpul de tratare este este crescut dar in anumite cazuri saturatia a fost raportata dupa o anumita suma de impulsuri. In timp ce pentru camerele de lot numarul de impulsuri pe elementul de volum este bine definit pentru camerele cu flux continuu numarul mediu trebuie sa fie luat in considerare. In afara de asta in cele mai multe cazuri zona de tratare cu un camp electric mai sus decat intensitatea critica a campului electric este diferita de tratarea geometriei camerelor. Aceasta poate fi gasita in particular in cazul configuratiilor cooliniare unde distribuitia intensitatii campului trebuie luata in vizor cand se caculeaza timpul mediu de resedinta in zona de tratare.

Pentru acestea energia specifica impusa a fost sugerata ca un parametru de intensitate si poate fi estimata de cresterea temperaturii produsului si a capacitatii de caldura specifica a mass-media prin asumarea unui sistem adiabatic unde energia livrata tratamentului mass-media este transformata in totalitate in caldura. Cea mai mare acuratete poate fi calculate pentru toate formele de unda pe baza semnalelor de tensine si curent determinate aproape de elctrozi: WPulse = ∫ U (t ) I (t )dt

Ecuatia 5.

Pentru decaderea impulsurilor exponentiale energia specifica impusa poate fi deasemenea estimate de energia imagazinata in condensatorul banca (ecuatia 6), unde U denota incarcarea de tensiune si C capacitatea de stocare,dar raportul de pierderi intr-un rezistor de eventuala protectie sau o retea de formare a impulsurilor si cablurilor trebuiesc luata in vizor.

Ecuatia 6

8

Bazata pe conductivitatea mass-media si intensitatea campului electric a masurat energia specifica impusa pentru decaderea exponetiala si impulsuri rectangulare si poate fi calculate de asemenea prin formula:

Ecuatia 7

Unde E,K(T),f si m denota intensitatea campului electric,conductivitatea mass-media, rata de repetitie si respectiv debitul de masa. Cresterea temperaturii datorata disiparii de energie poate fi utilizata pentru evolutia procesului prin compararea energiei impuse cu temperatura produsului vrac dupa tratament.

Din punct de vedere al procesarii energia intrata trebuie sa atinga o anumita rata microbiana de inactivare sau matricele de celule dezintergrate. Par a fi avatajoase pentru a fi folosite ca un parametru intens de tratament, pentru ca poate indica costul operatiunii. Totusi nici timpul de tratare sau energia specifica nu sunt adecvati sa descrie suficient parametrii de procesare, cum nici o informatie nu este data despre energia data / impuls sau numarul de impulsuri pe elementul de volum.

Desi mai multe forme de unda diferite sunt aplicabile pentru tehnologia CEP formele puls utilizate in mod obisnuit sunt fie descompunera exponentiala fie impulsuri de valuri patrate.Unda patrata generatoare de sisteme necestia un comutator cu capacitate turn-off sau un puls de formare de retea.

Cum comutatoarele cu capacitate turn-off sunt rar disponibile pentru sistemele cu aplicatii inalte(Mohan 1995) ,conexiuni in serie sau in paralel de comutatoare (Gaudreau 2001) ,impulsuri concentrate sau distribuite care formeaza retele cu mai multe condensatoare si elemente inductive care trebuiesc fi folosite. In acest caz sistemul generator de impuls ,in particular impedanta liniei trebuie sa fie adaptata la o incarcare rezistenta a camerei de tratament. O comparatie intre performanta energiei a diferitelor sisteme generatoare de impulsuri a fost efectuata de De Haan (Willcock 2002) ajungand la concluzia ca sistemul de descompunere exponentiala nu va depasi o energie eficienta de 38%. Au comparat square waves pulses cu un anumit varf de tensiune Upeak si durata tp celor exponentiale prin montarea pe blocuri de Upeak si tp sub un impuls exponential asumandusi faptul ca excesul de tensiune produs de impulsurile exponentiale rezulta din pierderiile in exces.

Impactul de crestere a impulsului ori impulsurile dreptunghiulare de 1ms de la 2 la 100 µs privind permeabilitatea celulelor membranare a fost investigate de Kotnik (2003). Nu a fost gasita nici o diferenta si eficacitatea tratamentului a fost corelata la timp cu amplitudinea impulsului sus-criticala. Caracteristicile impulsului unei descompuneri exponentiale de impuls sunt extrem de dependente de parametrii de incacare si descarcare a circuitului. Tensiunea de varf si capacitatea de stocare a energiei determina energia intrata/impuls, rezistenta si inductivitatea circuitului de descarcare si influenta impulsului,timpul de crestere si latimea impulsului. Impactul caracteristicilor unui impuls pe inactivarea microbiana a fost discutata pe larg dar din moment ce nu sunt parametrii independenti influenta lor nu a fost complect elucidate pana acum.

9

2.3. Temperatura de tratament

Temperatura de tratament are un efect sinergetic ridicat asupra eficacitatii tratamentului,are o influenta semnificativa asupra fluiditatii si stabilitatii membranelor celulare.Intrucat la temperaturi scazute,structura de fosfolipide este ambalata intr-o structura gel,ordinea lor scazand cu cresterea temperaturii.Temperatura de faza dependenta trece de la forma de gel la lichid cu structura cristalina si afecteaza astfel stabilitatea membranei celulare(Stanley 1991).Dunn si Pearlman(1987) au observat o crestere de inactivare a lui S,dubla in lapte de la 1 la 4 autentificate pentru cicluri cand cresterea temperaturii de tratament de la 40 la 50 grade celcius.Jayaram(1993) a raportat o schimbare a inactivarii L.brevis cand cresterea temperaturii de tratament era de la 24 la 60 de grade celsius,asumandu-si faptul ca faza de tranzitie a fosfolipidelor este responsabile pentru acest efect.Efectul cresterii eficientei a aplicatiei PEF la temperaturi ridicate de tratament a fost raportat in diferite studii (Evrendilek si Zhang 2003;Heinz 2003;Li 2005).

Efectul temperaturii de tratament asupra propritatilor texturale a tesutului de mere a fost investigata de Lebovka(2004) aratand ca preincalzirea la 50 de grade celsius a dus la leziuni tisulare mai eficiente decat singurul tratament PEF si extractie de suc mai buna prin presare.

2.4.Tratamentul factorilor de mediu

Proprietatile produselor si constiutia lor au influenta semnificativa asupra cresterii microbiene precum si rezistivitate importiva diferitelor tehnici de inactivare.Similar cu tratamentul termic,o dependenta puternica de sensibilitate impotriva campurilor electrice pulsatorii pe parametrii produselor a fost raportata,si parametrii fizici si chimici ca pH-ul sau activitatea apei produsului si au o influenta puternica de inactivare microbiana.Mediul in sine reprezinta scopul tratamentului daca tratamentul CEP este aplicat pentru tesutul de dezintegrare.Proprietatile tesutului cum ar fi marimea celulei si conductivitatea, vor avea un impact asupra eficientei tratamentului,propritatile produsului ca pompare,fructe,tubercul sau dimensiunea bucatii vor influenta manipularea produsului in timpul unei aplicatii continue CEP.

2.4.1 Conductivitatea

Unul din parametrii cheie pentru prelucrarea campului electric pulsatoriu este conductivitatea mediului K(T) care este de asemenea o functie a temperaturii mediului(Reitler 1990).Mediul bogat in specii ionice ca de exemplu sucul de rosii prezinta probleme pentru a obtine o tensiune suficienta pentru intensitatea campului supercritica, din moment ce o putere mai mica de varf de camp este generata in intreaga camera de tratament.Acest efect este important pentru tratamentul celulelor de

10

plante sau animale,precum si pentru a obtine o inactivare microbiana pentru conservarea alimentelor lichide.Conductivitatea este inversul rezistivitatii si este masurata in simens/unitate de lungime(S/m).

Deoarce conductivitatea majoritatii materialelor de hrana este stabilita prin proprietatile sale intrinseci sau retete ,numai alegerea unui electrod de configurare si de geometrie cu rezistivitate mare de incarcare ajuta la diminuarea acestui efect si imbunatateste divizia de tensiune in circuitul de descarcare.Cu toate acestea cresterea temperaturii va duce la schimbari in conductivitate in timpul tratamentului.

In afara de influenta acestuia asupra intensitatii campului conductivitatea ar trebui sa stabileasca diferenta intre taria inonica in mediu si citoplasma(Jayaram 1993).Membrana va fi slabita si mai sensibila la un puls electric in mediu cu tarie ionica mai mare,provocand o permeabilitate mai mare si schimbari structurale.Relatia dintre rata de inactivare si conductivitatea mediului a fost investigata de catre Hulsheger(1981)si Vega-Mercado(1996) care arata o crestere semnificativa in inactivare la puteri ionice mici ci conductivitate,intrucat Alvarez(2000) nu a confirmat acest lucru.Heinz(2002)a calculat influenta conductivitatii mediului pe incarcare constanta de timp si a aratat o influenta neglijabila a conductivitatii mediului privind potentialul trans-membranar construit.

2.4.2 Efectele particulelor si a bulelor de aer

In afara de conductivitatea electrica rigiditatea dielectrica a matricei alimentare are o influenta semnificativa asupra aplicabilitatii CEP,o defalcare dieletrica trebuie sa fie prevenita.Bulele de aer care nu pot rezista la forte de camp electric ridicate pot fi prezente in cazul produselor spumante sau pot fi eliberate ca urmare a cresterii temperaturii sau reactiilor electrochimice.In particular pentru inacvtivarea microbiana unde intensitatea campului electric in intervalul 30-50 kV/cm este necesara,aerul trebuie sa fie inlaturat din produs.In afara de descoperirea dielectrica unde curentul inalt va circula intr-un canal ingust intr-un balon in loc de lichid,propritatile dielectrice a aerului vor influenta eficacitatea tratamentului.Efectul perturbator al bulelor de aer prezente in interiorul camerei de tratament a fost raportat de Gongora-Nieto(2003) indicand faptul ca legiunile limita de bule o scadere semnificativa a intensitatii campului va cauza probleme de siguranta alimentara. Un efect similar a fost descoperit atunci cand aglomerarile de microorganisme si/sau particule cu proprietati dielectricediferite,cum ar fi prezenta globulelor de grasime(Toepfl 2004).Prin urmare constitutia produsului trebuie luata in considerare pentru alegerea parametrilor de procesare pentru un anumit produs.Pentru tratamentul alimentelor solide ca materialul vegetal sau animal sau mash-uri de fructe incapsularea trebuie sa fie eliminate pentru a evita descarcarile electrice,produsele care fac spuma ar putea fi nepotrivite pentru tratamentul CEP.

11

2.4.3. Caracteristicile celulelor microbiene

Deja in anii 1960 Sale si Hamilton(1967-1968) a observat ca levurile au fost mai predispuse la un tratament de impulsuri de camp electric decat bacterile,Hulseger(1983) aratat o varietate larga in inactivarea diferitilor microbi.In afara de efectul campului electric cum este descris inainte, constitutia membranei diferitilor microbe influenteaza rezistivitatea lor.In general organismele gram-pozitive par a fi mai putin sensibile.O influenta a tratamentului CEP de celule de la diferite faze de crestere nu a fost observat de Sale si Halmiton.

Alvarez a raportat o eficacitate mai mare de celule in faza de crestere logaritmica.Chiar daca unele grupuri de cercetare au descris o inactivare usoara a catorva tipuri de spori(Raso 1998) dupa un tratament CEP este important sa retinem ca CEP nu este un instrument suficient pentru inactivarea de endo sau asco spori si ca o germinatie dupa un tratament nu este indusa.Prin urmare nu poate fi posibila sterilizarea produselor alimentare cu exceptia unei combinatii cu alte tehnici cum ar fi caldura sau germinatia anterioara si se efectueaza o inactivare de celule vegetative.

Este de remaract faptul ca rezistenta celulelor impotriva CEP nu prezinta nici o corelatie cu rezistenta lor impotriva altor tratamente termice sau nontermice,de exemplu tulpini de Listeria care sunt foarte sensibile la caldura au aratat ca sunt foarte rezistente impotriva tratamentului CEP(Unal 2001;Toepfl 2004;Arosson 2005) Lado si Yosef(2003) au comparat inactivarea a noua tulpini diferite de Listeria monocytogenes dupa un tratament la 25 de KV/cm si 25 de grade Celsius care a variat de mai putin de 1 pana la 3,4 log-cicluri.Nici o corelatie cu caldura sensibilitatea de caldura sau genotip nu a fost gasita.Acest soi sublineaza faptul ca inca exista nevoie de a indentifica tulpini tinta rezistente pentru a evalua si a dovedii eficacitatea si siguranta procesului.

2.5 CEP ca tehnica de dezintegrare

Atunci cand un tratament CEP este aplicat pentru dezintegrarea tesutului produsul in sine si proprietatile sale vor determina aplicabilitatea si eficacitatea unui electropermeabilizator. Tratamentul unei varietati de plante si animale de origine prima a fost rsaportata in literature si va fi descrisa in sectiunea 2.7.2 si rezultatele in discutia 4.1.

Propritatile materilor prime cum ar fi dimensiunea celulei si structura tesutului vor determina parametrii de procesare ceruti,necesari(Chalmerchat 2005).De obicei celulele de plante si animale au un diametru intr-un interval de 20 pana la 140 de micrometrii aproximativ un ordin de magnitudine mai larg decat celulele microbiene.In cadrul acestei lucrari propritatile materilor prime si constitutia difeitelor plante si maeriale diferite de carne nu pot fi descrise in detaliu dar proprietti relevante pentru aplicatia CEP vor fi discutate in sectiunea 4.

Pentru tesutul de carne este de remarcat ca fiecare fibra a muschilor scheletici este o celula musculara longitudinala singura.Un schelet muscular este format din fibre musculare grupate inconjurat de un tesut conjuctivde acoperire.

12

Fiecare muschi este inconjurat de un tesut conjuctiv pe post de invelis numit epimisium.Tesutul conjuctiv in afara de epismisium separa si incojoara muschii.Fibrele musculare au un diametru intre 10 si 100 de micrometrii dar o lungime de pana la 30 cm, astfel incat impactul unui tratament CEP ar putea arata o dependenta seminificativa pe directia de aplicarea campului electric.Taierea unui muschi de-a lungul directiei de fibre va duce la o distrugere mecanica a celulelor depinzand de marimea pieselor rezultate.

Cererea cutter va provoca un grad mecanic ridicat de distrugerea celulelor de carne in comparatie cu celulele de carne,in cazul in care celulele sunt mai mici ,si au elemente structurale separate.In plus proprietatile structurale si texturale ale carnii sunt in principal determinate de gradul ridicatde proteine si continutul de tesut conjuctiv,intrucat rezistenta tesuturilor din plante sau fructe este in plus fatade unitatile strucurale formate de hidrocoloizi cum sunt celuloza,hemiceluloza sau lignina,de multe ori un rezultat de presiune turgescenta care este pierduta dupa o electropermeabilizare.

Impactul unui tratament CEP pe proprietati structurale ale plantelor sau tesuturilor de animale a fost asteptat sa fie diferit cu privire la acest aspect.In afara de materile prime de asemenea un tratament de formule de produse sau produse finale cum ar fi carnea de carnati sau carnea marinata a fost reliazata,ingrediente cum ar fi sarea sau hidrocoloizii vor influenta conductivitatea tesuturilor precum si unflarea proteinelor si activitatea de legare a apei.Reprezentarea schematica a structurii musculare si dimensiunea acestuia este prezentata in figura 2.8

13

2.6. Designul echipamentului CEP

Componentele necesare pentru o aplicatie a campului electric pulsatoriu sunt un sistem generator de impuls si o camera de tratament.O premisa cruciala pentru o productie economica si eficienta este o operabilitate continua cu o rata mare a capacitatii fluxului care duce la dezvoltatrea unor camere de tratament continue unde alimentele sunt pompate inauntru timp in care sunt expuse la campul electric.

Inaintea tratamentului,schimbatoarele de caldura pot fi folosite pentru a preincalzi mediul. Dupa tratament energia electrica disipata rezultata dintr-o crestere a temperaturii trebuie sa fie indepartata inaintea ambalaii aseptice.Se realizeaza o ambalare aseptica pentru a preveni recontaminarea.Unul dintre principalele avantaje ale utilizarii tratamentului cu CEP este operabilitatea sa continua cu timp de procesare foarte scurt; prin urmare poate fi implementat cu usurinta un sistem in liniile de procesare existente.

2.6.1.Generearea campului electric pulsatoriu

Sistemul de modulatie al pulsului transforma puterea electrica dintr-un nivel de tensiune scazut in pulsuri de mare intensitate ale campului electric.Circuitele simplificate pentru generarea unei caderi exponentiale si pulsurile dreptunghiulare sunt reprezentate in fig.2.9 constand intr-un circuit de incarcare si de descarcare. In primul,un dispozitiv de depozitare a energiei este incarcat pe un rezistor de incarcare de inalta tensiune.Generarea campurilor electrice pulsatorii impun incarcari lente si descarcari rapide de energie, in timp ce latimea pulsului este scurta in comparatie cu timpul dintre pulsuri.Tensiunea de incarcare U0 impune generarea pulsurilor cu rezistenta suficienta ca campurilor electrice si depinde foarte mult de distanta electrodului, pentru doi electrozi plati paraleli rezistenta campului electric E este data de ecuatia 8:

Ecuatia 8

unde U este tensiunea (kV) si d(m) distanta dintre electrozi.Tensiunile aflata intre 10-60 kV se folosesc pentru tratamentul alimentelor.Marind distanta d pentru a obtine o rata a capacitatii fluxului mai ridicata impune marirea tensiunii de incarcare si totodata comutarea stresului sistemului.Puterea electrica este stocata cel mai frecvent intr-o banca de condensatori conectati in serie sau in paralel si descarcati intr-o camera de tratament pe rezistori protectori de inalta tensiune in cateva microsecunde.

Curentul este dependent de rezistenta camerei de tratament si poate atinge cativa kA cand se opereaza cu o camera de tratament cu o rezistenta mica.Cresterea rezistentei sarcinii printr-o configurare potrivita a designului camerei de tratament va duce la curenti mult sub ordinul kA.

O lipsa a scanteiei,care este in principiu un sistem din 2 electrozi cu un arc-over cand este atinsa o cadere de tensiune, prevede o generare a pulsului foarte simpla si realizabila care poate

14

suporta o tensiune ridicata dar este limitata la ratele de repetitie sub 100Hz si maximul duratei de viata de 106 cadre.

Figura 2.9:Circuitele electrice simplificate ale sistemelor de generare a impulsurilor pentru scadere exponentiala(stanga) si pentru valuri patrate de impulsuri(dreapta)

Switch-urile starii solide cade exemplu SCR (silicone,controlled,rectifier,)GTO(Gate Turn-off) sau IGBT(poarta izolata transistor polar)intrerupataorele de circuite necesita mai putine complexe de conducere si sunt usor de manevrat si de controlat de variabilitatea externa de declansare si variabilitatea parametrilor de impulsuri.Repetitia switch-urilor de impulsuri standard pot ajunge pana la cativa KHz potrivite pentru aplicatiile la scara industriala.Limitarile au fost gasite in utilizarea pe termen lung in special atunci cand sunt expuse la inversari actuale in situatii cum ar fi blocarea camerei de tratament sau interferente electromagnetice.Pentru impulsuri de inalta tensiune mai mari de 100 de KV este utilizat frecvent un generator “Marx”inventat de Marx in 1923.In aceasta configurare condensatorii sunt incarcati in paralel si comutati in serie de eclatoare pentru descarcare pentru a creste tensiunea de iesire mai sus de tensiunea de incarcare.

Intr-un sistem de stocare capacitiv, cand comutatorul de inalta tensiune este inchis printr-un semnal de declansare sau dupa ce tensiunea de defalcare a fost atinsa,energia stocata este deversata in sol de-a lungul circuitului de descarcare de gestiune cu un resistor de protectie si camera de tratament cu produsele alimentare.In functie de tipul de comutator si de configuratia circuitului de descarcare de gestiune mai multe forme de unda sunt posibile dar in principal doua au fost folosite:-descompunerea exponentiala si valuri patrate de impulsuri.

15

Generarea unui impuls de descompunere exponentiala necesita un comutator cu capacitatea numai de a activa dupa cum energia totala stocata in banca condensator va fi descarcata.Impulsurile de unda pot fi realizate fie prin descarcarea incompleta de gestiune a unui condensator cu capacitate mare de un cumulator cu capacitate on-off sau un puls mult mai complex de formare de retea oferind un nivel relativ constant tensiunii in timpul impulsului.

Cum switch-urile cu capacitate de a dezactiva sunt greu disponibile pentru sistemele cu cerere mare de putere(Mohan 1995),conexiunile in serie sau in paralel a switch-urilor(Gaudeau 2001)retelele de impulsuri distribuite sau concentrate formate cu mai multe sectiuni de condensatoare si elemente inductive trebuie sa fie folosite.

In acest caz sistemul de generare de impulsuri in special impedanta de linie trebuie sa fie adaptata la sarcina existenta la camera de tratament care este greu de realizat in practica(Zhang 1995) si eventual poate duce la un sistem inflexibil in ceea ce priveste aplicabilitatea pentru tratarea diferitor medii care pot avea o gama larga de conductivitati.Impulsurile val mentin un nivel de tensiune ridicat pentru latimea pulsului total,intrucat impulsurile exponentiale au o coada lunga cu camp electric scazut.Studiile care au comparat eficacitatea diferitelor forme de unda pentru inactivarea CEP au fost efectuate(De Haan si Willcock 2002,Gongora-Nieto 2002,kotnik 2003),care au concluzionat ca ambele sunt posibile pentru inactivarea microbiana dar impulsurile de valuri patrate ar putea economisii energie si necesita mai mult efort de racire.

Pentru o exploatare industriala cu debite mari de rate ridicate repetitia impulsurilor poate creste pana la cativa KHz si sunt necesare la o tensiune inalta intre 40-100 KV si nivelurile actuale mai mari de 100 A care sunt greu de manipulat in special in cazul in care durata de viata a generatiei sistemului de impuls este luata in considerare.Evaluarile pe parcursul vietii variaza de la 106 pentru eclatoare,108 pentru thyrathons si pana la aproximativ 1012 impulsuri pentru intrerupatoare semiconductoare atunci cand functioneaza sub conditii nominale in conformitatea arcului sau operatie sub conditii non-optime vor reduce drastic durata de viata.La o repetare de 1 KHz o durata de viata de 109 impulsuri este intr-o continua functionare de 11 zile.Fiabilitatea in caz de functionare defectuasa, defectarea pompei,a arcului si protectia impotriva scurt circuitului vor fi un parametru essential pentru aplicabilitatea unui comutator si a modulatorului de configurare total de puls.

2.6.2 Designul camerei de tratament

Camera de tratament,in care produsul alimentar este expus la impulsurile campului electric este format din cel putin 2 electrozi,unul pe inalta tensiune precum si alte pe potentiale de teren separate prin materiale izolante in diferite configuratii geometrice.Placile paralele,coaxiale sau buteliile coliniare au fost utilizate in mod obisnuit.Un numar mare de studii au fost efectuate cu stisteme de placa paralele in flux discontinu si mai tarziu in flux continu. Camerele lot ofera mai multe avantaje pentru utilizarile in laborator,volume mici de tratament Media sunt necesare si temperaturi de tratament este usor de intretinut prin racirea electrozilor si prin rata de repetitie lenta.Mai presus de toate numarul de impulsuri pentru fiecare elemnt de volum este bine cunoscut.In afara de produse de nisa pentru camerele de aplicatie industriala continua va fi necesar sa se atinga o capacitate de volum mare si o integrare usoara in produsele alimentare déjà existente.

16

Printre diferitele configuratii de electrozi prezentate in figura 2.10 placile paralele prevad cel mai uniform camp electric intr-o suprafata mare utila prezenta intre placi,dar intensitatea tratamentului este redusa in regiunile de frontiera.In camerele de lot fara a amesteca un produs conduce la schimbari ale pozitiei unei parti considerabile unui volum ce poate ramane sub procesare,de observat sunt:efectele de decantare in cinetica de inactivare microbiana.In camerele continue de tratament acest lucru poate fi prevenit prin adaugarea de zone multiple de tratament in conformitate sau canale derutante de debit(Zhang 1995).Pentru a atinge rata de flux mare cum este necesar pentru aplicatiile industriale,impulsurile trebuiesc aplicate cu o frecventa de repetitie mare ducand la o rapida crestere a temperaturii de mediu.

Mentinerea temperaturii constante poate necesita eforturi mari de racire,punerea in aplicarea canalelor de racire in materialele de electrozi sau de racire intermediara intre zonele multiple de tratament.Electrodul si materialul isolator trebuie sa fie de calitate alimentara si autoclavabile si in plus proprietatile sau electrochimice trebuie luate in considerare.Bushnell (1996) a sugerat oxizi de aur.platina,carbon si metal ca alternativa la utilizarea frecventa a elctrozilor din otel inoxidabil.Eroziunea de electrod si eliberarea de particule metalice in produse alimentare a fost raportate in ultima vreme(Morren 2003;Roodenburg 2003;Toepfl 2003;Mastwijk 2004).Pentru a evita expunerea produsului la suprafata electrodului,Lubiki si Jaiyaram 1997 au dezvoltat un system constituit dintr-o bobina din sticla inconjurand anodul si au confirmat ca inactivarea microbiana poate fi obtinuta chiar si fara contact direct.Tratamentul CEP a alimentelor ambalate a fost discutat in ultimii anii,intrebari ca,cat de efficient poate fi indusa intensitatea unui camp electric sau daca energia pulsului necesar poate fi transferata in produs,vor trebui abordate.O camera coliniara consta dintr-un set de electrozi coliniari cilindrici,separate prin izolatori,in care produsul este pompat prin foraj,fluxul nu este perturbat de nici un impediment.Geometria camerei de tratament are un impact decisive asupra rezistentei sale toatale si prin urmare pe circuitul de descarcare de gestiune.

Raportul dintre rezistenta totala a camerei de tratament si rezistorul de protectie este extrem de importanta dupa cum tensiunea de incarcare aplicata este impartita intre ei.La rezistorul de protectie unde este necesar a preveni distrugerea sistemului de comutare in caz de scurt circuit,o cantitate considerabila de energie poate fi disipata in cazul in care rezistenta sa este in acelasi interval cu cel din camera de tratament.

17

Intrebari si raspunsuri despre CEP

1.Ce este procesarea prin camp electric pulsatoriu?

Procesarea prin camp electric pulsatoriu(PEF) este o metoda non-termica pentru conservarea alimentelor , care utilizeaza impulsuri scurte de electricitate pentru inactivarea microbilor si care nu cauzeaza efecte daunatoare in calitatea alimentelor.PEF poate fi folosit pentru procesarea alimentelor lichide sau semilichide.

2.Cum poate aceasta tehnologie sa aduca beneficii consumatorilor?

Procesarea prin PEF ofera alimentelor lichide proaspete o calitate ridicata, o aroma deosebita ,valoare nutritiva, si o perioada de valabilitate mai mare.De cand se conserva alimente fara utilizarea calduriii,acestea isi pastreaza aroma proaspata,gustul si aspectul.

3.Cum actioneaza PEF?

Procesarea prin PEF implica tratarea alimentelor plasate intre electrozi prin impulsuri de mare tensiune (20-80kv)(de obicei cateva microsecunde).Inalta tensiune produsa provoaca un camp electric care cauzeaza inactivarea microbilor.Dupa tratament alimentele sunt ambalate si depozitate pentru refrigerare.

4.Cum se inactiveaza microorganismele prin PEF?

Tratamentul cu PEF are efecte letale pentru numeroase bacterii vegetative, mucegaiuri si drojdii.Eficienta inactivarii sporilor de catre PEF in asociere cu caldura este un subiect actual de cercetare.O serie de pulsuri electrice scurte, de inalta tensiune rupe membranele celulare ale micoorganismelor vegetative in mediu lichid prin extinderea porilor existenti sau prin crearea unor noi pori.Formarea porilor este reversibila sau ireversibila,ea depinde de intensitatea campului electric, de durata pulsului si de numarul pulsurilor.Membranele celulelor tratate prin PEF devin permeabile pentru moleculele mici; permeabilitatea creeaza umflaturi si eventuale rupturi ale membranei celuare.

5.Ce tipuri de alimente beneficiaza de pe urma tratamentului cu PEF?

Aplicatiile tehnologice ale PEF au fost demonstrate cu success pentru pasteurizarea alimentelor ca: sucuri,lapte,iaurt,oua lichide si supe.Aplicatiile procesarii prin PEF sunt limitate pentru produsele alimentare care nu contin bule de aer sau care au o conductivitate electrica scazuta.PEF este o

18

metoda de procesare continua care nu se foloseste pentru alimentele solide.PEF este polosit de asemenea pentru a spori extragerea zaharurilor sau a altor constituent celulari din celulele plantelor, de exemplu din sfecla de zahar.PEF se aplica si in cazul reducerii namolului din apele uzate.

6.Care este perioada de valabilitate a unui produs tratat prin PEF?

In general, perioada de valabilitate a alimentelor tratate prin PEF este comparabila cu a celor pasteurizate prin caldura.Pasteurizarea prin PEF ucide microorganismele si inactiveaza unele enzime si,daca produsul este acid,necesita depozitare frigorifica. Pentru alimentele lichide termo-sensibile unde pasteurizarea prin caldura nu este o optiune (dauneaza aromei,texturii,sau modifica culoarea), tratarea cu PEF va fi mai avantajoasa.

7.Cum sunt depozitate alimentele tratate cu PEF?

Produsele pasteurizate prin PEF depozitate in depozite frigorifice.In undele cazuri(lapte) acest lucru este necesar pentru siguranta(pentru prevenirea inmultirii sporilor in alimentele cu aciditate scazuta).Pentru alimentele acide refrigerarea nu este necesara, dar se foloseste pentru pastrarea aromei pentru o perioada mai lunga de timp.

8.Este valabil la scara comerciala echipamentul PEF?

Da.In SUA primul echipament commercial de PEF continuu se gaseste la Departamentul de Stiinta si Tehnologie Alimentara din cadrul Universitatii de Stat din Ohio. Technologii diversificateInc., Bedford, MA comercializeaza sisteme PEF pentru procesarea a 500 pana la 2000 litri pe ora iar Universitatea de Stat din Ohio furnizeaza camere de tratament cu PEF.

9.Echipamentul PEF este sigur pentru mediul inconjurator?

Da.Acest procedeu foloseste elecricitate obisnuita. Instalaţia electrica respectă standardele de siguranţă şi nu dauneaza mediului inconjurator prin produsele rezultate in urma procesarii cu PEF.

10.Ce este un sistem de prelucrare continua integrata PEF?

Un sistem PEF integrat costa intr-o unitate de manipulare a lichidului, un generator de puls de inalta tensiune, camere de tratament cu PEF si o masina de ambalat.Unitatea de manipulare a lichidului ofera un flux uniform si stabil, cu functii de sterilizare si curatire a locului.Generatorul de puls ofera pulsuri de inalta tensiune prin alimentele care curg prin camerele de tratament cu PEF.Alimentele tratate sunt ambulate in mod continuu.

19

11.Ce este o camera de tratament cu PEF?O camera de tratament cu PEF este formata din cel putin doi electrozi si izolatie care formeaza un volum,zona de tratament cu PEF,unde alimentele primesc pulsuri.Electrozii sunt confectionati din materiale inerte ca titaniul.

12.Cat de economica este procesarea cu PEF?

PEF este un proces eficient din punct de vedere al energiei comparativ cu pasteurizarea prin caldura.La scara comerciala sistemul PEF poate procesa intre 1000 si 5000 de alimente lichide pe ora.Procesarea cu PEF va adauga numai 0.03-0.07$ per litru la costurile finale ale alimentelor.

13.Ce aprobare este necesara pentru comercializarea unui produs prelucrat prin PEF?

In prezent, cerintele evolueaza,dar cel mai probabil implica planul de dezvoltare al (HACCP) pentru majoritatea sucurilor si bauturilor.

20

14. Sunt disponibile facilităţi pentru dezvoltarea produsului înainte de a se aventura în prelucrarea cu PEF?

Procesatorii de alimente sunt invitati să profite de expertiza facuta de personalul din cadrul universitatii din Ohio,precum şi de facilităţile de a efectua evaluări confidenţiale ale produselor pentru siguranţa alimentară, calitate, şi perioada de valabilitate, şi pentru a obţine indrumare privind dezvoltarea de produse.

21