principiul analizei cromatografice

19
CRIOGENIE „PRINCIPIUL ANALIZEI CROMATOGRAFICE” CENUŞĂ VIOREL UNIVERSITATEA DIN PITEŞTI – FACULTATEA DE STIINŢE – INGINERIE-FIZICĂ – AN III 1

Upload: dinno-dinnobolique

Post on 06-Sep-2015

394 views

Category:

Documents


12 download

DESCRIPTION

Principiul analizei cromatografice

TRANSCRIPT

CRIOGENIE

PRINCIPIUL ANALIZEI CROMATOGRAFICE

CENU VIORELUNIVERSITATEA DIN PITETI FACULTATEA DE STIINE INGINERIE-FIZIC AN III

PRINCIPIUL ANALIZEI CROMATOGRAFICE

Introducere

Metoda cromatografic a fost iniiat de botanistul rus vet M. (ntalnit i Tswet) care a separat pigmeni vegetali printr-o coloan umlput cu carbonat de calciu folosind ca eluent, eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul ca iniial a folosit-o pentru separarea unor colorani (chromos = culoare, graphos =scriere, n limba greac).Domeniul de aplicaie al cromatografiei s-a extins i s-a diversificat foarte mult, denumirea rmnd consacrat prin folosina i sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferenial ntre dou faze dintre care una staionar, iar cealalt mobil.Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat n etape, pe masur ce apareau noi lucrari ceintroduceau modificari n metodologia operaional.Cromatografia cu dou faze lichide iniiat de catre Martin i Synge pentru separarea aminoacizilor acetilai, obinut din distribuia acestora ntre o faz staionar format din silicagel saturat cu ap i o faz mobil constituit din cloroform n amestec cu n-butanol. Ulterior, n acest tip de analiz, au fost folosite faze staionare mai puin polare ca ap sau chiar nepoalre, ultim faza constituind metoda cromatografic cu faze inversate.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separari de amestecuri complexe din substane anorganice, organice sau compui hidrosolubili biologici.Cromatografia pe hrtie de filtru de calitate superioar, care permite abordarea analizei la scar microanalitic, a fost iniiat de Consden, Gordon i Martin. Izmailov i Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subire, care se dezvolt mai ales dup perfecionarile introduse de Stahl. Fracionarea cromatografic pe coloan umplut cu gel a luat mare amploare n ultimul timp, sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere-difuzie, metod propusa de Porath i Flodin.Cromatografia n faza gazoas a fost descris prima dat de James i Martin, deschiznd noi domenii de aplicaii ale cromatografiei, fiind una dintre cele mai raspndite i mai eficace tehnici de analiz att n cercetare ct i n industrie.Electroforeza, att de binecunoscut azi este o alt metoda eficient al carei principiu este reprezentat de separarea particulelor ncarcate relizat prin migrarea lor difereniat n cmp electric.

1. Principiul analizei cromatografice

1.1. Noiuni generale

Cromatografia este o metod de separare i analiza a subsanelor chimice din amestecuri , care se bazeaz pe interaciunea difereniata a doi sau mai muli compui de separat (numii soluii) cu dou faze cromatografice: faza staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan); faza mobil (aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze).Indiferent de natura chimic sau starea de agregare, faza staionar se gsete ntr-o pronunat stare de dispersie (n stare fin divizat) pentru a oferi o suprafaa de contact ct mai mare.Ca mecanism de separare, orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a caror direcie se deplaseaza n sens favorabil separarii i eluiei (procedeu chimic prin care se elibereaz o substan de pe absorbantul sau prin splare) de pe suportul cromatografic.

Avantajele cromatografiei ca metoda de separare:a) permite separarea, identificarea i dozarea cantitativ simultana a componentelor unui amestec;b) se poate aplica unui numr foarte mare de produse, practice orice produs organic putnd fi separate printr-o metod cromatografic;c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicat, ceea ce nseamn c necesitdoar o cantitate foarte mic de prob. n acelai timp ns, se pot aplica i la scar preparativ;d) durata analizei este redus, comparativ cu alte metode de analiz ale amestecurilor complexe.

1.2. Principiul cromatografiei sau al separrii cromatografice

Principiul cromatografiei const n distribuia inegal a componentelor unui amestec ntre faza mobil i faza staionar.Amestecul strbate sistemul cromatografic , fiind antrenat de catre faza mobil. Distribuia inegal este determinat fie de afinitatea diferit a componentelor amestecului fa de cele dou faze, fie de capacitatea diferit de a difuza n acestea.Principiul este ilustrat n Figura 1, pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaz prin faptul c faza staionar se gsete depusa n strat foarte subire pe pereii coloanei.

Figura 1 Principiul separrii cromatografice.

Moleculele celor doi compusi, 1 i 2 care se gsesc n momentul iniial amestecate, ntr-un volum restrns, vor avea tendina de a se transfera continuu din faza mobil n faza staionar i invers, din cauza agitaiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fa de faza staonar, ele vor fi mai puternic reinute n aceast faz. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va nregistra o rmnere n urm a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab reinut 1. Trebuie remarcatfaptul c aceast separare are loc n timpul deplasrii n coloan, deci este n proces dinamic.

Separarea unei probe n doi componeni decurge datorit faptului c unul din componeni rmne mai mult vreme pe faza staionar a coloanei. Suprafaa de contact a fazei staionare are proprietatea de a reine componenii probei pentru scurt timp. Prin adsorbii i desorbii succesive, fiecare component se transfer din nou n faza mobil. Acest proces se repet mereu. Timpul de retenie al unei substane depinde de competiia ntre afinitatea pentru faza staionar i solubilitatea n solvent (faza mobil). Timpul necesar pentru ca substana s ajung la captul coloanei (din momentul injectrii) se numete timp de retenie, tR.Mobilitatea diferit a componentelor se manifest prin deplasare cu viteze diferite de-alungul suportului cromatografic (sau de-alungul fazei staionare). Suport cromatografic: hrtie poroas (cromatografie pe hrtie); strat subire depus pe un suport plan (TLC/CSS); coloan umplut cu faza staionar; tub capilar cu suprafaa intern acoperit cu faza staionar.

1.3. Clasificarea metodelor cromatografice

Clasificarea acestor metode se face lund n considerare o serie de criterii, cum sunt: starea i natura probei de analizat, mediul de absorbie (lichid, solid, hrtie, etc), configuraia sistemelor cromatografice, etc.

a) n funcie de mecanismul ce st la baza procesului elementar de separare i dup natura celor dou faze, metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie, n care fenomenul principal care st la baz separri este adsorbia, iar afinitatea componentelor pentru cele dou faze este n funcie de coeficientii lor de adsorbie. Cromatografie de repartiie, n care fenomenul care determin separarea este extracia i separarea componentelor care se face n funcie de diferena dintre coeficienii lor de repartiie ntre cele dou faze. Cromatografie cu faze chimic legate, care este intermediar ntre cromatografia de adsorbie i cea de repartiie, fiind o combinare a acestora. Cromatografia de schimb ionic, care are la baz interaciunile electrostatice i difuzia, iar separarea componentelor se face n funcie de sarcinile lor electrice, constantele de disociere i diametrul efectiv al ionilor. Cromatografia de excluziune (numit i cromatografie pe gel), n care fenomenul principal este difuzia, iar separarea se face n funcie de mrimile efective ale moleculelor componentelor. Cromatografia de bioafinitate, n care separarea are loc datorit unor interaciuni biochimice specifice cu aa-numitele grupari de afinitate.De asemenea, n practica cromatografic se ntlnesc i variante intermediare sau mixte ntre aceste tipuri principale i exist i alte tipuri de cromatografie, care sunt nsa mai puin uzuale.

b) Clasificarea n funcie de natura fazelor cromatografice, cu condiia ca ca cele dou faze selecionate n prealabil s fie nemicabile, iar una din ele sa fie mobil, i anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC); gaz-lichid (GLC); cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC); lichid-solid (LSC).

De asemenea, se mai ntlnete i cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) n denumirea creia nu se face refrire la natura fazei staionare.

c) Clasificarea n funcie de configuraia sistemului cromatografic este de dou tipuri: cromatografie pe coloan: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutur); cromatografia pe coloane capilare; cromatografie planar: cromatografie n strat subire; cromatografie pe hrtie.

1.4. Schema de principiu a cromatografului

Schema de principiu a cromatografului este prezentata n Figura 2. Faza mobil care se gsete ntr-un rezervor de faza mobila 1 trece printr-un dispozitiv de msurare i reglare a debitului 2, apoi ajunge n dispozitivul pentru introducerea probei 3. Aici are loc preluarea probei de ctre faza mobil, proba fiind n continuare transportat prin coloana cromatografic 4, unde are loc separarea componentelor. Coloana 4 se gsete n mod uzual ntr-o incint termostatat (cuptor n cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza s se desfoare la o temperatur stabilit. Componentele separate ajung n detectorul 5, unde fiecare component este pusa n evidena sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale sunt nregistrate de un nregistrator 6 sau reprezint semnalul de intrare al unui sistem de achiziii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea i stocarea rezultatelor.

Figura 2 Schema de principiu a cromatografului.

1. Rezervor faz mobil;2. Dispozitiv de reglare i msurare a debitului;3. Dispozitiv de itnroducere a probei;4. Coloana cromatografic;5. Detector;6. nregistrator sau integrator.

Diagrama care reprezint rezultatul analizei cromatografice se numete cromatogram. Aceast diagram este nregistrat n general ca o funcie a intensitii semnalului detectorului n raport cu timpul. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare n cromatograma se numete pic cromatografic, iar aria picului este proporional cu concentraia componentei respective. n cazul cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hrtia pe care a avut loc analiza, iar componentele sunt evideniate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatograma este data n Figura 3.

Figura 3 - Analiza cromatografic a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatograficreprezint cte o component separat.

Principalele caracteristici ale unei cromatogrameCromatogram: diagrama semnal obinut in funcie de timpul de eluie al analitului: forma peack-lui; poziia; rezoluia.

Peak individual (semnal individual) a) Timpul de retenie (tr) timpul necesar analitului de a ajunge la detector dupa introducerea lui n sistemul cromatografic. b) Un peak cromatografic ideal forma Gaussian (w = 2.35 , w = 4 ).

Figura 4 Pic cromatografic ideal.

Peak-uri multiple Elicienta separarii doi factori contribuie la ct de bine sunt separare componentele unui amestec: latimea peak-lui (lime mare separare insuficient); spaiile de timp (spacing n time), (distan mare separare bun).

Figura 5 Picuri cromatografice multiple.

Rezoluia:

Figura 6 Exemplu rezoluie 0.5 i 1.0.

Determinarea calitativa i cantitativa:a) Calitativ: Cromatografie; Spectrometrie de mas; Spectrometrie IR.

Figura 7 Analiza calitativ.

b) Cantitativ: Aria peak-lui; Standard intern.

Figura 8 Analiza cantitativ.

Valorile optime ale parametrilor cromatografici

Nr.crt.ParametrulRelaia de calculValorile optime

1Legea Lambert-BeerExprim proprietatea speciei de a absorbi radiaiaA = axbxC0,1-0,8 AU

2Legea distribuiei NernstArat de cte ori este mai solubil componentul, n solventul 1 dect n solventul2K = C1 /C2T = ct.

K>>1

3Timpul de retenie nettR = tR - tm1-15 min.

4Aria peak-uluiProporional cu concentraiaA = H x WH

-

5Factorul de asimetrieReflect simetria peak-ului

Valori ct mai apropiate de 1

6Factorul de coadReflect simetria peak-ului

Valori ct mai apropiate de 1

7Numrul de talere teoreticeEficiena de separare a coloanei

N=4.000-10.000pentru o coloan cu lungimea de 100 mm i dim. particulelor 5 m

N=6.000-15.000pentru o coloan cu lungimea de 150 mm i dim. particulelor 5 m

8Numrul de talere/metrun = N / Ln=40.000-100.000

9nlimea talerului teoreticCu ct este mai mic H, cu att este mai ngust peak-ulH = L / N

H=10-25 mpentru particule de 5 m

H=(25)xdiam.particulelor

10Factorul de capacitateAbilitatea coloanei de a reine componentulk = 1-15

11SelectivitateaReflect capacitatea coloanei de a separa doi componeni

.> 1

12Rezoluia cromatograficArat ct de bine sunt separate peak-urile

R > 1

Pt. R = 1,5Separare net

13Ecuaia Van-Deemternlimea talerului teoretic n funcie de viteza liniar a fazei mobileH(u) = A + B / u + C u

Difuzia Eddy...............................ADifuzia longitudinal...................B / uFactorul de transfer de mas.C uH(u) are valoare minim pentru: u= 2-3 mm/s pentru particule de 5 m

1.5. Cromatografia de afinitate

Cromatografia de afinitate este utilizat mai mult in scop de cercetare; moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii i activitii lor biologice. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizai ntr-o matrice de suport, din care este efectuat o coloana; peste coloan se toarn proba care conine protein de interes i care se leag de liganzii coninui n coloan; proteina este apoi eluat, fie prin modificarea condiiilor din coloana (modificarea pH-ului sau concentraiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra n competiie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Exemple de liganzi n funcie de substana de purificat: substrat, inhibitor, cofactor (pentru enzime), antigene (pentru anticorpi), secvene de baze complementare (pentru acizi nucleici).Matricele folosite pentru cromatografia de afinitatePentru polimerul la care se ataeaza covalent o specie reactiv exist mai muli termeni care l definesc, cum ar fi: matrice, suport solid, suport insolubil, gel. Matricea este un suport solid insolubil, ce prezint o serie de grupari care pot stabili o serie de legturi de tip covalent (M). Ligandul (L) este o substan reactiv care se leag covalent la matrice direct sau indirect i poate recunoate i lega selectiv dintr-un amestec multicomponent, teoretic, o singur molecul. ntre ligand i molecul exista interacii de tipul celor existente ntre enzima i inhibitor, ntre antigen i anticorp etc. Ligandul poate fi substrat, inhibitor, coenzima i chiar enzim sau alt protein cu funcie biologica. Braul de spaiere (spacer - S) este interpus ntre matrice i ligand, pentru a evita mpiedicarile sterice de legare a substanei la ligandul L.Gruparea conector (C) este o grupare implicat n reaciile de cuplare: matrice-ligand, matrice-spacer-ligand, matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand.Principiul cromatografiei de afinitate are la baz ataarea covalent a ligandului la suportul insolubil, adic matricea, i mpachetarea acestui suport ntr-un strat cromatografic.Ca exemplu, daca un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloan, numai acea protein care manifesta o bioafinitate pentru ligand va fi reinut. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereinute. Proteina absorbit specific poate fi ulterior eluat prin modificarea compoziiei solventului, pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat.

Utilizari ale cromatografiei de afinitateCromatografia de afinitate poate fi aplicat dac o interacie specific poate fi stabilit ntre doua tipuri de biomolecule, drept pentru care aplicaiile acestui tip de cromatografie la purificarea i separarea macromoleculelor de interes biologic sunt, teoretic, nelimitate. n acest fel, pot fi selectai adsorbani specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor, acizilor nucleici, cofactorilor i proteinelor implicate n diferite procese de recunoatere biologic.Tehnica poate fi utilizat pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare, precum celule, organite celulare i virusuri.Ca i aplicaii practice ale cromatografiei de afinitate: purificarea unor proteine cum ar fi: enzime, anticorpi, proteine de legare, proteine de transport, proteine receptor, proteine represor; procedee de separare: celule, virusuri, acizi nucleici i nucleotide complementare, izoenzime, proteine denaturate i modificate chimic, proteine mutant, peptide marcate pentru afinitate; concentrarea de soluii proteice diluate; studii cinetice i a unor mecanisme de legare; determinarea constantelor de disociere i de echilibru.1.6. Cromatografie lichid de nalt performan (HPLC)

HPCL este prescurtarea de la High Performance Liquid Chromatography (Cromatografie lichid de nalt performan), metod de analiz calitativ utilizat n biochimie i chimie analitic pentru separarea, identificarea i cuantificarea compuilor. HPLC folosete o coloan ncrcat cu diferite materiale (faza staionar), o pomp ce mpinge faza(ele) mobil(e) prin coloana i un detector care arat timpurile de retenie ale moleculelor. Timpul de retenie depinde de interaciunea dintre faza staionar, moleculele de analizat i solvenii utilizai.AnalizaProba de analizat este introdus n volum mic n fluxul fazei mobile. Trecerea analitului prin coloan este ncetinit de prezena unor interacii de natur chimic sau fizic in faza staionar, acestea trecnd de a lungul coloanei. Totalul ncetinirilor depinde de fiecare analit n parte, faza staionar i compoziia fazei mobile. Timpul la care un analit specific elueaz (iese afar din coloan) este numit timp de retenie; timpul de retenie sub condiii particulare este considerat o caracteristic unic de identificare a analitului dat. Folosirea unei coloane ncrcat cu particule mici (care creeaz o presiune de mpingere mai mare) crete viteza linear, acordnd compuilor timpul minim s difuzeze prin coloan, conducnd astfel la o mbuntire a rezoluiei cromatogramei rezultate. Solvenii comuni care se utilizeaz includ orice combinaie miscibil cu apa sau lichide organice variate (de obicei metanol sau acetonitril). Apa poate conine soluii tampon sau sruri care ajut la separarea componenilor de analizat sau componeni ca acid trifloroacetic care acioneaz ca agent de mperechere ionic.O rafinare mai bun a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziia fazei mobile n timpul analizei; aceasta este cunoscut sub denumirea de gradient de eluie. Un gradient normal pentru o faz cromatografic invers poate se nceap cu 5% metanol i s creasc pn la 50% n 25 minute; gradientul ales depinde de ct de hidrofob este analitul. Gradientul separ amestecul de analii n funcie de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza staionar.

1.7. Aplicaii practice

Ca i aplicaie practic, cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metoda de separare a celulelor n subpopulaii pe baza proprietilor lor de suprafa, stabilindu-se interacii reversibile biospecifice ntre suportul de afinitate i un component (ligandul) de pe suprafaa unui tip de celule. Astfel, iniial se realizeaza o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mrimea sau densitatea celular, izolndu-se o fracie a populaiei celulare, care apoi este supus cromatografiei de afinitate. n acest mod, celulele care au la suprafa ligandul sunt adsorbite, celalalt tip de celule fiind eluate liber, astfel avnd loc prin modificarea condiiilor cromatografice, disocierea interaciilor celula-ligand. Separrile de celule se realizeaz pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lasa ntreacestea spaii largi ce permit trecerea celulelor. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um.

Bibliografie

1. Peter Francisc, Metode cromatografice de separare i analiz, Universitatea din Timioara, 2005.2. Jercan Elena, Analiza cromatografic, Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia, Bucureti, 1982.3. Jercan Elena, Metode de separare n chimia analitica, Editura tehnica, Bucureti, 1983.4. Dana Iordachescu, Analize biochimice speciale, Bucureti, 19875. https://ro.wikipedia.org/wiki/HPLC;6. https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatography;7. http://www.chem.ucalgary.ca/courses/351/laboratory/chromatography.pdf.8. http://www.chem.ucalgary.ca/courses/351/laboratory/chromatography.pdf.

13