81

POLIMORFISMUL RAPD-PCR LA PLANTELE DE CUCUMIS SATIVUS L.

Duca Maria, Port Angela, Homenco Tatiana

Universitatea de Stat din Moldova

Introducere

Identi carea polimor smului genetic n scopul aprecierii diversitii genetice, selectrii formelor parentale i a caracterelor calitative i cantitative prezint o importan deosebit n procesul de obinere a hibrizilor nalt productivi. Polimor smul poate identi cat la diverse nivele de organizare prin analiza caracterelor morfo ziologice [4, ?18, 19], biochimice [11, 12], citogenetice [5, 6, 9], moleculare [7, 10, 12, 13] etc. In aspect fundamental, cercetarea variabilitii caracterelor ce determin polimor smul poate contribui la identi carea marcherilor genetico-moleculari utilizai n analiza genetic i logenetic [16, 17]. n aspect practic, analiza polimor smului genetic este primordial pentru rezolvarea problemelor de conservare a biodiversitii [10, 15], ameliorarea la heterozis asistat de marcheri moleculari [11, 13, 15], etc.

Fenomenul de heterozis este larg rspndit n natur i rmne a n continuare una dintre cele mai actuale probleme ale geneticii i ameliorrii contemporane. Succesul seleciei la heterozis este determinat de identi carea i studierea nsuirilor valoroase, inclusiv analiza polimor smului i evidenierea caracterelor complexe [1, 2, 8, 11].

Scopul lucrrii const n relevarea unor particulariti genetice speci ce prin analiza polimor smului RAPD-PCR la diverse genotipuri de castravei - linii, soiuri i hibrizi F1 cu diferit productivitate i corelarea acestora cu vigoarea hibrid i efectul de heterozis.

Material i metode

Investigaiile au fost efectuate pe parcursul anilor 2003-2007 n cadrul laboratorului Securitate biologic al catedrei Biologie Vegetal, USM. Materialul de cercetare - ase hibrizi de castravei (Cucumis sativus L.) i formele parentale ale acestora a fost oferit de Institutul de legumicultur i irigaie din Tiraspol (tab.1.). Experienele s-au efectuat n trei repetri biologice i au inclus genotipuri care formeaz o schem dialel incomplet.

Tabelul 1. Liniile parentale i hibrizii de castravei utilizai n cercetare.

Forma parental

Hibrizi cu productivitatenalt

Varianta martor Hibrizi cu productivitate joas

H 273 H 274 Vzglead Epilog H 6 H 7 L 222 L 203 L 371 L 371 L 222 L 222 L 203 L 316 Beregovoi Favorit Beregovoi Favorit

ADN-ul a fost izolat cu DNAzol (GIBCO BRL) i cuanti cat spectrofotometrtic [3]. Mediul de reacie PCR (25l) a inclus: 50 ng ADN, dNTP 200M de ecare tip, primer 1 M, 1,25 uniti/pe reacie GoTaq ADN-polimeraza (Promega), MgCl2 2,5 mM. Programul de ampli care: 95?C - 3 min urmat de 45 cicluri: 95?C 1 min., 36?C 1

82

min., 72C 2 min. i 72C 5 min. Ampliconii s-au analizat prin electroforez n gel de agaroz 1,6%, bromur de etidiu 0,5 g/ml i au fost notai conform primerului asociat cu dimensiunea ampliconului, de ex.: P36800 amplicon de 800 pb obinut n reacia PCR cu P36. Au fost utilizai opt primeri: P28 (GACCGCTTGT), P36 (CCGAATTCGC), P37 (CTGACCAGCC), P43 (AGTCAGCTGC), P44 (GGACCCCGCC), P46 (GGTTGGGGAG), P48 (GCGGTGCTCG), P49 (GACAGCCTA).

Rezultate

Relevarea organizrii genetice a organismului n baza analizei ADN-ului ca unitate structural a genei, evitnd ncruciarea i aciuni ndelungate de testri n cmp, rmne a una dintre direciile de perspectiv n ameliorarea plantelor. Aceste argumente au motivat o serie de analize RAPD-PCR cu utilizarea a opt primeri arbitrari.

Toi primerii testai au participat la ampli care, rezultnd un numr variabil de ampliconi. Primerii P43, P46, P48, P49 au generat pro luri cu cate 1- 4 benzi comune pentru toate genotipurile homo- i heterozigote studiate: P43470; P46500; P46290; P46180; P48480; P48290; P48150; P49920; P49800; P49750; P49600 ( g. 1. A; B; C; D), rezultate care ne-au determinat s le excludem din analizele ulterioare.

Fig. 1. Pro lul ampliconilor RAPD obinui cu primerii: P43 (A), P46 (B), P48 (C), P49 (D).

M-martor; 1- L216; 2- H 274; 3- /L203; 4-L 222; 5- Beregovoi; 6- Vzglead; 7- L 371; 8- Epilog; 9- Favorit; 10 - L22; 11- H 6; 12- H 7.

Analiza polimor smului genetic la hibrizii cu productivitate nalt. PCR -RAPD obinut cu P28, P36, P37 i P44 a pus n eviden spectre electroforetice heterogene att dup dimensiunea ampliconilor, ct i dup intensitatea uorescenei, sugernd cantiti diferite ale produsului de ampli care.

Astfel, pro lul hibrizilor experimentali cu productivitate nalt obinut cu primerul P28 a prezentat 12 ampliconi cu dimensiuni de la130 pn la 830 pb ( g. 2). Genotipurile formelor parentale ale hibrizilor H 274 i H 273 conin trei ampliconi comuni: P28480, P28500 i P28600, ultimii doi variind dup intensitatea uorescenei n funcie de genotip. Restul 9 produse de ampli care cu acest primer au prezentat un polimor sm estimat ?prin prezen/absen i inclusiv - luminozitate. Liniile, homozigote patern i matern, ale hibridului H 274 s-au caracterizat prin dou (P28130; P28270) i respectiv una (P28300) benzi polimorfe, toate trei ind cu uorescen slab. Linia patern a hibridului 273 este similar liniei materne a hibridului H 274 (L 203). Cealalt linie parental a acestui hibrid L 222, conine dou benzi polimorfe dintre care una similar dup dimensiune cu linia patern a hibridului H 274 (P28270) i una cu greutate molecular medie de 700 pb ( g. 2).

83

Hibrizii H 274 i H 273 conin ase i respectiv 4 locusuri polimorfe. Studiul polimor smului molecular prin intermediul secvenelor de ADN ampli cate arbitrar cu primerul P36 a relevat prezena a 7 fragmente cu lungimea de 450-950 pb ( g. 2).

Diversitatea genetic n cadrul hibrizilor omologai i formelor parentale.

Analiza RAPD a hibridului H 274 i a formelor parentale a constatat ase benzi cu masa molecular cuprins ntre 550-850 pb. Similar primerului analizat P28, trei ampliconi cu aceeai greutate molecular, ns diferii dup coninut au fost comuni pentru formele homo- i heterozigote. Forma parental 203 comun ambelor combinaii de ncruciare nu conine ampliconi speci ci. Celelalte dou forme parentale ale hibriz-ilor analizai se deosebesc ntre ele att prin numrul benzilor polimorfe, ct i dup in-tensitatea uorescenei. Linia patern a hibridului H 274 conine dou benzi polimorfe P36800 i P36900, iar cea matern a hibridului H 273 o singur fracie P36900 .

Primerul 37 a generat pro le cu ase secvene polinucleotidice dintre care dou comune pentru toate genotipurile studiate: P37280 i P371300. Aceti ampliconi se deosebesc ntre ei dup coninut. P37280 s-a remarcat printr-o uorescen mai intens comparativ cu ampliconul cu greutate molecular mare - P371300. Majoritatea benzilor polimorfe au fost de o intensitate medie a luminozitii ( g. 2). Linia 203 s-a evideniat printr-o singur band polimorf (P37480) care este motenit i de hibridul H 274. Linia patern a acestui hibrid conine doi ampliconi speci ci P37560, i P37900 care de asemenea sunt regsii n pro lul genotipului heterozigot. H 274 se deosebete de ambele linii parentale prin prezena produsului de ampli care P37600. Electroforegramele hibridului 273 i formelor parentale au pus n eviden cinci benzi cu masa molecular cuprins ntre 280-1300 pb. Forma matern se deosebete de cea patern prin prezena a dou benzi polimorfe cu greutate molecular medie: P37560 i P37900 cu o intensitate slab a luminozitii ( g. 2).

Spectrele electroforetice obinute cu primerul P44 au prezentat un polimor sm mai pronunat determinat att de genotip (homo- sau heterozigot), ct i de modul de asociere n combinaii de ncruciare. Acest primer a generat 12 componeni polinucleotidici cu dimensiuni de 100 - 1000 pb variabili n coninut ( g.2). Pro lele RAPD ale primerului P44 au demonstrat trei produi de ampli care comuni pentru formele parentale i hibrizii de prima generaie - P44100, P44250 i P44650. Linia patern are dou benzi polimorfe cu dimensiunea de 200 i 500 pb. Linia matern este mai heterogen, prezentnd patru benzi polimorfe dintre care banda de 330 pb n lungime este speci c, lipsind la forma patern i la hibrid. Linia matern a hibridului H 273 de asemenea conine patru benzi polimorfe, ns nici una dintre ele nu este speci c. Toate secvenele sunt prezente i n genotipul homozigot patern (P44200, P44500 ) sau in cel heterozigot (P44380, P44400 ).

Analiza comparativ a spectrelor electroforetice a hibrizilor omologai Vzglead i Epilog, inclusiv a formelor parentale ale acestora demonstreaz, c produsele de ampli care a ADN-ului cu primerul P28 s-au se parat n ase i respectiv apte componeni electroforetici, dintre care patru au fost polimor . Lungimea fragmentelor de ampli care a fost cuprins n limitele 270-730 pb ( g. 3).

84

Fig. 2. Pro lul electroforetic RAPD generat de primerii P28, P36, P37, P44 la hibrizii nalt productivi i formele parentale.

M-martor; 1 - L216; 2 -H 274; 3 -L203; 4 -H 273; 5 -L222.

Ampliconii P28480; P28500 i P28600 comuni pentru genotipurile hibrizilor cu productivitate nalt sunt prezeni i la aceste genotipuri heterozigote i homozigote, care de asemenea variaz dup intensitatea luminozitii benzilor n cadrul unei combinaii de ncruciare. n aspect comparativ formele parentale ale hibrizilor omologai se deosebesc de cele ale hibrizilor H 274 i H 273 prin faptul, c toi aceti ampliconi sunt de o intensitate mai mare a luminozitii la ambii hibrizi. Forma matern a hibrizilor nu conine benzi speci ce spre deosebire de formele paterne care prezint un amplicon P28270 n cazul soiului Beregovoi i doi ampliconi P28700 i P28730 in cazul soiului Epilog ( g.3). Genotipul heterozigot Vzglead conine trei benzi polimorfe dintre care P28270 prezent i la forma patern i doi ampliconi P28310 i P28700 care lipsesc la liniile parentale. Hibridul Epilog are un pro l similar cu cel al F1 Vzglead. Acesta nu conine ampliconul P28730 prezent la linia patern.

Primerul arbitrar P36 a produs 5 ampliconi: trei comuni i patru polimor cu masa molecular cuprins ntre 450 - 950 bp ( g. 3). La nivelul spectrelor electroforetice ale liniilor parentale ale hibridului Epilog nu au fost relevate deosebiri calitative. ns,

85

spre deosebire de hibridul Vzglead, hibridul Epilog a motenit toi componenii de la prini.

Fig. 3. Pro lul electroforetic RAPD generat de primerii P28, P36, P37, P44 la hibrizii omologai i formele parentale.

M-martor; 1- Beregovoi; 2- Vzglead; 3-L 371; 4-Epilog; 5- Favorit.

Genotipurile studiate cu primerul P37 au fost caracterizate prin 5 locusuri, ampliconii incluzndu-se n limita de valori ale greutii moleculare 280-1300 pb. Spectrele RAPD ale ambelor combinaii de ncruciare au constatat dou benzi nespeci ce de 280 i1300 pb i trei benzi polimorfe P37480, P37560 i P37 900 ( g. 3).

Paternele ampliconilor ale hibrizilor sunt asemntoare, cu excepia faptului, c F1 Vzglead conine P37900 iar hibridul Epilog - P37560 care lipsesc la prini. ADN-ul acestor dou familii ampli cat cu primerul P44 a prezentat apte benzi. Spre deosebire de formele parentale a hibrizilor experimentali cu productivitate nalt, n pro lul obinut cu acest primer s-au depistat 5 benzi comune formelor homo- i heterozigote, inclusiv ampliconul P44500 care a prezentat polimor sm de prezen/absena la primele combinaii de ncruciare analizate ( g. 3).

86

Analiza polimor smului genetic la hibrizii cu productivitate joas

Spectrele RAPD la hibrizii H 6 i H 7 i la formele lor parentale cu primerul P28 a stabilit prezena diferenelor calitative i cantitative. Genotipul matern comun ambilor hibrizi s-a caracterizat prin doi ampliconi polimor : P28270 i P28700. Formele paterne se deosebesc de cea matern prin lipsa fraciilor P28700 in cazul hibridului H 6 i lipsa P28270 corelat cu prezena ampliconului P28730 in cazul hibridului H 7 ( g. 4).

Fig. 4 . Pro lul electroforetic RAPD generat de primerii P28, P36, P37, P44 la hibrizii cu productivitate sczut i formele parentale.

M-martor; 1- Beregovoi; 2- H6; 3-L 222; 4-H 7; 5- Favorit.

Hibrizii H 6 i H 7 se caracterizeaz prin prezena a trei i doi ampliconi polimor . O particularitate distinctiv n acest caz este faptul c P28270 este prezent la formele parentale ale H 6 iar P28700 - la cele ale hibridului H 7. Hibrizii se deosebesc intre ei la nivelul ampliconului cu dimensiunea de 310 pb care este prezent la H6 i lipsete la H7, inclusiv i variaii cantitative ale ampliconilor nespeci ci.

Paternele ampliconilor obinute prin ampli carea cu primerul P36 sunt caracterizate prin prezena a trei benzi nespeci ce prezente la toate genotipurile analizate indiferent de combinaia de ncruciare, o band polimorf la hibridul H6 cu dimensiunea de 900 pb, care de altfel se conine i la linia matern i un amplicon speci c

87

P36450 n cazul hibridului H 7 ( g. 4). La nivelul spectrelor obinute cu primerul P37 s-a constatat prezena a dou benzi nespeci ce i trei secvene de ADN polimorfe de 480 pb, 560 i 900 pb ( g.4). Analiza hibrizilor H 6 i H 7 reprezint similaritate la nivel tuturor produselor de ampli care, insumand ampliconii de la formele parentale. Pro lul RAPD generat de primerul 44 a demonstrat aceeai heterogenitate comparativ cu ceilali primeri, observat la analiza hibrizilor cu productivitate nalt ( g. 4).

Generaliznd rezultatele obinute putem constata, c nivelul polimor smului difer de la un genotip la altul, cel mai nalt grad al diversitii genetice a fost nregistrat la hibrizii cu un heterozis superior, iar cel mai mic la hibrizii cu productivitate sczut n special la H 7. Tabloul general al analizei RAPD (tab. 2) a evideniat un numr mai mic i aproape constant (n aproximativ 50% din cazuri) de benzi la linia matern n comparaie cea patern i n special n raport cu F1. Cea mai mare heterogenitate s-a constatat la hibrizii de prima generaie, unde numrul de benzi a variat ntre 5 i 9 produse de ampli care. Mai informativi au fost primerii P28 i P44.

Tabelul 2. Numrul benzilor generate de primeri analizai prin RAPD-PCR.

Hibrizi cu:

efect de heterozis superior productivitate nalt, omologai

productivitate sczut

H 274 H 273 Vzglead Epilog H6 H7

F1

P28 9 7 6 6 6 5P36 5 5 4 5 4 5P37 6 5 5 5 5 5P44 7 8 7 5 7 5

P28 5 4 4 5 4 5P36 5 3 3 4 3 4P37 4 3 3 5 3 4P44 5 7 5 5 5 5

P28 4 5 3 3 5 5P36 3 4 4 4 4 4P37 3 4 3 3 4 4P44 7 7 7 7 7 7

Concluzii

Analiza spectrelor electroforetice ale ampliconilor RAPD-PCR la 12 genotipuri de castravei cu opt primeri arbitrari a permis s constatm o heterogenitate nalt a materialului ameliorativ, care re ect structura genotipic a liniilor i hibrizilor inclui in cercetare.

Patru primeri au pus n eviden 1-4 ampliconi identici pentru toate genotipurile, iar ali patru au evideniat un nalt grad de polimor sm. Cel mai nalt grad al diversitii genetice a fost relevat la H 273, iar cel mai mic la H 7. Cel mai inalt polimor sm molecular a fost relevat la analiza RAPD-PCR cu primerii P28 i P44.

88

Referine

Goral H. Heterosis and Combining Ability in Spring Triticale (x Triticosecale, Wittm.). Plant 1. Breed. Seed Sci., 1999, vol. 43, p. 25-34.

Lopez-sese A.I., Staub J.E., Gomez-guillamon M.L. Combining ability analysis of yield 2. components in cucumber. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 2002, vol. 127, p. 931-937.

Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning: a laboratory manual, V. II, New-York, 2001. 3. Smith O.S., Smith J.S.C., Bowen S.L., Tenborg R.A., Wall S.J. Similarities among a group of 4.

elite maize inbreds as measured by pedigree, F1 grain yield, grain yield, heterosis, and RFLPs. Theor. Appl. Genet., 1990, vol. 80, p. 833-840.

Staub J.E., Sun Z., Chung S.M., Lower R.L. Evidence for colinearity among genetic linkage 5. maps in cucumber. HortScience, 2007, vol. 42, p. 20-27.

Wilde P. Multi-stage selection for combining ability among pollen parent lines in hybrid rye 6. breeding. Vortr. P anzenzuchtg, 1996, vol. 35, p. 15-25.

Witkowicz J., Urbaczyk E., Przybecki Z. AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis 7. sativus L.) near isogenic lines differing in sex expression. Cellular & Molecular Biology Letters, 2003, vol. 8, Nr. 2, p. 375-381.

.., .. ()- 8. . . ., 1986, . 33, . 4, . 769-777.

.., .., .. 9. . i i. . i. , 1997, 3, . 37-40.

. 10. : . . - .-. : . ., 2002, 33.

.. . . . .-. 11. .. . ., , 1983, 320.

.. . .: , , 12. 1982, . 163-177.

.. - 13. . , 1984, . 9, . 99-104.

. 14. // ., . . .. . : 2001.c. 128-133.

.., .., .. .. : 15. . . ., . . . .-. . ., 1997, . 211.

. . : . 16. . ., 1974, . 35, 5, c.666-678.

.. . 17. , 1986, . 22, 2, c.229-242.

.., .. 18. . , 1994, . 41, 1, . 92-96.

.. . ., 1972, 32c.19. Cercetarile au fost efectuate cu suportul nanciar oferit de Moldavian esearch and Development

Association (MRDA) i U.S. Civilian Research & Development Foundation (CRDF) prin grantul MERL-1300``.