1

PLATELIA™ LYME IgG 1 placă – 96 72952 DETECŢIA CALITATIVĂ A ANTICORPILOR IgG SPECIFICI DE BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ÎN SER, PLASMĂ SAU LICHID CEFALORAHIDIAN UMAN PRIN ANALIZĂ IMUNOENZIMATICĂ

883689 – 2015/11 1. DESTINAŢIA TRUSEI Platelia™ Lyme IgG este o analiză imunoenzimatică de tip ELISA indirectă pentru detecţia calitativă a anticorpilor IgG specifici de Borrelia burgdorferi sensu lato în ser, plasmă sau lichid cefalorahidian (LCR) uman. 2. VALOAREA CLINICĂ Borelioza Lyme (sau boala Lyme) este o infecţie necontagioasă cauzată de o bacterie din familia spirochetelor, Borrelia burgdorferi, transmisă de căpuşele din genul Ixodes (2). Diverse animale sunt gazde pentru bacterii, iar transmiterea la om se face prin înţepătura căpuşelor infectate. Riscul transmiterii este proporţional cu contactul avut cu căpuşa. Prevalenţa bolii Lyme este mare în ţările cu climat temperat sau rece din emisfera nordică, de la China la America de Nord, şi din Scandinavia până în nordul Africii. Se estimează că sunt circa 17.000 cazuri anual în Statele Unite (3), şi probabil peste 50.000 în Europa, unde cazurile sunt distribuite inegal, în creştere de la vest la est (4). În prezent, s-a demonstrat cu certitudine că Borrelia burgdorferi, descrisă în 1984 ca specie bacteriană unică, este în realitate un complex de mai multe specii, dintre care cinci sunt patogene pentru om: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii și Borrelia bavariensis (7,8). Alte două specii sunt potențial patogene: Borrelia valaisiana și Borrelia lusitaniae. Aceste șapte specii sunt răspândite în Europa, în timp ce în Statele Unite ale Americii este prezentă doar B. burgdorferi sensu stricto.Simptomele clinice ale bolii Lyme sunt diverse şi uneori dificil de recunoscut (6). Evoluţia bolii are trei stadii. Stadiul timpuriu (stadiul I) poate fi asimptomatic şi se caracterizează printr-un sindrom similar cu gripal. În 50-80% din cazuri, la câteva zile sau săptămâni după înţepătura de căpuşă, apare raş cutanat localizat, cu expansiune centripetă, denumit erythema migrans (EM). Fără tratament, diseminarea hematogenă a Borrelia va induce câteva săptămâni mai târziu artrită inflamatorie, tulburări neurologice sau meningeale şi simptome cutanate sau cardiace (stadiul II). După luni sau ani, boala poate evolua la stadiul cronic, asociind la diferite nivele acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopatie, encefalomielită şi artrită cronică (stadiul III) (1). Fiecare specie de Borrelia burgdorferi are un tropism particular. Erythema migrans în stadiul I este asociată tuturor celor trei specii. Cu toate acestea, complicaţiile neurologice sunt mai frecvent asociate cu B. garinii, iar artrita este mai frecvent asociată cu B. burgdorferi ss, în timp ce acrodermatitis chronica atrophicans este specifică pentru B. afzelii. Diagnosticul bolii Lyme nu trebuie confirmat fără o investigare atentă a antecedentelor medicale ale pacientului, a criteriilor clinice şi biologice, şi estimarea riscului înţepăturii de căpuşă. Din cauza dificultăţilor decelării directe, ale izolării prin cultură sau implementării metodelor de biologie moleculară, serologia rămâne elementul cheie al diagnosticului biologic în boala Lyme (1,5,9). Anticorpii IgM specifici de Borrelia burgdorferi apar la 3-6 săptămâni după contaminare şi pot persista în evoluţia bolii, în timp ce anticorpii IgG apar mai târziu şi ating maximul doar după luni, sau chiar ani. Chiar dacă serologia este mai puţin utilă în stadiul timpuriu, aceasta este esenţială în stadiile secundar sau terţiar, mai ales în absenţa erythema migrans. Când serologia este negativă, în ciuda unui status clinic sugestiv, trebuie efectuată o nouă analiză la 3 săptămâni după testarea iniţială. Prezenţa anticorpilor IgM specifici nu indică neapărat o infecţie recentă. Similar, prezenţa anticorpilor IgG specifici nu este întotdeauna asociată unei infecţii trecute. De asemenea, determinarea indicelui de sinteză intratecală al anticorpilor IgG specifici anti-Borrelia burgdorferi sensu lato reprezintă un ajutor important în orientarea diagnosticului când se suspectează o neuroborelioză Lyme (10,11,12). Antigenele şi anticorpii utilizaţi în trusele de analiză Platelia™ Lyme IgG (cod 72952) şi Platelia™ Lyme IgM (cod 72951) au fost selectate pentru a permite decelarea anticorpilor IgG şi IgM specifici pentru diverse tulpini americane şi europene de Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIPIUL METODEI Platelia™ Lyme IgG este o analiză calitativă pentru detecţia în ser, plasmă sau LCR uman a anticorpilor IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato, folosind o metodă enzimatică ELISA indirectă. Microplaca este sensibilizată cu antigene inactivate de Borrelia burgdorferi. Conjugatul este alcătuit din anticorpi monoclonali specifici de lanţuri gama umane (anti-IgG) şi marcaţi cu peroxidază. Testarea cuprinde următoarele etape: Etapa 1 Probele recoltate de la pacienţi (ser sau plasmă) şi controalele sunt diluate în proporţie de 1:101. Probele de LCR sunt diluate în proporţie de 1:2. Probele diluate sunt apoi distribuite în godeurile microplăcii. În timpul incubării de 1 oră la 37°C, anticorpii IgG anti-Borrelia burgdorferi prezenţi în probă, se leagă la antigenul Borrelia din godeurile microplăcii. După incubare, anticorpii nespecifici nelegaţi şi alte proteine din ser sunt îndepărtate prin spălare.

2

Etapa 2 Conjugatul (anticorpi monoclonali specifici de lanţuri gama umane, marcaţi cu peroxidază) este adăugat în godeurile microplăcii. În timpul acestei incubări de 1 oră la 37°C, conjugatul se leagă la IgG serice capturate de antigenul Borrelia. Conjugatul nelegat este îndepărtat prin spălare la terminarea incubării. Etapa 3 Prezenţa complexelor imune (antigen Borrelia, anticorpii IgG anti-Borrelia burgdorferi, conjugat anti-IgG) este demonstrată prin adăugarea în fiecare godeu a unei soluţii de developare enzimatică. Etapa 4 După incubare la temperatura camerei (+18-30°C), reacţia enzimatică este oprită prin adăugarea unei soluţii de acid sulfuric 1N. Densitatea optică citită la spectrofotometrul setat la 450/620 nm este proporţională cu cantitatea de anticorpi IgG anti-Borrelia burgdorferi prezenţi în probă. 4. CONŢINUTUL TRUSEI Cantităţile de reactivi livrate s-au calculat să fie suficiente pentru efectuarea a 96 de teste în maximum 6 serii de lucru. Toţi reactivii se vor utiliza exclusiv pentru diagnostic in vitro.

Eticheta Natura reactivilor Prezentare

R1 Microplate Microplacă (gata de utilizare) 12 barete a câte 8 godeuri, detaşabile, sensibilizate cu antigen Borrelia inactivat

1

R2 Concentrated Washing Solution

(20x)

Soluţie de spălare concentrată (20x) Tampon TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween® 20 Conservant: 0,04 % ProClin™ 300

1 x 70 ml

R3 Negative Control Control negativ Ser uman negativ pentru anticorpi IgG anti- Borrelia burgdorferi, HBs negativ şi negativ pentru anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Conservant: 0,15 % ProClin™ 300

1 x 0,75 ml

R4 Cut-off Control Control cut-off Ser uman reactiv pentru anticorpi IgG anti-Borrelia burgdorferi, HBs negativ şi negativ pentru anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Conservant: 0,15 % ProClin™ 300

1 x 0,75 ml

R5 Positive Control Control pozitiv Ser uman reactiv pentru anticorpi IgG anti-Borrelia burgdorferi, HBs negativ şi negativ pentru anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Conservant: 0,15 % ProClin™ 300

1 x 0,75 ml

R6 Conjugate (51x) Conjugat (51x) Anticorpi monoclonali murini specifici de lanţuri gama umane, cuplaţi cu peroxidază din hrean Conservant: 0,16 % ProClin™ 300

1 x 0,7 ml

R7 Diluent Diluant pentru probe şi conjugat (gata de utilizare) Tris-NaCl (pH7,7), ser fetal de viţel, 0,1% Tween® 20 şi roşu fenol Conservant: 0,15 % ProClin™ 300

2 x 65 ml

R9 Chromogen TMB Cromogen (gata de utilizare) 3,3’.5.5’ tetrametil benzidină (< 0,1%), H2O2 (<1%)

1 x 28 ml

R10 Stopping Solution Soluţie de stopare (gata pentru utilizare) Soluţie de acid sulfuric 1N

1 x 28 ml

Pentru condiţiile de păstrate şi data expirării, vă rugăm să citiţi indicaţiile menţionate pe cutie. 5. ATENŢIONĂRI ŞI PRECAUŢII Fiabilitatea rezultatelor depinde de implementarea corectă a următoarelor recomandări de Bune Practici de Laborator: Nu utilizaţi reactivi expiraţi. Nu amestecaţi sau asociaţi în aceeaşi serie de testare reactivi din loturi diferite. REMARCĂ: Pentru soluţia de spălare (R2, identificare pe etichetă: 20x, scris cu verde), cromogen (R9, identificare pe etichetă: TMB, scris cu turcoaz) şi soluţia de stopare (R10, identificare pe etichetă: 1N, scris cu roşu), este posibilă folosirea altor loturi decât cele din trusă, cu condiţia ca aceşti reactivi să fie strict echivalenţi şi ca în cursul unei serii de testare să se utilizeze acelaşi lot.

3

Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 minute pentru a permite reactivilor să ajungă la temperatura camerei (+18-30°C). Reconstituiţi sau diluaţi cu grijă reactivii, prevenind orice contaminare. Nu executaţi testul în prezenţa unor vapori reactivi (vapori acizi, alcalini, aldehidici) sau a prafului, deoarece se poate altera

activitatea enzimatică a conjugatului. Utilizaţi sticlărie temeinic spălată şi clătită cu apă deionizată sau, preferabil, din materiale de unică folosinţă. Spălarea microplăcii este o etapă critică a protocolului de testare: respectaţi numărul recomandat de cicluri de spălare şi

asiguraţi-vă că toate godeurile sunt bine umplute, apoi complet golite. Spălările incorecte pot duce la rezultate imprecise. Nu lăsaţi ca microplaca să se usuce între sfârşitul operaţiei de spălare şi distribuirea reactivilor. Nu utilizaţi niciodată acelaşi container pentru distribuirea conjugatului şi a soluţiei de developare. Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la metale sau ioni metalici. În consecinţă, nu permiteţi niciunui element metalic să

intre în contact cu diversele soluţii ce conţin conjugatul sau cromogenul. Soluţia de cromogen (R9) trebuie să fie incoloră. Apariţia culorii albastre arată că reactivul nu mai poate fi folosit, şi ca

atare trebuie înlocuit. Utilizaţi un vârf nou de pipetă pentru fiecare probă. Controlaţi precizia şi funcţionarea corectă a pipetelor şi a celorlalte echipamente. Instrucţiuni de igienă şi protecţia muncii Materialele de origine umană utilizate la prepararea reactivilor au fost testate şi găsite nereactive pentru antigenul de suprafaţă al hepatitei B (AgHBs), anticorpi specific de virusul hepatitei C (anti-HCV) şi virusul imunodeficienţei umane (anti-HIV1 şi anti-HIV2). Deoarece nici o metodă nu poate garanta în mod absolut lipsa agenţilor infecţioşi, manipulaţi reactivii de origine umană şi probele bolnavilor ca fiind potenţial capabile de a transmite boli infecţioase. Orice material, inclusiv soluţiile de spălare, care vine în contact direct cu probe şi reactivi conţinând materiale de origine

umană, trebuie considerat capabil de a transmite boli infecţioase. La manipularea probelor şi reactivilor, purtaţi mănuşi de unică folosinţă. Nu pipetaţi cu gura. Nu împroşcaţi probele sau soluţiile care conţin probe. Stropii trebuie clătiţi cu clor menajer (hipoclorit de sodiu) diluat la

10%. În cazul stropirii cu un acid, acesta trebuie mai întâi neutralizat cu bicarbonat de sodiu, apoi curăţat cu soluţie de hipoclorit de sodiu diluată la 10% şi uscat cu hârtie absorbantă. Materialele folosite la curăţenie trebuie aruncate în containerul de deşeuri contaminate.

Probele de la bolnavi, reactivii conţinând material de origine umană, ca şi materialele şi produsele contaminate, trebuie aruncate numai după decontaminare:

fie prin imersiune în hipoclorit de sodiu de concentraţie 5% timp de 30 de minute, - fie prin imersiune în hipoclorit de sodiu de concentraţie 5% timp de 30 de minute, - sau autoclavare la 121°C timp de cel puţin 2 ore.

ATENŢIE: Nu introduceţi în autoclavă soluţii conţinând hipoclorit de sodiu. Evitaţi orice contact al cromogenului sau soluţiei de stopare cu pielea şi mucoasele (risc de toxicitate, iritaţie sau arsuri). Reziduurile chimice şi biologice trebuie manipulate şi eliminate în conformitate cu Bunele Practici de Laborator. Toţi reactivii se vor utiliza exclusiv pentru diagnostic in vitro . Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice din acest kit de test, vă

rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.

6. RECOLTAREA, PREGĂTIREA ŞI PĂSTRAREA PROBELOR 1. Se recomandă utilizarea probelor de ser, plasmă (EDTA, heparină sau citrat) şi LCR. 2. Respectaţi următoarele recomandări pentru manipularea, prelucrarea şi păstrarea probelor de sânge:

Recoltaţi toate probele de sânge respectând precauţiile de rutină pentru venopuncţie. Pentru ser, lăsaţi probele să coaguleze complet înainte de centrifugare. Păstraţi întotdeauna eprubetele închise. După centrifugare, separaţi serul sau plasma de cheag sau hematii într-o eprubetă de stocare bine închisă. Probele pot fi păstrate la +2-8°C dacă testul este executat în decurs de 7 zile. Dacă testul nu se execută în decurs de 7 zile, sau în vederea transportului, congelaţi probele la -20°C sau mai rece. Nu folosiţi probe care au fost dezgheţate mai mult de cinci ori. Probele anterior îngheţate, trebuie omogenizate viguros

(vortex) după dezgheţare, înainte de testare. 3. Probele de ser sau plasmă care conţin 90 g/l de albumină sau 100 mg/l de bilirubină neconjugată, probele lipemice

conţinând echivalentul a 36 g/l trioleină (trigliceride) şi probele hemolizate cu până la 10 g/l de hemoglobină, nu afectează rezultatele.

4. Nu încălziţi probele. 5. Pentru a demonstra o sinteză intratecală de IgG, utilizaţi probe de LCR recoltate prin puncţie lombară în acelaşi timp cu

probe de ser sau plasmă. Respectaţi recomandările aplicabile în mod obişnuit probelor de LCR. Este deosebit de important să nu utilizaţi probe tulburi cu aspect eterogen (în acest caz, optati pentru supernatantul obtinut după centrifugare) sau probe intens hemolizate. LCR trebuie testat imediat după recoltare. Dacă este necesară păstrarea pentru investigaţii ulterioare, probele se pot depozita la 4-8°C (pe termen scurt) sau la -20°C (pe termen lung) (11).

NOTĂ: Stabilitatea probelor de LCR la 4-8°C sau -20°C sau în urma mai multor cicluri de îngheţare – dezgheţare sau în prezenţa componenţilor interferenţi enumeraţi la punctul 3 de mai sus nu a fost studiată.

4

7. PROCEDEUL DE ANALIZĂ 7.1 Materiale necesare dar nefurnizate

Agitator tip vortex. Cititor de microplăci echipat cu filtre pentru 450 nm şi 620 nm (*). Incubator pentru microplăci cu termostat setat la 37±1°C (*). Spălător pentru microplăci automat, semi-automat sau manual (*). Apă distilată sau deionizată sterilă. Mănuşi de unică folosinţă. Ochelari sau mască de protecţie. Hârtie absorbantă. Pipete sau pipete multi-canal, automate sau semi-automate, reglabile sau fixe, pentru măsurarea şi pipetarea

volumelor de 10-1000 μl, 2 ml şi 10 ml. Cilindrii gradaţi cu capacitate de 25 ml, 50 ml, 100 ml şi 1000 ml. Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu. Conteiner pentru deşeuri biologice. Eprubete de unică folosinţă.

(*) Adresaţi-vă departamentului nostru tehnic pentru detalii cu privire la echipamentele recomandate. 7.2 Reconstituirea reactivilor

R1: Înainte de deschidere, lăsaţi punga 30 de minute temperatura camerei (+18-30°C). Scoateţi cadrul suport, reţineţi numărul de barete necesar şi returnaţi imediat în ambalaj baretele nenecesare şi verificaţi ca deshidratantul să rămână în interior. Închideţi cu grijă punga şi păstraţi-o la +2-8°C.

R2: Diluaţi 1/20 soluţia de spălare R2 în apă distilată: de exemplu 50 ml de R2 şi 950 ml de apă distilată, pentru a obţine soluţia de spălat gata de utilizare. În cazul spălării manuale, pregătiţi 350 ml de soluţie diluată de spălare pentru o placă cu 12 barete.

R3, R4, R5: Diluaţi 1/101 în diluant (R7) (exemplu: 10 μl de R3 + 1 ml de R7). R6+R7: Conjugatul (R6) este concentrat de 51x şi trebuie omogenizat înainte de utilizare. Diluaţi 1/51 în diluant (R7).

Pentru 1 placă diluaţi 0,5 ml din conjugat (R6) în 25 ml de diluant (R7). Împărţiţi aceste volume la 5 pentru a calcula volumul necesar pentru 2 barete.

7.3 Păstrarea şi valabilitatea reactivilor deschişi şi/sau reconstituiţi Trusa trebuie păstrată la +2-8°C. Când trusa este păstrată la +2-8°C înainte de deschidere, fiecare component poate fi utilizat până la data expirării indicat pe eticheta externă a trusei.

R1: Odată deschise, baretele rămân stabile până la 1 lună dacă sunt păstrate la +2-8°C în aceeaşi pungă bine închisă (controlaţi prezenţa deshidratantului)

R2: După diluare, soluţia de spălare poate fi păstrată timp de 2 săptămâni la +2-30°C. Soluţia de spălare concentrată păstrată la +2-30°C, în absenţa contaminării, este stabilă până la data expirării indicată pe etichetă.

R3, R4, R5, R6, R7: După deschidere şi fără nicio contaminare, reactivii păstraţi la +2-8°C sunt stabili timp de maxim o lună.

R6+R7: După reconstituire, soluţia de conjugat este stabilă timp de 8 ore la temperatura camerei (+18-30°C) sau 24 ore la +2-8°C.

R9: După deschidere şi în lipsa contaminării, reactivul păstrat la +2-8°C este stabil timp de maxim 2 luni. R10: După deschidere şi în absenţa contaminării, reactivul păstrat la +2-8°C este stabil până la data de expirare

indicată pe etichetă.

7.4 Procedeu pentru probele de ser sau plasmă Respectaţi strict procedeul de analiză şi Bunele Practici de Laborator. Înainte de utilizare, lăsaţi reactivii să ajungă la temperatura camerei (+18-30°C). În vederea validării rezultatelor analizei, utilizaţi controalele negativ, cut-off şi pozitiv la fiecare serie de testare. 1. Stabiliţi cu grijă planul de distribuire şi identificare pentru controale şi probele pacienţilor. 2. Preparaţi soluţia diluată de spălare (R2) [vezi secţiunea 7.2]. 3. Scoateţi cadrul suport şi baretele (R1) din punguţa protectoare [vezi secţiunea 7,2]. 4. Diluaţi controalele R3, R4, R5 şi probele pacienţilor (S1, S2…) în diluant (R7) pentru obţinerea unei diluţii de 1/101: 10 μl

probă şi 1,0 ml diluant (R7). Omogenizaţi la vortex probele diluate. 5. Respectând strict ordinea indicată mai jos, distribuiţi în fiecare godeu 200 μl din controalele şi din probele diluate:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12

5

6. Acoperiţi microplaca cu o folie adezivă, apoi apăsaţi bine pentru asigurarea etanşeităţii. Incubaţi microplaca imediat într-o

baie de apă termostatată sau în incubator uscat timp de 1 oră ± 5 minute la 37°C ± 1°C. 7. La sfârşitul primei perioade de incubare, îndepărtaţi folia adezivă de etanşare a plăcii. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor

într-un container pentru deşeuri biologice (care conţine hipoclorit de sodiu). Spălaţi microplaca de 4x cu 350 μl de soluţie de spălat (R2) per godeu. Răsturnaţi microplaca şi pentru îndepărtarea lichidului remanent, tapotaţi-o uşor pe hârtie absorbantă.

8. Preparaţi soluţia de lucru de conjugat (R6+R7) [vezi secţiunea 7.2]. Distribuiţi imediat 200 μl din soluţia de lucru de conjugat (R6+R7) în toate godeurile. Agitaţi uşor soluţia înainte de utilizare.

9. Acoperiţi microplaca cu o nouă folie adezivă, apoi apăsaţi bine pentru asigurarea etanşeităţii. Incubaţi microplaca imediat într-o baie de apă termostatată sau în incubator uscat timp de 1 oră ± 5 minute la 37°C ± 1°C.

10. La sfârşitul celei de a doua perioade de incubare, îndepărtaţi folia adezivă de etanşare a plăcii. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri biologice (care conţine hipoclorit de sodiu). Spălaţi microplaca de 4x cu 350 μl de soluţie de spălare (R2) per godeu. Răsturnaţi microplaca şi pentru îndepărtarea lichidului remanent, tapotaţi-o uşor pe hârtie absorbantă.

11. Distribuiţi rapid ferit de lumină în fiecare godeu câte 200 μl de soluţie de cromogen (R9). Lăsaţi reacţia să se dezvolte la întuneric timp de 30 ± 5 minute la temperatura camerei (+18-30°C). În timpul acestei incubări, nu folosiţi folie adezivă.

12. Stopaţi reacţia enzimatică prin adăugarea a 100 μl de soluţie de stopare (R10) în fiecare godeu. Pipetaţi în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză ca şi pentru soluţia de developare.

13. Ştergeţi cu grijă fundul plăcii. Folosind un cititor de plăci, citiţi densitatea optică la 450/620 nm în decurs de 30 minute după oprirea reacţiei. Baretele trebuie întotdeauna protejate de lumină înainte de citire.

14. Înaintea raportării rezultatelor, verificaţi citirile cu planul de distribuire al probelor în placă. 7.5 Procedeu pentru probele de lichid cefalorahidian NOTĂ: Determinarea sintezei intratecale de anticorpi IgG anti-Lyme se bazează pe aplicarea formulei lui Reiber. Pentru fiecare pacient cu neuroborelioză Lyme suspectată, se vor recolta simultan probe perechi de ser/plasmă şi LCR. Ambele probe vor fi testate în cadrul aceleiaşi serii de testare. Diluaţi probele de LCR în diluant (R7) pentru a asigura o diluţie de 1:2: 150 µl din proba de LCR şi 150 µl de diluant (R7). Exceptând diluarea probelor de LCR, respectaţi cu stricteţe protocolul descris mai sus pentru probele de ser sau plasmă. 8 CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR 8.1 Calculul valorii cut-off (CO) Valoarea cut-off (CO) corespunde valorii medii a densităţilor optice (OD) ale duplicatelor cut-off (R4): CO = media OD R4

8.2 Calcularea raportului de reactivitate al probelor (ser sau plasmă) Rezultatul probelor este exprimat printr-un raport, utilizând formula următoare: Raportul de reactivitate = ODprobă/CO 8.3 Controlul de calitate Includeţi toate controalele pe fiecare microplacă şi la fiecare serie de testare, apoi analizaţi rezultatele obţinute. Pentru validarea analizei trebuie îndeplinite următoarele criterii:

Valori ale densităţii optice: - CO > 0,200 - 0.80 x CO < OD R4 replicat 1 < 1,20 x CO - 0.80 x CO < OD R4 replicat 2 < 1,20 x CO (Fiecare valoare OD a fiecărui replicat de cut-off (R4) nu trebuie să se abată cu mai mult de 20% de la valoarea CO).

Rapoartele densităţilor optice: - Raport R3 (OD R3 / CO) < 0,5 - Raport R5 (OD R5 / CO) > 2,0

Dacă nu sunt îndeplinite aceste criterii ale controlului calităţii, testarea trebuie repetată.

6

8.4 Interpretarea rezultatelor (ser sau plasmă)

Raport de reactivitate probă Rezultat Interpretare

Raport < 0,80 Negativ Proba se consideră nereactivă pentru prezenţa anticorpilor IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato.

0,80 ≤ Raport < 1,2 Ambiguu

Proba se consideră incertă pentru prezenţa anticorpilor IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato. Rezultatul trebuie confirmat printr-un test suplimentar executat pe o a doua probă prelevată la cel puţin 3 săptămâni după prima.

Raport ≥ 1,2 Pozitiv Proba se consideră reactivă pentru prezenţa anticorpilor IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato.

Dacă se suspectează o infecţie, sunt utile teste serologice complementare, cum ar fi detecţia anticorpilor IgM anti-Borrelia pentru confirmare a diagnosticului. Dacă serologia este pozitivă sau ambiguă, este recomandată testarea probei cu o metodă de confirmare, cum este Western-Blot (9). 8.5 Calculul pentru determinarea sintezei intratecale Determinarea sintezei intratecale se efectuează prin calcularea indicelui anticorpilor IgG (AI IgG) utilizând formula lui Reiber (10,11,12). Determinaţi pentru fiecare pereche de probe de ser şi LCR valorile OD respective (OD IgG ser, OD IgG LCR) şi verificaţi dacă aceste valori OD sunt cuprinse în intervalul 0,000 - 3,000.

ATENŢIE: Dacă valoarea OD a serului (OD IgG ser) sau valoarea OD a LCR (OD IgG LCR) nu se încadrează în intervalul OD menţionat mai sus, retestaţi proba utilizând o diluţie mai înaltă a probei în diluant R7 furnizat în cadrul trusei. După diluare, valoarea OD a probei trebuie să fie cuprinsă între 0,000 şi 3,000. În acest caz, luaţi în considerare factorul de diluţie utilizat pentru calcularea indicelui de sinteză intratecală de IgG (a se vedea mai jos). Pentru fiecare probă de ser testată, determinaţi următoarele date:

Albumină (g/l) = Albumină ser IgG total (g/l) = IgG total ser

Pentru fiecare probă de LCR testată, determinaţi următoarele date:

Albumină (mg/l) = Albumină LCR IgG total (mg/l) = IgG total LCR

Calculaţi diferiţii coeficienţi utilizând formulele următoare:

Q Alb = Albumină LCR / [Albumină ser x 1000] Q lim(IgG) = 0,93 x [Q Alb

2 + (6 x 10-6)] 1/2 – 1,7 x 10-3 Q IgG = IgG total LCR / [IgG total ser x 1000] Q spec(IgG) = OD IgG LCR / [OD IgG ser x 50,5]

ATENŢIE: Dacă, de exemplu, probele de LCR şi de ser au fost diluate în proporţie de 1:5 şi, respectiv, 1:10 pentru a se încadra în intervalul OD 0,000 - 3,000, atunci înmulţiţi valoarea OD a LCR (OD IgG LCR) cu 5 şi valoarea OD a serului (OD IgG ser) cu 10 înainte de a utiliza formula de calcul a coeficientului Q spec(IgG). Determinaţi indicele anticorpilor IgG (AI IgG) utilizând una dintre cele două formule de mai jos:

AI IgG = Q spec(IgG) / Q IgG [dacă Q IgG < Q lim(IgG)] Sau AI IgG = Q spec(IgG) / Q lim(IgG) [dacă Q IgG > Q lim(IgG)]

8.6 Interpretarea indicelui anticorpilor (AI IgG) pentru determinarea sintezei intratecale Formula lui Reiber pentru determinarea indicelui anticorpilor IgG nu se aplică în următoarele situaţii:

Raportul de reactivitate al probei de LCR < 0,50 (*) Raportul de reactivitate al probei de LCR ≥ 0,50, dar cu un raport ser/plasmă < 0,50 (*)

(*) Raport = OD / media R4

7

Interpretaţi rezultatele LCR în conformitate cu algoritmul de mai jos:

Algoritm de determinare a indicelui anticorpilor IgG utilizând trusa Platelia™ Lyme IgG Sinteza intratecală de IgG este confirmată atunci când indicele anticorpilor IgG este mai mare decât 1,30. Nu există sinteză intratecală de IgG când indicele anticorpilor IgG este mai mare decât 0,70, dar mai mic decât sau echivalent cu 1,30. Rezultatul nu trebuie considerat a fi valid când indicele anticorpilor IgG este mai mic decât sau echivalent cu 0,70 (eroare de procedură, probele de ser şi LCR nu au fost recoltate în aceeaşi zi, contaminarea probei de LCR etc.…)

Interpretarea AI IgG

Pozitiv AI IgG > 1,30

Negativ 0,70 < AI IgG ≤ 1,30

Rezultat invalid AI IgG ≤ 0,70 8.7 Ghid pentru remedierea problemelor Reacţiile nevalidate sau nerepetabile sunt adesea cauzate de: Spălarea necorespunzătoare a microplăcilor. Contaminarea probelor negative cu ser sau plasmă cu titru ridicat de anticorpi. Contaminarea soluţiei de developare de agenţi chimici oxidanţi (clor, ioni metalici, etc.). Contaminarea soluţiei de stopare. 8.8 Exemplu de calcul (ser sau plasmă) Notă: Următoarele rezultate sunt date ca exemplu şi nu trebuie folosite în locul rezultatelor reale obţinute de utilizator.

Controale şi

probe biologice OD (450/620 nm) Raport Rezultat

R3 0,144 0,29 Negativ R4 0,502 / / R4 0,498 / / R5 1,440 2,88 Pozitiv

Proba 1 1,650 3,30 Pozitiv Proba 2, etc... 0,120 0,24 Negativ

Determinati raportul de reactivitate al LCR

Raport dereactivitate al LCR < 0,50

Raport dereactivitate al LCR ≥ 0,50

LCR negativ pentru prezenta anticorpilor IgG

Determinati raportul dereactivitate al serului

Raport dereactivitate al serului < 0,50

Raport dereactivitate al serului ≥ 0,50

Formula lui Reiber

Interpretarea indicelui anticorpilor IgG

Raport dereactivitate al LCR < 0,80

Raport dereactivitate al LCR ≥ 0,80

Nu interpretati rezultatul LCR LCR pozitiv pentru prezenta anticorpilor IgG

8

Valoare cut-off:

- CO = (0,502+0,498)/2 = 0,500 Valori ale densităţii optice :

- OD CO = 0,500 (N > 0,200) - OD R4 replicat 1 = 0,502 (0,80 x OD CO < OD R4 replicat 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replicat 2 = 0,498 (0,80 x OD CO < OD R4 replicat 2 < 1,20 x OD CO)

Rapoartele densităţii optice : - Raport R3 = 0,29 (N < 0,5) - Raport R5 = 2,88 (N > 2,0)

Controlul calităţii : Acceptat

9 PERFORMANŢE 9.1 Prevalenţa Determinarea prevalenţei anticorpilor IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato în ser uman a fost realizată pe un panel de 295 de probe obţinute de la donatori de sânge din nordul Franţei. Rezultatele au fost următoarele: 291 seruri negative, 1 incert şi 3 pozitive. Prevalenţa determinată cu trusa Platelia™ Lyme IgG s-a stabilit la 1,02% (3/295). 9.2 Specificitatea 9.2.1 SPECIFICITATEA ÎN ARIILE NEENDEMICE Specificitatea a fost estimată folosind 279 de seruri de la donatori sănătoşi dintr-o zonă neendemică din nordul Franţei. Probele au fost selectate pe baza rezultatelor negative obţinute la testarea cu o trusă comercială de tip EIA folosită în Europa (marcată CE) şi considerată de referinţă. 9.2.2 SPECIFICITATEA ÎN ARIILE ENDEMICE Specificitatea a mai fost determinată şi pe 193 de seruri prelevate de la donatori de sânge sănătoşi dintr-o arie endemică din estul Franţei, dintre care niciunul nu a prezentat elemente asociate bolii Lyme (niciun simptom clinic de borelioză, nici antecedente de înţepătură de căpuşe). Probele au fost selectate pe baza rezultatelor negative obţinute la testarea cu o trusă comercială de tip EIA folosită în Europa (marcată CE) şi considerată de referinţă. Rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelul următor:

Panel de seruri Negativ Incerte (1) Pozitiv (2) Specificitate

Aria neendemică (n=279) [IC 95 %]

278 1 0 100,0 %

(278/278) [98,9 %-100,0 %]

Aria endemică (n=193)

[IC 95 %] 190 2 1

99,5 % (190/191)

[97,1 %-99,9 %] (1) Rezultatele incerte au fost excluse din calculul specificităţii. (2) Proba pozitivă în testul Platelia™ Lyme IgG a fost găsită negativă prin Western-blot. IC 95%: interval de confidenţă de 95%.

9

9.3 Sensibilitatea Sensibilitatea testului Platelia™ Lyme IgG s-a calculate şi s-a coroborat cu rezultatele pentru sensibilitate obţinute cu trusa Platelia™ Lyme IgM (cod 72951) pe un panel de 70 de probe de la bolnavi cu diferite forme de boală Lyme, în stadii diferite de evoluţie clinică. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor şi au fost comparate cu sensibilitatea obţinută cu trusa EIA comercială folosită în Europa (marcată CE) ca trusă de referinţă:

Stadiul clinic Număr

de seruri

Platelia™ Lyme (1) Referinţa europeană (1)

IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM

Erythema migrans (Stadiul I) [IC 95 %]

17 66,7 % [38,4 %-88,2 %]

58,8 % [32,9 %-81,6 %]

82,4 % [56,6 %-96,2 %]

93,3 % [68,1 %-99,8 %]

Neuroborelioză (Stadiul II) [IC 95 %]

33 96,9 % [83,4 %-99,9 %]

36,7 % [19,9 %-56,1 %]

96,9 % [83,4 %-99,9 %]

97,0 % [84,2 %-99,9 %]

Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadiul III)

[IC 95 %] 5 100,0 %

[54,9 %-100,0 %] 20,0 %

[0,05 %-71,6 %] 100,0 %

[54,9 %-100,0 %] 100,0 %

[54,9 %-100,0 %]

Artrită Lyme (Stadiul III) [IC 95 %]

15 100,0 % [81,9 %-100,0 %]

0,0 % [0,0 %-18,1 %]

100,0 % [81,9 %-100,0 %]

100,0 % [81,9 %-100,0 %]

(1) Rezultatele incerte au fost excluse din calculul sensibilităţii.. IC 95%: interval de confidenţă de 95%. Sensibilitatea trusei Platelia™ Lyme IgG a mai fost demonstrată şi pe un panel bine caracterizat de probe puse la dispoziţie de CDC (Center for Disease Control), fiind comparate cu sensibilitatea trusa EIA comercială folosită în Europa (marcată CE) şi USA (aprobată FDA) ca trusă de referinţă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Stadiul clinic Număr

de seruri

Platelia™ Lyme (1) Referinţa europeană (1)

Referinţa USA (1)

IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM

Erythema migrans [IC 95 %]

28 38,5 %

[20,2 %- 59,5 %]

73,7 % [48,8 %- 90,9 %]

86,4 % [65,1 %- 97,1 %]

70,4 % [49,8 %- 86,3 %]

87,0 % [66,4 %- 97,2 %]

Artrită / Artralgie [IC 95 %]

6 100,0 % [60,7 %- 100,0 %]

40,0 % [5,3 %- 85,3 %]

100,0 % [60,7 %- 100,0 %]

100,0 % [60,7 %- 100,0 %]

100,0 % [60,7 %-

100,0 %]

Stadiu necunoscut

[IC 95 %] 4

100,0% [36,8 %- 100,0 %]

100,0% [0,05 %- 100,0 %]

100,0% [47,3 %- 100,0 %]

100,0 % [19,4 %- 99,9 %]

100,0 % [36,8 %- 100,0 %]

(1) Rezultatele incerte au fost excluse din calculul sensibilităţii.. IC 95%: interval de confidenţă de 95%. 9.4 Calcularea indicelui anticorpilor IgG pentru determinarea sintezei intratecale O evaluare externă a fost efectuată asupra a 104 de probe perechi de la pacienţi fără neuroborelioză Lyme (n=19) sau cu neuroborelioză Lyme suspectată (n=29), probabilă (n=36) şi confirmată (n=20). În continuare sunt prezentate rezultate detaliate pentru fiecare categorie:

Statut Total LCR neinterpretabil LCR negativ LCR pozitiv Indice

AI IgG pozitiv

Indice AI IgG

negativ

Indice AI IgG invalid

Non-LNB 19 0 18 1 0 0 0

LNB suspectată 29 0 11 0 14 4 0

LNB probabilă 36 1 6 2 22 4 1

LNB confirmată 20 0 0 0 17 2 1

10

Statut Total Pozitiv

(raport LCR sau AI IgG)

Negativ (raport LCR sau

AI IgG)

Neinterpretabil (raport LCR sau

AI IgG)

Non-LNB 19 1 (5,3%) 18 (94,7%) 0 (0,0%)

LNB suspectată 29 14 (48,3%) 15 (51,7%) 0 (0,0%)

LNB probabilă 36 24 (66,7%) 10 (27,8%) 2 (5,5%)

LNB confirmată 20 17 (85,0%) 2 (10,0%) 1 (5,0%)

9.5 Precizia Precizia in seria de testare (repetabilitate) : Pentru a evalua repetabilitatea la testare, s-au analizat 1 probă negativă, 1 probă ambiguă şi trei pozitive de 30 de ori în aceeaşi serie de lucru. Raportul (DO probă / DO CO) a fost determinat pentru fiecare probă. Rapoartele medii, deviaţiile standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV %) pentru fiecare din cele patru probe sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Precizia intra-testare (repetabilitate)

N=30 Probă negativă Probă slab pozitivă Probă pozitivă Probă intens pozitivă

Raport (DO probă / DO cut-off) Medie 0,10 0,95 1,38 6,31

DS 0,007 0,082 0,116 0,134 CV % 6,0 % 8,6 % 8,4 % 2,1 %

Precizia inter-serii de testare (reproductibilitate) : Pentru evaluarea reproductibilităţii la testare, 4 probe (1 probă negativă, 1 ambiguă şi 2 pozitive) au fost testate în duplicat în două serii de lucru zilnic, timp de 20 de zile. Raportul (OD probă / DO CO) a fost determinat pentru fiecare probă. Rapoartele medii, deviaţiile standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV %) pentru fiecare din cele patru probe sunt prezentate în tabelul de mai jos: Precizia inter-testări (reproductibilitate)

N=80 Probă negativă Probă slab pozitivă Probă pozitivă Probă intens pozitivă

Raport (DO probă / DO cut-off)) Medie 0,19 0,85 3,92 6,67

DS 0,032 0,115 0,335 0,650 CV % 17,3 % 14,8 % 8,4 % 9,7 %

9.6 Reactivitatea încrucişată S-au testat cu trusa Platelia™ Lyme IgG un număr de 384 de probe de sânge cu caractere potenţial generatoare de reacţii nespecifice. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor:

Panel Număr

de seruri

Incerte (1) Pozitiv Reactivitate încrucişată %

Sifilis 83 4 1 1,3% (2)

CMV 50 1 1 2,0% (2)

EBV 22 1 0 0,0%

Leptospiroză 15 1 1 7,1% (2)

Malarie 20 1 1 5,3% (2)

Anticorpi antinucleari (ANA) 22 0 0 0,0%

Anticorpi heterofili (HAMA) 10 0 0 0,0%

11

Panel Număr

de seruri

Incerte (1) Pozitiv Reactivitate încrucişată %

Factor reumatoid 44 1 1 2,3% (2)

HSV 30 0 0 0,0%

Toxoplasmoză 38 0 0 0,0%

Rubeolă 10 0 0 0,0%

Rujeolă 10 0 0 0,0%

Oreion 10 0 0 0,0%

HIV 10 0 0 0,0%

VZV 10 0 0 0,0%

TOTAL 384 9 5 1.33% (1) Rezultatele incerte au fost excluse din calculul reactivităţii încrucişate. (2) Nu au fost diferenţe semnificative faţă de prevalenţa din aria endemică (testul Fisher, p>0,05). Cele 2 seruri CMV şi Malarie găsite pozitive la testarea cu trusa Platelia™ Lyme IgG au fost pozitive şi la testarea cu trusa comercială EIA folosită în Europa (marcată CE), dar nu s-au confirmat prin metoda western-blot. Serul cu factor reumatoid testat pozitiv cu trusa Platelia™ Lyme IgG a fost confirmat pozitiv cu trusa comercială EIA folosită în Europa şi a fost confirmat prin metoda western-blot. Serul cu leptospiroză testat pozitiv cu trusa Platelia™ Lyme IgG a fost găsit ambiguu la testarea cu trusa comercială EIA folosită în Europa şi a fost confirmat negative prin metoda western-blot. Serul cu sifilis găsit pozitiv în testul Platelia™ Lyme IgG a fost confirmat negative atât cu trusa comercială EIA folosită în Europa cât şi prin metoda western-blot. 10 LIMITELE ACESTUI TEST Diagnosticul infecţiei cu Borrelia burgdorferi poate fi stabilit doar prin combinarea rezultatelor clinice şi biologice. Rezultatul unui singur test pentru detecţia anticorpilor IgG anti-Borrelia burgdorferi nu constituie o dovadă suficientă pentru diagnosticul unei infecţii cu Borrelia burgdorferi sensu lato. Dacă serologia este pozitivă sau ambiguă, este recomandabilă testarea probei cu o metodă de confirmare, cum este Western-Blot (9). Diagnosticul de neuroborelioză Lyme poate fi stabilit doar pe baza unei combinaţii de date clinice şi biologice ale pacientului. Rezultatele şi interpretările probelor de LCR obţinute prin utilizarea acestui protocol nu trebuie analizate separat şi nu constituie o dovadă suficientă pentru un diagnostic cert. Calcularea indicelui anticorpilor IgG pe baza formulei lui Reiber în cadrul acestui protocol nu este valabilă dacă nu au fost luate în considerare toate datele biologice (Albumină ser, Albumină LCR, IgG total ser, IgG total LCR, OD IgG ser şi OD IgG LCR). De asemenea, este important să se utilizeze unităţile corecte descrise în formula de mai sus. Acest protocol a fost adaptat exclusiv pentru anticorpii IgG anti-Borrelia. Nu a fost evaluat pentru anticorpi IgM anti-Borrelia şi pentru alţi anticorpi IgG. Acest protocol a fost adaptat doar pentru testarea LCR. Nu au fost evaluate alte lichide biologice (lichid sinovial …). 11 CONTROLUL CALITĂŢII LA PRODUCĂTOR Toţi reactivii produşi sunt preparaţi în conformitate cu sistemul nostru de calitate, începând de la recepţia materiei prime şi până la comercializarea produsului finit. Fiecare lot este supus evaluărilor de control de calitate şi este eliberat pentru comercializare, doar dacă se conformează criteriilor de acceptare prestabilite. Înregistrările cu privire la producţie şi rezultatele controlului fiecărui lot sunt păstrate la firma Bio-Rad.

12

12 BIBLIOGRAFIE 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. 2005. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev.

18: 484-509. 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P. 1982. Lyme disease – a tick-

borne spirochetosis? Science. 216: 1317-1319. 3. Center for Disease Control and Prevention. 2004. Lyme disease – United States, 2001-2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep.

53: 365-369. 4. Hubalek, Z., Halouzka, J. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J.

Epidemiol. 13: 951-957. 5. Reed, K. D. 2002. Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: 319-324. 6. Stanek, G., Strle, F. 2003. Lyme borreliosis. Lancet. 362: 1639-1647. 7. Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J. 1999. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato:

taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: 633-653. 8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L. 2011. Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to

public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): 123-128. 9. Wilske, B. 2003. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: 215-227. 10. Bednarova, J. 2006. Cerebrospinal-Fluid profile in neuroborreliosis and its diagnosis significance. Folia Microbiol. 51:

599-603. 11. Deisenhammer F., Bartos A., Egg R., Gilhus N.E., Giovannoni G., Rauer S., Sellebjerg F. 2006. Guidelines on Routine

Cerebrospinal Fluid Analysis. Report from EFNS Task Force. Europ. Journ. of Neurol. 12. Reiber H., Lange P. 1991. Quantification of Virus-Specific Antibodies in Cerebrospinal Fluid and Serum: Sensitive and

Specific Detection of Antibody Synthesis in Brain. Clin. Chem. 37: 1153-1160.

13

14

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré

92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2015/11

Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 883689 www.bio-rad.com