LICEUL TEORETIC DE SERVICII SF. APOSTOL ANDREI

PLOIEȘTI

PROIECTEXAMEN DE CERTIFICARE A

COMPETENȚELOR PROFESIONALE NIVEL 3+CALIFICARE PROFESIONALĂ ASISTENT

MEDICAL DE LABORATOR

TEMAENZIME – IMPLICAȚII BIOLOGICE

COORDONATOR ABSOLVENT

PROF. GHEORGHE EVELINE BOGDAN ADRIANA

ANUL III AML

PROMOȚIA 2015

Enzime

Introducere – generalități

Enzimele sunt catalizatori biochimici propriu-ziși, așadar ele sunt compuși care măresc viteza reacțiilor chimice ce se desfășoară in sistemele biologice, fără să se consume în timpul acestora.

Din cele mai vechi timpuri (din antichitate), sunt cunoscute procese enzimatice cum sunt: fermentația vinului, dospirea pâinii, etc. Dar cunoștințele sistematice în acest domeniu s-au obținut începând cu identificarea primelor enzime: amilaza din malț (Kirchoff, 1814 ), amilaza salivară (Leuchs, 1831 ) și pepsina (Schwann, 1836 ). Ulterior progrese importante s-au realizat prin lucrările privind cataliza și biocataliza ale lui Berzelius Liebig, prin studiile asupra cineticii ale lui Michaelis și Menten (1912), prin obținerea enzimelor în stare cristalizată (Sumner, 1926).

S-au efectuat lucrări numeroase de-a lungul anilor, dovedindu-se prin acestea că enzimologia constituie studiul bazelor moleculare ale vieții. În organismele vii, mii de reacții chimice se desfășoară foarte rapid în condițiile de presiune și temperatură ale acestora. Toate eceste transformări sunt mediate de enzime (denumite inițial fermenți sau diastaze), proteine specializate să catalizeze reacțiile metabolice.

Ca și catalizatorii industriali, enzimele duc la creșterea reacțiilor biochimice posibile. În timpul acestor reacții, enzimele nu își modifică compoziția.

E + S ↔ E S ↔ E + PE = enzimăS = substratES = complex între enzimă și substratE = enzimăP = produs de recțieDin punct de vedere biochimic, enzimele sunt molecule

proteice. În marea majoritate au structură și proprietăți deosebite. La nivelul organismului uman există câteva mii de enzime funcționale. Fiecare porțiune de enzimă, respectiv moleculă, dispune de o porțiune la nivelul căreia are loc transformarea biochimică. De obicei această porțiune se situează în interiorul moleculei și este numită ‚‚centru’’ și ‚‚miezul activ’’ al enzimei.

Prin determinarea felului și naturii reacției catalizante ‚‚centrul activ’’ stabilește și specificitatea de acțiune a enzimei.

2

‚‚Substratul’’ se fixează în apropierea centrului, acționând pe o altă porțiune a suprafeței enzimei, respectiv în centrul de legare, determinând astfel specificitatea de substrat.

În unele cazuri, centrul activ face parte din structura enzimei, în altele însă se leagă separat de molecula enzimei.

Viteza reacțiilor catalizate poate fi stimulată , dar și inhibată. În cazul catalizatorilor anorganici, temperatura sisitemului influențează direct proporțional rata de reacție.

Caracteristicile enzimelor

Enzimele pot fi definite drept biocatalizatori care prezintă următoarele trăsături caracteristice:

1. Enzimele au o putere catalitică enormă, accelerând viteza reacțiilor cu până la 1016 față de viteza reacției necatalizate. Această capacitate depășește puterea oricărui catalizator folosit în sinteza organică. Enzimele au această imensă putere catalitică în soluții diluate, în condiții moderate de pH și temperatură. Puterea catalitică poate fi definită ca: raportul între viteza reacției catalizate și viteza reacției necatalizate enzimatic.

2. Enzimele nu se consumă și nu se transformă în reacțiile catalizate.

3. Enzimele se caracterizează printr-o mare specificitate. Orice enzimă este foarte selectivă atât în ceea ce privește substanța pe care o transformă (substrat) cât și din punctul de vedere al reacției catalizate.

4. Enzimele scad energia de activare a moleculelor de substrat pe care le transformă, accelerând astfel viteza reacției biochimice.

5. Capacitatea de reglare- Reglarea activității enzimatice se realizează în moduri diferite, ce variază de la controlul calității de enzimă sintetizată de celulă, pâna la modularea activității sale, interacțiuni reversibile cu activatori și inhibatori metabolici. Enzimele contribuie astfel la coordonarea și reglarea proceselor metabolice.

3

6. Enzimele se găsesc în celule și acționează în cantitate foarte mică, dar cu efect semnificativ.

7. Enzimele pot cataliza reacțiile în condițiile organismului, la temperatura de aproximativ 37 oC, pH optim și la presiune atmosferică. Fiecare enzimă are un pH optim de acțiune deoarece în centrul activ al enzimei există de obicei mai mulți aminoacizi. Variațiile pH-ului în organism au loc în limite relative restrânse, adică de la 6,9 - 7,8 maxim, cele mai multe enzime acționând optim în acest interval. Există și excepții precum:

- Pepsina secretată la nivelul lumenului gastric, având un pH= 1,5 - 2,0

- Tripsina și chimiotripsina din sucul pancreatic cu un pH optim alcalin

- Enzimele lizozomale care acționează la pH acidOrice afecțiune fizică denaturată ca: radiațiile, căldura din

mediu, sau acțiunile chimice, prezența unor metale grele în organism Pb, Sn, Hg fac posibilă denaturarea reacției biochimice și duce la imposibilitatea manifestării funcțiilor enzimatice.

Modul de clasificare al reacțiilor biochimice în mediul apos și la temperatură constant o constituie viteza reacțiilor chimice reversibile. Această viteză determinată de concentrația partenerilor de reacție, ducând la instalarea unei stări de echilibru la care cele două viteze V1

și V2 sunt considerate identice.În cursul reacției enzimatice există mai multe etape:- Prima etapă - prima fază o constituie fixarea substratului S

→ adică formarea complexului enzimă - substrat- A doua etapă - are loc eliberarea procesului de reacție- A treia etapă - are loc eliberarea enzimei. Prin eliberarea

enzimei se produce regenerarea ei și, deci aceasta devine capabilă pentru a intra din nou în reacție. Un număr relativ mic de particule catalizatoare pot realiza transformarea chimică a unor cantități însemnate de substrat fără ca ele să se consume.

În cadrul reacțiilor biochimice există mai mulți factori care afectează activitatea enzimelor serice , respectiv:

- Cantitatea enzimei eliberate în circulație- Gradul diluării enzimei în volumul plasmatic

4

- Viteza eliberării enzimei în plasmăActivitatea enzimelor poate să crească în ser din următoarele

cauze:1. Creșterea permeabilității membranei celulelor fără a exista

manifestarea unor leziuni perceptibile. Astfel de cazuri se întâlnesc în cazul fazei de incubație a hepatitelor virale, atunci când activitatea GPT crește mult în ser fără a se observa vre-o leziune morfologică hepato - celulară.

2. Manifestarea unor leziuni celulare perceptibile, întâlnite mai ales la glandele exocrine. În pancreatita acută crește valoarea serică a α amilazei și a lipazei. Activitatea tripsinei și chimotripsinei eliberate de celulele pancreatice exocrine care sunt lezate la început se neutralizează de către alte enzime existente deja în plasmă.

3. Obstrucția canalelor excretoare ale glandelor exocrine din cauza calculilor sau litiazei. În acest caz are loc o creștere a amilazei, a fosfatazei alcaline, producându-se o reducere a fluxului biliar.

4. Eliminarea renală scăzută a unor enzime în cursul insuficienței renale ducând la creșterea activității enzimelor în ser și lipsa leziunilor celulare.

5. Producerea fiziologică în exces a unor enzime cauzează în mod similar creșterea activității serice a enzimelor; fosfataza alcalină la copii este mare.

Nomenclatura și clasificarea enzimelor

La începutul enziomatologiei au fost caracterizate în special enzime ce catalizau reacții de hidroliză a legăturilor covalente din molecula diverselor substraturi și de aceea erau denumite prin adăugarea sufixului ‚‚aza’’ la numele substratului asupra căruia acționau.

De exemplu:Ureaza= enzima care hidrolizează ureeaLipaza= enzima care hidrolizează lipideleFosfataza= enzima care hidrolizează legăturile fosfat din

compușii organici fosforilați5

Amilaza= enzima care hidrolizează amidonulProteaza= enzima care scindează proteinele.

Altele erau denumite cu nume uzuale mai vechi: pepsina, tripsina.

Această nomenclatură a condus la o serie de confuzii, și din acest motiv, Comisia pentru Enzime a Uniunii Internaționale de Biochimie a introdus în 1956 o bază sistematică pentru denumirea enzimelor.

În prezent fiecărei enzime îi este atribuit un cod și un nume sistematic.

Numărul de cod este format din patru cifre precedate de prescurtarea EC (Enzyme Comission) acestea indicând:

- Prima cifră - clasa de enzime (în funcție de reacția catalizată)

- A doua cifră - subclasa (dă indicații asupra donorului din reacție)

- A treia cifră - subsubclasa (face referire la natura acceptorului din reacție)

- A patra cifră - indică enzima individuală.În funcție de reacția pe care o catalizează, multe din enzime sunt

repartizate în șase clase:1. Oxidoreductoare2. Transferaze3. Hidrolaze4. Liaze5. Izomeraze6. LigazeNumele sistematic conține informații referitoare la:a. Natura donoruluib. Natura acceptorului c. Tipul reacției catalizate

1. Oxidoreductaze = catalizează reacții de oxidoreducere prin care se transferă hidrogen sau electroni între două substraturi.

Cifra subclasei indică donorii echivalenților de reducție:- alcool

6

- aldehide sau cetone- catene hidrocarbonate- amina primară- amina secundară- formele reduse ale coenzimelor p313c26d iridinice- alți compuși azotați

Cifra a treia se referă la acceptorul de hidrogen sau electroni- Formele oxidate ale coenzimelor piridinice- Citocromii- Oxigen- Alți acceptori

Subclasele oxidoreductazelor au și denumiri uzuale: oxidaze, peroxidaze, dehidrogenaze, monoxigenaze.

Coenzimele oxidoreductazelor sunt diferite:- Coenzime piridinice – NAD+, NADP+

- Coenzime flavinice – FAD, FMN- Coenzime hematinice – citocromi

Exemplu: EC1.1.1.27L- lactat NAD+ oxidoreductaza (usual lactate dehidrogenaza) L-lactat+NAD+ - piruvat+NADH

În cazul în care în reacția catalizată de oxidoreductaze se realizează și o altă transformare, se menționează în paranteză acțiunea secundară a enzimei.

Exemplu:EC1.1.1.41L- izocitrat: NAD+ oxidoreductaza

(decarboxilantă) catalizează cu decarboxilarea acestuia.

2. Transferazele = sunt enzime care catalizează transferul unor grupe variate între două substraturi. Numele acestora este în funcție de natura grupei transferate:

- Metiltransferaze- Aminotransferaze- Formiltransferaze- FosfotransferazeA doua cifră indică tipul de grupă transferată:

7

2.1- grupa cu un atom de carbon2.2 – grupe aldehidice sau cetonice2.3 – grupe acil2.4 – grupe glicozil2.5 – grupe alchil2.6 – grupe ce conțin azot2.7 – grupe ce conțin fosfor2.8 – grupe ce conțin sulfA treia cifră descrie exact grupa care este transferată în cazul în

care subclasa presupune mai multe grupe:2.1.1 – metiltransferaze2.1.2 – hidroximetiltransferaze2.6.1 – aminotransferazeCoenzimele transferazelor sunt numeroase:

- Piridoxal fosfatul- Tiamin pirofosfatul- Coenzima A- Acizi folici- Coenzimele B12- Biotina- S- adenozil metionina- Nucleotid polifosfați (ATP)- Formele active ale unor compusi: UDP- glucoza; CDP-

colinaExemplu:

EC2.7.1.2 ATP: D-glucoza-6Fosfotransferaza (glucokinaza)D-glucoza + ATP = D- glucoza-6-fosfat + ADP

În cazul transferazelor de grupe fosfat denumirea face obligatoriu referire la acceptor:

2.7.1- alcool2.7.2- carboxil2.7.3- grupa azot Pentru fosfotransferaze ce necesită ATP ca donor de grupe

fosfat se utilizează denumirea uzuală ‚‚kinaza’’.

8

3. Hidrolazele = sunt enzime care participă la hidroliza unor legături diverse, fiind subclasificate (a doua cifră) în funcție de natura acestora:

3.1 – legătură esterică → esteraze3.2 – legătură glicozidică → glicozidaze3.3 – legătură fosfat → fosfataze3.4 – legătură peptidică → peptidaze3.5 – legături între carbon și azotA treia cifră indică mai exact tipul de legatură hidrolizată:3.1.1 – hidroliza esterilor carbonici3.1.6 – hidroliza esterilor acidului sulfuric

Exemplu: EC3.1.3.9 D– glucozo – 6 – fosfat – fosfohidrolază

(glucozo – 6 – fosfataza)D – glucozo – 6 – fosfat + H2O = D – glucoză + Pi

4. Liazele = sunt enzime care participă la formarea unor legături duble C-C, C-N, C-O prin îndepărtarea nehidrolitică a unor grupe din substrat.

A doua cifră indică tipul legăturii scindate:4.1 – C-C4.2 – C-O4.3 – C-N4.4 – C-SA treia cifră face referire la natura grupei îndepartate:1 – carboxil2 – aldehidă3 – α- cetocarboxilSe poate face referire la acestea și folosesc denumirile uzuale:

aldolaze, hidrataze, sintaze,decarboxilaze.Exemplu:

EC 4.1.1.22 L-histidin-carboxi-liaza (histidin decarboxilaza)

Histidina = Histamina + CO2

9

5. Izomerazele = sunt enzime care permit desfășurarea reacțiilor de izomerizare fiind subclasificate în funcție de tipul reacției catalizate.

5.1 – racemaze și epimeraze5.2 – izomeraze cis- trans5.3 – oxidoreductaze intramoleculare5.4 – mutazeA treia cifră indică tipul de moleculă ce este supus izomerizării:– racemaze ce transformă aminoacizii– epinmeraze ce transformă carbohidrațiExemplu:

EC 5.1.1.1 Alaninracemaza transformă L – alanina în D – alanină

6. Ligazele = sunt enzime care intervin în formarea unor noi legături C-C, C-O, C-N, C-S folosind ATP- ul ca sursă de energie.

A doua cifră indică legătura formată:6.1 –C-O6.2 – C- S6.3 – C- N6.4 – C- CA treia cifră descrie mai exact legătura ce se formează:6.3.1 – amidosintetaze6.3.2 - peptidsintetaze 6.4.2 – carboxilazeExemplu:

EC 6.4.1.1 piruvatcarboxilaz L – piruvat + CO2 = L – oxalilacetat

Enzimele sunt enzime proprii ale plasmei:- Eliberate ocazional de către glandele exocrine- Eliberate în condiții fiziologice în cantități reduse

Se exprimă la nivelul lichidului biologic, nu pe baza cantității , ci în funcție de activitatea lor.

Din punct de vedere al activității, unitatea de măsură din cadrul sistemului internațional (S.I.) este: KATAL.

10

KAT-UL → unitatea care reprezintă acea cantitate de enzimă care la temperatura constantă de 25oC, transformă în 1 sec. 1mol de substrat / 1 litru de soluție.

Pentru aplicațiile medicale s-s considerat că se obțin rezultate foarte mari, incomod de folosit în practică, și de aceea s-a definit unitatea internațională biochimică U/L sau U.I.

U/L (U.I.) → reprezinta acea cantitate de enzimă care transformă intr-un minut 1μmol de substanță dizolvat într-un litru de soluție.

Structura EnzimelorEnzimele sunt proteine globulare putând avea o structură:Unitară – enzime monocomponente, alcătuite numai din

aminoacizi: tripsina, chimotripsina, pepsina, lipaza, ribonucleaza.Binară – enzime alcătuite dintr-o parte proteică (apoenzima) și o

grupă neproteică; definite de Euler astfel:Holoenzima = Apoenzima + CofactorStudiul structurii enzimelor s-a realizat prin tehnici exacte:

difracția cu raze X, dicroism circular, fluorescență, analize în UV și IR, RMN, spectometrie Raman.

Cunoașterea localizării intracelulare a diverselor enzime are și valoare diagnostică, întrucât o lezare celulară care duce la eliberarea din celule a enzimelor mitocondriale, este mai gravă decât o leziune limitată la membrana celulară și care duce doar la ieșirea enzimelor citoplasmatice.

S-a stabilit ca enzimele glicolitice (aldolaza, LDH) sunt localizate în citoplasmă pe când enzimele implicate în respirația celulară, enzimele afectate ciclului acizilor tricarboxilici (piruvatdehidrogenaza, izocitrat dehidrogenaza) sunt localizate în mitocondrii.

Dintre transaminaze, alanil-amino-transferaza și malicodehidrogenaza se găsesc atât în citoplasmă cât și în mitocondrii.

La nivelul lizozomilor se găsesc incluse enzime cu rol în degradarea lipidelor, proteinelor și acizilor nucleici (ribonuclează, dezoxiribonuclează, fosfataze, proteaze, colagenaze). Cât timp membrana lipoproteică a lizozomilor rămâne intactă, enzimele

11

lizozomale nu atacă substratele din citoplasmă. Dezintegrarea acestei membrane este urmată de liza celulei.

Enzimele care se găsesc în plasmă pot fi clasificate în doua grupe:

a. Enzimele specifice plasmei , denumite și enzime plasmatice funcționale, includ toate enzimele care au o funcție bine definită și specifică în plasmă. Plasma este locul lor de acțiune și ele se găsesc la un nivel mai ridicat decât în majoritatea țesuturilor.

Aceste enzime sunt sintetizate în ficat și sunt eliberate constant în plasmă. Ele prezintă interes clinic când în plasmă au o concentrație mai scăzută față de normal.

Dintre aceste enzime amintim: enzimele coagulării, lecitin-colesterol-acil-transferaza (LCAT), pseudocolinesteraza, ceruloplasminarenina.

2. Enzimele nespecifice plasmei , care nu prezintă funcții fiziologice în plasmă. Ele se găsesc în plasmă în concentrații mult mai mici decât concentrația lor în țesuturi. În multe cazuri plasma este deficitară în activatori sau coenzime necesare pentru activitatea optimă a acestor enzime.

Acest grup conține:a. Enzimele de secreție , provenind din glandele exocrine și

pancreas; sunt secretate și acționează la nivelul tubului digestiv și dintre acestea amintim: amilaza, lipaza, tripsina, pepsinogenul. Deși ele se secretă în cantități ridicate, sunt rapid și complet eliminate prin canalele excretoare obișnuite, în tractul gastrointestinal, bilă, urină și concentrația plasmatică este scăzută și constantă. Ori de câte ori o cale uzuală de excreție este blocată, sau dacă eliberarea în lichidul extracelular este brusc accelerată, rata de producere este crescută, concentrația în plasmă a acestor enzime va crește semnificativ.

b. Enzime celulare (AST, ALT, CK, LDH) au loc de acțiune în celulele din care provin, unde se găsesc într-o concentrație ridicată. Dacă membrana celulară este intactă, aceste enzime sunt absente în lichidul extracelular și plasmă sau în concentrație extrem de mică. Prezența lor în plasmă se datorește unor scurgeri minime în cadrul procesului de uzură celulară sau în cursul diviziunii celulare, sau când există o perturbare a proceselor energetice celulare,

12

caracterizate printr-o scădere a concentrației ATP din celule, care se repercutează asupra permeabilității membranei celulare. Așa se explică creșterea moderată a CK (creatinkinazei) în cursul unui efort muscular intens.

După ce enzimele celulare s-au scurs în plasmă, activitatea lor scade rapid, având timp de înjumătățire (îndepărtare) de câteva ore, de exemplu pentru AST este de 46- 58 ore.

Scăderea activității plasmatice a enzimelor s-ar datora câtorva mecanisme:

a. În cursul trecerii prin membrana celulară poate suferi modificări structurale. De exemplu CK suferă un proces de oxidare a grupelor –SH.

b. Enzimele cu greutate moleculară mică, cum este α- amilaza se elimină pe cale urinară, iar fosfataza alcalină pe cale biliară.

c. Majoritatea enzimelor sunt îndepărtate din plasmă printr-un proces de captare și degradare în macrofage.

Viteza cu care enzimele pătrund din celule în lichidul interstițial și de acolo în plasmă și limfă, precum și viteza de înjumătățire, variază de la enzimă la enzimă. Acest lucru prezintă importanță diagnostică pentru cunoașterea perioadei de timp când trebuie recoltate probele de sânge. De exemplu: activitatea AST-ului crește la 4-8 ore de la producerea infarctului de miocard și revine la normal după 3-6 zile. LDH-ul pătrunde mai greu în torentul circulator, creșteri semnificative înregistrându-se după 8-12 ore, valori care se mențin 10-15 zile. Mecanismul de trecere a acestor enzime în plasmă implică o creștere a permeabilității membranelor celulare care denotă de regulă o lezare a celulelor.

Mecanismul trecerii enzimelor și izoenzimelor tisulare în plasmă este foarte complex. Ele pot ajunge în plasmă direct sau prin sistemul limfatic, ducând la modificarea concentrației lor plasmatice. Aceste disenzimii sunt datorate interacțiunii mai multor factori dintre care amintim:

- Localizarea intracelulară a enzimei și permeabilitatea membranei celulare, mitocondriale și nucleare;

- Gradul de vascularizare a organului lezat;- Prezența sau absența unei bariere inflamatorii;

13

- Greutatea moleculară a enzimelor, cele cu greutate mai mare traversând mai greu membranele.

Datorită acestor eliberări există posibilitatea localizării leziunii celulare indicată prin modificări enzimatice ce permit concluzii diagnostice cu caracter de specialitate.

Principalele enzime plasmatice cu valoare diagnostică

Lactatdehidrogenaza (LDH)

Se găsește în cantități mari în mușchiul striat, ficat, miocard, rinichi și ganglionii limfatici, și în cantități mai reduse în pancreas, eritrocite și plămâni.

LdH poate fi separat în 5 izoenzime. Ele diferă prin raportul în care sunt asociate lanțurile polipeptidice de bază. Cele două lanțuri de bază în cadrul LDH sunt H (de la heart = inima) și M (de la muscle = mușchi). Izoenzimele LDH sunt tetrameri cu următoarele asocieri:

LDH1; LDH2; LDH3; LDH4; LDH5

H4 H3M H2M2 HM3 M4

Cele cinci izoenzime sunt repartizate diferit în țesuturi. Astfel:LDH1- predomină mușchiul cardiacLDH5- în ficat și mușchii scheletici

Valori normale: 120-240U/L

14

Variații patologiceCreșteri: infarct miocardic (de 4 ori valorile normale) - creșterea

debutează la 10 ore după infarct cu maximum la 48-72 ore și revine la normal după 15 zile

miocardita, miopatie hepatita leziuni hepatice toxice infarct pulmonar anemie hemolitică – când poate crește pâna la 200 U/L și

anemie pernicioasă (valori pâna la 8000 U/L)Valoarea diagnostică specifică o au modificările izoenzimatice.

Astfel, creșteri ale LDH1 și LDH2 se întâlnesc în infarctul miocardic și anemie, iar LDH4 și LDH5 în leziuni hepatice și procese neoplazice.

Determinarea activității LDHPrincipiul metodei se bazează pe transformarea NADH în NAD+

sub acțiunea LDH în prezența piruvatului. Viteza de oxidare a NADH este proporțională cu activitatea LDH.

Izoenzimele LDH pot fi separate din ser prin electroforeză pe folii de acetat de celuloză, în gel de amidon, agar, poliacrilamidă prin vizualizare pe baza unei reacții de culoare.

Transaminazele

Aspartat aminotransferaza (AST) se găsește în special în ficat, miocard, mușchii striați. La nivelul ficatului 60% din AST este localizat în citoplasmă și 40% în mitocondrii. Cantități mai reduse de enzimă se găsesc în rinichi, pancreas, plămâni și eritrocite.

Valori normale:- bărbați = 37U/L- femei = 31U/L

Valori patologice: mai mari de 40U/L

15

Creșteri:1. patologia hepatică (raportul AST/ALT mai mic decât 1 –

cu excepția cirozei) cresteri marcate se întâlnesc în:

o hepatita viralăo necroza toxică a ficatului

creșteri moderate (maxim de 10 ori valorile normale) pot apare în:o hepatita cronicăo hepatita medicamentoasăo cirozăo icter

2. patologia cardiacă (raportul AST/ALT mai mare decât 1) creșteri marcate ( de 10-100 ori valorile normale) s-au

observat în infarctul miocardic (creștere după 4 ore maxim 16-48 ore, revine la normal după 4-6 zile)

creșteri moderate ( maxim 10 ori valorile normale)o miocardităo chirurgie cardiacăo embolie pulmonară

3. patologie musculară – sindrom de strivire poli și dematomiozită distrofii musculare intervenții chirurgicale

4. stări hemolitice 5. hipotiroidie cu mixedem Determinări de laboratorPrincipiul metodei este bazat pe reacția dintre L- aspartat si 2-

oxo- glutarat cu formare de oxalacetat care va oxida NADH la NAD+. Viteza oxidării NADH este proporțională cu activitatea catalitică a AST.

Se mai poate doza colorimetric prin determinarea piruvatului în cursul reacției cu 2,4- dinitrofenilhidrazină și formare a hidrazinei respective în mediu alcalin.

16

Alanil aminotransferaza (ALT)

Se găsește în cantități mari în citoplasma celulelor hepatice și în cantități mai reduse în musculatura striată, miocard, rinichi, pancreas.

Valori normale:- Bărbați = 13-30 U/I- Femei = 10-20 U/I

Valori patologice - mai mari de 30U/I

Creșteri:Patologia hepatică ( raportul AST/ALT mai mic decât 1 cu

excepția cirozei) Creșteri marcate ( de 10-100 ori valorile normale)

o Hepatita virală acutăo Necroza toxică a ficatului

Creșteri moderate (de maxim 10 ori valorile normale)o Hepatita cronicăo Cirozeo Icter mecanic

Creșterea ALT semnifică o citoliză hepatică care permite evoluția bolii și o eventuală recădere.

Determinări în laboratorLa fel ca în cazul AST-ului (SFBC și IFCC) recomandă aceleași

condiții de reacție, și anume: reacția de transfer a grupării aminice de la L-alanină la 2-oxoglutanat în prezența ALT și oxidarea NADH la NAD+. Viteza oxidării este proporțională cu activitatea catalitică a ALT.

Creatinfosfokinaza (CK)

Este localizată cu predominanță în musculatura scheletică, creier, miocard. S-au pus în evidență trei izoenzime: CK/MM de

17

origine musculară și miocardică, CK/BB găsită în țesutul cerebral și CK/MB provenită doar din miocard.

Această enzimă catalizează formarea de ATP din creatinfosfat și ADP și se inactivează foarte repede prin oxidarea grupării SH.

Valori normale- Femei = 25-175 U/I- Bărbați = 25/200 U/I- CK-MB sub 24 U/I

Risc crescut de infarct miocardic:- Creșteri ale CK-MB și CK, iar CK-MB reprezintă între 6 și

25% din activitatea totală a CK.Variații patologice:

Creșteri marcate (de 8 ori valorile normale) în infarct miocardic, ele sunt foarte precoce, survin în primele 3-6 ore, cu maximum în 24-36 ore, și revin la normal după 3-4 zile paralel cu creșterea CK-MB.

o Distrofii, miopatiio Infecții musculare repetateo Tetanos

Creșteri ale CK-BBoAccident cerebral vascularo Traumatism cerebraloMeningită, encefalită

Determinări de laborator: prin metoda colorimerică, bazată pe reacția de culoare (albastru de molibden) a acidului fosforic eliberat de reacție. Spectofotometric se determină prin două metode de hexokinază și glucozo-6-fosfatdehidrogenază ca reactiv enzimatic și metoda cu fosfoenolpiruvat, enolază, piruvat-kinază.

Amilaza

Este o enzimă de secreție exocrină și prezentă în ser cu două forme izoenzimatice principale: salivară și pancreatică.

18

Enzima este prezentă în salivă, pancreas, ficat, suc duodenal, intestin subțire.

Valori normale:- 230-2700 U/I- 30-110 U/I – metoda cinetică

370C- 8-30 U/I Wolghemuth- 5-100 U/I Domogyi

Variații patologice: Creșteri marcate ale amilazei (de 30-40 ori valoarea

normală) se întâlnesc în pancreatita hemoragică. Creșterea se manifestă la 3-6 ore de la debutul bolii, maxim la 20-30 ore și se normalizează după 2-8 zile. Determinarea amilazei se completează cu amilazuria deoarece amilaza se elimină prin urină. Decalajul creșterii amilazuriei față de amilazemie este de 6-12 ore.

Creșteri moderate se intâlnesc în:o Cancer de cap de pancreaso Afecțiuni abdominale acute (ulcer perforat, ocluzie

intestinală, colecistită acută, litiază biliară)o Afecțiuni ale glandelor salivare ( parotida, calculi

salivari)o Sarcină extrauterină, administrări de narcotice opiode.

O creștere a amilazemiei se poate întâlni și în caz de defect de eliminare renală prin diminuarea filtrării glomerulare. Amilaza se poate combina cu glicoproteinele sanguine (imunoglobulinele IgG sau IgA) formând ‚‚macroamilaze’’ care nu se pot filtra prin glomerul. În acest caz se observă o hiperamilazemie fără hiperamilazurie.

Determinări de laborator:a) Măsurarea degradării amidonului prin acțiunea alfa-

amilazei. Amidonul dă cu iodul un compus de adiție de culoare albastră, intensitatea culorii iod-amidon, măsurată fotometric, este proporțională cu concentrația amidonului rămas după incubația cu enzime și deci invers proporțională cu activitatea enzimatică.

19

b) Degradarea polimerilor de amidon insolubili în apă, legate de un colorant (remazo/briliant-blau-B). Evaluarea se face pe baza creșterii extincției dotorită colorantului eliberat.

Fosfataza alcalină

Fosfataza alcalină serică este alcătuită din trei forme izoenzimatice: hepatobiliară, intestinală, la care se adaugă în timpul sarcinii o formă tranzitorie, forma placentară.

Fosfataza alcalină osoasă este produsă de osteoblaști și are rol în formarea țesutului osos.

Valori normale:- copii = 110-400 U/I- femei = sub 104 U/i- bărbați = sub 117 U/I

Variații patologice:Creșteri patologice ale fosfatazei alcaline se observă în afecțiuni

hepatice și osoase. Creșterea fosfatazei alcaline hepatobiliare

o Colestează de orice cauză (extra și intrahepatică). În cazul unui icter cu valoarea fosfatazei alcaline crescute dar cu transaminazele normale sau moderat crescute, denotă un icter colestatic.

o Forma intestinală ajunsă pe cale limfatică în ser crește în cirozele hepatice și ulcer duodenal

o Forme atipice se întâlnesc în procesele neoplazice, în special hepatice

Creșterea fosfatazei alcaline osoaseo În perioada creșteriioRahitismoOsteomalacieoMetastaze osoase

20

o În rahitism creșterea fosfatazei alcaline între 150-1000 U/I este considerată a fi cel mai sigur criteriu de diagnostic, crește cu o lună și jumătate înainte de manifestarea clinică și scade după tratamentul cu vitamina D2

o În hipertiroidism primar fosfataza alcalină serică crește până la 500 U/I după ce survin modificări scheletice extensive

Modificările fosfatazei alcaline sunt însoțite de hipercalcemie și hipofosfotemie

o În boala Paget apar valori crescute ale fosfatazei alcaline, dar calciul și fosforul rămân în limite normale

o Fosfataza alcalină de origine placentară apare în ser în ultimele luni de sarcină

o Semnificația fosfatazei alcaline placentare în diagnosticul tumorilor maligne a fost evaluată întâmplător prin descoperirea izoenzimei placentare în serul unui bolnav cu cancer bronșic și a fost numită ‚‚Regan’’ după numele acestuia.

Izoenzima Regan – crește în plasmă în tumorile maligne, cancer ovarian, cancer de col uterin, cancer pulmonar.

Incidența izoenzimei placentare în serul bolnavilor de cancer variază între 5-33%. Ea poate fi utilizată pentru urmărirea evoluției prognosticului în tratamentul cancerului.Valoarea ei scade după un tratament eficient, reapărând odată cu reluarea procesului neoplazic.

A mai fost identificată o izoenzimă Nagao în unele tumori (testiculare, timus). Aceste două forme patologice se diferențiază de fracția placentară prin proprietățile lor imunologice.

Mai există o altă formă intestinală fetală. Este o enzimă care există la nivelul intestinului fătului până în săptămâna 25-32 de gestație (și poate fi dozată în lichidul amniotic). Este alcătuită din două forme de origine intestinală și placentară și posedă proprietăți biochimice ale celor două enzime.

S-a observat creșterea fosfatazei alcaline și în boala Hodgkin și mielomul multiplu, în insuficiența cardiacă concestivă, în bolile intestinale inflamatorii.

Determinări de laborator: colorimetric, prin metoda standardizată internațional, bazată pe hidroliza paranitrofenil-fosfatului.

21

Izoenzimele se pun în evidență și se caracterizează prin: electroforeză în gel de amidon sau poliacrilamidă, vizualizarea făcându-se prin azocuplare cu sarea de diazoniu, Fast blue BB, cu naftolul provenit din alfa-naftil fosfat.

Fosfataza acidă

Se găsește în cantități mai mari în prostată și în canttăți mult mai mici în ficat, splină, rinichi, eritrocite, trombocite și glandele endocrine.

Fracțiunea prostatică a fosfatazei acide este inhibată de tartrat ceea ce permite dozarea diferențiată a acestei fracțiuni.

Valori normale:- Fosfataza acidă totală = 0-9

U/I- Fosfataza acidă prostatică = 0-

3 U/I

Variații patologice: Creșterea fosfatazei acide totale are loc în:

o Carcinom de prostatăo Adenom de prostată (creșteri moderate)

Creșterea fosfatazei acide trombocitare are loc în:o Infarct, embolie pulmonarăo Trombocitozăo Hemolizăo Boala Paget

Creșterea fosfatazei acide prostatice:o Carcinom de prostatăo Adenom de prostată (creșteri moderate)

Determinări de laborator: colorimetric, bazat tot pe reacția de hidroliză a paranitrofosfatului, dar în mediu acid. Izoenzimele se caracterizează prin mobilitate electroforetică sau inhibiție chimică diferențiată:

22

- L-tartratul inhibă activitatea izoenzimei prostatice (și leucocitare)

- Formaldehida inhibă izoenzimele eritrocitare și trombocitare.

Lipaza

Lipaza pancreatică degradează trigliceridele în digliceride, în monogliceride și apoi acesta sunt transformate în glicerol și acizi grași.

Valori normale:- 7-60 U/I (metoda Cormway la

550nm)- 20-210 U/I (turbidimetric la

400nm)

Variații patologice:Hiperlipazemie apare în :

Pancreatită acută și cronică Cancer de cap de pancreas

În pancreatita acută lipaza se menține mai mult timp crescută decât amilaza.

Determinări de laborator: prin metoda turbidimetrică, bazat pe hidroliza trigliceridelor la mono- și digliceride solubile și citirea la 400 nm sau cinetic colorimetric la 550 nm.

Aldolaza

Este de origine musculară și hepatică. Ea scindează fructoza 1,6 difosfatul în 3-fosfogliceraldehidă și fosfodihidroxiacetonă la nivelul tuturor celulelor și fructozo-1-fosfat în fosfodihidroxiacetona și gliceral-aldehidă la nivelul ficatului.

Valori normale:- 0,5-7,6 U/I la 370C (cinetic la

23

340nm)

Variații patologice: Crește marcat în miopatii Aldolaza împreună cu CK crește în patologia musculară Crește marcat în hepatita virală, dar în general această

enzimă nu se utilizează pentru depistarea sau urmărirea evoluției unei hepatite virale.

Pseudocolinesteraza serică (PsCE)

Este o enzimă secretată activ în plasmă de către ficat. Pseudocolinesteraza serică aeste un indicator al funcției proteosintetice a ficatului. Ea scade mult în insufuciențele hepatice (hepatite, ciroze), în intoxicații cu organofosforice și la bolnavii cu denutriție proteică gravă.

Scăderile moderate se pot întâlni în:o anemiile grave de tip Biermer, o infecții acute, o după infarct miocardic.

Creșteri ale pseudocolinesterazei serice se întâlnesc în: o sindromul nefrotic, o perioada de vindecare a unei hepatite, o la obezi, diabetici, o hiperparatiroidismul neînsoțit de ceșexie.

Determinări de laborator: Pseudocolinesteraza eliberează prin hidroliza butirilcolinei,

ticolina care reacționează cu DTNB (acid 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoic) dând un compus colorat galben colorimetrabil.

Gamma-glutamyl-transferaza (γ- -GT sau GGT)

24

Gamma-glutamyl-transferaza se găsește predominant în celulele hepatice, renale, pancreas, prostată. Activitatea plasmatică a gamma-glutamyl-transferazei este mai crescută la bărbați decât la femei.

Valori normale:- Cinetic la 450nm = 5-80U/I- Femei (la370C colorimetric) =

7-32U/I- Bărbați = 11-50 U/I

Cauzele creșterii gamma-glutamyl-transferazei: Icter colestatic, când activitatea crește paralel cu fosfataza

alcalină Creșteri marcate se mai întâlnesc în :

o Hepatite alcooliceo Administrare de anticonvulsivante, fenitonină,

fenobarbitalo Administrare de tratament anticoncepționalo În maladiile hepatocelulare ca hepatita infecțioasă este

de preferat determinarea transaminazelor serice care este mai relevantă decât GGT

o Atingeri pancreatice (pancreatită, cancer)Determinări de laborator:Metoda cinetic colorimetrică utilizând γ-glutamil-4 nitroanilină.Viteza formării de 4-nitroanilină corespunde activității gamma-

glutamyl-transferazei.

25

Factorii care influențează activitatea enzimelor

Fiind proteine, enzimele sunt sensibile la acțiunea unor factori externi care pot să influențeze disocierea grupelor implicate în cataliză, legarea substratului la situsul catalitic sau structura în ansamblu a părții proteice. Astfel de factori sunt:

- Temperatura- pH-ul- efectorii enzimaici (activatori sau inhibitori)

Influența temperaturii

Efectul temperaturii asupra activității enzimelor este rezultanta acțiunii a doi factori opuși, creșterea vitezei de reacție cu temperatura și denaturarea termică a enzimelor. Activitatea oricărei enzime variază cu temperatura.

Influența temperaturii asupra activității enzimelor

26

Fiecare enzimă este caracterizată de un coeficient termic al reacției notat Q10, ce reprezintă creșterea vitezei de reacție pentru o creștere cu 100C a temperaturii, în condițiile menținerii constante a celorlalți parametri. Pentru reacțiile enzimatice Q10 este între 1 și 2 fiind mai mic decât pentru reacțiile necatalizate, pentru care Q10 este între 2 și 4. Această relație este valabilă numai până la temperatura optimă, pentru care viteza de reacție este maximă. Creșterea temperaturii peste temperatura optimă determină scăderea vitezei de reacție, datorită denaturării părții proteice a enzimei.

Temperatura optimă pentru enzimele organismului uman este 37-400C, la plante 50 - 600 C, iar pentru cele din microorganismele din apele termale este 80-1000 C.

Determinarea activității unei enzime trebuie sa se facă la o temperatură de 25-370C.

Influența pH-ului

Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim de acțiune este pH-ul normal al mediului în care ele își manifestă acțiunea.

Centrul activ al enzimelor conține grupe ionizabile, acide sau bazice, deci modificarea pH-ului are ca efect modificarea gradului de disociere și implicit modificarea vitezei de reacție.

pH-ul optim de acțiune al unor enzime 27

Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim este între 5-9, dar există enzime ce acționează și în afara acestui interval.

De exemplu:Pepsina acționează la pH = 1,5-2Fosfatazele alcaline acționează la pH = 9-10Fosfatazele acide acționează la pH = 4,5-5

Aplicații practice ale enzimelor

28

A. Principiile enzimologiei sunt aplicate în laborator la măsurarea activității enzimatice în scop diagnostic și a concentrației de substrat.

Enzimele plasmatice sunt: enzime plasmatice funcționale, active asupra unor substraturi plasmatice (de exemplu, lipoprotein lipaza) și enzime plasmatice nefuncționale ce ajung în plasmă în cantitate foarte mica în condiții normale, activitatea lor crescând în cazul unor afecțiuni ale organelor ce le conțin. Dintre acestea cele mai importante sunt enzimele celulare. Modificarea permeabilității membranelor sau distrugerea celulelor sunt însoțite de eliminarea enzimelor în spațiul extracelular. Enzimele citoplasmatice apar înaintea enzimelor mitocondriale. De exemplu, transaminazele, LDH, CK, aldolaza.

Pentru diagnosticarea unor afecțiuni specifice unui anumit organ este ideală cunoașterea unor enzime specifice organului respectiv, numite enzime marker. Găsirea unor markeri exclusivi este extrem de dificilă totuși se poate considera că unele dintre enzimele a caror activitate se determina în laborator au aceasta calitate.

De exemplu, amilaza este marker pentru pancreas, fosfataza acidă pentru prostată, OCT pentru ficat, izoenzimele LDH1 si CK-MB sunt markeri în afecțiunile miocardului, izoenzimele LDH4 si LDH5 sunt markeri pentru ficat și mușchi.

În laborator, enzimele se folosesc și ca ‚‚reactivi’’ pentru dozarea unor componente plasmatice prin metode enzimatice, cum ar fi glucoza, colesterolul, ureea, creatinina, etc.

B. Enzimele imobilizate sunt enzimele legate chimic de un suport diferit ca structura: gel de silice, alumină, cărbune activ, rășini schimbatoare de ioni, polizaharide modificate (DEAE -sephadex, carboximetil celuloza). Suportul trebuie să îndeplinească anumite caracteristici: să permită atacul enzimei fără pierdere de activitate enzimatică, nu trebuie să fie inactivat de sânge, nu trebuie să provoace hemoliza sau să reacționeze cu plachetele sanguine, nu trebuie să prezinte toxicitate sau să genereze răspuns imun, să elibereze produși toxici (în cazul în care enzimele imobilizate pe acesta vin în contact cu organismul uman).

1. Tehnicile moderne de imunologie (EIA, ELISA) folosesc enzimele ca indicatori. Anticorpii specifici pentru un antigen sunt

29

cuplați cu enzime indicatoare (peroxidaza din hrean, fosfataza alcalină). Acestea, după transformarea unui substrat specific, generează produși colorați a căror concentrație este proporțională cu cea de antigen.

2. Enzimele imobilizate se folosesc ca reactivi în analizoarele de chimie uscată. Ele sunt imobilizate într-un suport de dimensiuni reduse cu tamponul adecvat, cofactorii, cosubstratul si indicatorul de culoare. Plasma furnizează substratul și apa necesara activării sistemului. Enzimele sunt stabile prin legarea de o matrice și păstrarea într-un loc uscat.

3. Enzimele imobilizate pe o matrice insolubila se folosesc și în reactoarele chimice din industria farmaceutică, ca reactivi specifici.

Molecula țintă Ligand ProbăAntigeneAnticorpiLectineGlicoconjugațiEnzimeReceptoriAcizi nucleiciVirusuri, bacteriiCelule, organite subcelulare

AnticorpiAntigeneGlicoconjugațiLectineSubstraturi inhibitoriHormoni, toxineProbe ADN/ARNToate

EnzimeMarkeri radioactiviCompuși fluorescenți cromofori

C. Enzimele – agenți terapeutici. Se utilizează cu prudență, deoarece datorită naturii proteice pot fi hidrolizate de enzimele digestive sau pot provoca reacții imunologice în cazul unei prelucrări și purificări ineficiente.

Enzimele în medicația vasculară. Streptokinaza, amestec enzimatic obținut din streptococ, are acțiune fibrinolitică (trombolitică), fiind utilă pentru activarea hidrolizei trombilor formați în condiții patologice, de exemplu în infarct miocardic.

Urokinaza obținută din urină are același rol.

30

Diferitele produse farmaceutice ce reprezintă activatorul tisular al plasminogenului (tPA) sunt folosite pentru dizolvarea cheagului de fibrină. Heparinaza microbiană imobilizată poate fi folosită pentru îndepărtarea heparinei folosite în tratament ca anticoagulant.

Hemocoagulaza (reptilaza) activează transformarea fibrinogenului în fibrină și este folosită pentru tratarea hemoragiilor nedeterminate de deficitul unor factori ai coagulării.

Enzimele în terapia antitumorală. Ex. asparaginaza este folosită de pacienții cu leucemie deoarece celulele tumorale au afinitate mare pentru asparagină și scăzând nivelul acesteia nu mai este posibilă dezvoltarea lor. Fenilalanin amonioliaza este o altă enzimă ce se poate utiliza imobilizată pentru a reduce cantitatea de fenilalanină la pacienții cu cancer sau fenilcetonurie.

Enzimele folosite în tulburarile digestive. Enzimele digestive se folosesc ca terapie de substituție pentru a realiza digestia proteinelor (pepsina, chimotripsina, tripsina, carboxipeptidaza), glucidelor (amilaza) și lipidelor (lipaza). Se utilizează asocieri de mai multe enzime, dar și cu substanțe utile digestiei (bila, hemicelulaze). Există și preparate ce conțin enzime proteolitice de natură vegetală (ficina, bromelina, papaina).

Enzimele folosite ca antiinflamatoare și cicatrizante. Sunt diferite endopeptidaze și enzime ce acționeaza asupra proteoglicanilor care degradează țesuturile alterate de la suprafața unor leziuni facilitând penetrarea medicamentelor, vindecarea rănilor, reducerea edemelor (se asociază în medicația dermatologică, ORL, oftalmică): hialuronidaza, tripsina, chimotripsina, papaina, lizozim.

31

Variațiile enzimelor serice în câteva boli caracteristice

Infarctul miocardic

Infarctul miocardic se însoțește de modificări enzimatice caracteristice. Creșterea AST, CPK, și LDH prezintă o anumită dinamică , ceea ce face ca în aprecierea rezultatelor date de laborator să se țină cont de intervalul de timp care a trecut de la producerea infarctului, respectiv de la aparația manifestărilor clinice. Acest interval de timp corespunde decalajului între producerea obstrucției coronariene și modificările suferite de celulele lezate, ieșirea enzimelor din aceste celule și trecerea lor în circulația sanguină. CPK se modifică cel mai precoce, dar creșterea ecestei enzime este de scurtă durată. AST-ul prezintă o creștere maximă în ser după 16-48 ore de la producerea infarctului, normalizându-se după 4-6 zile, iar modificările LDH (LDH1 si LDH2) sunt cele mai persistente. LDH crește la 10 ore după infarctul miocardic și revine la normal după 15

32

zile. Intensitatea modificărilor enzimatice în ser dă o orientare destul de fidelă asupra extinderii zonei lezate. Creșteri ale AST peste 150 mU/I și ale LDH la peste 4 ori limita superioară a normalului, denotă o leziune extinsă.

Interpretarea datelor se face în strânsă legătură cu rezultatele obținute la ECG. Explorarea enzimelor serice are valoare diagnostică deosebită, în special atunci când ECG este necaracteristică pentru infarct și în special în microinfarcte.

enzimaDebutul creșterii

(ore)

Concentrația max. după producerea

infarctului (ore)

Durata mentinerii

concentrației crescute

(zile)CK

(total) 4-6 24-48 3-5

AST 6-8 24-48 4-6LDH 12-24 7-12 7-12

Boli ale ficatului

În mod normal raportul AST și ALT în ser, raportul De Ritis, este de aproximativ 1,3. Ficatul este principala sursă de ALT, deci o creștere a acestei enzime care depășește nivelul AST (scade raportul De Ritis) atrage atenția asupra unei suferințe hepatice.

- Hepatita virală acută = se caracterizează prin creșterea progresivă a transaminazelor serice și în special a ALT. Se poate afirma că nu există hepatită acută fără modificări ale transaminazelor. Creșterea acestor enzime începe înainte de creșterea bilirubinei, iar în cursul primelor două săptămâni atinge valori maxime. Valori excesiv de mari ale transaminazelor serice denotă existența unei hepatite severe, cu zone întinse de necroză. O importanță prognostică mai mare decât gradul de creștere al transaminazelor se atribuie duratei acestei creșteri. Lipsa tendinței de normalizare a ALT-ului după 8-10 săptămâni de boală este un indiciu de trecere spre ‚‚hepatita persistentă’’. Nu se poate vorbi despre o vindecare a hepatitei acute

33

decât atunci când transaminazele s-au normalizat și rămân normale și după eforturi moderate.

- Hepatita acută = se însoțește de o scădere moderată a pseudo- colinesterazei serice, fenomen care denotă o alterare a funcției proteosintetice a ficatului, dând indicii asupra gravității procesului. În perioada de vindecare a hepatitei acute se constată o creștere a pseudocolinesterazei și indică un prognostic favorabil.

- Hepatitele cronice = se caracterizează prin valoarea moderat-crescută a transaminazelor serice (20-100 mU/ml). În aceste situații trebuie efectuate și testele de disproteinemie pentru explorarea mezenchimului hepatic.

- În cirozele hepatice creșterea enzimelor este de regulă moderată, deoarece masa celulară este redusă. Diminuarea sintezelor proteice la nivelul ficatului în ciroză, duce la o sărăcire a celulelor în ALT, astfel încât în formele avansate ale unor ciroze această enzimă nu mai crește nici măcar în cursul exacerbărilor acute.

- Tumorile hepatice nu dau modificări enzimatice caracteristice, dar în ficatul metastazat se constată o creștere moderată a transaminazelor și totodată o creștere marcată a LDH și a GGT. Fosfataza alcalină și bilirubina cresc în funcție de gradul în care se perturbă eliminarea bilei.

Boli ale căilor biliare

Litiaza biliară = nu se însoțește de modificări ale enzimelor serice, atât timp cât nu apar complicații.

În icterul mecanic se produce o retenție a enzimelor eliminate prin bilă constatându-se o creștere a fosfatazei alcaline sau a GGT.

În procesul de colestază alături de creșterea bilirubinei conjugate și a acizilor biliari în ser cresc și unele enzime cum sunt : fosfataza alcalină, GGT, 5-nucleotidaza (5-NT) și leucinaminopeptidaza (LAP).

Importanță diagnostică prezintă fosfataza alcalină și GGT care prezintă creșteri și când valoarea bilirubinei este normală. Dar fosfataza alcalină poate crește și în bolile osoase precum și în bolile

34

intestinului. Din acest motiv, ori de câte ori se observă o creștere a fosfatazei alcaline, fără semne clinice, trebuie determinate izoenzimele sale. Când crește fosfataza alcalină și este însoțită și de o creștere a GGT, se poate afirma existența unui proces colestatic.

Nivelul GGT nu crește în maladiile osoase. În sindroamele colecistice GGT crește de 10-50 ori față de normal, iar fosfataza alcalină de 3-10 ori.

Trebuie subliat faptul că determinările GGT nu pot face diferențierile între colestaza intrahepatică și cea extrahepatică.

Creșterea izolată a GGT sugerează un alcoolism cronic. Dar această creștere se poate produce și după tratament prelungit cu antidepresive sau anticonvulsivante.

Leziunile toxice ale ficatului pot duce și ele la creșteri importante ale GGT. În intoxicațiile cu solvenți organici alături de creșteri ale AST, ALT, LDH crește și GGT.

Bolile pancreasului

În bolile pancreasului se urmăresc în primul rând creșterile α-amilazei și lipazei, care survin în pancreatita acută și în puseurile acute ale pancreatitei cronice. Creșterea α-amilazei are loc la 3-6 ore de la debutul pancreatitei acute și atinge valori maxime după 20-30 ore, când poate depăși de 10 ori limita superioară. O necroză extinsă a pancreasului duce la creșteri de 40 de ori valoarea normală. Datorită eliminării prin urină a acestei enzime, valorile normale în ser revin după 48-72 ore. Din acest motiv determinările activității α-amilazei în urină sunt superioare ca valoare diagnostică determinărilor efectuate pe ser. Trebuie avut în vedere că activitatea serică a amilazei poate fi datorată și amilazei provenite din glandele salivare.

Parotidele se însoțesc de creșteri importante ale α-amilazei. În aceste situații cele două izoenzime se diferențiază prin separări electroforetice sau prin absorbția pe schimbători de ioni.

În pancreatita cronică și în carcinomul pancreatic α-amilaza crește doar în cursul unor pusee.

35

Pancreatita cronică are un caracter lent progresiv și poate ajunge cu timpul la insuficiență pancreatică. În astfel de situații α-amilaza ar trebui să scadă, dar aceste scăderi nu au importanță diagnostică deoarece 2/3 din α-amilaza serică este provenită din glandele salivare. Din acest motiv o scădere a amilazei pancreatice influențează în mică măsură valoarea amilazei totale serice.

Boli ale musculaturii

Distrofiile musculare sunt însoțite de creșteri ale CK, aldolazei, transaminazelor și LDH. Leziunile traumatice ale musculaturii (după accidente sau intervenții chirurgicale) dau modificări ale CK, transaminazelor, LDH și aldolazei.

În cazul de debut al distrofiilor musculare progresive, când manifestările locomotorii sunt încă diminuate se constată creșteri ale CK și ale aldolazei. Când boala progresează și musculatura este înlocuită cu țesut conjunctiv și grăsime, nivelul enzimelor serice scade.

În patologia musculară se mai determină mioglobina, miozina și creatinina care cresc în miopatii.

Boli ale oaselor

Când se poate exclude pe baze clinice o afecțiune hepatobiliară, fosfataza alcalină reflectă starea funcțională a osteoblastilor.

Fosfataza alcalină este crescută în afecțiunile osoase care evoluează cu reacție osteoblastică. În rahitism au loc creșteri importante ale fosfatazei alcaline. Valori crescute se mai întâlnesc în hiperparatiroidism primar sau secundar, când s-a ajuns la afectarea oaselor. În hiperparatiroidismul primar (adenom al parotidelor) decalcifierea oaselor este însoțită de hipercalcemie și hipofosfatemie,

În boala Paget (osteodistrofia deformantă) nivelul calcemiei este normal deoarece calciul rezultat din procesele de osteoliză dintr-o zonă, este reutilizat într-o altă zonă în osteogeneză. Din acest motiv determinarea fosfatazei alcaline este foarte importantă pentru

36

punerea diagnosticului. Creșterea fosfatazei alcaline la un bolnav cu o afecțiune neoplazică poate sugera dezvoltarea metastazelor osoase.

Neoplazii

Diagnosticarea sigură a tumorilor maligne pe baza determinărilor enzimatice nu poate fi efectuată. Interpretarea însă în lumina datelor clinice poate fi de ajutor în problemele de diagnostic.

Creșterea LDH constantă în 40-90% din cazuri cu tumori maligne, este o modificare nespecifică, întâlnindu-se și în numeroase alte afecțiuni: infarct, hepatită, anemie de tip Biermer.

Metastazele în ficat produc creșteri ale transaminazelor, al LDH, glutamatdehidrogenazei (GLDH), iar fosfataza alcalină crește mai mult decât ar putea explica eventuala retenție biliară. Astfel de manifestări la un bolnav cu carcinom gastric, pancreatic sau intestinal sugerează apariția metastazelor hepatice.

Carcinomul pancreatic produce creșteri ale amilazemiei doar în 50% din cazuri.

Carcinomul de prostată produce creșteri ale fosfatazei acide tartrat-inhibată în 80% din cazuri, de asemenea crește și GGT.

Carcinoamele mamare cu metastaze în oase și ficat se însoțesc și ele de creșteri ale fosfatazei acide.

Importanța enzimelor pentru organismul uman

37

Sunt proteine sau proteide fără de care celule vii nu pot înfăptui reacţii complexe într-un timp scurt, la temperatura mediului înconjurător. Enzimele numite şi fermenţi, sunt substanţe naturale produse doar de către celulele vii. Ele intervin în numeroase reacţii biochimice, îndeplinind rolul de biocatalizatori. Activitatea enzimatică este una dintre însuşirile esenţiale ale materiei vii.

 Ele sunt substanţe care catalizează reacţiile biochimice din organism, având un rol esenţial în biosinteza şi degradarea substanţelor din materia vie, întâlnindu-se în toate organismele animale, vegetale şi în microorganisme, mai fiind denumite din această cauză biocatalizatori. Fără enzime, procesele biochimice s-ar desfăşura cu viteze foarte mici.

 Conform teoriei chimice, catalizatorul este o substanţă care grăbeşte desfăşurarea unei reacţii, fără să se modifice structural în timpul desfăşurării acesteia şi fără să se regăsească în produsul final al reacţiei respective. În lipsa catalizatorului, oricum reacţia ar putea avea loc, însă într-un timp mai îndelungat. Aplicată sistemelor vii, teoria catalizatorului, are o conotaţie deosebită, căci reacţiile biochimice întârziate, care teoretic pot avea loc şi în lipsa enzimelor, nu sunt compatibile cu viaţa.

Dacă degradările şi sintezele celulare s-ar desfăşura mult încetinit, celulele s-ar sufoca şi îneca în propriile deşeuri iar nutriţia celulară ar fi blocată, ceea ce ar conduce la moartea lor.

 Enzime endogeneÎn corpul omului, se produc în fiecare secundă, mii şi mii de

enzime. Orice deficit enzimatic este resimţit destul de dur de către organism.

 Există două mari categorii de enzime endogene: - enzimele digestive = descompun proteinele, carbohidrații și

grăsimile în alimente. Enzimele digestive sunt, de asemenea, responsabile cu extragerea, asimilarea, metabolizarea și absorbția substanțelor nutritive, a vitaminelor și amineralelor.

 - enzime metabolice = acționează pe post de catalizatori la creșterea oaselor, refacerea țesuturilor, reglarea metabolismului, vorbire, respirație, reproducere, auz și contracția oricărui mușchi. Aceste enzime metabolice se găsesc în mod natural în biochimia

38

organismului nostru. Totuși, pe măsură ce îmbătrânim, activitatea enzimelor metabolice slăbește.

Toate enzimele digestive sunt extracelulare ( sunt eliberate şi acţionează în afara celulei ). Fermenţii metabolici pot fi atât intracelulari, cât şi interstiţiali.

Enzime exogene Multe din enzimele produse de vieţuitoarele aflate în diverse

stadii ale evoluţiei, acţionează, dacă sunt introduse în corp, asupra organismului uman. Această acţiune poate fi directă ( enzimele participă la reacţiile metabolice sau în altfel de reacţii, ca biocatalizatori ) sau indirectă ( enzimele exogene nu se comportă în organismul uman ca fermenţi, dar prezintă un alt tip de acţiune fiziologică ). Din acest motiv, enzimele produse de către microorganisme, de către plante sau de către animale, au fost valorificate din cele mai vechi timpuri de către om. Pe baza lor s-au obţinut atât produse de fermentaţie ( băuturi alcoolice, murături, lactate, etc. ), cât şi stimulente digestive şi metabolice.

Enzimele determină digestia, detoxifierea, imunitatea şi toate celelalte procese metabolice şi regeneratoare. Enzimele, întâlnite în toate organismele vii, sunt molecule de proteine care digeră hrana, descompunând-o în fragmente suficient de mici încât să treacă în sânge prin porii minusculi ai intestinelor. Ele reprezintă „clasă muncitoare“ a organismului. Pe lângă acţiunea de digerare a hranei, enzimele distrug toxinele, descompun grăsimile şi celuloza, şi metabolizează amidonul şi proteinele. Oamenii de ştiinţă au identificat peste 2500 de enzime diferite în corpul uman.

Enzimele sunt implicate în orice funcție biochimică și fiziologică. Fiecare acțiune a noastră în calitate de ființe vii necesită enzime. Toate procesele vieții sunt formate dintr-o rețea complex de reacții chimice cunoscute sub denumirea de metabolism. Enzimele sunt chiar catalizatorii care fac posibil metabolismul. Deci catalizatorul, enzimele în cazul oamenilor, reprezintă materialul biochimic ce determina reacţiile chimice necesare pentru că viaţa să fie posibilă. Aşadar, fără enzime, am înceta să existăm.

În cazul în care avem o activitate scăzută a enzimelor, putem să ne confruntăm cu niște afecțiuni destul de severe.

39

Dr. Anthony Cichoke, în cartea sa ‚‚Enzimele și terapia cu enzime’’, nu contenește să arate importanța enzimelor prntru specia umană. El afirma că organismele noastre depind de enzime pentru a gândi, respire, vorbi, digera mâncarea și a funcționa la capacitate optimă. Pentru ca organismul să funcționeze în cea mai bună stare, să învingă bolile și să refacă celulele afectate, este necesar ca enzimele să fie vii și în cantitate mare. Enzimele ne refac organismul, îl apără și îl susțin.

Activitatea scăzută a enzimelor este poate cea mai răspândită problemă în zilele noastre. O viață trepidantă, îndreptată spre performanță, acompaniată de mâncarea de tip fast - food are ca rezultat o populație practic lipsită de enzime digestive. Implicațiile sunt multiple și grave. Totuși, sunt reversibile și pot fi corectate.

40

Bibliografie

1. Prof. Univ. Dr. Denisa Mihele – Biochimie clinică, Ed.Medicală, București-2001

2. Prof.dr. Băbeanu Ileana Cristina – Biochimie Manual pentru învățământul la distanță, Craiova-2010

3. Dinu V, Truția E, Popa Cristea E, Popescu A – Biochimie medicală,Ed.Medicală-1998

4. Dobjanschi Luciana – Biochimie Medicală -internet

41