PROIECT BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE

ndrumtor:Dr.Ing.Alexandra Blaga Student: Abramiuc Alexandru Grupa:2405 (IB)

TEMA DE PROIECTARE:Proiectarea unei instalatii industriale de ontinere a Penicilinei G cu o productivitate de 26 T/AN.

2

CUPRINS Cap.1 Memoriu tehnic Cap.2 Tehnologii de fabricatie5 2.1 Domenii de utilizare si proprietatile produsului...9 2.1.1 Domenii de utilizare....9 2.1.2 Proprietati chimice,fizice si biologice....10 2.2 Variate tehnologice...13 2.3 Alegerea variantei optime....13 2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat. ....15 2.4.1 Elaborarea schemei tehnologice.........15 2.4.2 Materii prime intermediare si auxiliare....30 2.4.3 Mecanismul reactiilor biochimice......42 2.4.4 Cinetica reactiilor biochimice.46 2.4.5 Termodinamica reactiilor biochimice....54 2.4.6 Bilantul de materiale.......58 2.4.7 Consumuri specifice Cap.3 Controlul fabricatiei.73 3.1 Controlul,reglarea si automatizarea proceselor tehnologice....73 3.2 Controlul de calitate.....79 3.2.1 Metode de analiza ale materiilor prime si intermediare.79 3.2.2 Metode de analiza ale produsului finit......90 Cap.4 Produse secundare,deseuri de fabricatie ,epurarea apelor reziduale.91 Cap.5 Utilitati....92 Cap.6 Transport,ambalare,depozitare...93 Cap.7 Norme de prevenire a muncii si PSI....99 7.1. Norme de protec ia muncii................................................................99 7.2. Masuri P.S.I........................................................................................101 Bibliografie.........................................................................................................103

3

Cap.1 MEMORIU TEHNICn cadrul acestui proiect s-a proiectat procesul biotehnologic de obinere a Penicilinei G. Penicilina G este un produs de biosintez produs de diferite microorganisme din clasa Penicillium i Aspergiullius. Penicilina G conine n structura ei un nucleu tiazolidinic. Penicilina G descoperit n anul 1929 de Alexander Fleming reprezint unul din cele mai valoaroase antibiotice de biosintez, avnd o puternic aciune bactericid i bacteriostatic. Procesul tehnologic de obinere a penicilinei G se realizeaz printr-un proces discontinuu de fermentaie n profunzime. Pe baza procesului tehnologic optim adoptat s-a realizat schema bloc a procesului tehnologic de obinere a Penicilinei G. Schema bloc conine fiecare etap necesar procesului de obinere a Penicilinei G. Tehnologia de obinere a Penicilinei G cuprinde urmtoarele faze: pregtirea mediului de cultur fermentaia filtrarea soluiei native separarea i purificarea. n capitolul 2 etapa 2.4.2. sunt relatate materiile prime i auxiliare necesare mediului de cultur. In acest proiect s-au prezentat mecanismulul reaciilor biochimice dar i cinetica i termodinamica procesului.

4

Cap.2 TEHNOLOGII DE FABRICATIE

Industria produselor farmaceutice, ca o ramur important a industriei chimice, se ocup cu descoperirea i ob inerea prin biosintez, sintez, semisintez sau extrac ie din plante sau organe animale de medicamente si substan e cu ac iune biologic. Medicamentele au aparut ca rezultat al dorin ei omului de a- i men ine organismul n perfect stare de sntate. Acestea sunt substan e organice sau anorganice, naturale sau de sintez care prezint n doze foarte mici, anumite ac iuni farmacodinamice. nceputurile utilizrii medicamentelor, pentru men inerea strii fizice normale i ameliorarea durerilor, pornesc din antichitate, unde medica ia avea un caracter empiric, bazat pe observa ii accidentale, repetate si acumulate, cu privire la efectele plantelor asupra organismului uman. n evul mediu apar primele medicamente de origine mineral datorit dezvoltrii alchimiei, totodat extractele de plante devin mai pure. Se introduc in pactica terapeutic medicamentele anestezice, saruri de mercur i argint. Dezvoltarea spectaculoas a chimiei secolului al XIX-lea a permis identificarea i separarea n stare pur, a principiilor active din plante, precum i sinteza unui mare numar de substan e chimice cu propriet i terapeutice. n 1803 se separa din plante morfina, apoi stricina, nicotina, atropina, codeina si cocaina si multe alte produse utilizate astzi n terapia modern. Sub impulsul acestor descoperiri s-au sintetizat o serie de substan e organice care i-au gsit imediat aplicarea in medicin: eterul etilic(1846), cloroformul(1849), acidul salicilic(1887), novocaina, aspirina etc. Datorit calit iilor terapeutice ridicate ale acestor substan e, fabricarea lor prse te laboratoarele si revine unei noi aparute industrii specializare: industria farmaceuric. Industria medicamentelor , unul dintre cele mai eficiente sectoare ale industriei chimice, se caracterizeaz n esen prin: 5

- valorificarea superioar a materiilor prime furnizate de industria organic i petrochimic - ob inerea unei game largi de medicamente printr-un numr redus de transformri chimice - existen a sec iilor specializate pe un anumit produs, alturi de instala ii cu caracter universal - asimilarea permanent de produse noi - nbunt irea calit ii medicamentelor prin modelarea i optimizarea tehnologiilor existente [1,11,14] Datorit variet ii mari de medicamente denumirea lor reprezint o problem, drept dovad, faptul ca n prezent, nu s-a reu it s se stabileasc denumiri comune pentru toate podusele. Numele lor a fost ales in mod arbitrar, fapt care a generat confuzii. De exemplu, sulfanilamida se ntlne te sub 60 de denumiri, iar aspirina sub 91 de denumiri. In acest sens, medicamentele se gsesc sub urmtoarele denumiri: - denumire nregistrat sau denumire depus - denumire comun interna ional - denumire chimic Denumirea nregistrat. Ob inerea industrial a medicamentelor se poate realiza dupa diverse proceedee care, de obicei, sunt brevetate, iar n cadrul brevetului este nregistrat i o denumire a produsului propus de fabricant. n acest mod apar mai multe denumiri pentru unul i acela i medicament i se eviden iaz firma productoare. Denumirea comun interna ional. Organiza ia mondial a snt ii inpune utilizarea denumirilor comerciale interna ionale. Acestea nu trebuie s fie lungi i s se bazeze pe nrudirea farmacologic i chimic.S-au propus o serie de silabe sau grupe de silabe ce definesc categorii de medicamente si care se gsesc la sfr itul denumirii produsului. Denumirea chimic este specific fiecrui produs, iar utilizarea ei alturi de denumirile comune interna ionale i de cele nregistrate, evit confuziile ce pot aprea i ofer informa ii asupra structurii chimice. n continuare, tot pentru evitarea confuziilor, n literarur se folosesc toate cele trei tipuri de denumiri. [1,19,20] Clasificarea medicamentelor. Dou criterii principale sunt adoptate pentru clasificarea medicamentelor, si anume: clasificarea dup structura chimic i clasificarea dupa ac iunea farmacologic. Clasificarea dup structura chimic are avantajul de a grupa medicamentele pe clase chimice i e func iuni organice, dar nu ine cont de aplica iile terapeutice ale acestora, i prin aceasta este rupt de practic. Mai mult, produse din aceea i clas au ac iuni fiziologice total diferite. Astfel naftazolina i tolazolinul de i sunt imidazoline au ac iuni farmacologice opuse: prima este un medicament vascoconstrictor, iar a doua este vascodilator puternic.

6

Naftazolina

Tiolazolinul

Clasificarea dup ac iunea biologic area avantajul de a grupa pe ac iuni farmacoterapeutice toate tipurile de substan e cu efect biologic apropiat sau sinergic. Se foloseste in literatur clasificarea dupa ac iunea biologic, urmat de o subclasificare pe baza structurii chimice. Dupa acest criteriu, medicamentele se clasific n dou clase pricipale: medicamente chimioterapeutice i medicamente simptomatice. Medicamentele simptomatice stimuleaza sau deprim func iile fiziologice sau biochimice intr-un mod care poate fi prevzut, astfel nct acestea s poat fi utilizate pentru a modifica evoli ia unei boli. Ele nu ac ioneaz asupra cauzei care produce boala, dar anihileaz simptomele cauzate de aceasta. Din aceast categorie fac parte medicamentele sistemului nervos central i vegetativ, medicamentele aparatelor(respirator, cardiovascular, renal, digestiv, genital), medicamente metabolice, substan e hormonale i antihormonale, enzime. Medicamentele chimioterapeutice sau etiologice ac ioneaz direct asupra cauzei care produce nbolnvirea, iar distrugerea organismelor patogene favorizeaz vindecarea organismului bolnav. Din aceast categorie fac parte antibioticele, medicamentele antimalarice, medicamente antituberculoase. Aceste medicamente trebuie sa posede ac iuni farmacodinamice minime i antimicrobiene maxime. [1,20,21] Antibioticele sunt medicamente chimioterapice produse de microorganisme i au proprietatea de a ncetini multiplicarea unor organisme patogene(viru i, ricketsii, protoplaste, bacterii), implicate etiologic n diferite boli i sindroame infec ioase i au rolul de a le distruge. Provenind din metabolismul celulelor vii, cu structuri extrem de variate, aceste medicamente se obtin in general prin fermenta ie. Biosinteza in cazul penicilinelor se face cu microorganisme specifice, in general, fungi de tipul Penicillium. In func ie de natura chimica a antibioticului, separarea se face prin extrac ie cu solven i organici, prin sorb ie pe schimbtori de ioni, prin adsorb ie pe crbune sau alumin. Clasificarea antibioticelor. O clasificare generala a antibioticelor se refer la grupul de agen i patogeni asupra crora sunt active antibioticele. Astfel, avem: 1. Antibiotice antibacteriene: Gramicidina, Bacitracina, Polimixinele 2. Antibiotice antifungice: Penicilinele, Grizeofulvina 3. Antibiotice antituberculoase: Streptomicina 4. Antibiotice antivirale: Aciclovir, Amantadina, Vidarabin 7

5. Antibiotice cu ac iune mpotriva protozoarelor i metazoarelor: antimalarice, antihelmintice 6. Antibiotice cu ac iune antitumoral. Un alt criteriu de clasificare este mecanismul de ac iune mpotriva infec iei: 1. Ac iune asura peretelui celular, cu efect bactericid, numai n faza de multiplicare a bacteriilor: Penicilinele G i V, Oxacilina, Ampicilina, Carbenicilina, Cefalosporinele 2. Ac iunea asupra membranei citoplasmatice, cu efect bactericid: Polimixina B, Colistina, Amfotericina B 3. Ac iune de inhibare a sintezei proteinelor, la nivelul ribozomilor, cu efect bactericid in faza de multiplicare i de stagnare a bacteriilor: Streptomicina, Gentamicina, Tobramicina, Kanamicina, Neomicina, Tetraciclinele, Cloramfenicol, Eritromicina, Lincomicin 4. Ac iune de inhibare a sintezei acizilor nucleici, cu efect bacteriostatic i bactericid: Novobiocina, Rifampicina, Griseofluvina, Acidul nalidixic 5. Ac iune competitiv prin substituire de metaboli i analogi. Aici se incadreaz sulfamidele care nu sunt antibiotice, dar posed efect bacteriostatic i bactericid. n func ie de structura chimic antibioticele se grupeaz n: 1. Beta-lactamice: Peniciline, Cefalosporine 2. Aminoglicozidice: Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, Amikacina 3. Polipeptide ciclice: Colistina, Polimixina 4. Tetraciclinele: Doxicilina 5. Macrolide: Eritrimicina Dup spectrul antimicrobian exist: 1. Antibiotice cu spectru ngust de tip penicilinic 2. Antibiotice cu spectru ngust de tip streptomicinic: aminoglicozide, polipeptide 3. Antibiotice cu spectru larg i foarte larg de ac iune: Tetracicline, Cloramfenicol, cefalosporine din genera ia a II-a i a III-a 4. Antibiotice de nlocuire, in cazul apari iei fenomenului de rezisten : macrolidele, lincosamdele, rifampicina 5. Antibiotice de rezerv, toxice: Vancomicina 6. Antibiotice de excep ie: Fosfomicina [2,33-34] Penicilinele de biosintez fac parte din clasa antibioticelor lactamice, i sunt substan e chimice produse de diferite specii de microorganisme din clasa Penicillium notatum i Penicillium crysogenum. Penicilinele con in n structura lor un nucleu tiazolic, condensat cu unul tetragonal, diferind ntre ele prin natura radicalului R.

8

Pentil Metil p-aminobenzil p-hidroxibenzil 2-pentil Benzil Heptil L-4-amino-4carboxi-butil Alil-mercaptometil 3-clor-2-buteniltiometil Fenoximetil

Radicalul R CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 CH 3 H 2 N-C 6 H 4 -CH 2 HO-C 6 H 4 -CH 2 CH 3 -CH=CH 2 -CH 2 -CH 2 C 6 H 5 -CH 2 CH 3 -(CH 2 -) 5 -CH 2 CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH(NH 2 ) (COOH)CH 2 =CH-CH 2 -S-CH 2 -

Dihidropenicilina F Metilpenicilina Penicilina T Penicilina X Penicilina F Penicilina G Penicilina K Penicilina M Penicilina O

CH 3 -CCl=CH-CH 2 -S-CH 2 -

Penicilina S

C 6 H 5 -O-CH 2 -

PenicilinaV

(2,35) n secolul trecut, 1929, Alexander Fleming descoper penicilina G i o introduce n tratament n 1941. Penicilina G este unul dintre cele mai de pre antibiotice de biosintez, cu o puternic ac iune bactericid i bacteriostatic. Ini ial, penicilina a fost produs de subculturile de Penicillium notatum, ulterior, s-a descoperit c i Penicillium crysogenum, citro-roseum, ribrum, i unele specii de Aspergillus secret penicilin. Men inerea tulpinilor la un nivel inalt de productivitate s-a realizat prin culturi succesive ale tulpinelor tinere, viguroase, i utilizndu-se uscarea tulpinilor prin liofilizare. (3,46) 2.1 Domenii de utilizare i proprieta ile produsului Dintre penicilinele de biosintez, n practica medical au fost introduse penicilina G, sub form de sruri de porasiu, sodiu sau cu amine. 2.1.1 Domenii de utilizare Potrivit statisticilor, anual se produc cca. 26000 tone penicilina G la nivel mondial. Domeniile de utilizare ale acesteia sunt urmatoarele: - utilizare n terapeutic: 13% - ob inerea de acid 6-aminopenicilanic: 65% - ob inerea de acid 7-desoxicefalosoranic i al i intermediari: 20% 9

- alimenta ie: 2% (2,30) n cazul utilizrii terapeutice a penicilinei G, aceasta prezint o toxicitate sczut, fiind activ impotriva agen ilot patogeni de tipul bacililor gram pozitivi, a cocilor gram pozitiv i negativ, fiind recomandat n angine streptococice, erizipel, scarlatin, pneumonie streptococic, otite, sinuzite, antrax, difterie, sifilis, blenoragie. Deasemenea este utilizat n profilaxia antitetanic i cea a infec iilor prin mu cturi de animale. Nu este utilizat n cazul infec iilor cu agen ilor patogeni secretori de penicilinaz (stafilococii de spital) care sunt rezisten i la ac iunea antibioticului. (3,46) Penicilina G se prezinta cu formula bruta: C16H18O4N2S, masa moleculara M m =334 moli/g. In comert la noi in tara se gaseste sub denumirile Penicilina G sodica si Penicilina G potasica produse fabricate de S.C. Antibiotice S.A.

(2S,5R,6R)7-oxo-6-(2-

3,3-dimetill-

fenilacetamido)-4-thia-1-aza-biciclo[3.2.0]heptan-2-carboxilat 2.1.2 Propriet ile produsului Propriet i fizice Penicilina G se prezint sub forma unei substan e albe, cristaline, solubile in ap i solven i organici, insolubil n eter, cloroform, uleiuri grase, parafin. p.t.=80C Miros slab, caracteristic, gust amar. Substan higroscopic. (1,86) Propriet i chimice . Penicilinene sunt instabile n prezen a acizilor, alcalilor, oxidan ilor, alcoolilor, metalelor grele i la temperaturi ridicate. Penicilina i i pierde propriet ile in solu ii cu pH acid mai mic de 5 sau bazic mai mare de 8. (4,3) In solu ii apoase prezint pH= 5,5-7,5. Prezint trei atomi de carbon asimetrici (C 3 , C 5 ,C 7 ), fiind optic activ cu D 2 0 +241 Produsul ini ial rezultat prin hidroliza nucleofil (prezen a lactamazelor, a penicilinazelor sau a ionilor metalici) a penicilinei este acidul peniciloic, biologic inactiv, acesta prin acidulare pierde o molecul de CO 2 trecnd n acid peniloic. ac. peniciloic ac. peniloic

10

Sub aciunea clururii mercurice, acidul peniloic se degradeaz la aldehid penilic i penicil amin.

Penicilinele reacioneaz nucleofil cu hidroxiamina formnd acizi hidroxiaminici:

In reacia cu alcooli a penicilinelor se formeaz esteri:

In prezenta de alchilamine, penicilinele formeaza alchilamide.

11

In mediu acid, penicilinele (1) izomerizeaza la acid penicilinic (10), printr-un mecanism implicand structura de tranzitie oxazolonica(11). Daca concentratia acidului este mare atunci structura oxazolonica trece in acid penicilinic (12) care izomerizeaza rapid fie in acid penilic (10), fie in acid peniciloic(2), functie de pH-ul mediului. La o valoare mai mare a pH-ului, acidul penicilinic trece in aldehida penilica (5) si penicilamina (6). (1,82,83)

Proprietai biologice Penicilina G se prezint sub form de sruri de sodiu sau potasiu fiind activ bacteriostatic i bactericid fa de bacili i coci grampozitivi. (1,86) n studiul aciunii biologice a antibioticelor se urmrete stabilirea relaiei dintre structura chimic a medicamentului i aciunea sa farmacologic pe de o parte, 12

iar pe de alta se caut determinarea naturii i a structurii chimice a receptorilor i modul de interaciune ntre receptor i medicament. De exemplu, cunoscndu-se aciunea anestezic a cocainei s-a sintetizat novocaina care este mai ieftin i mai accesibil. Proprietile biologice a penicilinei sunt date de structura chimic, proprietile fizice i chimice, conformaia spaial, natura interaciunilor cu receptorul, viteza de metabolizare. (1,25) Penicilinele au ca mecanism de aciune, impiedicarea formrii peretelui celular, prin legarea transversal a lanurilor aparinnd unui polimer peptidoglicanic, format dintr-un lan de uniti N-acetilglucozamin-acid N-acetilmuramic, cu lanuri de pentapeptid-entaglicin, ataate perpendicular. Legtura dintre glicina terminal a pentaglicinei i D-alanin o realizeaz transpeptidaza membranar. Penicilinele se cupleaz cu transpeptidaza, o blocheaz, imiedicnd astfel formarea legturilor transversale , care asigur existena peretelui bacterian. Celulele microbiene, lipsite de perete, sunt expuse tensiunilor osmotice i mor. Bacteriile care nu au perete celular nu sunt sensibile la aciunea penicilinelor. Penicilinele pot aciona asupra funciei enzimatice a proteinelor, ducnd la autoliza unora dintre bacterii, sau la inhibarea creterii. (3, 44) Administrarea penicilinei se face intramuscular, intravenos sau intrarahidian, la intervale de 6 ore. Eliminarea se produce pe cale renal, n form nemodificat.

2.4. Descrierea procesului tehnologic Procesul tehnologic de obinere a penicilinei G se realizeaz prin procedeul discontinuu de fermentaie n profunzime care prezint o serie de avantaje precum: pericolul de infectare a mediilor de cultur este redus randament ridicat procesul este omogen costuri de investiie reduse

Obinerea penicilinei G s-a efectuat dupa urmtoarea schem bloc:

13

Hidrati de carbon Extract de porumb Saruri nutritive Aer nesterilPregatire mediu de cultura

Abur, 5 a.t.a. Penicillium crysogenum Sterilizare m.c. Condens Ag. antispumant Acid fenilacetic Fermentatie Sterilizare aer

Filtrare Masa celulara Acetat de butil Sol. dil. H 2 SO 4 Extractie Faza apoasa Reextractie Sol.NaCO 3 Butanol Distilare azeotropa Solventi reziduali

`CH 3 Cl 3 butanol

Filtrare, spalare pe

Uscare

Pe ni c G ilina

14

2.4. Descrierea procesului tehnic adoptat. Tehnologia de obtinere a Penicilinei G cuprinde urmatoarele faze: 1.Pregatirea mediilor de cultura 2.Sterilizarea mediilor de cultura si a aerului 3.Fermentatia biochimica 4.Filtrarea solutiilor native 5.Separarea si purificarea penicilinelor

1.Pregatirea mediilor Mediul de cultura reprezinta substratul nutritiv care contine complexul de substante folosite pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor in conditii artificiale. Pregatirea mediului consta in dizolvarea in apa a componentilor acestuia conform retetei pentru fiecare faza a procesului de fermentatie. Mediul de cultura trebuie sa contina hidrati de carbon:, saruri minerale, surse de azot oragnic si anorganic, precursori si apa. Deoarece sterilizarea mediului de cultura de face cu abur direct, cantitatea de apa ce se adauga la prepararea mediului de cultura este mai mica cu o cantitate egala cu cea a aburului care condenseaza in timpul sterilizarii. Pregatirea mediilor de cultura se face in aparate destinate acestui scop, prevazute cu agitatoare, conducte pentru abur, serpentine de incalzire respectiv racire. In aceste aparate se introduce apa, se incalzeste la 50-60C, apoi se adauga extractul de porumb principala sursa de aminoacizi- si se fierbe timp de 30-60 minute.Dupa aceasta, solutia se raceste la 50-60C si se adauga restul componentilor mediului in urmatoarea ordine: CaCO 3 , NH 4 NO 3 , NaSO 4 , MnSO 4 , KH 2 PO 4 , ZnSO 4 , lactoza, glucoza.

15

Componenii mediului de cultura pe faze de fermentaie: Componenii mediului de Inoculator cultur Extract de porumb 2 Lactoz 0,5-0,6 Glucoz 3-3,5 Fin de soia CaCO3 0,7-0,8 KH2PO4 0,1 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 MnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu Ap pn la 100% Intermediar 2-3 3-3,5 1,2 0,7 0,2-0,3 0,12 0,06 0,2 0,016 Regim 2,5-2,8 6-7 2-3 0,3 1,2-1,3 0,5-0,6 0,3 0,06 0,002 0,002 0,4 0,8

Mediul de cultur astfel realizat va cuprinde urmtoarele surse de carbon: lactoza i glucoza. Glucoza, sau dextroza, reprezint o excelent surs de carbon i energie, utilizatpentru producerea de antibiotic. n special se folose te pentru stimularea cre terii microbiene, ns poate genera i efecte nedorite, de tipul inhibi iei de substrat,indezirabile la producerea de metaboli i secundari, cum sunt penicilinele. Aceste efecte pot fi diminuate prin dou cai: - modelarea adaosului de glucoz n etapa de cre tere a biomasei, astfel nct s se ajung la viteze maxime de cre tere i s se reduc la minim concentra ia glucozei; - utilizarea zaharurilor cu vitez lent de metabolizare, cum este lactoza, care poate elibera glucoz i galactoz prin hidroliz enzimatic, n concentra ii departe de valoarea inhibitorie. [5.61-62] Lactoza, dizaharid reductor ( 4 D galactozido D glucoz ), se folose te n stare pur numai pentru biosinteza antibiotecelor, n mod deosebit la ob inerea penicilinei. [5.63] Surse de azot Necesarul de azot pentru mediul de cultur este asigurat de sursele organice naturale sau sintetice i din sursele anorganice. Microorganismele sunt capabile, n mod obinuit, s biosintetizeze toate tipurile de molecule de azot (aminoacizi, proteine)

16

plecnd de la ionul amoniu (NH4+) n funcie de energia existent, timp i gradul de tratare mutagen a suei cultivate. Viteza de cretere a microorganismelor atinge valori ridicate numai dac mediul conine surse organice de azot. Pentru culturile industriale folosite la obinerea de penicilina G, necesarul de azot este asigurat de extractul de porumb i fina de soia. Aceste surse natrale sunt bogate n proteine i aminoacizi, coninnd i acizi nucleic, vitamine, oligoelemente, lipide, zaharuri, compui cu sulf i fosfor. Prezena ionului amoniu n mediile necesare fermentaiilor industriale favorizeaz metabolizarea proteinelor, dar i formarea de produse din categoria antibioticelor. [5.66] Sruri minerale n biosintez, srurile minerale sunt compui folosii drept surse de: - elemente constitutive ale produselor: Na2SO4, ZnSO4, MnSO4, tiosulfat de sodiu; - elemente constitutive ale biomaselor: CaCO3, KH2PO4, NH4NO3; - modificatori ai presiunii osmotice i ai permeabilitii membranelor celulare: CaCO3; - ageni de complexare i de precipitare: ionul sulfat SO42- ( Na2 SO4, Mg SO4, KH2SO4 ). [5.67-68]

Precursori Precursorii sunt compui organici sau anoganici, care atunci cnd sunt adugai n mediul de cultur intervin ca molecule intermediare n biosintez sau dirijeaz biosinteza ctre o anumit direcie. Acidul fenilacetic dirijeaz procesul de biosintez ctre obinerea de penicilin G, folosind ca microorganism productor Penicillium Chrysogenum. Astfel se favorizeaz atingerea unor randamente ridicate de biosintez. Prin activitatea lor, extrem de eficient, n procesele de biosintez, precursorii sunt considerai componente ce nu lipsesc din mediile de cultur, iar pentru a evita efectele inhibitorii acetia se vor aduga treptat, meninndu-se o concentraie constant. [5.68] Reglatori ai proceselor de biosintez n biosinteza antibiotecelor se pot folosi unele molecule organice sau anorganice, ce acioneaz ca inductor, activatori sau represani. Un exemplu tipic este ionul fosfat (PO43-), prezent prin KH2 PO4, care dup o anumit concentraie devine un inhibitor pentru acumularea produselor utile. ). [5.69]

17

2.Sterilizarea este procesul prin care are loc distrugerea sau indepartarea microorganismelor patogene sau apatogene din substante, preparate, spatii inchise, obiecte etc. Metodele diferite de sterilizare se pot clasifica dupa urmatoarele criterii: a. metode termice: - sterilizare cu aer cald la 140-200C - sterilizare cu vapori de apa sub presiune la 120-140C - sterilizare prin incalziri repetate la 70-100C b. metode fizice: - filtrare prin umpluturi fibroase - filtare prin materiale poroase - filtrare prin membrane - utilizarea radiatiilor UV, IR, raze X, etc. c. metode chimice: - utilizarea agentilor chimici : oxid de etilena, formaldehida, fenol, ozon, etc. [7,80] Sterilizarea mediilor de cultura se poate realize prin metode mecanice(filtrare, centrifugare, flotatie, electrostatic), pe cale termica, cu agenti chimici sau cu unde electromagnetice. S-a ales ca posibilitate de sterilizare a mediului de cultura din industria de biosinteza, sterilizarea cu abur. Procedeul de sterilizare cu abur este foarte simplu si permite obtinerea unui grad inalt de sterilitate. Acest procedeu prezinta totusi o serie de dezavantaje date de reactiile secundare pe care le sufera principalele componente ale mediului in timpul procesului: - denaturarea proteinelor si inactivarea enzimelor - degradarea artiala a vitaminelor si a anumitor factori de crestere - supraincalziri ce pot initia reactii chimice. Aceste dezavantaje sunt diminuate prin alegerea judicioasa a procesului, care este totusi cel mai sigur. Procedeul de sterilizare termica a mediului de cultura poate fi realizat prin procedeu continuu sau discontinuu, utilizand drept sursa de incalzire aburul sau energia electrica. Deoarece sterilizarea directa in fermentator prin proedeu discontinua la 120C necesita un timp mare si degradarea mediului este mai avansata, se alege procedeul de sterilizare mediului de cultura in instalatia continua. [6, 27]

Sterilizarea continua a mediilor de cultura la 120-125C

18

Pentru sterilizarea unor cantitati mari de medii de cultura se recomanda utilizarea proceselor continue de sterilizare care prezinta o serie de avantaje: o conservarea mai buna a proprietatilor nutritive ale mediului o control superior al calitatii o utilizarea rationala a consumului de abur o eficacitate si productivitate sporita o control automat Realizarea in conditii optime a procesului impune un control al spumarii mediuliu si a vascozitatii acestuia. Pentru sterilizarea continua a mediilor de cultura se folosesc instalatii industriale care lucraza la 120-125C.

Instalatia este compusa din trei parti distincte: coloana de sterilizare, mentinator si racitor. Coloana de sterilizare este formata din doua tevi concentrice: prin teava interioara trece aburul de 5 a.t.a, iar prin spatiu inelar circula mediul supus sterilizarii. In coloana de sterilizare are loc incalzirea mediului pana la 120C, dupa care acesta este trecut prin mentinator si racitorul teava in teava, pentru desavarsirea procesului de sterilizare si racirea la 35-40C. Din diagrama timp-temperatura pentru sterilizarea continua la 120-125C rezulta ca incalzirea mediului cu abur direct de 5 ata in coloana de sterilizare se face in 4-5 secunde, iar timpul de mentinere(1519

20minute) permite o distrugere a tuturor microorganismelor patogene capabile de multiplicare in conditiile din fermentator. In acest procedeu, contributia perioadei de racire si de incalzire fiind de 5-6%, se poate considera ca procesul de sterilizare are loc numai in mentinator. [6,36]

C

35-40C

Sterilizarea aerului. Procesele industriale de fermentatie sunt aproape in totalitate procese aerobe si in marea lor majoritate aseptice. Necesarul orar de aer steril variaza intre 60-120 m 3 aer/m 3 mediu de cultura. In sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificultati generate, pe de o parte de varietatea microoganismelor prezente si de rezistenta lor la temperaturi uscate si pe de alta de limitele largi ale dimensiunilor acestora. [5,110] Pentru sterilizarea aerului au fost propuse urmatoarele metode: - sterilizare termica - sterilizare cu raze ionizante sau untra-violete - sterilizarea cu agenti chimici - sterilizarea prin filtrare Pentru sterilizarea prin filtrare se pot folosi urmatoarele materiale filtrante: - fibre de sticla cu diametru intre 5 si 18 - nitrat de celuloza pentru filtru cu membrana - teflon cu o rezistenta termica mare(300C) si caracter hidrofob - poliamida In sterilizarea prin filtrare aplicabilitate practica: - filtrul cu fribra de sticla - filtre disc cu membrana - filtre-lumanare exista trei tipuri de filtre cu

Filtrul cu fibre de sticla este alcatuit dintr-un strat de material filtrant fixat intre doua site, sustinute de doua placi perforate( cu diametrul perforatiilor de 0.7-0.8 cm). Filtrul este prevazut cu manta de 20

incalzire, care permite uscarea materialului filtrant sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru ofera posibilitatea sterilizarii unor debite ridicate de aer, realizarea unui grad inalt de purificare si durata indelungata de functionare.

21

3.Fermentatia. Este faza fundamentala a procesului de biosinteza si se realizeaza in trei etape: - inoculator - intermediar - regim Aceste etape corespund unor faze de dezvoltare a microorganismelor. Astfel, in inoculator se petrece procesul de aclimatizare a Penicillium crysogenum la noile conditii de dezvoltare, in intermediar incepe cresterea exonentiala a numarului de microorganisme, iar in regim se termina procesul de crestere a microorganismelor si de formare a penicilinei. Aceasta etapizare reprezinta o imagine generala si putin idealizata a procesului de biosinteza, deoarece chiar in intermediar incepe procesul de elaborare a penicilinelor ca rezultat al distributiei varstelor microorganismului. Acumularea unor cantitati mari de masa moleculara face ca volumele fermentatoarelor, in care are loc procesul, sa creasca in raport zecimal. Eficacitatea procesului de biosinteza este determinata de conformatia genetica a tulpinei. Tulpina utilizata este P. Crysogenum Q176 a carei potenta a fost ridicata foarte mult prin procese de mutatie. O tulpina buna se caracterizeaza prin capacitatea mare de inmultire, utilizare rapida a azotului si a precursorului, lipsa pigmentilor in biomasa si miceliu fibros. Procesul de fermentatie cuprinde trei faze distincte: - faza de crestere - faza de producere - faza autolitica Faza de crestere se caracterizeaza prin acumularea de masa miceliana si utilizarea intensiva a componentelor mediului de cultura. Glucoza este asimilata foarte rapid atat pentru formarea masei celulare, cat si pentru formarea energiei necesare. Cerintele de oxigen sunt maxime in aceasta perioada, iar activitatea respiratorie, volumul de CO 2 degajat este mare. Faza de producere a penicilinelor se caracterizeaza prin incetinirea cresterii miceliului fie datorita epuizarii constituentilor usor asimilabili, fie altor conditii existente cum ar fi scaderea consumului de oxigen, mentinerea pH-ului la 6.8-7.5 si acumularea de penicilina. In aceasta faza lactoza este folosita lent de catre miceliu si furnizeaza energia necesara proceselor de biosinteza sau pentru formarea constituentilor celulari. Faza autolitica corespunde stadiului in care microoganismele se epuizeaza ca urmare a activitatii metabolice prelungite, iar sursele de carbon din mediu sunt consumate. Continutul de azot al miceliului descreste considerabil si incepe procesul de autoliza al acestuia cu elibereare de amoniac si cresterea pH-ului peste 8. Producerea

22

penicilinelor inceteaza si apare un proces de hidroliza alcalina a penicilinelor formate. In practica industriala nu este permisa prelungirea fermentatiei pana la aparitia autolizei. Cantitatea de peniciline formate intr-o fermentatie biochimica normala este rezultatul imbinarii rationale a urmatorilor factori: - conformatia genetica a tulpinii care decide caacitatea de producere a penicilinelor - folosirea unor constituenti adecvati in mediu si un echilibru corect in proportiile acestora - mentinerea pH-ului la un nivel optim in mediul de fermentatie - dozarea corecta a raportului intre hidratii de carbon - adaugarea de precursori care vor decide natura catenei laterale si tipul de penicilina produsa - asigurarea necesitatilor de substante minerale - mentinerea temperaturii optime Din datele existente in literatura se poate se poate trage concluzia ca pH-ul afecteaza vitezele reactiilor enzimatice, permeabilitatea membranelor celulare si gradul de ionizare a sarurilor. Pentru faza de crestere a masei celulare pH-ul optim este de 4.55.0, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7.0-7.5. Prin urmare, procesul va trebui condus inter cele doua etape in regim diferit. Nu se recomanda depasirea pH-ului de 7.5 deoarece incepe procesul de autoliza insotit de degradarea penicilinelor formate. Mentinerea pH-ului la valoarea 7 in ultima parte a ciclului de fermentatie asigura valori ridicate pentru vitezele de respiratie si elaborare de peniciline. Regimul optim de temperatura este de 25C cu o toleranta de un grad, iar necesarul de aer, deoarece este un proces aerob, este de 1-1.5 l aer/l mediu x min., la o turatie a agitatorului elicoidal de 110-140 rot/min. [6,182,183] . Viteza de dizolvare a oxigenului creste cu turatia agitatorului, dar acesta nu poate depasi anumite limite deoarece se ajunge la deteriorarea mecanica a biomasei. Mecanismul de transfer al oxigenului din bula de aer la celula in sistem eterogen gaz-lichid-solid implica urmatoarele etape: difuzia oxigenului molecular prin filmul de aer dizolvarea oxigenului la interfata gaz-lichid difuzia oxigenului solvit prin filmul de lichid difuzia oxigenului solvit in intreaga masa difuzia oxigenului solvit prin filmul de lichid de la suprafata microorganismelor difuzia oxigenului prin membrana celulara reactia de consum a oxigenului

23

Din datele existente in literature de specialitate rezulta ca in sisteme eterogene gaz-lichid-solid, bine agitate, viteza procesului de transfer de masa al oxigenului este determinate de difuzia oxigenului dizolvat prin filmul de lichid. [1,92] Compozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza deoarece, in dezvoltarea sa, microorganismele au nevoie de surse de hidrati de carbon, azot, substante minerale si precursori. Sursele de hidrati de carbon sunt necesare pentru dezvoltarea microorganismelor si pentru producerea penicilinei. Este necesar sa se mentioneze ca biomasa unei molecule asa de complexe, necesita un flux de energie din exterior, procesul fiind endoterm. Prin urmare, biosinteza penicilinelor se poate realiza numai daca se desfasoara simultan si procesele de oxidare ale hidratilor de carbon care constituie sursa principala de energie. Oxidarea lenta a lactozei elibereaza o energie ce depaseste cu 66kJ/l mediu de cultura energia necesara sistemului ; din aceasta cauza procesul de biosinteza in ansamblu este exoterm. Viteza de utilizare a hidratilor de carbon se inscrie in urmatoarea schema: glucoza acid lactic lactoza; fapt care confirma ca in faza de crestere a microorganismelor se consuma glucoza, iar in faza de producere a penicilinelor se consuma lactoza. Introducerea fructozei sau lactozei in locul glucozei are ca efect scaderea brusca a vitezei de crestere a masei celulare. Sursele de azot sunt necesare pentru formarea grupelor aminice si obtinerea acozilor aminici. Se utilizeaza azot mineral din saruri de amoniu si azot organic furnizat de aminoacizii si peptidele din extractul de porumb. Prezenta substantelor minerale este vitala in pocesul de crestere deoarece ele afecteaza direct permeabilitatea membranei sau intra in sistemele enzimatice. Astfel KH 2 PO 4 ofera K 3 - entru activarea unor sisteme enzimatice si PO + pentru fosforilare. Necesarul de substante minerale pentru fazele de crestere a masei celulare si elaborarii de peniciline pentru P.crysogenum Q174 este urmatorul: Element Potasiu Magneziu Fosfor Fier Sulf Valori exprimate in mg/l mediu Cresterea ciuercii Producerea penicilinei 40 40 8 8 80 200 0.2 7 70 100

Dirijarea procesului de biosinteza spre obtinerea Penicilinei G se face cu ajutorul cu 24

ajutorul unei substante care este inglobata in catena laterala si poarta numele de precursor. Acesta este acidul fenilacetic. Precursorul se adauga in portiuni deoarece in concentratii mai mari de 0/1-0/2% sunt toxici pentru microorganisme. Procesul de formare a penicilinelor fiind aseptic, sterilizarea aparatelor se face cu abur la 120-125C, iar mentinerea sterilitatii in timpul procesului este asigurata de suprapresiunea creata prin barbotarea aerului steril necesar biosintezei. Procesul de fermentatie se realizeaza in fermentatoare cilindrice verticale contruite din otel inoxidabil, echipate cu agitator elice sau turbina, serpentina pentru racire, conducta pentru aerare, dispozitive spargere-val, teaca termocuplu, filtru individual de aer si rezervor de antispumant. Fundurile fermentatoarelor sunt sudate pentru a asigura un grad sporit de securitate impotriva infectiilor, iar stuturile au garnitura metalica pe toata suprafata flanselor de legatura. Dinamica procesului de fermentatie a penicilinelor Controlul procesului de fermentatie se realizeaza prin determinarea sterilitatii mediului, a gradului de determinare mofologica a ciupercii, a pH-ului mediului, a activitatii lichidului de cultura si a consumului de de zahar. Probele se iau la interval de 4-6 ore, iar procesul se considera terminat atunci cand continutul de zahar al biomasei ajunge la 0.2-0.6%, iar concentratia solutiei ramane aproape constanta intre doua determinari. Perametrii procesului de fermentatie biochimica a penicilinei: Etapa de T Agitarea Debit aer Presiunea fermentatie [C] [Rot/min] [l/l mediu x [ata] min] Inoculator 261 270 1.0 1.2-1.3 Intermediar 261 170 1-1.2 1.2-1.3 Regim 261 120 0.6-1 1.2-1.3

Durata [h] 30-40 20-40 90-120

Concentratia penicilinelor in solutia nativa la terminarea procesului de fermentatie este cuprinsa intre 5%-6%. Valoarea exacta depinde de potenta susei folosite si de conditiile de realizare a procesului de fermentatie. [6,184,185]

25

4.Filtrarea solutiilor native Filtrarea la nivel industrial a lichidelor de fermentatie intampina dificultati considerabile datorate naturii masei celulare. Alegerea utilajului pentru filtrare este conditionata de: - caracterul suspensiei, - productivitate, - grad de recuperare - materialul de constructie al suprafetei filtrante Filtrarea lichidelor care contin masa celulara cu caracter fibros este o operatie relativ usoara, deoarece miceliul nu colmateaza materialul filtrant si se desprinde usor de pe acesta. Pentru aceste lichide, la nivel industrial sunt recomandate filtre rotative cu vid. Filtrele ofera o suprafata mare de filtrare, posibilitatea spalarii miceliului pe filtru, pentru recuperarea avansata a produselor utile si nu necesita operatii manuale. Filtrul rotativ cu vid, denumit filtru celular Oliver, poate fi construit din otel-carbon, otel inoxidabil, otel captusit cu cauciuc sau teflon, din diferite aliaje. Alegerea materialului de constructie este determinata de caracterul agresiv al lichidelor supuse filtrarii. Filtrul consta dintr-un tambur rotativ, cu lungimea 1-4.5, si diametrul 1.75-3m, construit din doi cilindrii orizontali coaxiali. Cilindrul exterior este perforat si acoperit cu material filtrant, iar spatiile dintre cei doi cilindrii este impartit in 10-12 celule etanse care functioneaza succesiv si independent ca un filtru nuce. Legatura dintre aceste celule si conductele de vid sau aer comprimat se realizeaza rin intermediul capului de distributie. Suprafata tamburului este impartita in mai multe zone corespunzatoare operatiilor de filtrare, spalare, uscare si indepartare a stratului de miceliu depus. In timpul unei rotatii a tamburului, fiecare celula trece prin toate aceste zone. Indepartarea miceliului se realizeaza cu ajutorul unui cutit razuitor fix.[3,37,38] . Soluia rezultat se trece printr-un rcitor tubular unde se rcete pn la 35C i se depoziteaz n rezervorul de ateptare, de unde este trimis la extracie. Rcirea este absolut necesar pentru a reduce viteza reaciilor de degradare a penicilinelor. n unele tehnologii de fabricaie soluia rcit se trateaz cu cetazol 10% pentru coagularea albuminelor, se filtreaz i se trimite la extracie. [6,186] 26

5.Separarea si purificarea penicilinelor Separarea penicilinelor prin extractie fizica rerezinta singurul procedeu de separare cu aplicabilitate industriala. Concentratia finala a penicilinei in lichidele de fermentatie este de 3-6%, in functie de tulpina utilizata. Datorita dilutiei foarte mari, este necesara concentrarea solutiei prin extractii repetate a penicilinelor cu solventi. Fluxul general al separarii penicilinelor cuprinde urmatoarele etape: - filtrarea lichidului de fermentatie in scopul separarii biomasei - extractia penicilinelor din filtru cu solvent organic in doua sau mai multe stadii, in functie de conc sa in solutie - reextractia penicilinelor din solventul organic cu o solutie de carbonat de sodiu - cristalizarea si purificarea. Extrac ia i reextrac ia Extracia reprezint operaia de separare a componenilor unui amestec lichid sau solid pe baza diferenei de solubilitate a acestora ntr-unul sau mai muli solveni. Dac amestecul supus separrii este lichid, operaia este de extracie lichid-lichid, iar pentru solid, extracie solid-lichid. Atunci cnd procesul are loc prin intermediul operaiilor fizice, extracia este fizic, iar atunci cnd intervin reacii chimice, extracia este reactiv. Extracia fizic lichid-lichid cuprinde 4 etape: 1. contactarea soluiei iniiale cu solventul (amestecarea) 2. solubilizarea i difuzia solutului n faza solventului (transferul de masa a solutului) 3. separarea celor dou faze rezultate (extractul-faza solventului care conine solutul, rafinatul-soluia iniiala epuizat) 4. recuperarea solventului att din extract, ct i din rafinat. [3.52] Viteza extraciei depinde de 3 factori: aria interfacial de contact dintre cele 2 faze lichide, fora motrice a trasnferului de mas al solutului ntre soluia iniial i solvent, coeficienii de transfer de mas ai solutului n fiecare faz. Operaia de extracie prezint capacitate maxim, atunci cnd se obine un contact intim ntre fazele din sistem, reflectat de gradul de dispersie ale uneia n cealalt, respective de valoarea ariei interfaciale. Produsele de biosintez se gsesc n lichidul de fermentaie n concentraii reduse (0.5-8%), fiind n general, compui labile chimic i termic. n plus, n lichidele de fermentaie se gsesc numeroi compui secundari, unii cu caracterisitici fizicochimice asemntoare cu ale produselor utile, de aceea separarea i purificarea produselor de biosintez sunt operaii dificile, ce implic etape complicate. [8.48] Extracia fizic reprezint pn n prezent singurul procedeu de separare industrial al penicilinei G. Concentraia final a penicilinei G n lichidele de fermentaie este cuprins ntre 3 i 6 %, n funcie de tulpina utilizat. Datorit diluiei

27

foarte mari este necesar concentrarea soluiei prin extracie i reextracie. Penicilinele pot fi extrase fie din soluia apoas rezultat n urma filtrrii biomasei, fie direct din lichidul de fermentaie. [7.61] Fluxul general al separrii penicilinelor de biosintez este alctuit din 4 etape: 1. filtrarea lichidului de fermentaie cu ajutorul filtrelor rotative cu vid, n scopul separrii biomasei de lichidul care conine penicilinele; 2. 3. 4. extracia penicilinelor din filtrat cu un solvent organic n dou sau mai multe stadii, n funcie de concentraia lor n soluie; reextracia penicilinelor din solventul organic cu o soluie de carbonat de sodiu sau de potasiu; cristalizarea i purificarea, n funcie de tipul de penicilin.

Extrac ia penicilinei G folosete ca mediu supus extraciei fizice, lichidul de fermentaie filtrate, iar ca solvent acetatul de butil la pH cu valoarea 2. [8.49-50] Extracia penicilinei G n acetat de butil decurge cu randamente maxime numai n condtiile n care acest antibiotic se va gsi n soluia apoas supus extraciei n form nedisociat. Acesta deoarece acetatul de butil este un solvent nepolar sau cu polaritate redus. Din analiza procesului de extractive fizica a penicilinei G cu acetat de butil s-a constat ca: - n solvent sunt extrase numai molecule de penicilina nedisociat - ntre molecule de penicilina, n condtiile n care se realizeaz extracia, nu are loc formarea unor asociaii - n acetatul de butil penicilina G nu disociaz [3.62] Schema de operaii pentru separarea penicilinelor prin extracie este prezentat n schema urmtoare:

Pentru extracia penicilinei G se folosete extractorul Podbielniak.Acesta este construit dintr=o foaie metalic nfurat n spiral n jurul unui arbore care se rotete cu 28

2000-5000rpm..Rotorul are forma unei spirale cu un numr variabil de spire( 6-33 spire) a cror seciune formeaz canale paralele.

1. 2. 3. 4. 5.

ansamblu rotor +ax carcas lagre curea de tranmisie foaie metalic spiralat perforat 6. conducte de distribuie a fazelor 7. conduct pentru lichidele de splare i curare 8. tuuri de alimentare i evacuare

Distilarea azeotrop n prezent pentru separarea srurilor penicilinei G din soluia apoas rezultat de la reextracia n carbon de Na(K), se folosete procedeul antrenrii azeotrope a apei cu butanol, la vid, astfel ncat, odat cu ndeprtarea apei are loc cristalizarea srii respective, apoi, acesta se filtreaz si se spal cu butanol i cloroform. Utilizarea butanolului, dei prezint avantajul unui timp relativ scurt al fazei de cristalizare si al unei solubilitai relativ bune a impuritatilor are o serie de inconveniente cum ar fi: - conduce la pierderi mari de butanol, datorita solubilitatii ridicate a acestuia in apa(7,45%), precum si datorita solubilitatii mari a apei in butanol (20,5%); acest aspect determina si cheltuilei sporite cu recuperarea solventului. - posibilitatea degradarii termice a penicilinei, datorita temperaturii necesare evaporarii amestecului butanol-apa - posibilitatea degradarii chimice a penicilinei in butanol.[8,85] Uscarea Uscarea este o operatie prin care se indeparteaza umiditatea dintrun material cu ajutorul energiei termice.Termenul de uscare se mai utilizeaza si in cazul indepartatii unui component in stare lichida sau de vapori dintr-un gaz sau dintr-un amestec lichid. Uscatoarele se pot clasifica in functie de mai multe criterii: 1) dupa regimul de fuctionare pot fi: - continue - discontinue 2) dupa presiunea de lucru pot fuctiona: - la presiune atmosferica

29

- la vid 3) dupa procedeul de uscare pot fi: - cu agent termic gazos - cu incalzirea materialului 4) dupa sensul de circulatie a solidului si a gazului pot fi in : - echicurent, - contracurent, - curent mixt - curent incrucisat 5) din punct de vedere constructive sunt: -uscatoare cu strat fix, -cu strat mobil, -cu strat fluidizat, -cu pulverizare, -de contact Penicilina G precipitata se filtreaza pe filtrul Nuce si se usuca in uscator dulap la 35-45C sub vid de 100-225 mmHg, timp de 16-20 ore.

2.4.2. Materii prime, Intermediare, Auxiliare. Microorganismul producator Mucegaiurile(ciuercile sau fungii) sunt microorganisme ce se prezinta sub forma de filamente, de diverse dimensiuni, ce formeaza un miceliu care provoaca degradarea mediului in care se dezvolta. Unele specii de mucegaiuri sunt producatoare de antibiotice cum ar fi Penicillium si Aspergillus, in special antibiotice -lactamice Mediul de cultura are in componenta urmatorii constituenti: 1. Lactoza Generaliti: Formul brut: C12H22O11 Mas molecular: 360.30 g/mol Prezinta o usoara solubilitate in apa si este insolubil n alcool etilic, eter etilic i cloroform. Zerul i materialele auxiliare folosite la fabricarea lactozei trebuie s corespund documentelor telenice normative ale produselor respective i s respecte dispoziiile legale sanitare i sanitar veterinare n vigoare. Condiii tehnice de calitate: Denumirea caracteristicii Condiii de admisibilitate Tipul Lactoz rafinat Lactoz telenic Calitatea I Calitatea a II-a

30

Aspect Culoare Gust i miros Aspectul soluiei apoase Puterea rotaiei specifice []2020 Pierderi prin uscare: -la 130C, %, max. -la 100C, %, max. Aciditatea exprimat a acidului lactic, %, max. Cloruri, %, max. Sulfai (SO4), %, max. Calciu Metale grele (Pb) Arsen, %, max. Fier

pulbere cristalin alb alb - galben galben slab dulceag, fr miros strin incolor, limpede galben deschis, Galben slab tulbure +52 +53 +51 +52 +47 +51 5.5 0.05 0.004 0.002 lips n condiiile determinrii lips n condiiile determinrii 0.01 lips n condiiile determinrii 0.4 0.07 2 1 -

2. Extractul de porumb Conditii tehnice de calitate Constituienti g/100g extract de porumb Substanta uscata Cenusa N total Zahar total (exprimat ca glucoza) Acid lactic Aciditate(ml sol NaOH 0,1N/100g) extract de porumb Fe P Ca Zn K SO2 Sedimente solide % 46-49,6 8,04-10,73 3,33-3,67 4,00-4,70 0,74-4,39 11,6-19,3 0,009-0,02 1,5-1,9 0,02-0,7 0,05-0,012 2,0-2,5 0,02 38,4-52,9

Generalitati. Proprietati fizice. - Aspect: lichid cremos de culoare galben inchis - Miros: caracteristic unei fermentatii lactice - Sedimentare dupa 24 ore intr-un cilindru de 100 ml de 100% - Aspect microscopic: in frontiu colorat prezinta o masa bacteriana tipica bacililor lactic, in proportie de peste 90% - Substanta uscata: minim 50%

31

- pH= 3.5-4 - Continutul in acid lactic: minim 20g la 100g substanta uscata - Zahar total: maxim 2.5% 3. Faina de soia Generalitati: Faina de soia este o sursa de azot naturala, bogata in proteine, aminoacizi continand si acizi nucleici, vitamine, oligoelemente, lipide, zaharuri, compusi cu sulf si fosfor dupa cum urmeaz:

Proteine Materii grase Metionina Cisteina Lizina Calciu Sodiu Potasiu Magneziu Sulf Fosfor

42 % 3.5 % 0.54 % 1.1 % 2.4 % 0.2 % 0.287 % 1.7 % 0.21 % 0.32 % 0.6 %

4. Glucoza Generaliti:

SR 13359-7

Obiect i domeniu de aplicare: Prezentul standard se refer la glucoza obinut din cartofi i din porumb, destinat pentru consum i scopuri industriale. Tipuri de gluxoza: -glucoz lichid -glucoz solid: - aromatizat - nearomatizat Glucoza aromatizat poate fi fabricat cu diferite adaosuri: esene, aromatizani i colorani alimentari avizai din punct de vedere sanitar, miez de nuc, miez de floarea-soarelui etc., conform acordului ntre productor i beneficiar.

32

-Sirop de glucoz: soluie apoas, concentrat i purificat de zaharuri nutritive, obinute din amidon de cartofi i de porumb. -Glucoz solid: mas de zaharuri nutritive, obinut prin hidroliz avansat a amidonului de cartofi i de porumb. Condiii tehnice de calitate: Pentru glucoza de cartofi i de porumb, materiile prime i auxiliare trebuie s corespund standerdelor i normelor sanitare n vigoare Proprieti organoleptice: Caracteristici Condiii de admisibilitate Tip de glucoz Lichid Solid Aromatizat Nearomatizat Lichid vscos Mas solid, Mas solid sub form de tablete Incolor pn Crem pn la Crem pn la la galben galben sau galben specific colorantului adugat Lips Caracteristic Lips aromei adugate Dulce Dulceag, uor amrui specific Lips Metod de verificare

Aspect Culoare

SR 13359-1

Miros Gust Corpuri strine

Proprieti fizico chimice: Caracterisitici Condiii de admisibilitate Tip de glucoz Lichid Solid Aromatizat Nearomatizat 20 21 200 1.5 Metod de verificare SR 13359-2 SR 13359-3

Umiditate, % max. RBU, max. Culoare ml iod soluie 0.1 n/100 ml, max Densitate 20/20C, g/ml, min Indice de refracie la 20C Aciditate, grade, max. Acizi minerali liberi, % pH, la o soluie 20 g/100 ml

1.42 1.49 2.5 Lips 4.5...5.5

2.8

SR 13359-4 SR 13359-5 SR 13359-6 SR 13359-7 SR 110-12

33

Coninut de -n produs SO2 ml/100 g nealbit max. -n produs albit Coninut de cenu conductometric, raportat la s.u., %, max. Coninut de dextroz raportat la s.u., (DE), %

4 40 0.6 15 -

SR EN 1185 SR 110-2 SR 13359-8 sau SR 13359-9 sau SR ISO 5377

32...49

min. 75

5. CaCO3, Carbonatul de calciu STAS 1083-76 Prezentul standard se refera la carbonatul de calciu precipitat, tehinic, obtinut prin tratarea solutiei de var cu bioxid de carbon.Produsul se prepara sub forma de pulbere microcristalina. Formula chimica:CaCO3 Masa moleculara relativa: 100,09 g/mol Carbonatul de calciu precipitat, tehnic se livreaza in patru tipuri: - tipul I destinat, in special, la fabricarea pastei de dinti; - tipul A destinat, in special, industriei de produse cosmetice, industriei de antibiotice si industriei electrotehnice; - tipul B destinat, in special, industriei de material plastic si industriei cauciucului; - tipul C pentru alte utilizari; Conditii tehnice de calitate a carbonatului de calciu Tipul I A Grad de alb, %min 97 92 Finite: -rest pe sita cu tesatura de sarma 0063 STAS 1077-67, %max 0,1 1,0 -rest pe sita cu tesatura se sarma 009 STAS 1077-67, %max 0,05 0,5 Densitate in gramada in stare tasata, 0,45 0,45 g/cm3, max Cifra de sedimentare, cm3, min 95 91 Umiditate, % max 0,4 0,4 Substante insolubile in acid clorhidric, 0,1 0,2 %max Oxizi de fier si de aluminiu 0,5 0,5 (Fe2O3+Al2O3), %max Carbonat de calciu (CaCO3),% min 99 99 Alcalinitate[Ca(OH)2], % max 0,008 0,008 Limite de pH la un adaos de 130cm3 5,5.6,0 acid clorhidric n(capacitate de tamponare) pH-ul suspensiei 2% in apa, max 8,5 9,5 pH-ul suspensiei 10% in apa, max 9 10 B 92 1,0 0,5 0,45 90 0,6 0,2 0,5 98,5 0,10 C 1 0,47 90 0,6 0,2 0,5 97 0,15 -

34

Cupru(Cu), %max Mangan(Mn), %max Arsen

0,001 0,003 -

0,001 0,003 -

0,001 0,003 -

-

6. Fosfat monopotasic S.T.A.S 10497-76 Generalitati: Prezentul standard se refera la fosfatul monopotasic tehnic utilizat, n principal, in mediu de cultura la fabricarea antibioticelor. Formula chimica: KH2PO4 Masa moleculara: 136,09 g/mol Condiii tehnice de calitate Aspect i culoare Cristale albe Umiditate , %, max. 0.3 Fosfat monopotasic (KH2PO4), %, min. 96 Cloruri (Cl), %, max. 0.25 Fier (Fe), %, max. 0.003 Metale grele (Pb), %, max. 0.01 Substane insolubile n ap, %, max. 0.5 Observaii: - Caracteristicile din tabel, cu exceptia umiditatii, se refera la fosfatul monopotasic uscat la 105 2C - Cu acordul beneficiarilor produsul se poate livra si cu max. 0.05 % fier. 7. Sulfat de sodiu S.T.A.S 2126-84 General itai Prezentul standard se refera la sulfatul de sodiu, anhidru, tehnic, intrebuintat in industria de medicamente. Formula chimic: Na2SO4 Masa moleculara relativ: 142.044 g/mol Caliti Sulfatul de sodiu, anhidru, tehnic se livreaz n trei calitai: calitatea I produs secundar la bile de filare, de la obinerea fibrelor artificiale; calitatea II obinut prin tratarea fosfogipsului rezidual cu sod calcinat (Na2CO3), urmat prin uscarea produsului prin atomizare. - calitatea III produs secundar din fabricaia acidului formic din formiat de sodiu i acid sulfuric. Condiii tehnice de calitate Calitatea I II Aspect praf neaglomerabil praf neaglomerabil Culoare Alb alb Sulfat de sodiu 99 97.5 III praf aglomerabil Alb cenuiu 97 35

(Na2SO4), %, max. Umiditate, %, max. Substane insolubile n ap, %, max. Acid sulfuric liber(H2SO4) Clorur de sodiu (NaCl), %, max. Fier (Fe), %, max. Acizi organici (HCOONa) Densitate n stare netasat kg/dm3

0.3 0.3 Lips 0.1 0.001 lips 0.7...1.55

0.1 0.3 lips 1.2 0.001 0.4...0.7

0.5 0.5 %, max. 1.0 1.2 0.03 %, max. 1.5 1.26...1.30

Observaie: - toate valorile din tabel, exceptnd umiditatea si densitatea n stare netasat, sunt raportate la produsul uscat la 105 2C. 8. Sulfat de zinc S.T.A.S. 2367-80 Generalitati : Prezentul standard se refera la sufatul de zinc tehnic cristalizat, granulat si lichid. Sulfatul de zinc tehnic cristalizat si granulat se livreaza in 3 calitati: - calitatea I - calitatea II - calitatea III Sulfatul de zinc tehnic lichid se livreaza in 2 calitati: - calitatea I - calitatea II Formula chimica: ZnSO4 Masa moleculara: 161 g/mol La data aprobarii standardului, sulfatul de zinc tehnic granulat si lichid se importa. Conditii tehinice de calitate a sulfatului de zinc tehnic cristalizat, calitatea I: Calitatea Aspect Culoare Zinc(Zn) %min. Substante insolubile in apa, %max. Fier(Fe), %max Cupru(Cu), %max Alba 22,5 0,05 0,035 0,005 I II cristale mici alba sau alb-galbui 22,1 0,1 0,5 alb-galbuie-cenusie 21,6 0,5 1,0 III

36

Acid sulfuric liber(H2SO4), %max Arsen Cloruri, %max

0,1 Lipsa 0,2

0,5 -

-

Observatii: - pentru industria chimico-farmaceutica se va folosi sulfat de zinc tehnic cristalin, calitatea I. 9. Azotat de amoniu S.T.A.S. 450-30 Generalitai Standardul cu nr. 450-30 se refera la azotatul de amoniu tehnic, granulat obinut prin neutralizarea acidului azotic cu amoniac utilizat la fabricarea explozivilor i n alte scopuri industriale. Formula chimica: NH4NO3 Masa molecular relativ: 80.04 g/mol Azotatul de amoniu tehnic granulat, se livreaz n dou tipuri: tip I folosit la fabricarea explozivilor; tip II folosit n alte scopuri industriale. I Granule neaglomerabile alb 95 5 0.2 0.02 98.8 0.2 34.6 0.2 II granule neaglomerabile alb-roz 95 5 0.3 0.02 99.4 34.8 -

Condiii tehnice de calitate Tip Aspect Culoare Granulaie: granule ntre 1...3 mm, %, min. granule sub 1 i peste 3 mm, %, max. Umiditate, %, max. Aciditate liber (HNO3), %, max. Azotat de amoniu, %, min. Azotat de magneziu, %, min. Azotat total, %, min. Reziduu de calcinare, %, max.

Observaie: - coninutul de azotat de amoniu, azotat de magneziu, azot total i aciditatea liber sunt raportate la produsul uscat.

37

Precursor in obtinerea Penicilinei G: Acidul fenilacetic. Generalitati : Formula chimica: C6H5CH2COOH Masa moleculara: 136.15 g/mol Proprietati fizice : - pulbere alba, alba-galbuie - punctul de topire la 77-78.5C, - temperatura de fierbere: 265C, - densitate 1.081 g/cm3 , - solubilitate moderata in apa - stabil in conditii normale. Descriere generala si aplicatii: Acidul fenilacetic se prezinta sub forma de cristale albe, cu un miros neplacut, caracteristic, solubil in alcool si eter. El serveste ca ingredient in parfumuri oferind un miros asemanator mierii. Se gaseste in concentratie mica in unii alcaloizi si hormoni din plante. Acidul fenilacetic substituit in pozitie alfa si esterii acidului fenilacetic sunt folositi in medicina, deasemeni acidul fenilacetic este folosit ca precursor in obtinerea penicilinei G. In comert se gaseste sub forma de pudra galbuie de puritate minim 99% si umiditate maxima 1%, livrat in saci de 25kg.

Agent antispumant: Ulei de floarea soarelui tehnic Generaliti: Standardul cu numarul 2710-70 se refer la uleiul tehnic obinut din seminele de floarea soarelui. Uleiul tehnic de floarea soarelui se livreaz n dou caliti: -calitatea I, obinut prin presare sau extracie cu solveni i prelucrare ulterioar; -calitatea II, obinut prin presare sau extracie cu solveni. Proprieti fizice i chimice: Calitatea Aspect, la 60C I Limpede fr impuriti II Metode de analiz STAS 145/1-67 STAS 2710-70

38

Densitate relativ la 20C Indice de refracie la 20C Culoare de iod, mg I/ 100 cm3 max. Impuriti insolubile n eter etilic, % max. Umiditate i materii volatile, % max. Indice de aciditate, mg KOH/g max. Substane organice nesaponificate, % max. Indice de iod, g I/100g min. Cenu, % max. Indice de saponificare, mg KOH/g Substane mucilaginoase Punct de inflamabilitate (Penki-Martens), c min.

mecanice 0.914...0.927 1.4710...1.4760 20 0.1 1 0.2 1 2 12 1.2 1.2 119...135 0.05 186...198 lips 165 135

STAS 145/3-67 STAS 145/4-67 STAS 145/2-67 STAS 145/11-67 STAS 145/10-67 cap 1 STAS 145/16-67 cap 1 STAS 145/15-67 STAS 145/19-67 cap 1 STAS 145/13-67 STAS 145/17-67 STAS 18-70 STAS 145/6-67 cap 1

Observatii: - la uleiul rafinat de floarea soarelui tip A, imbuteliat pe linii fara uscare, se admite un continut de apa si substante volatile de max 0.15% - indicele de peroxid pentru uleiul destinat pastrarii indelungate se stabileste prin intelegere intre parti

Acetat de N-butil S.T.A.S 904-89 Generalitati: Standardul cu numarul 904-89 se refera la acetatul de n butil tehnic obtinut prin esterificarea acidului acetic cu alcool n butilic sau prin transesterificarea acetatului de metil. Formula chimica: CH3CO2(CH2)3CH3 Masa moleculara relativa: 116.16 g/mol Acetatul de n butil tehnic este un produs inflamabil, avand punctul de inflamabilitate de cca. 28C. Acetatul de nbutil tehnic se livreaz n trei tipuri, funcie de continutul de ester si anume: - tipul 98 tipul 92 tipul 88

Condiii tehnice de calitate Denumirea caracteristicii 98 Condiii de admisibilitate Tipul 92 88 39

Aspect Culoare , mg K2Cr2O7/ l, max. Miros Densitate relativa, d2020 Distilare (la presiunea de 1013,2 mbar)*: - interval de distilare, C... - n intervalul de distilare distila, % vol., min... Acetat de nbutil, %, min. Aciditate (acid acetic), %, max. Reziduu la evaporare, %, max. Ap , %, max.

Lichid limpede, far substane n suspensie 16 caracteristic 0.878...0.884 0.872...0.880 0.868...0.874 120...127 95 98.0 0.01 0.01 0.2 116...128 95 92.0 0.03 0.02 0.35 113...130 95 88.0 0.03 0.02 0.5

* 1013.2 mbar = 760 mm Hg Observaie: - tipul 98 destinat industriei de antibiotice trebuie s aib intervalul de distilare 123...127C.

Acid sulfuric tehnic.

S.T.A.S 97-80

Generalitati: Formula chimica:H2SO4 Masa moleculara: 98,08 g/mol Dupa contiuntul de acid sulfuric monohidrat, acidul sulfuric fehnic se livreaza in 4 tipuri: -tipul 98 -tipul 96 -tipul 92 -tipul 73 Conditiile tehnice de calitate a acidului sulfuric Tipul 98 96 92 73 Aspect lichid nicios, limpede sau opalescent Culoare Conform STAS 9482-74 Densitate g/cm3, min 1,836 1,835 1,821 1,634 Acid sulfuric monohridat(H2SO4), 98 96 92 73 % max Dioxid de sulf(SO2), % max 0,1 0,1 0,1 Fier(Fe), % max 0,02 0,02 0,02 Reziduu la calcinare, % max 0,1 0,15 0,15 Arsen(As), % max 0,001 0,001 0,001 Cloroform S.T.A.S. 3306-82 Generalitati: Formula chimica:HCCl3 Masa moleculara: 119,38 g/mol Cloroformul se livreaza in urmatoarele tipuri si calitati: -tipul A, stabilizat cu 0,61% alcool etilic absolute, utilizat in industria de medicamente: 40

-calitatea I -calitatea II - tipul B, nestabilizat tehnic utilizat ca solvent

Conditii tehnice de calitate Denumirea caracteristicii

Aspect Miros Gust Densitatea relativa Cloroform, %min Distilare: -punct initial de fierbere, 0C, min 59 57 57 -punct final de fierbere, 0C, max 62 63 63 -intre punctual initial si final de fierbere distilata, %vol, min 97 96 94 Reziduu la evaporare, % max 0,002 0,002 0,015 Clor liber Cloruri(Cl), % max 0,0008 0,0008 Aciditate Substante organice straine 15mg l/100cm3 Substante volatile straine Apa Observatii: Cloroformul este greu solubil in apa, miscobil in orice proportie cu alcoolul etilic absolute, eterul etilic, benzina si majoritatea uleiurilor,Este neinflamabil.

Tipul A (stabilizat) B(nestabilizat) calitate I calitatea II lichid limpede, incolor, volatil Caracteristic dulceag, arzator 1,473-1,480 1,473-1,490 98,0 97,0 -

[9]

41

2.4.3 Mecanismul reactiilor biochimice Desi mecanismul biosintezei penicilinelor nu este pe deplin elicudat, totusi tinand seama de faptul ca in molecula lor se gasesc trei componente de baza: d-valina, l-cisteina si un acid substituir, precum si identificarea in miceliul de Penicillium crtsogenum a unei tripeptide, se pot concepe etapele care intervin in biosinteza. Prima etapa consta in formarea, din glucoza, a l-cisteinei si d-valinei, iar din aceasta a amino-adipil-cisteinil-valinei conform urmatoarei scheme:

42

Pentru elucidarea mecanismului celei de a doua etape, in care se formeaza sistemul biciclic al penicilinelor sunt propuse doua ipoteze. In urmatoarea schema este prezentata ipoteza conform careia se pleaca de la o tripeptida.

43

Dupa aceasta schema sinteza nucleului de baza al penicilinei, acidul 6aminopenicilanic ar rezulta din acidul -amino-adipic, l-cisteina si l-valina trecand prin faza tripeptidei. In ultima etapa se formeaza enicilina G sau acid 6-aminopenicilanic prin pierderea grupei acil.

44

Aceasta ipoteza nu este, deocamdata, confirmata deoarece toate incercarile de a schimba in tripeptida acidul amino-adipic au acidul fenilacetic, necesar formarii penicilinei G, au esuat. Penicilinele s-ar putea forma si direct din l-cisteina su l-valina printr-o serie de faze intermediare, despre care nu se stie daca se formeaza in stare libera, asa cum sunt redate in schema de mai sus. In esenta, se distung in aceasta schema urmatoarele faze in formarea penicilinei: condensarea aminoacizilor, dehidrogenarea peptidei, hidrogenarea si ciclizarea intermediarului la acid 6-aminopenicilanic si introducerea catenei laterale. Formarea acidului 6-AP in lipsa precursorului, recum si obtinerea diferitelor peniciline in functie de recursorul folosit, demonstreaza ca rocesul de biosinteza oate decurge si dupa aceasta schema. 2.4.4. Cinetica reactiilor de biosinteza Prin metoda cinetica, se face studiul mecanismului reactiilor enzimatice, a proceselor metabolice i a vitezei de transformare a substratului n produs. Aceasta metoda este singura modalitate de studiu a proceselor enzimatice, deoarece numarul enzimelor pure separate pna n prezent este relativ redus. Viteza de fermentatie este definita prin variatia momentana a concentratiei produsului, a intensitatii respiratiei sau a concentratiei masei celulare. Viteza volumetrica este definita prin cantitatea de produs obtinuta, cantitatea de substrat utilizata, consumul de oxigen sau cantitatea de celule obtinute pe unitatea de volum de mediu de cultura i n unitatea de timp.

A- viteza de utilizare a oxigenului, g/l.h B- viteza de cretere a masei celulare, g/l.h C- viteza de consum a zaharurilor, g/l.h D- viteza de producere a penicilinei, g/l.h

45

Fig. Vitezele volumetrice la fermentatia penicilinei

Viteza specifica se definete prin raportul dintre viteza volumetrica i densitatea bacteriana, fiind exprimata n grame produs obtinut n unitatea de timp i pe gram de masa celulara. A- viteza de producere a penicilinei, g/g.h B- viteza de utilizare a oxigenului, g/g.h C- viteza de consum a zaharurilor, g/g.h

Fig.Vitezele specificela fermentatia penicilinei Procesele metabolice ce se desfaoara n interiorul celulelor vii sunt catalizate de enzime. Enzimele sunt macromolecule organice cu structura proteica care catalizeaza procesele biochimice. Din punct de vedere stuctural, enzimele sunt compui de natura heteroproteica cu sensibilitate deosebita la toti factorii care afecteaza proteinele. Activitatea enzimelor este influentata de temperatura, pH, presiune osmotica, concentratia substratului, concentratia produilor rezultati n reactie etc. Activitatea enzimatica este inhibata de anumiti agenti specifici precum: sulfamidele, antibioticele, narcoticele, colorantii, apa oxigenata, dioxidul de carbon, dezinfectantele. Substratul este acea substanta asupra careia se excercita actiunea enzimelor. Prezenta enzimelor permite transformarea sustratului la temparatura normala a materiei vii, oferind astfel, energia necesara desfaurarii procesului de biozinteza. Functia esentiala a enzimelor este de a accelera viteza reactiilor metabolice la temperatura normala a organismelor. Avnd activitatea catalitica foarte ridicata (de mii de ori mai mare comparativ cu activitatea catalizatorilor anorganici uzuali), enzimele reduc considerabil barierele de potential ale reactiilor de transformare a substratului, facilitnd astfel deplasarea echilibrului spre formarea produsului. 46

Mecanismul prin care enzimele transforma substratul poate fi descris cu ajutorul teoriei starii de tranzitie. Aceasta teorie presupune ca substratul se combina cu enzima formnd un complex activat, instabil, care ulterior se descompune n produs i enzima. Enzima eliberata reia ciclul de transformare a substratului conform schemei:

E S

k

1

k

E S*1

k2

P E

in care: E enzima libera S substrat P produs E S* complex activat enzima substrat k k k2 constanta de viteza a reactiei de formare a complexului enzima substrat1

constata de viteza a reactiei de formare a substratului si a enzimei din complexul enzima substrat constanta de viteaza a reactiei de formare a produsului din complexul enzima substrat

- se admite ca ntre enzima i substrat, ct i ntre complexul enzima-substrat exista un echilibru descris de ecuatia:

Kc*= k+1 = CE-S* k 1 CE CSiar viteza specifica de descompunere a complexului enzima-substrat n produs este redata prin intermediul urmatoarei expresii:

K 2 = kB T hunde CE-S* concentratia complexului enzima substrat in stare activata constanta de echilibru kC* constanta Boltzman kB h constanta Planck

Viteza de formare a produsului este prezentata n relatia:

vp =

kB T h

CE-S*

Reformulnd se obtine:

vp =

kB T h

K C* C E C S

Constanta de echilibru a formarii complexului activat se poate exprima functie de energia libera standard G*: G* = H* - TS* = -RTlnKC* (6) Din aceasta relatie rezulta expresia constantei de echilibru: KC* = 47

Modele cinetice pentru viteza de formare a procesului Michaelis si Menten au dezvoltat modelul cinetic al vitezei de formare a produsului n functie de concentratia susbtratului i a enzimei. Dupa acestia, se considera ca reactia dintre enzima i substrat se desfaoara n doua etape: n prima etapa viteza de reactie este dependenta direct de cantitatea de substrat, iar n a doua etapa are loc formarea produsului i eliberarea enzimei, care este capabila sa reia ciclul descris de sistemul de reactie, viteza depinde de concentratia complexului enzima substrat: k 1 E S E S k 1 k2 P E S Viteza de formare a produsului n procesul enzimatic descris de sistem este : dCp Vp = = k2 * Cc d Pentru determinarea concentratiei complexului enzima substrat, Cc, se utilizeaza expresia vitezei de formare a acestuia, pentru cazul n care Cs>>CE. dCp Vp= = k 1* (CE Cc)* Cs k 1 * Cc k2 * Cc d E n regim stationar, concentratia complexului nu variaza n timp, iar expresia devine :k 1*(C Cc)*Cs k E1*

Cc k2*Cc= 0

Cc =

C E * Cs k1

k21

k

Cs

De mai sus rezulta ca: k2 * C E* Cs V * Cs dCp Vp= = k 2 *Cc = = d k 1 k2 k2 Cs Cs Ks k 1 k 1

48

Unde avem: V= k2*CE : viteza maxima de formare a produsului ce corespunde stadiului n care ntreaga cantitate de enzima formeaza complexul enzima substratul;

Ks =

k2 : constanta de echilibru la disocierea complexului enzima substrat k 1k2 k1

KM = K s

: constanta Michaelis Menten

Constanta KM este egala cu constanta KS numai atunci cand k2CE Creterea concentratiei enzimei din mediul de fermentatie peste o anumita limita atrage dupa sine anularea ipotezei, si in consecinta viteza reactiei enzimatice nu va mai fi direct proportionala cu concentratia enzimei. Din reprezentarea grafica a ecuatiei MichaelisMentin, se vede ca KM este acea valoare a concentratiei substratului CS pentru care reactia pornete cu jumatate din viteza maxima V.

Reprezentarea grafica a ecuatiei Michaelis-Menten

49

Deoarece valoarea vitezei maxime de reactie este limita asimptotei la curba, ea nu poate fi determinata cu exactitate. Pentru determinarea constantei KM i a vitezei maxime V, se utilizeaza metode de linearizare. Una din aceste metode este metoda Lineweaver Burk, care folosete inversul relatieiVp= dCp V*Cs = KM Cs d

. * Cs Vp V V Prin reprezentarea grafica a ultimei relatii n coordonate 1/Vp i 1/Cs conduce la obtinerea diagramei LineweaverBurk, ce permite determinarea constantelor V i KM n functie de variatia concentratiei substratului i de valorile experimentale ale vitezei de formare a produsului.1

=

K M

1

1

Fig. Reprezentarea grafica a ecuatiei Lineweaver Burk In literatura se mai intalnesc si alte reprezentari ale ecuatiei MichaelisMenten: Edaie-Hofstee sau Woolf.

50

Modelul MichaelisMenten a fost conceput ca un model ideal i descrie viteza de formare a produselor n procese de fermentatie perfecte. Totusi, acest model, ce abordeaza cinetica enzimatica n regim stationar, poate fi extins i la procese n care, alaturi de transformarea enzimatica a substratului n produs, intervin reactii de inhibitie competitiva sau necompetitiva a enzimelor. Prezenta inhibitorilor nu se poate evita, deoarece ei apar ca urmare a degradarii mediului nutritiv n timpul sterilizarii, a unor reactii secundare i nu numai. Principalele tipuri de inhibitii ntlnite curent n procesele de fermentatie sunt : -inhibitie competitiva; -inhibitie necompetitiva; -inhibitie de substrat; -inhibitie de produs. Procesul de transformare enzimatica a substratului nsotit de inhibitie competitiva este descris prin reactiile: Cc Ks k2 E S E S P EKI E I CD E I

Caracteristic pentru procesul de transformare enzimatica nsotit de inhibitie competitiva este faptul ca enzima pusa n libertate prin disocierea complexului enzimainhibitor, E-I, si pierde capacitatea de a cataliza transformarea substratului in produs. Viteza de formare a produsului este proportionala cu concentratia complexului enzima-substrat, de aceea este necesara cunoasterea valorii acesteia in regim stationar.

Fig.Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice nsotita de inhibitie competitiva dupa metoda Lineweaver Burk. In cazul in care inhibitorul nu actioneaza competitiv, afinitatea enzimei pentru substrat sau inhibitor ramne neschimbata, indiferent daca enzima este libera sau fixata n complex. Reactiile ce au loc n sistemul cu inhibitie necompetitiva sunt:

51

Ks E S KI

E S

k2

P

E

E I

E ' KS K'I

I E S I E S I

E I S E S I

Fig.Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice nsotita de inhibitie necompetitiva dupa metoda Lineweaver Burk. Cinetica procelesor de biosinteza poate fi studiata i sub aspectul creterii masei celulare functie de concentratia substratului. Astfel, Monod, analizand procesul de crestere bacteriana n corelatie cu variatia concentratiei unui singur substrat (substrat limitativ), a stabilit pentru faza de cretere logarit mica a masei celulare urmatoarea expresie de calcul a vitezei specifice: Cs = max * Ks Cs n care: - viteza specifica de cretere a masei celulare cnd substratul este limitat max viteza maxima de cretere a masei celulare cnd substratul

nu este limitat

KS constanta de saturatie (corespunde concentratiei substratului la care viteza specifica de cretere este jumatate din viteza maxima ).

52

Dependenta dintre viteza specifica de cretere a masei celulare i concentratia substratului limitativ este redata n figura de mai jos, din care se constata ca viteza specifica de cretere tinde asimptotic catre valoarea maxima. Fig Dependenta dintre viteza specifica de cretere i concentratia substratului limitativ.

Substratul limitativ poate fi sursa de carbon si energie (glucoza, alcool, nparafine), un aminoacid esential (triptofan, arginina), oxigenul, fosforul sau azotul anorganic. ecuatia de cretere a masei celulare n functie de concentratia substratului limitativ, Cs: Cs dCx = max * * Cx Ecuatia lui Monod d Ks Cs

Trebuie remarcat faptul ca ecuatia Monod este valabila numai n cazul n care creterea este limitata de un singur substrat, ceea ce n conditiile industriale se ntmpla foarte rar. De obicei, n aceste procese intervine i un al doilea substrat, care, de cele mai multe ori, este chiar oxigenul. n aceste conditii, vitezele specifice de cretere a masei celulare sunt descrise prin ecuatia lui Monod modificata sau prin ecuatia Monod Cantois : CL Cs = max * * KL CL Ks Cs = max * n care: CL, CS- concentratiile substraturilor limitative; KL, KS constantele de saturatie corespunzatoare substraturilor limitative; B constanta Cantois; Pentru culturi industriale discontinue, Monod a introdus o constanta caracteristica Y, denumita constanta de exploatare sau de cretere: CL KL CL Cs B* Cx Cs

*

53

dCs dCx =Y* d d n functie de valorile constantelor cinetice KS, max, Y stabilite de Monod, se pot caracteriza cantitativ culturile microbiene discontinue.

2.4.5. Termodinamica reactiilor biochimice Procesul de fermentatie se ncadreaza, din punct de vedere termodinamic, n grupa sistemelor termodinamice deschise, sisteme ce sunt specifice organismelor vii, caracaterizate prin schimb de energie i de materie cu mediul nconjurator, pe care l transforma. Sistemele termodinamice deschise au drept conditie de baza, faptul ca ele nu pot fi n echilibru cu mediul lor. Organismele vii se afla, de obicei, intr-o stare stationara care reprezinta conditia de baza a sistemelor deschise n care viteza transferului de materie i energie din mediu n sistem este compensata total de viteza transferului de materie i energie din sistem n afara lui. Faptul ca celula definita ca un sistem deschis, care nu se gasete n echilibru cu mediul sau, un mecanism ce capteaza energie libera din mediu, producmdu-i simultan o cretere oarecare a gradului de dezordine, a entropiei, face arte din logica moleculara a starii vii. O caracteristica a sistemelor deschise aflate in aceasta stare stationara este capacitatea de a efectua un lucru, deoarece sunt departe de conditia de echilibru. In starea stationara viteza de producere a entropiei are valoare minima, iar n aceste conditii sistemul va opera la valoarea maxima de eficienta in conditiile date. nsa, organismele vii fiind obligate sa respecte principiul al doilea al termodinamicii, i anume sa produca entropie, au ales sa faca acest lucru dar folosind o viteza minima, mentinndu-se astfel ntr-o stare stationara n care reactiile din celulele vii decurg cu o viteza foarte mare. Ca urmare, studiul entropiei n termodinamica proceselor de biosinteza este foarte important. Analiza acestor fapte arata ca sistemele termodinamice deschise sunte traversate de un flux de energie ce determina autoorganizarea sistemului , i astfel se mentine la valori minime viteza de producere a entropiei.De asemeni, microorganismele se remarca printr-o eficienta deosebita n prelucrarea energiei i a materiei, eficienta ce depaete cu mult majoritatea mainilor cunoscute de omenire. Analiza acestor aspecte evidentiaza ca celulele vii functioneaza ca maini izoterme ce absorb energia din mediul lor, energie pe care o transforma n energie chimica, folisita apoi pentru realizarea functiei chimice de biosinteza a componentelor celulare, a functiei osmotice, necesara transportului de materiale n celula, i a functiei mecanice, de contractie i locomotie, toate aceste functii fiind realizare la temperatura constanta.

54

Sursa de energie a sistemelor termodinamice deschise sunt energie hidratii de carbon, lipidele, alcoolii, proteinele etc., care prin combustie chimica elibereaza o mare cantitate de energie. O parte din aceasta energie se elimina din sistem, iar o parte este nmagazinata de sistem n compui organici macroenergetici, dintre care se remarca acidul adenozintrifosforic(ATP), compusul responsabil cu rezerva energetica a celulei. Din structura ATP-ului, prezentata in continuare, rezulta ca legaturile dintre gruparile fosfat adiacente din ATP i ADP(acidul adenozindifosforic) sunt legaturi de tip anhidrida, notate cu (.....), n timp ce legatura dintre acidul fosforic i riboza din AMP(acidul adenozinmonofosforic) este o legatura esterica, notata cu linie dreapta.

n acest context, trebuie subliniat faptul ca energia libera standard de hidroliza a legaturilor tip anhidrida este mult mai mare comparativ cu cea a legaturilor esterice. Chiar daca ATP-ul are n structura doua legaturi macroergice (~), n reactiile enzimatice intervine, de obicei, doar fosfatul terminal. n plus, ATP-ul nu are doar functia de a nmagazina energie chimica, ci este, n primul rnd un transmitator sau trasnportor de energie chimica n celulele vii. Prin acest proces de transport al energiei la alte molecule,ATP-ul pierde gruparea fosfat terminala, trecnd n ADP, care, la rndul sau, poate accepta energie chimica i reface ATP-ul, primind o grupare fosfat. Prin reunirea acestor observatii asupra ATP-ului, s-a postulat ca ATP-ul functioneaza ciclic ca transportor de energie chimica de la reactiile de ardere, ce furnizeaza energia chimica, la diferite procese celulare care necesita un consum energetic

CO2 H2 Energie rezultat O2 la oxidarea P moleculei sursa combustibile de energie O2\ Surse de energie P

ATP

Biosintez (lucru chimic)

Transport activ (lucru osmotic)

Contrac ie muscular (lucru mecanic)

ADP

Fig. Ciclul ATP-ADP i modalitatile de utilizare a energiei eliberate de ATP

55

S-a demonstrat experimental ca indiferent de natura substratului limitativ, folosit drept sursa de energie, sau molecule de combustibil(exceptiile fiind foarte rare), raportul dintre cantitatea n grame a celulelor microbiene obtinute n stare uscata i numarul de molecule de ATP sintetizate este aproximativ constant i are valoarea de 10.5. n plus, s-a aratat i ca n procesul de cultivare a bacteriilor n conditii aerobe 605% din cantitatea de carbon din mediu este asimilata de celule i numai 405% este oxidat de CO2. Analiznd din punct de vedere energetic, circa 62% din energia libera de oxidare a substratului reprezinta energia libera de ardere a componentelor masei bacteriene, astfel nct HC=22kJ/g s.u. masa microbiana. Daca substratul furnizor de energie este glucoza, ce se consuma ntr-un proces de fermentatie aerob prin catabolism, atunci se formeaza, conform urmatoarei reactii, 38 moli ATP, ce pot nmagazina 1159kJ din cei 2870 kJ obtinuti prin combustia unui mol de glucoza: Glucoza + 6 O2 --> 6CO2 + 6H2O + 38 moli ATP Moleculele de ATP i ADP fiind puternic ionizate, datorita faptului ca pH-ul lichidului intracelular are valoarea 7, vor forma n prezenta ionilor Mg2+, compleci de tipul celui prezentat mai jos, compleci ce constituie, de altfel, chiar forma activa a ATP-ului.

56

2.4.6 Bilantul de materiale Determinarea productiei pe sarje (Pan) Pan = 26 tone/an = 26*103 kg/an Numarul de sarje (ns)

FAT = fondul anual de timp FAT = 330 zile = 330 * 24 h ts = tf + taux tf = durata fermentatiei tf = 140 h taux = timpii auxiliari = [10-15] h se adopta taux = 13 h ts = 140 + 13 = 153 ore Productia pe sarje (Ps)

Productia in

fermentator

g randament global

Randamentele specifice pentru fiecare etapa a procesului tehnologic sunt urmatoarele :

57

-

filtrare : 80% extractie : 94% reextractie 90% g = 0,59229 %

- cristalizare + distilare azeotropa : 94% - filtrare + spalare : 95 % - uscare : 98%

Productivitatea microorganismului Productivitatea microorganismului pentru penicilina este de 80000 ui/ml, iar activitatea standard este de 1670 ui/ml 1 mg................................1670 ui/ml kg/m3 x mg..............................80000 ui/ml P = productivitatea microorganismului ; P = x P = 47,9041 kg/m3 Vu = volumul util x = 47,9041 mg/ml = 47,9041

Mmdc = masa mediului de cultura Mmdc = Vu * = densitatea apei la temperatura de 25C = 997,047 kg/m3M mdc

= 17,9676 * 997,047 = 17914,581 kg/sarja

58

1. Pregatirea mediului de cultura In fermentatorul de regim, compozitia mediului de cultura este urmatoarea: Componentii mediului de cultura 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa Fermentatorul de regim (%) 2,6 6,5 2,5 0,3 1,25 0,55 0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 84,736

Apa = 100 - xi 100 kg M.d.c. ..................................2,6 kg extract de porumb 17914,581 kg M.d.c.........................x1 kg extract de porumb x1 = 465,779 kg extract de porumb/sarja 100 kg M.d.c.......................................6,5 kg lactoza 17914,581 kg M.d.c............................x2 kg lactoza x2 = 1164,448 kg lactoza/sarja 100 kg M.d.c...........................2,5 kg glucoza

59

17914,581 kg M.d.c.................x3 kg glucoza x3 = 447,865 kg glucoza/sarja 100 kg M.d.c.............................0,3 kg faina de soia 17914,581 kg M.d.c..................x4 kg faina de soia x4 = 53,744 kg faina de soia/sarja 100 kg M.d.c...............................1,25 kg CaCO3 17914,581 kg M.d.c.....................x5 kg CaCO3 x5 = 223,932 kg CaCO3/sarja 100 kg M.d.c..............................0,55 kg KH2PO4 17914,581 kg M.d.c....................x6 kg KH2PO4 x6 = 98,53 kg KH2PO4/sarja 100 kg M.d.c.............................0,3 kg NH4NO3 17914,581 kg M.d.c.....x7 kg NH4NO3 x7 = 53,744 kh NH4NO3/sarja 100 kg M.d.c..0,06 kg Na2SO4 17914,581 kg M.d.cx8 kg Na2SO4 x8 = 10,748 kg Na2SO4/sarja 100 kg M.d.c..............................0,002 kg ZnSO4 17914,581 kg M.d.c...................x9 kg ZnSO4 x9 = 0,358 kg ZnSO4/sarja 100 kg M.d.c..............................0,4 kg Acid fenilacetic 17914,581 kg M.d.c..................x10 kg Acid fenilacetic x10 = 71,658 kg Acid fenilacetic/sarja 100 kg M.d.c........................0,8 kg Tiosulfat de sodiu 17914,581 kg M.d.c.............x11 kg Tiosulfat de sodium x11 = 143,316 kg Tiosulfat de sodium/sarja

60

100 kg M.d.c........................0,002 kg MnSO4 17914,581 kg M.d.c............x12 kg MnSO4 x12 = 0,358 kg MnSO4/sarja 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Materiale intrate Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa TOTAL % 2,6 6,5 2,5 0,3 1,25 0,55 0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 84,736 100 kg/sarja 465,779 1164,448 447,865 53,744 223,932 98,53 53,744 10,748 0,358 71,658 143,316 0,358 15180,099 17914,575 Materiale iesite Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa TOTAL % 2,6 6,5 2,5 0,3 1,25 0,55 0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 84,736 100 kg/sarja 465,779 1164,448 447,865 53,744 223,932 98,53 53,744 10,748 0,358 71,658 143,316 0,358 15180,099 17914,575

Deoarece in timpul sterilizarii o parte din componentii mediului de cultura se degradeaza, urmatoarele componente se iau in exces de 10% : extractul de porumb, lactoza, faina de soia.

Componentii in exces: extract de porumb: 1,1 * 2,6 = 2,86 % ; kg/sarja lactoza : 1,1 * 6,5 = 7,15% ; kg/sarja gluzoca : 1,1 * 2,5 = 2,75% ; faina de soia : 1,1 * 0,3 = 0,33% ; % 2,86 7,15 2,75 0,33 1,25 kg/sarja 512,357 1280,891 492,65 59,118 223,932 1,1 * 447,865 = 492,65 kg/sarja 1,1 * 53,744 = 59,118 kg/sarja Materiale iesite Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 % 2,86 7,15 2,75 0,33 1,25 61 kg/sarja 512,357 1280,891 492,65 59,118 223,932 1,1 * 1164,448 = 1280,891 1,1 * 465,779 = 512,357

1 2 3 4 5

Materiale intrate Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3

6 7 8 9 10 11 12 13

KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa TOTAL

0,55 0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 83,546 100

98,53 53,744 10,748 0,358 71,658 143,316 0,358 14966,915 17914,575

KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa TOTAL

0,55 0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 83,546 100

98,53 53,744 10,748 0,358 71,658 143,316 0,358 14966,915 17914,575

Datorita componentilor care se degradeaza si adaugarii lor in exces, cantitatea de apa este : Apa = 100 - xi = 83,546%

2. Sterilizarea In aceasta etapa se degradeaza compusii care la etapa precedenta au primit un excedent de 10%. Marimi intrate Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 % 2,86 7,15 2,75 0,33 1,25 0,55 kg/sarja 512,357 1280,891 492,65 59,118 223,932 98,53 Marimi iesite Extract de porumb Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 % 2,6 6,5 2,5 0,3 1,25 0,55 kg/sarja 465,779 1164,448 447,865 53,744 223,932 98,53

1 2 3 4 5 6

62

7 8 9 10 11 12 13

NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa TOTAL

0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 83,546 100

53,744 10,748 0,358 71,658 143,316 0,358 14966,915 17914,575

NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 Acid fenilacetic Tiosulfat de sodiu MnSO4 Apa TOTAL

0,3 0,06 0,002 0,4 0,8 0,002 84,736 100

53,744 10,748 0,358 71,658 143,316 0,358 15180,099 17914,575

3. Fermentatia In etapa de fermentatie este necesar calculul a 3 cantitati : necesarul de aer, cantitatea de biomasa si cantitatea de apa evaporata. Aer. Necesarul de aer pentru etapa de fermentatie se considera a fi min 1L = 10-3m3 M.d.c................................1L = 10-3m3 aer Vu = 17,9676 m3 M.d.c.........................x m3 aer x=17,9676 m3 aer/min 1 min.........................................17,9676 m3 aer tf = 140 * 60 = 8400 min..........y y = 150927,84 m3 aer/sarja Maer = Vaer * aer 0 = 1,293 kg/m3 T0 = 273 K T = 298 K P = 1 atm P0 = 1,1 atm 1 Laer / 1 Lm.d.c *

63

Maer = 196508,047 kg/sarja

Biomasa. cx = 20 g s.u./l M.d.c Celulele vii contin 20% substanta uscata si 80% apa. 1L = 10-3 m3 M.d.c.......................................100 g celule 17,9676 m3 .................................................cx g celule cx = 1796,76 kg biomasa/sarja

Apa evaporata.

- 1 kg de aer trecut prin mediul de cultura preia 0,01 kg de apa ; 1 kg aer.............................0,01 kg apa evaporata 196508,047 kg aer............x kg apa evaporata x = 1965,080 kg apa evaporata/s