Slide 1

Diagnostic de laborator in infectiile produse de PARVOBACTERII

Reuneste bacterii ce poseda un echipament enzimatic sarac, motiv pentru care necesita conditii speciale pentru cultivare, crescand cu greutate pe mediile de cultura artificiale.Familia Parvobacteriaceae cuprinde mai multe genuri importante pentru patologia umana:Genul HaemophilusGenul BrucellaGenul BordetellaGenul PasteurellaGenul FrancisellaGenul LegionellaGenul CampylobacterGenul Helycobacter

Diagnostic de laborator in infectiile produse de Genul HaemophilusCocobacili polimorfi, imobili, nesporulai, gram negativi, aerobi, facultativ anaerobi:

Haemophilus influenzae (Multe tulpini de H. influenzae sunt capsulate, se transmite pe cale respiratorie. Determina initial o rinofaringit acut, urmat de epiglotit, laringotraheit, otit, sinuzit, mai rar de pneumonie dar i de meningit acut purulent la copiii mici.)

Haemophilus ducreyi( strict patogen pentru om, determina BTS, ancrul moale, diagnosticul de laborator bacteriologic, direct)

Comensali ai tractului respirator (TR) si sporadic ai intestinului, vaginului si uretrei anterioare;

Patogeni oportunisti;

Exceptie - H. influenzae biogrup aegyptius si H. ducreyi patogeni ai mucoasei conjunctivala si genitourinara - nu au fost izolati la persoane sanatoase.

Colonizeaza tractul respirator din a 4-a zi pana la 2 ani dupa nastere cand constituie 10% din microbiota orofaringiana.

Pot produce: - boli primare, secundare, complicatii si reacutizari ale unor boli cronice, in orice zona sau organ al gazdei;

HABITAT SI IMPLICATII IN PATOLOGIEINFECTII Haemophilus spp

Pneumona H. influenzae

Celulita periorbitala

ConjuntivitaCelulitaPneumonieIMPORTANTA MEDICALA- H. influenzaeH.influenzae - al doilea gen, ca frecventa in infectiile comunitare ale TR: otite medii, sinusite, bronsite cronice acutizate si pneumonii;

- tulpinile capsulate tip b (Hib) determina infectii sistemice severe la copii sub varsta de 5 ani, in special meningite, facand parte din cei trei agenti etiologici majori ai acestui sindrom;

- introducerea in unele tari a vaccinului conjugat Hib a redus drastic incidenta infectiilor invazive.

IMPLICATII IN PATOLOGIE

Meningit: LCR 50-95% culturi pozitive;Snge 50-95% culturi pozitive.Conjunctivit:Ochi 50- 75% culturi pozitive;Snge < 10% culturi pozitive.Sinuzit:Aspirate sinusale;50- 57% culturi pozitive.Celulite: Piele 75-90% culturi pozitive;Snge 50-75% culturi pozitive.Otita medie:Timpanocentez50- 70% culturi pozitive.Epiglotit:Snge 90-95% culturi pozitive;Pneumonie, bronit:Sput 25-75% culturi pozitive;Snge 10-30% culturi pozitive.Artrit:Fluid sinovial 70-90% culturi pozitive;Snge 50-80% culturi pozitive.IMPLICATII IN PATOLOGIEPneumonii, meningite, epiglotita acuta, celulite, artrite, pericardite, endocardite, osteomielite, septicemii, bacteriemii, infectii variate ale tractusului respirator, otita medie, conjunctivita, infectii urogenitale, maternofetale, osteoarticulare, dentobucale, ale plagilor accidentale si operatorii, digestive, biliare, abcese cu localizari variate si foarte rar infectii nozocomiale.

Frecvente si grave la copii, batrani si imunodeficienti, rare la tineri si adulti.H. influenzae tip b - potential patogen cel mai pronuntat - 90% din infectiile invazive produse de hemofili;urmat de : H. parainfluenzae, H. ducreyi.

Vom discuta diagnosticul in meningita produsa de Haemophilus influenzae (Hib), diagnostic bacteriologic, URGENT! RISC DECES!!!!!

I.Recoltare si transport produs patologicLCR

Recoltare prin puncie (dup verificarea presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) la patul bolnavului,transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C, refrigerarea este contraindicat).

H. influenzae ar putea fi izolat i prin: hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene12II. Examen direct al produsului patologic

macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.

microscopic: MINIM 2 FROTIURI (LCR franc purulent utilizat ca atare, altfel centrifugare)

vedem celulele inflamatorii (ex. leucocite) cocobacili gram-negativi, fini, capsulai, dispui separat sau n grmezi aranjate n aceeai direcie, uneori dispui n lanuri scurte, situai intra sau extraleucocitar

se coloreaz relativ slab n coloraia Gram, ar putea fi necesar colorarea frotiului de rezerv printr-o alt metod sau, recolorarea prelungit cu fucsin.

Haemophilus Species

Direct smear of H. influenzae in CSF in a case of meningitis. Note the intracellular and extracellular pleomorphic gram-negative bacilli.III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea obtinerii de colonii izolate

Este foarte pretenios, nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite (creste pe geloza sange sau chocolat, sau chocolat cu bacitracina), necesit 5-10% CO2, incubare in atmosfer umed, la 35-37 C, minim 24-48 de ore.

Sunt necesari factori de cretere precum hemina (factor X) i factorul V.

Coloniile de tip S sau M, de 0.5-0,8 mm/24 h, 1-2 mm/48 h, picturi de rou pe geloz chocolat.

Ambii factori se obin din eritrocite, ns este necesar eliberarea coninutului acestora n mediu (de exemplu prin cldur, sau prin digestie peptic).

15EXIGENTE DE CRESTERENumele acestui gen reflecta incapacitatea bacteriilor de a se dezvolta pe medii fara sange sau constituienti sanguini. Au nevoie de prezenta in mediul de cultura, a factorilor de crestere din hematiile de cal, iepure sau berbec:

factorul X (hemina sau protoporfirina), termostabil - necesar pentru sinteza enzimelor respiratorii care conin fier: citocromul C, citocromoxidaza, catalaza i peroxidaza (Mihaescu G., 2007 );

factorul V ( NAD sau NADP sau coenzima I)- termolabil, eliberat din hematii sub efectul temperaturii (geloza chocolat) sau prin actiune enzimatica (extract Fildes), inactivat de NAD-aza- necesar pentru procesele de oxido-reducere ale metabolismului bacterian (Mihaescu G., 2007).

Utilizarea factorilor X si V

Haemophilus Species: Identification

This organism would be identified as H. influenzae because it is using both X and V factors.Haemophilus Species: Identification

This organism would be identified as H. parainfluenzae because it is using V factor only.Haemophilus Species: Identification

This organism would be identified as H. aphrophilus because it is using X factor only.SpecieCerinte de factori X V -hemolizape geloza cu sange de iepureH.influenzae++-H.parainfluenzae(ornitina pozitiv)-+-H.haemolyticus+++H.parahaemolyticus-++H.aphrophilus+--H.paraphrophilus(ornitina negativ)-+-Pe geloz-snge cu infuzie de inim-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore prezint irizaii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliz.

Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz snge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a fost nsmnat o tulpin hemolitic de Staphylococcus aureus. fenomenul de satelitism

Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz snge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a fost nsmnat o tulpin hemolitic de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism).

23IV. Izolare in cultura pura si Identificare pe baza caracterelor:

Caractere morfotinctoriale:

cocobacili gram negativi, mici (1-1,5 /0,3 mm), dispui separat sau n grmezi, sau n lanuri scurte

la 6-8 ore, predomin formele cocobacilare, care au i capsul.

n culturile vechi se caracterizeaz prin pleomorfism i pierderea capsulei

Gram negativi, cocobacili, bacili scurti, forme filamentoase, cu grade variate de polimorfism, imobili; rezistenti la decolorare (15-20 sec.); recolorare prelungita cu fucsina bazica 5 min.;capsula, prezenta la tulpinile invazive de H.influenzae, poate fi pusa in evidenta prin metode imunologice (reactia de umflare a capsulei, latex aglutinare);

Colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, pe geloza sange.Coloniile de tip S sau M,picturi de rou pe geloz chocolat. Caractere de cultur:

Caractere biochimice:

Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transform triptofanul n indol). Fermenteaz inconstant diferii carbohidraii. Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi mprit n biotipuri.

Utiliznd galeriaAPINH(manual) putem identifica specii de Neisseria,Haemophilus i Branhamella catarrhalis,n numai 4 ore.Identificarea pe baza caracterelor biochimice- API-NH

- Identificare biochimica si biotipare: galerii API-NH/ REMEL;30Identificarea pe baza caracterelor biochimice- REMEL

Testarea producerii de lactamaza:

-lactamaza- produsa de bacteriile care sunt rezistente la peniciline si cefalosporine. Nitrocefinul- degradat de -lactamaza produsa de bacterii; Virajul cefalosporinei cromogene de la galben la rosu, cand este expusa la o cultura bacteriana producatoare de -lactamaza. Test -Test +Caractere antigenice:

Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus influenzae, prin tehnici imunologice, n funcie de Ag K. Tipurile (a-f) se pot diferenia prin reacii de umflare a capsulei i de imunofluorescen.

Tulpinile capsulate (Ag K) se pot identifica n p.p. (LCR sau urin) prin contraimunoelectroforez, latex aglutinare sau ELISA.

Tulpinile necapsulate se pot identifica prin electroforeza.

Diagnosticul H. influenzae utilizand tehnici de biologie molecularaReacia PCR pentru H. influenzae are trei etape i detecteaz prezena a 3 gene:

ce codific proteina de membran extern P2 (outer membrane protein= ompP2)- confirm identitatea H. influenzae.

- bexA- detecteaz capacitatea tulpinilor de a exporta la suprafaa celulelor polizaharidul capsular.

- capII (a-f)- confirm serotipul tulpinii (Falla et al., 1994).

bexA 345 pbtip b 480 pbompP21000pb Electroforeza n gel de agaroz a ampliconilor genelor ompP2 i bexA la tulpinile 14, 37 i ompP2, bexA i capII tip b pentru tulpina 17.V. Antibiograma

este necesar

se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice.

Este recomandat utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot utiliza i truse automate pentru testare.

Determinarea CMI i CMB poate fi necesar i se realizeaz prin metode clasice sau cu ajutorul testului E.

Identificarea rspunsului imun fa de Haemophilus influenzae

Identificarea prezenei de anticorpi fa de H. influenzae ar putea fi util pentru verificarea rspunsului imun n urma vaccinrii.

n acest scop au fost utilizate RIA i ELISA.

Haemophilus ducreyi

n regiunea genital apare ancrul moale (iniial se formeaz o papul sensibil, cu eritem n jur, urmat de apariia unei pustule i apoi a unei eroziuni care ulcereaz),dureros, cu eritem i edem. Pot exista ancre multiple.

Ganglionii regionali sunt mrii, dureroi i pot supura.

Diagnosticul diferenial se face cu sifilisul, infecia cu virusul Herpes simplex i limfogranulomatoza venerian.Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli: ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc

n infeciile produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreii de la nivel genital:

raclarea secreiei de sub marginea ancrului; puroi din abces.2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram.

Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, gram negativi, dispui n perechi sau lanuri paralele (n iruri), frecvent n asociere cu alte microorganisme.

3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur.

Cultivarea H. ducreyi este dificil.

Necesit pentru cultivare factorul X.

Se poate dezvolta dac produsul patologic este recoltat de la baza ancrului i cultivat pe geloz chocolat plus vancomicin 3 mg/ml la 33C n atmosfer de 5-10% CO2.4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, gram negativi, dispui n perechi sau lanuri paralele. Caractere de cultur: Produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, dup 3-7 zile de la cultivare. Pe geloz-snge pot produce hemoliz. Caractere biochimice: Necesit prezena n mediul de cultur a factorului de cretere (X). Haemophilus ducreyi este catalazo negativ.

5. Antibiograma este necesar i poate realiza prin metode difuzimetrice.

Diagnosticul de laborator imunologic

ancrul moale este singura afeciune produs de microorganisme din genul Haemophilus n care diagnosticul serologic ar putea fi util.

Identificare prezenei anticorpilor este util i n scop epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor IgG sau IgM care apar fa de H. ducreyi.

Este nc n discuie utilitatea IDR cu Ag extrase din cultur de bacili Ducreyi.

Diagnostic de laborator in infectiile produse de Genul Bordetella

cocobacili polimorfi, imobili, nesporulai, capsulai, gram negativi, strict aerobi. Specia tip este reprezentat de Bordetella pertussis.

Incadrare taxonomicaFamilia AlcaligenaceaeGenul Bordetella Speciile genului:

B.pertussis B.hinziiB.parapertussisB.aviumB.bronchisepticaB.trematumB.holmesiiB.petriiB.ansorpii

Importanta medicalaB.pertussis, B.parapertussis: - izolate numai la om- agenti etiologici ai tusei convulsiveB.bronchiseptica:- izolata de la animale (infectii respiratorii)- rar intalnita la om (imunodeprimati)B.holmesii:- izolata din hemoculturi la om (tineri cu afectiuni subiacente)B.hinzii, B.avium:- izolate din prelevate de la pui si curcani ( coriza)B.trematum:- infectii cutanate si auriculare la omB.petrii :-izolata dintr-o statie de epurare, ulterior de la subiecti umaniB.ansorpii (2005):- secretie purulenta din chist epidermic

Bordetella pertussisAgentul etiologic al tusei convulsiveBoala prevenibila prin vaccinareDiagnosticul este bacteriologic, cel serologic este tardiv, retrospectiv.

p.p.= secreii de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian)

vom realiza recoltarea cu ajutorul tamponului din alginat de calciu care se las pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza adsorbia B. pertussis (bumbacul inhib dezvoltarea microorganismelor)

prin aspirarea secreiilor traheobronice

metoda plcilor tuite (se expune o plac Petri cu mediul Bordet-Gengou la care s-a adugat antibiotic, deschis, la aproximativ 20 cm n faa gurii bolnavului n timpul accesului de tuse).

Este recomandat prelucrarea imediat a p.p., dac este posibil la patul bolnavului (microorganismul fiind foarte puin rezistent n mediul extern).

I.Recoltare si transport produs patologic

Recoltarea produsului patologic

Recoltarea produsului patologic

FILMConditii de transport:

insamantare la patul bolnavuluimediu de transport (Regan-Lowe semisolid selectiv)

mediude transport universal ( Amies, Stuart)

II. Examen direct al produsului patologic

celulele inflamatorii (ex. leucocite) i cocobacili gram-negativi, dispui separat sau n perechi, rareori n lanuri scurte.

III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea obtinerii de colonii izolate

este un microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuitenecesit pentru cultivare acid nicotinic, 35-37C, incubare 3-7 zile, n aerobioz i atmosfer umed. mediul Bordet-Gengou conine agar, macerat de cartof, snge, glicerol i devine selectiv prin adugare de penicilin / meticilin sau cefalexin. Dezavantajul este timpul scurt n care poate fi utilizat (1-7 zile).se recomand utilizarea unui mediu folosit iniial ca mediu de transport, care include geloz nutritiv, crbune activat i este suplimentat cu 10% snge de cal, poate fi utilizat pe parcursul a 1-2 luni, coloniile apar mai rapid.

La izolarea primara este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu crbune activat, ns prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta i pe geloz-snge sau chiar i pe geloz simpl. este un microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuitenecesit pentru cultivare acid nicotinic, 35-37C, cu incubare timp de 3-7 zile, n aerobioz i atmosfer umed. Cel mai cunoscut mediu de cultur este mediul Bordet-Gengou care conine agar, macerat de cartof, snge, glicerol i devine selectiv prin adugare de penicilin / meticilin sau cefalexin. Dezavantajul principal al mediului clasic este timpul scurt n care poate fi utilizat (1-7 zile).Actualmente se recomand utilizarea unui mediu folosit iniial ca mediu de transport, care include geloz nutritiv, crbune activat i este suplimentat cu 10% snge de cal. Acest mediu poate fi utilizat pe parcursul a 1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.n vederea izolrii primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu crbune activat, ns prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta i pe geloz-snge sau chiar i pe geloz simpl. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace i vor aprea modificri morfologice (pleomorfism), alterri structurale, virulena fiind sczut.

55Caractere morfotinctoriale:cocobacili gram negativi, mici, imobili, dispui separat sau n perechi, rareori n lanuri scurte, cu tendina de a deveni pleomorfi utiliznd coloraii speciale, se pot evidenia structurile capsulare. IV. Izolare in cultura pura si Identificare pe baza caracterelor:

Caractere morfotinctorialecocobacili mici (0,2-0,3m pana la 0,5-1m)Gram negatividispusi izolati, perechi, rareori lanturi scurte4 specii imobile:B.p.,B.pp.,B.holmesii, B.petrii5 specii mobile:B.br.,B.hinzii,B.avium,B.trematum, B.ansorpiistrict aerobi, metabolism respiratorexigente nutritive:cultiva numai pe medii cu a-a,vitamine, saruri minerale, substante neutralizante (amidon, carbune), nu necesita factori X si VTemperatura optima de cultivare: 350-370C

Caractere de cultur:pe mediul Bordet-Gengou se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uor transparente, cu strlucire metalic, foarte aderente, nconjurate de un halou de hemoliz difuza

Pe mediul cu crbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu suprafaa perlat.

Pearl-like colonii de tip S sau M

Bordetella pertussis on Charcoal Agar supplemented with Cephalexin

Caractere biochimice si metaboliceSpeciile genului Bordetella sunt in general inactive metabolicnu fermenteaza hidratii de carbonnu produc gaznu produc indol si hidrogen sulfuratnu lichefiaza gelatinaalcalinizeaza laptele turnesolatBordetella pertussis este hemolitic, oxidazo pozitiv, ureazo negativ.

Specii de interes medical-caractere diferentiale CaracteristiciB.pertussisB.parapert.B.bronchi.Crestere pe B-G (timp)3-6 zile1-3 zile1-2 zileCatalazav++Oxidaza+-+Utilizare citrat+++Mobilitate--+Ureaza-++Reducere nitrati--+ Caractere antigenice:Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis, prin reacia de aglutinare pe lam.

V. Antibiograma

poate fi necesar n scopul supravegherii apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice

se realizeaz prin metode difuzimetrice

Diagnostic serologicutil pentru diagnosticul cazurilor cultura negative sau PCR nerealizabilsupraveghere epidemiologicadiagnostic retrospectiv (in faza de convalescenta)se efectueaza pe doua probe de seruri recoltate la debut si la 3-4 saptamani de boala

Metode de diagnostic serologic:a) reactia de aglutinare in tuburi (tip Flosdorf) -punerea in evidenta a Ac aglutinanti antipertussis si antiparapertussis b) ELISA - determinare IgA (boala) si IgG (boala si vaccinare) - determinare Ac anti-PT, anti-FHA