prezentare teoretica
DESCRIPTION
purificare proteineTRANSCRIPT
Proteina Lac Represor
În genetică, un operon este o unitate de funcționare a ADN genomic care conține un
grup de gene (cistroni) sub controlul unui promotor unic. Genele sunt transcrise împreună
într-o catenă ARNm și sunt fie traduse împreună în citoplasmă, fie supuse unui proces de
trans-splicing pentru a crea molecule de ARNm monocistronic care sunt traduse separat, adică
mai multe catene de ARNm care codifică fiecare un produs al unei singure gene. Rezultatul
acestui fapt este că genele conținute în operon sunt fie exprimate împreună, fie deloc. Mai
multe gene trebuie co-transcrise pentru a defini un operon.
Inițial, se credea că operonii există numai în procariote, dar de la descoperirea primilor
operoni la eucariote la începutul anilor 1990, au apărut mai multe dovezi care sugerează că
sunt mult mai frecvenți decat a fost estimat anterior. În general, expresia operonilor la
procariote conduce la generarea de ARNm policistronic, în timp ce la eucariote duce la
ARNm monocistronic.
Un operon este format din mai multe gene structurale având un promotor comun și
reglate de către un operator comun. Este definit ca un set de gene structurale adiacente, plus
semnalele reglatoare adiacente care afectează transcrierea genelor structurale. Reglatorii unui
operon dat, inclusiv represorii, co-represorii și activatorii, nu sunt neapărat codificați de acel
operon.
Un operon este alcătuit din 3 componente ADN de bază:
- Promotor - o secvență de nucleotide care permite ca o genă să fie transcrisă.
Promotorul este recunoscut de către ARN polimerază, care apoi inițiază transcripția. În
sinteza ARN, promotorii indică ce gene trebuie utilizate pentru crearea de ARN mesager - și,
prin extensie, controlează ce proteine produce celula.
- Operator - un segment de ADN la care se leagă un represor. Este definit clasic în
operonul lac ca un segment între promotor și genele operon. În cazul represorului, proteina
represoare împiedică fizic ARN polimeraza de a transcrie genele.
- Gene structurale - gene care sunt co-reglate de operon.
Nu întotdeauna inclusă în operon, dar importantă în funcționarea lui este o genă
reglatoare, o genă constant exprimată care codifică pentru proteinele represor. Gena
reglatoare nu este necesar să fie în, lângă, sau chiar în apropierea operonului pentru a-l
controla.
1
Operonul lac este un operon necesar pentru transportul și metabolismul lactozei în
Escherichia coli și multe alte bacterii enterice. Deși glucoza este sursa de carbon preferată
pentru cele mai multe bacterii, operonul lac permite digestia eficientă a lactozei când glucoza
nu este disponibilă. Reglarea genelor operonului lac a fost primul mecanism de reglare
genetică înțeles clar, astfel că a devenit un exemplu principal de reglare a genelor la
procariote.
Operonii bacterieni sunt transcripții policistronici care sunt capabili să producă mai
multe proteine dintr-un ARN transcript. În acest caz, atunci când lactoza este necesară ca o
sursă de zaharide pentru bacterii, cele trei gene ale operonului lac pot fi exprimate și ulterior
traduse la proteinele lor: lacZ, lacY și lacA. Produsul genei lacZ este β-galactozidaza care
scindează lactoza, un dizaharid, în glucoză și galactoză. LacY codifică lactozo-permeaza, o
proteină care se incorporează în membrana citoplasmatică pentru a permite transportul de
lactoză în celulă. În cele din urmă, lacA codifică galactozid O-acetiltransferaza.
Ar fi inutil să se producă aceste enzime atunci când nu există o lactoză disponibilă sau
dacă există o sursă de energie disponibilă mai preferabilă, cum ar fi glucoza. Operonul lac
folosește un mecanism de control dual pentru a se asigura că celula consumă energie pentru a
produce enzimele codificate de operonul lac numai atunci când este necesar.
În absența lactozei, represorul lac oprește producția enzimelor codificate de operonul
lac. În prezența glucozei, proteina activatoare de cataboliți (CAP), necesară pentru producția
de enzime, rămâne inactivă, iar EIIAGlc blochează lactozo-permeaza pentru a preveni
transportul de lactoză în celulă. Acest mecanism dublu de control determină utilizarea
secvențială a glucozei și a lactozei în două faze distincte de creștere, cunoscută sub numele de
diauxie.
2
Structură: Operonul lac este alcătuit din trei gene structurale, un promotor, un
terminator, un reglator și un operator. Cele trei gene structurale sunt: lacZ, lacY și lacA.
- lacZ codifică β-galactozidaza (LacZ), o enzimă intracelulară care clivează
dizaharidul lactoza în glucoză și galactoză.
- lacY codifică lactozo- permeaza (LacY), un simport transmembranar care pompează
β-galactozide în celulă utilizând un gradient de protoni în aceeași direcție.
- lacA codifică galactozid O-acetiltransferaza (LacA), o enzimă care transferă o
grupare acetil de la acetil-CoA la β-galactozide.
Doar lacZ și lacY par a fi necesare pentru catabolismul lactozei.
Reglare: Controlul specific al genelor lac depinde de disponibilitatea lactozei ca
substrat pentru bacterii. Proteinele nu sunt produse de către bacterii când lactoza nu este
disponibilă ca sursă de carbon. Genele lac sunt organizate într-un operon; aceasta înseamnă că
ele sunt orientate în aceeași direcție, imediat adiacente pe cromozom și sunt co-transcrise într-
o singură moleculă de ARNm policistronic.
Transcrierea tuturor genelor începe cu legarea ARN polimerazei (RNAP), o proteină de
legare de ADN, care se leagă la un situs specific de legare ADN, promotorul, situat imediat în
3
amonte de gene. Legarea ARN polimerazei de promotor este ajutată de proteina legată de
cAMP activatoare de cataboliți (CAP, de asemenea cunoscută sub numele de proteina
receptor de cAMP). Cu toate acestea, gena lacI (gena reglatoare pentru operonul lac) produce
o proteină care blochează RNAP să se lege de promotorul operonului. Această proteină poate
fi îndepărtată doar atunci când allolactoza se leagă de ea, și-l inactivează Proteina care se
formează prin transcrierea genei IacI este cunoscută ca represorul lac.
Tipul de reglare pe care îl suferă operonul lac este menționat ca fiind inductibil
negativ, ceea ce înseamnă că gena este oprită de factorul de reglare (lac represorul) doar dacă
nu se adaugă unele molecule (lactoză). Datorită prezenței proteinei represoare lac, inginerii
genetice care înlocuiesc gena lacZ cu o alta genă vor trebui să crească bacteriile
experimentale pe agar cu lactoză. În cazul în care nu fac acest lucru, gena pe care încearcă să
o exprime nu va fi exprimată deoarece proteina represor blochează RNAP de la legarea de
promotor și transcrierea genei.
Odată ce represorul este îndepărtat, RNAP trece apoi să transcrie toate trei gene
(lacZYA) în mARN. Fiecare dintre cele trei gene de pe catena ARNm are propria secvență
Shine-Dalgarno, astfel încât genele sunt traduse în mod independent.
Primul mecanism de control este răspunsul reglator la lactoză, care folosește o
proteină intracelulară de reglare numită represorul lactozei care împiedică producerea de β-
galactozidază în absența lactozei. Gena lacI care codifică pentru represor se află în apropiere
de operonul lac și este întotdeauna exprimată (constitutivă). Dacă lactoza lipsește din mediul
de creștere, represorul se leagă foarte strâns de o secvență de ADN scurtă chiar în aval de
promotor aproape de începutul lui lacZ, numită operator lac.
Legarea represorului la operator interferează cu legarea RNAP la promotor, și, prin
urmare, ARNm care codifică LacZ și LacY este sintetizat numai la niveluri foarte scăzute.
Când celulele sunt crescute în prezența lactozei, totuși, un metabolit al lactozei numit
allolactoză, format din lactoză prin produsul genei lacZ, se leagă de represor, provocând o
schimbare alosterică. . Lactoza este galactozo-(β1->4)-glucoză, în timp ce allolactoza este
galactozo-(β1->6)-glucoză. Astfel modificat, represorul este incapabil de a se lega la operator,
permițând RNAP să transcrie genele lac și conducând astfel la niveluri mai ridicate ale
proteinelor codificate.
4
Operonul lac: Sus:Represat, Jos:Activ.
1: ARN Polimeraza, 2: Represor, 3: Promotor, 4: Operator, 5: Lactoză, 6: lacZ,
7: lacY, 8: lacA.
Gena este în esență dezactivată. Nu există nici o allolactoză care să inhibe represorul
lac, astfel încât represorul leagă strâns operatorul, care obstrucționează ARN polimeraza de la
legarea de promotor, care rezultă în lipsa transcripților ARNm laczya.
Jos: Gena este activată. Allolactoza inhibă represorul, permițând ARN polimerazei să
se lege la promotor și să exprime genele, rezultând în producția de LacZYA. In cele din urmă,
enzimele vor digera toate lactoza, până când nu mai există nici o allolactoză care să se poată
lega la represor. Represorul va lega apoi operatorul, oprind transcrierea genelor LacZYA.
Al doilea mecanism de control este un răspuns la glucoză, care utilizează
homodimerul CAP pentru a crește foarte mult producția de β-galactozidază în absența
glucozei. Adenozin monofosfatul ciclic (cAMP) este o moleculă semnal a cărui prevalență
este invers proporțională cu cea a glucozei. Se leagă la CAP, care la rândul său permite ca
CAP să se lege la situsul de legare al CAP (o secvență ADN de 16 bp în amonte de promotor,
la aproximativ 60 bp în amonte de situsul de start al transcripției), care asistă RNAP în legarea
la ADN. În absența glucozei, concentrația AMPc este mare și legarea CAP-cAMP la ADN
crește semnificativ producția de β-galactozidază, permițând celulei de a hidroliza lactoza și
elibera galactoză și glucoză.
5
Mai recent s-a demonstrat că excluziunea inductorului blochează exprimarea
operonului lac când glucoza este prezentă. Glucoza este transportată în celulă prin sistemul
fosfotransferazic dependent de PEP. Transportul glucozei este însoțită de fosforilarea sa de
către EIIBGlc, scoțând grupul fosfat de la alte proteine PTS, inclusiv EIIAGlc. Forma
nefosforilată de EIIAGlc se leagă la permeaza lac și împiedică aducerea lactozei în celulă. Prin
urmare, dacă ambele, glucoza și lactoza, sunt prezente, transportul glucozei blochează
transportul inductorului operonului lac.
Structura represorului: Lac represorul este un tetramer de subunități identice, cu o
masa totală de 154,52 kDa. Fiecare subunitate conține un motiv helix-turn-helix (HTH)
capabil de legare la ADN. Situsul operatorului unde se leagă represorul este o secvență de
ADN cu simetrie repetitiv inversată. Cele doua jumătăți ale situsului ADN de legare ale
6
operatorului împreună se leagă la două dintre subunitățile represorului tetrameric. Deși
celelalte două subunități de represor nu fac nimic în acest model, această proprietate nu a fost
înțeleasă mulți ani.
În cele din urmă s-a descoperit că mai sunt implicați doi operatori suplimentari în
reglarea lac. Unul (O3) se află la aproximativ 92 pb în amonte de O1 la capătul genei lacl, iar
celălalt (O2) este cu aproximativ 401 bp în aval de O1 în prima parte a lacZ.
Aceste două situsuri nu au fost descoperite mai devreme, deoarece acestea au funcții
redundante și mutațiile individuale nu afectează represia foarte mult. Mutații singulare fie la
O2 sau O3 au efecte numai de 2-3 ori. Cu toate acestea, importanța lor este demonstrată de
faptul că un mutant dublu defect atât la O2 și O3 este dramatic derepresat(de circa 70 ori).
În modelul actual, lac represorul este legat simultan la principalul operator O1 și fie la
O2 sau O3. Dacă represorul se desface de O1 temporar, legarea de un operator minor îl
păstrează în apropiere, astfel încât să poată relega rapid. Acest lucru ar crește afinitatea
represorului pentru O1.
LacI Tetrameric se leagă la două secvențe operator și induce buclarea ADN.
Două subunități funcționale dimerice LacI (roșu+albastru și verde+portocaliu) leagă fiecare o
secvență de operator ADN. Aceste două subunități funcționale sunt cuplate în regiunea de
tetramerizare, astfel, LacI tetrameric se leagă la două secvențe de operator. Aceasta permite
LacI tetrameric să inducă buclarea ADN.
7
Mecanism: Represorul este o proteină alosterică, adică poate asuma una din cele două
forme ușor diferite, care sunt în echilibru una cu cealaltă. Într-o formă represorul se va lega la
ADN-ul operatorului cu înaltă specificitate, iar în cealaltă formă a pierdut specificitatea.
Conform modelului clasic de inducție, legarea inductorului, fie allolactoză sau IPTG, la
represor, afectează repartizarea represorului între cele două forme. Izopropil-β-D-
tiogalactozidul (IPTG) este utilizat frecvent ca un inductor al operonului lac, fiind un analog
al lactozei. Astfel, represorul cu inductorul legat este stabilizat în conformația care nu leagă
ADN. Cu toate acestea, acest model simplu nu poate fi complet, pentru că represorul este
legat destul de stabil de ADN, dar este eliberat rapid prin adăugarea de inductor. Prin urmare,
este clar că inductorul se poate lega de asemenea, la represor, atunci când represorul este deja
legat de ADN. Nu este încă cunoscut în întregime mecanismul exact de legare.
Gena lac și derivații săi sunt frecvent utilizați ca genă reporter într-un număr de tehnici
de selecție bacteriene în care trebuie să fie determinată legarea cu succes a unui activator
transcripțional la o secvență specifică de promotor.
Integraza
Integraza retrovirală (IN) este o enzimă produsă de un retrovirus (cum ar fi HIV),
care permite ca materialul genetic al acestuia să fie integrat în ADN-ul celulelor infectate.
IN este o componentă cheie în complexul de pre-integrare retroviral (PIC).
Toate IN retrovirale din proteine conțin trei domenii canonice, legate prin linkeri flexibili:
- un domeniu N-terminal HH-CC de legare a zincului (un pachet de trei elice stabilizat
printr-o coordinare a unui cation Zn (II)) numit asa pentru motivul său zinc-finger HX3-
7HX23-32CX2C. Domeniul HHCC este critic pentru formarea unui complex stabil cu ADN
viral, iar domeniul poate fi implicat în multimerizarea integrazei.
- un domeniu de centru catalitic localizat într-un miez rezistent la proteaze, care este
extrem de conservat în retrovirusuri și elemente retrovirale. Miezul central este important
pentru cataliza zi dimerizare.
- un domeniu C-terminal de legare a ADN care reprezintă cea mai puțin conservată
regiune pentru integrazele virale. Domeniul C-terminal este capabil de legare a ADN
nespecific și se crede că ar conține situsul pentru legarea ADN țintă.
8
O trăsătură caracteristică a integrării ADN-ului retroviral este că multe situsuri de pe
ADN țintă pot fi folosite pentru integrare. Cu toate acestea, frecvența și distribuția integrării
nu sunt întâmplătoare, și există puncte fierbinți și reci ale integrării asupra ADN țintă.
Integrarea survine după producerea de ADN dublu catenar viral de către revers
transcriptaza ADN polimeraza ARN/ADN dependentă virală.
Funcția principală a IN este de a introduce ADN-ul viral în ADN-ul cromozomial
gazdă, un pas care este esențial pentru replicarea HIV. Integrarea este un punct fără întoarcere
pentru celulă, care devine un purtător permanent al genomului viral (provirus). Integrarea este
în parte responsabilă pentru persistența infecțiilor retrovirale. După integrare, expresia genelor
și producția particulelor virale poate avea loc imediat sau la un moment dat în viitor.
Momentul, se presupune, depinde de activitatea locusului cromozomal care găzduiește
provirusul.
IN retrovirale catalizează două reacții:
- procesarea 3', în care două sau trei nucleotide sunt îndepărtate din una sau ambele
capete 3 'ale ADN-ului viral pentru a expune dinucleotidele CA invariante la ambele capete 3'
ale ADN-ului viral.
- reacția de transfer a lanțului, în care capetele prelucrate 3' ale ADN-ului viral sunt
covalent legate la ADN-ul cromozomial al gazdei.
Ambele reacții sunt catalizate de către același centru activ și se efectuează prin
transesterificare, fără un intermediar covalent proteină-ADN, în contrast cu reacțiile catalizate
de Ser și Tyr recombinaze.
Integraza HIV este o proteină de 32 kDa produsă din porțiunea C-terminală a
produsului genei Pol și este o țintă atractivă pentru noi medicamente anti-HIV.
Structura completă a HIV-integrazei cu aminoacizii catalitici prezentați în formă de bile și
filamente
9
Izolarea și purificarea proteinelor
Un vector de expresie, cunoscut și sub numele de construct de expresie, este de obicei
o plasmidă sau virus proiectat pentru exprimarea proteinelor în celulele. Vectorul este utilizat
pentru a introduce o anumită genă într-o celulă țintă, și poate forța mecanismul celulei de
sinteză a proteinelor pentru a produce proteina codificată de genă. Plasmida este proiectată să
conțină secvențe care acționează ca regiuni reglatoare și promotor și conduc la transcripția
eficientă a genei transportate pe vectorul de expresie. Scopul unui vector de expresie bine
conceput este producerea de cantități semnificative de ARN mesager stabil, și, prin urmare
proteine
Alegerea vectorului de expresie
Vectorii de expresie conţin:
- un promotor la care se leagă ARN-polimeraza pentru a începe transcrierea
- operatorul
- situsul de legare a ribozomilor
- situsul de clonare
- originea de replicare
- gena de selecţie care dă rezistenţă la un antibiotic (de exemplu la ampicilină)
De cele mai multe ori vectorul conţine şi o secvenţă de mărime cunoscută –
« tag » - care va simplifica foarte mult izolarea, purificarea şi detectarea proteinelor de interes.
Proteinele obţinute prin acest proces sunt numite proteine de fuziune.
Clonarea genelor de interes în vectori de expresie si punerea lor sub controlul unui
promotor puternic permite producerea proteinelor codificate de aceste gene în gazde precum
Escherichia coli. Prin alegerea unui promotor a carei activitate este cunoscută și ușor de indus
apare un avantaj foarte mare: sinteza proteinei poate fi „ordonată” la momente de timp strict
controlate si de asemenea, cantitatea de proteina obținută poate fi extrem de mare comparativ
cu gazda nativă.
Promotorul T7. Polimeraza ADN-dependentă de ARN a bacteriofagului T7 (T7
RNAP) este tot mai mult utilizată pentru a exprima o gamă largă de proteine din gazde
bacteriene. In acest sistem, genele țintă sunt clonate în aval de promotorul T7 bacteriofag pe
un nr mediu de copii de plasmide. Deoarece gena țintă nu utilizează polimeraza gazdei,
expresia bazală de produse genetice toxice nu poate avea loc în absența T7.
10
RNAP pot fi furnizate prin încorporarea genei T7 RNAP în genomul tulpinii gazdă (de
exemplu, E. coli BL21). Expresia T7 RNAP în această tulpină este de la promotorul lacUV5-
IPTG inductibil.
Cu toate acestea, utilizarea unui promotor bazat pe lac duce la prezența unei
expresii de bază în absența inducerii (de care ne-am folosit pentru obținerea și izolarea
lacR cu activitate de legare ADN, fără inducție cu IPTG s-ar fi legat de el și l-ar fi
inactivat, și fără HisTag, dat fiind ca Histidinele constitutive ale lacR sunt astfel orientate
in spațiu încât au afinitate pentru coloana cu Ni)
Promotorul tac. Acesta este un promotor puternic, obținut prin fuzionarea regiunii -35
de la promotorul operonului responsabil de calea de sinteză a triptofanului cu regiunea -10 de
la operonul lac 5. Este capabil să inducă expresia genei țintă într-o asemenea masură încât
aceasta se acumulează în proporție de 20-30% din proteinele totale. Vectorii de expresie care
au acest promotor poartă de asemenea și gena lacO si lacI. Acestea sunt necesare deoarece în
lipsa lor ar avea loc expresia genei de interes în lipsa inductorului, numărul de molecule de
represor produse de copia cromozomială a genei lacI nefiind suficiente pentru a represa
numarul mare de promotori existenți datorită plasmidelor.
Promotor T7 1-17Operator lac 21-42GenaT7 10 Situs de legare al ribozomilor 50-80His-tag 92-109Polylinker 111-179Promotor SP6 184-202Terminatorul transcrierii T7 281-322Gena LacI 732-1813 (inversată)Gena -Lactamază (care confera rezistența la Amp) 2583-3433Originea replicării 3507-4203
11
Harta vectorului pGEX-4T-1
Sistemul de vectori de expresie PET
Procesul de expresie a fost monitorizat prin electroforeză denaturantă SDS-PAGE.
12
Celulele competente BL21 (DE3) sunt celule competente chimic E. Coli și sunt
purtători ai lizogenului (fag dormant) lambda DE3. Prin urmare, tulpina BL21 (DE3) conține
gena T7 a ARN polimerazei controlată de promotorul lacUV5 în ADN-ul ei cromozomial.
ARN polimeraza T7 este exprimată după adăugarea de izopropil-1-tio-β-D-galactopiranozida
(IPTG) care induce un nivel înalt de expresie proteică de la vectorii de expresie cu promotorul
T7 (de exemplu, PET).
Transformarea bacteriană
Avem nevoie de:
- Plasmid – ex pHAT2-integrază
- Celule competente BL21 (DE3) – se găsesc la -80°C – se pun pe gheață pentru
a se dezgheța.
Se adaugă 1µl plasmid (cca 200-400 ng ADN) în tubul Eppi cu celule competente. Se
incubează pe gheață 10 min.
Se face șoc termic prin incubare 1 min la 42°C pentru permeabilizarea celulelor și o
mai eficientă înglobare a ADN-ului plasmidial.
Se incubează pe gheață 2 min.
Peste celulele șocate se adaugă 900 µl mediu LB lichid fără antibiotic deoarece încă nu
au apucat să exprime genele de rezistență la antibiotic.
Incubare 1 h la 37°C.
Se distribuie 100 µl cultură pe placa cu mediu solid LB cu agar și antibiotic (Amp).
Incubare O/N la 37°C max 16 h deoarece coloniile cu rezistență secretă enzime care
descompun antibioticul și se formează astfel zone fără rezistență în jurul coloniilor principale
pe care se dezvoltă colonii mai mici satelit..
13