mycotoxin technical manual (romv2 - jan 12) low res

R-Biopharm Rhône

MicotoxineManual Tehnic

GB0

2/V1

2R-Biopharm Rhône – Mycotoxine Manual Technic

3

Acesata publicatie nu poate fi reprodusa, salvata intr-un program pentru a fi copiata, sau transmisa in orice fel: electronic, mecanic, fotocopiat, inregistrat etc, fara permisiunea editorului (R-Biopharm Rhône Ltd, Block 10, Todd Campus, West of Scotland Science Park, Acre Road, Glasgow, Scotland, G20 0XA).

Limita de incredere/ Garantie:Autorul a depus eforturi mojore in pregatirea acestui manual, dar nu garanteaza in totalitate acuratetea sau completitudinea continutului si nu-si asuma responsabilitatea pentru eventuale erori. Reprezentantii de vanzari nu ofera garantie materialelor scrise. Sfaturile si strategiile continute nu pot fii indeplinite in fiecare situatie; ar trebui consultat un profesionist in asemenea cazuri. Autorul nu poate fi condamnat pentru orice costuri sau daune comerciale, incluzand incidente sau alte daune.

Pentru informatii generale despre produse si servici sau suport tehnic, va rog sa ne contactati:

Sau distribuitorul:Diamedix Impex SAStr. Intrarea Sectorului nr. 20Bucuresti

Tel/Fax: 021/66.888.66/ 67 / 68 / 69 / 70Mobil: [email protected]


Continutul

1. Micotoxine - Introducere 5

2. Testarea Micotoxinelor 62.1 Legislatie 62.2 Prelevarea probelor 62.3 Detectia micotoxinelor 72.4 Principiul coloanelelor de imunoafinitate 72.5 Principiul derivatizarii 82.6 Derivatizarea aflatoxinelor 82.7 Produse disponibile la R-Biopharm Rhône 9

3. Introducere la Terminologia Utilizata in Detectia Micotoxinelor 10 3.1 Prescurtari utilizate in detectia micotoxinelor 103.2 Nivelul micotoxinelor 103.3 Greutate 113.4 Volum 113.5 Dilutii 12

4. Manipularea Micotoxinelor 134.1 Risc 134.2 Decontaminare 13

5. Curbe de Calibrare 145.1 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia aflatoxinelor 155.2 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia deoxinivalenolului 165.3 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia fumonisinelor 175.4 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia ochratoxinei 175.5 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia toxinelor T-2 si HT-2 185.6 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia zearalenonei 18

6. Cum Se Fortifica O Proba 19

7. Raportarea Rezultatelor 20

8. Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente 218.1 AFLAPREP® – Un exemplu 228.2 DONPREP® – Un exemplu 228.3 EASI-EXTRACT® AFLATOXIN – Un exemplu 228.4 EASI-EXTRACT® T-2 & HT-2 – Un exemplu 228.5 EASI-EXTRACT® ZEARALENONE – Un exemplu 238.6 FUMONIPREP® – Un exemplu 238.7 OCHRAPREP® – Un exemplu 23

9. Validarea unei Metode 249.1 Precizia 249.2 Repetabilitatea (r) 249.3 Reproductibilitatea (R) 24

10. Imbunatatirea Recuperarii 25

11. Imbunatatirea Cromatogramelor 2611.1 Zgomot de fundal crescut 2611.2 Contaminarea fazei mobile 2611.3 Contaminarea de la pompa 2611.4 Reproductibilitatea scazuta a ariei varfurilor 2611.5 Extinderea si impartirea varfurilor 2611.6 Varfuri fantoma 27

12. Probleme la HPLC 2812.1 Introducere 2812.2 Cand se ajusteaza faza mobila 2912.3 Solventi si faza mobila 3012.4 Pompa 3112.5 Coloana si incalzirea coloanei 3312.6 Detector 3312.7 Indepartarea bulelor din celula de detectie 3512.8 Curatarea celulei de detectie fara dezasamblare 3512.9 Prevenirea bulelor de aer 3612.10 Mentenanta detectorilor de fluorescenta 36

13. Glosar 37

5

Micotoxine - Introducere

Micotoxinele sunt compusi chimici produse de anumiti fungi. Producerea are loc in anumite conditii de umiditate si temperatura si sunt in general asociate cu recolta contaminata cu mucegaiuri. Nu toti fungii produc mucegaiuri; chiar si aceia care produc micotoxine se intampla sa nu le produca uneori.

Exista multe micotoxine, dar numai o parte din ele se gasesc in alimente si furaje. Majoritatea micotoxinelor sunt stabile din punct de vedere chimic lucru care le permite supravietuirea in timpul depozitarii si procesarii la temperaturi inalte, sau la inghet. Cele care apar in alimente au un impact major asupra sanatatii oamenilor si pot cauza pierderi economice semnificative in agricultura sau in cresterea animalelor.

Micotoxinele sunt responsabile de o multime de efecte toxice datorita structurilor chimice diferite. Efectele acute apar in urma consumarii alimentelor puternic contaminate si aceste incidente apar in special in tari slab dezvoltate unde controlul toxinelor este limitat. Efectele cronice sunt cauzate de acumulari ale toxinelor in organism de-a lungul unei perioade de timp indelungate si pot dauna sanatatii populatiei. O parte din cele mai cunoscute micotoxine sunt cencerigene, genotoxice sau pot afecta rinichii, ficatul sau sistemul imunitar.

1


Testarea Micotoxinelor

2.1 Legislatie

Legislatia pentru micotoxine este in continua schimbare in ceea ce priveste modul de prelevare a probelor, metoda de testare si precizia rezultatelor. Numarul de produse si micotoxine acoperite de legislatia EU este in continua crestere.

2.2 Prelevarea probelor

Micotoxinele sunt distribuite heterogen in produsele contaminate. Principalul scop al prelevarii este obtinerea unei probe reprezentative pentru lotul din care a fost recoltata. Pentru a obtine o proba reprezentativa este recomandata prelevarea unui numar mare de probe de greutate mica ca in imaginea de mai jos.

Acestea sunt cateva din sursele de variatie atunci cand se preleveaza o proba pentru analiza micotoxinelor:• Prelevarea si sub-prelevarea• Pregatirea probei• Analiza

Pentru mai multe informatii cu privire la planul de prelevare: http://eur-lex.europa.eu/en/index.htm.Exista si un “Sampling Advice booklet for Mycotoxins” disponibil la Food Standards Agency in UK, care pune la dispozitie un ghid simplu pentru prelevarea probelor de cereale, fructe uscate, nuci, condimente, cafea, sucuri de fructe si vin si informatii despre inregistrarea si interpretarea rezultatelor.

Numar Mic de Probe = Variatie Mare

Numar Mare de Probe = Variatie Mica

Fotografiile cu modul de prelevare au fost furnizate de catre:Kim EsbensenApplied Chemometrics, Analytical Chemistry, Applied Biotechnology, Bioenergy & Sampling Research Group,University of Aalborg Esbjerg, Denmark

2

7


2.3 Detectia micotoxinelor

Cantitatile de micotoxine din alimente sunt mici, de aceea identificarea si cuantificarea lor necesita prelevare sofisticata, pregatire, extractie si tehnici de analiza precum:• Cromatografie lichida de inalta presiune (HPLC)• Imunoanaliza (ELISA)• Lateral Flow (Teste Rapide Imunocromatografice)• Carduri cu membrana• Spectroscopia de masa (MS)• Cromatografia in strat subtire (CSS)• Cromatografia de Gaz (GC)• LC-MS/MS

2.4 Principiul coloanelelor de imunoafinitate

Coloanele de imunoafinitate R-Biopharm Rhône contin anticorpi monoclonali legati de un suport solid. Utilizarea anticorpilor monoclonali fac testul foarte specific pentru micotoxina tinta si

ofera sensibilitate imbunatatita. Coloanele de imunoafinitate au avantajul ca pot fi utilizate pentru analiza multor matrici.

Dupa extractia cu solventul corespunzator, diluare si filtrare, proba este trecuta prin coloana de imunoafinitate. Toxina prezenta in proba se va lega de anticorpul din coloana de imunoafinitate. Coloana se spala cu PBS sau apa si toxina este eliberata folosind solventul necesar. Eluatul poate fi analizat cu ajutorul sistemului HPLC. Extractia si curatarea dureaza aprox. 30 minute.

Produsele R-Biopharm Rhône sunt dezvoltate, fabricate, testate si expediate sub Sistemul de Management al Calitatii ISO 9001 si ISO 13485, garantand un produs sigur care indeplineste specificatiile de performanta.

SAMPLE WASHING ELUTION

The sample extract (containing the toxin) is

passed through the column

The antibody isolates and concentrates the toxin and

retains it in the column

Passage of pure methanol through the column

denatures the antibody and releases the toxin

2

Proba Spalare Elute

Extrasul probei (continand toxina) este trecut prin coloana.

Anticorpii izoleaza si concentreaza toxina si o retin in coloana.

Trecerea prin coloana a metanol 100 % denatureaza anticorpul si elibereaza toxina.

Micotoxine Alte Materiale



2.5 Principiul derivatizarii

Unele toxine nu au florescenta naturala si de aceea necesita o derivatizarea inainte de injectia in sistemul HPLC. Derivatizare este tehnica care transforma compusul chimic intr-un produs similar din punct de vedere al structurii chimice pentru a permite detectia. In general, in timpul derivatizarii este tintit un grup functional specific din compus. Compusul chimic rezultat este mai usor de detectat si poate fi utilizat pentru cuantificare.

2.6 Derivatizarea aflatoxinelor Atunci cand se testeaza aflatoxinele, doar aflatoxina B2 si aflatoxina G2 prezinta lumina fluorescenta in UV si pot fi usor detectate de HPLC cu un detector de fluorescenta. Aflatoxinele B1 si G1 nu au florescenta asa puternica si de aceea trebuie derivatizate. KOBRA® CELL este un sistem unic de derivatizare pentru aflatoxine. Este o celula electrochimica compusa dintr-un electrod de platina si un electrod din otel inoxidabil auxiliar. Aceste straturi sunt prinse intre 2 suporti din

plastic. KOBRA® CELL este fixata intre coloana si detector si genereaza agentul de derivatizare, bromura, in concordanta cu bromura de potasiu si acidul nitric prezenti in faza mobila. Rezultatul derivatizarii este cresterea semnalului florescent ale aflatoxinelor B1 si G1 permitand o detectie imbunatatita folosind detectorul de fluorescenta.

2

Derivatizare fara KOBRA® CELL Derivatizare cu KOBRA® CELL

9

2 Testarea Micotoxinelor

2.7 Produse disponibile la R-Biopharm Rhône

Coloane de imunoafinitate pentru analiza cantitativa a una sau mai multe micotoxine prin HPLC :• AflatoxineleB1,B2,G1siG2• AflatoxinaM1• Deoxinivalenol• FumonisinaB1,B2siB3• OchratoxinaA• T-2siHT-2• Zearalenona

Standarde si materiale de referinta:R-Biopharm Rhône produce o serie de standarde de micotoxine pentru utilizarea cu sistemul HPLC si un numar mare de materiale de referinta.

KOBRA® CELL pentru derivatizarea aflatoxinelor B1 si G1:Singura celula electrochimica recomandata de standarde CE si utilizata de clienti importanti (IISPV, DSVSA Constanta, DSVSA Bucuresti, DSVSA Timis, etc.), producatori de alimente si laboratoare guvernamentale din toata lumea.

Alte produse:R-Biopharm Rhône va pune la dispozitie si o serie de teste rapide si kituri ELISA pentru determinarea micotoxinelor.


3 Introducere la terminologia utilizata in detectia micotoxinelor

3.1 Prescurtari utilizate in detectia micotoxinelor

µ micro

n nano

m mili

L litru

g gram

ppb parti per bilion

ppm parti per milion

ppt parti per trilion

IAC coloane de imunoafinitate

dH2O apa distilata/deionizata

MeOH metanol

ACN acetonitril

PBS tampon salin

AA acid acetic

r repetabilitate

R reproductibilitate

3.2 Nivelul micotoxinelor

Atunci cand se vorbeste de micotoxine se utilizeaza “parti per” lucru care ajuta la descrierea unei portii de valoare in cantitati masurabile. Cele mai utilizate sunt ppm, ppb si ppt.

Parti per milion:

1 parte per 1,000,000 parti sau o parte in 10 la puterea a 6-a g / ml = mg / µl µg / ml = mg / L µg / g = µg / ml = ng / mg 1 g in 1.000 g or 1 kg = 1,000 ppm

Ex. : daca avem 1mg/g acest lucru reprezinta 1,000 x µg/g = 1,000 ppm

Parti per bilion:

1 parte per 1,000,000,000 parti sau o parte in 10 la puterea a 9-a µg / L = ng / ml ng / g = µg / kg 1 µg in 1,000 g or 1 kg = 1 ppb

Pentru transformare:

1 ppm = 1,000 ppb = 1,000,000 ppt 0.001 ppm = 1 ppb = 1,000 ppt 0.000001 ppm = 0.001 ppb = 1 ppt 1 ppm = 1,000,000 ppt

Sumar:

ppm --> ppb --> ppt (fiecare diferenta are factorul 1,000)

11

Introducere la terminologia utilizata in detectia micotoxinelor

3.4 Volum

Litrul este unitatea de volum cel mai des utilizata pentru a masura un material lichid.

Pentru a transforma litri in mililitri:

1 L = 1,000 ml (L x 1,000 = ml)

1 ml = 0.001 L (ml / 1,000 = L)

Pentru a transforma litru in microlitru:

1 L = 1,000,000 µl (L x 1,000,000 = µl)

1 µl = 0.00001 L (µl / 1,000,000 = L)

Pentru a tranforma mililitri la microlitri:

1 ml = 1,000 µl (ml x 1,000 = µl)

1 µl = 0.001 ml (µl / 1,000 = ml)

Sumar:

L --> ml --> µl (fiecare diferenta are factorul 1,000)

3

3.3 Greutate

Gramul este o unitate a masei si este cea mai utili-zata unitate de masurare pentru materiale solide.

Pentru a transforma grame si miligrame:

1 g = 1,000 mg (g x 1,000 = mg)

1 mg = 0.001 g (mg / 1,000 = g)

Pentru a transforma grame si micrograme:

1 g = 1,000,000 µg (g x 1,000,000 = µg)

1 g = 0.00001 g (g / 1,000,000 = g)

Pentru a transforma grame si nanograme:

1 g = 1,000,000,000 ng (g x 1,000,000,000 = ng)

1 ng = 0.000000001 g (ng / 1,000,000,000 =g)

Pentru a transforma miligrame la micrograme:

1 mg = 1,000 µg (mg x 1,000 = µg)

1 g = 0.001 mg (g / 1,000 = mg)

Pentru a transforma miligrame la nanograme:

1 mg = 1,000,000 ng (mg x 1,000,000 = ng)

1 ng = 0.000001 mg (ng / 1,000,000 = mg)

Pentru a transforma micrograme la nanograme:

1 g = 1,000 ng (g x 1,000 = ng)

1 ng = 0.001 µg (ng / 1,000 = µg)

Sumar:

g --> mg --> µg --> ng (fiecare diferenta are factorul 1,000)


Introducere la terminologia utilizata in detectia micotoxinelor

3.5 Dilutii

Urmatoarele exemple sunt pentru pregatirea solutiilor pentru testarea micotoxinelor:

1 % Solutie Bicarbonat de Sodiu 1 g bicarbonat de sodiu in 100 ml apa.

2 % Solutie Bicarbonat de Sodiu2 g bicarbonat de sodiu in 100ml apa.

60 % Metanol 60 ml metanol plus 40 ml apa.

80 % Metanol80 ml metanol plus 20 ml apa.

2 % Acid Acetic 98 % Metanol2 ml acid acetic plus 98 ml metanol.

1 in Dilutie 2 sau Dublul Dilutiei sau Dilutii Seriale

Se poate folosii tehnica dilutiilor seriale pentru a obtine solutiile si este folosita in mod normal in efectuarea curbelor de calibrare. Spre exemplu:

• Eprubeta 1 contine 2 ml metanol 100 %. Se ia 1 ml si se adauga in eprubeta 2.

• Eprubeta 2 contine 1 ml apa plus 1 ml metanol 100 % din eprubeta 1. Acum are 50 % metanol. Se ia 1 ml si se adauga in eprubeta 3.

• Eprubeta 3 contine 1 ml apa plus 1 ml metanol 50 % din eprubeta 2. Acum are 25 % metanol. Se ia 1 ml si se adauga in eprubeta 4.

• Eprubeta 4 contine 1 ml apa plus 1 ml metanol 25 %. Acum are 12.5 % metanol.

3

13

Manipularea Micotoxinelor

4.1 Risc

Micotoxinele sunt substante de mare risc. Aceste analize pot fi efectuate doar de laboratoare bine instruite. Trebuie sa se foloseasca halate corespunzatoare, manusi din plastic, ochelari de protectie.

Coloanele contin 0.01 % v/v timerosal. In caz ca o picatura cade pe piele sau ajunge in ochi este recomandata spalarea imediata cu cantitati mari de apa.

4.2 Decontaminare

Toate materialele utilizate trebuie decontaminate prin imersarea 30 minute in solutie de hipoclorit de sodiu (aprox. 5 %) urmata de adaugarea de acetona 5 % timp de 30 minute. Apoi se efectueaza spalarea normala.

4


Curbe de Calibrare

Curba de calibrare este utilizata pentru determinarea concentratiei unei substante dintr-o proba necunoscuta comparand necunoscutul la un set de probe standard de concentratii cunoscute.

Curba de calibrare este un grafic dupa raspunsul aparatului, asa numitul “semnal analitic”, care se schimba in functie de schimbarea concentratiei analitului. Sunt pregatite o serie de standarde de concentratii diferite, de preferat prin dilutie seriala, cu concentratia standardului din mijloc asemanatoare cu concentratia de interes. Analizarea fiecarui standard folosind tehnica potrivita va produce o serie de citiri. Pentru majoritatea analizelor, un grafic de raspuns versus concentratie va crea o relatie liniara. Raspunsul necunoscutului poate fi masurat utilizand caurba de calibrare.

Curba de calibrare ar trebui sa fie liniara si deviatia acestei drepte sa dea o indicatie asupra preciziei rezultatului. Ex. O corelatie de >98 % va indica ca toate standardele formeaza o dreapta si ofera un rezultat destul de sigur. Cu o corelatie <98 % rezultatele nu vor fi asa de sigure.

Pentru efectuarea unei curbe trebuie sa se urmareasca urmatorii factori:• Este recomandat crearea unei curbe din 3 - 6 puncte.• Construirea unei curbe trebuie facuta astfel incat concentratia tinta sa fie cuprinsa la mijlocul curbei

5

15

Curbe de Calibrare

5.1 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia aflatoxinelor

• Se iau 5 ml metanol si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se iau 400 µl.• Se adauga 400 µl de standard de aflatoxine 1,000 ng/ml pentru a obtine o concnetratie de 80 ng/ml.

Standard 4 HPLC• Se iau 2.5 ml solutie 80 ng/ml si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2.5 ml apa pentru a obtine un standard de 40 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 1 ng per aflatoxina (4 ng total) per 100 μl injectie.

Standard 3 HPLC• Se iau 2.5 ml standard 4 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2.5 ml 50 % metanol pentru a obtine un standard de 20 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 0.5 ng per aflatoxina (2 ng total) per 100 μl injectie.

Standard 2 HPLC• Se iau 2.5 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2.5 ml 50 % metanol pentru a obtine un standard de 10 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 0.25 ng per aflatoxina (1 ng total) per 100 μl injectie.

Standard 1 HPLC• Se iau 2.5 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2.5 ml 50 % metanol pentru a obtine un standard de 5 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 0.125 ng per aflatoxina (0.5 ng total) per 100 μl injectie.

5


Curbe de Calibrare

5.2 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia DON

Diluent – metanol : apa – 9.5 : 90.5.

Standard 5 HPLC• Se iau 5 ml diluent si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se iau 400 µl.• Se adauga 400 µl de solutie DON 50 µg/ml pentru a obtine 4 μg/ml (4 ppm = 4,000 ng/ml) standard.• Acesta este echivalent cu 400 ng per 100 μl injectie.

Standard 4 HPLC• Se iau 2 ml standard 5 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 25 ml diluent pentru a obtine un standard de 2 μg/ml (2 ppm = 2,000 ng/ml).• Acesta este echivalent cu 200 ng per 100 μl injectie.

Standard 3 HPLC• Se iau 2 ml standard 4 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2 ml diluent pentru a obtine un standard de 1 μg/ml (1 ppm = 1,000 ng/ml).• Acesta este echivalent cu 100 ng per 100 μl injectie.

Standard 2 HPLC• Se iau 2 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2 ml diluent pentru a obtine un standard de 0.5 μg/ml (0.5 ppm = 500 ng/ml).• Acesta este echivalent cu 50 ng per 100 μl injectie.

Standard 1 HPLC• Se iau 2 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2 ml diluent pentru a obtine un standard de 0.25 μg/ml (0.25 ppm = 250 ng/ml).• Acesta este echivalent cu 25 ng per 100 μl injectie.

5

17

Curbe de Calibrare

5.3 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia fumonisinelor

• Se iau 7.5 ml 1 : 1 : 2 acetonitril : metanol : apa si se pun intr-o eprubeta de 10 ml.• Se iau 200 µl.• Se adauga 200 µl de standard de fumonisin 150,000 ng/ml pentru a obtine o colutie de 4,000 ng/ml.

Standard 3 HPLC• Se iau 500 µl solutie 4,000 ng/ml si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 1.5ml 50 % metanol pentru a obtine un standard de 1,000ng/ml.• Acesta este echivalent cu 100 ng per 100 μl injectie.

Standard 2 HPLC• Se iau 1 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 1 ml 50 % metanol pentru a obtine un standard de 500 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 50 ng per 100 μl injectie.

Standard 1 HPLC• Se iau 1 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 1 ml 50 % metanol pentru a obtine un standard de 250 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 25 ng per 100 μl injectie.

5.4 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia ochratoxinei

• Se iau 5 ml 100 % metanol se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se iau 500 µl.• Se adauga 500 µl de standard de ochratoxina 1,000 ng/ml pentru a obtine o solutie de 100 ng/ml.

Standard 4 HPLC• Se iau 100 µl solutie 100 ng/ml si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 1.4 ml acid acetic : metanol 2 %.• Se adauga 1.5ml apa pentru a obtine 3.33 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 0.33 ng per 100 μl injectie.

Standard 3 HPLC• Se iau 1.5 ml standard 4 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 750 µl acid acetic : metanol 2 %.• Se adauga 750 µl apa pentru a obtine 1.67 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 0.167 ng per 100 μl injectie.

Standard 2 HPLC• Se iau 1.5 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 750 µl acid acetic : metanol 2 %.• Se adauga 750 µl apa pentru a obtine 0.833 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 0.0833 ng per 100 μl injectie.

Standard 1 HPLC• Se iau 1.5 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 750 µl acid acetic : metanol 2%.• Se adauga 750 µl apa pentru a obtine 0.416 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 0.0416 ng per 100 μl injectie.

5


Curbe de Calibrare

5.5 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia toxinelor T-2 si HT-2

Standard 3 HPLC• 30 µl solutie standard T-2 & HT-2 de 10 µg/ml se pun intr-o eprubeta.• Se evapora, se derivatizeaza conform IFU. Se reconstituie in 2 ml faza mobila pentru a obtine un standard de 15 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 15 ng per 100 μl injectie.

Standard 2 HPLC• Se iau 1 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 1 ml faza mobila pentru a obtine un standard de 75 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 7.5 ng per 100 μl injectie.

Standard 1 HPLC• Se ia 1 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 1 ml faza mobila pentru a obtine un standard de 37.5 ng/ml.• Acesta este echivalent cu 3.75 ng per 100 μl injectie.

5.6 Un exemplu de curba de calibrare pentru detectia zearalenonei

• Se iau 3 ml acetonitril si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se iau 1.8 ml.• Se adauga 1.8 ml standard de zearalenona de 1,000 ng/ml pentru a obtine o solutie de 600 ng/ml.

Standard 4 HPLC• Se iau 2 ml solutie 600 ng/ml si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2 ml apa pentru a obtine 300 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 30 ng per 100 μl injectie.

Standard 3 HPLC• Se iau 2 ml standard 4 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2 ml 50 % acetonitril pentru a obtine 150 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 15 ng per 100 μl injectie.

Standard 2 HPLC• Se iau 2 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2 ml 50 % acetonitril pentru a obtine 75 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 7.5 ng per 100 μl injectie.

Standard 1 HPLC• Se iau 2 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta de 5 ml.• Se adauga 2ml 50 % acetonitril pentru a obtine 37.5 ng/ml standard.• Acesta este echivalent cu 3.75 ng per 100 μl injectie.

5

19

Cum Se Fortifica O Proba

R-Biopharm Rhône va pune la dispozitie o serie de materiale de referinta. Puteti fortifica o proba urmand urmatoarea procedura:

C1 x V1 = C2 x V2

C1 = Concentratia standardului utilizat pentru fortificare

V1 = Volumul standardului care se adauga in proba

C2 = Concentratia necesara a probei

V2 = Volumul necesar al probei

40 ml lapte fortificat la 25 ppt folosind standard de 40 ng/ml:

C1 x V1 = C2 x V2 40 ng / ml x V1 = 25 ppt (0.025 ppb) x 40 ml 40 ng / ml x V1 = 0.025 ng / ml x 40 ml 40 ng / ml x V1 = 1 ng V1 = 1 ng / 40 ng / ml V1 = 0.025 ml

25 g boia fortificata la 5 ppb folosind standard de 1,000 ng/ml:

C1 x V1 = C2 x V2 1,000 ng / ml x V1 = 5 ppb x 25 g 1,000 ng / ml x V1 = 5 ng / ml x 25 g 1,000 ng / ml x V1 = 125 ng V1 = 125 ng / 1,000 ng / ml V1 = 0.125 ml

5 g porumb fortificat la 2 ppm folosind standard de 1,000 ng/ml:

C1 x V1 = C2 x V2 1,000 ng / ml x V1 = 2 ppm (2,000 ppb) x 5 g 1,000 ng / ml x V1 = 2,000 ng / ml x 5 g 1,000 ng / ml x V1 = 10,000 ng V1 = 10,000 ng / 1,000 ng / ml V1 = 10 ml

Se cantareste proba blank cunoscuta. Se adauga volumul calculat de standard si se lasa la intuneric peste noapte.

Daca proba este contaminata natural va recomandam sa nu o fortificati. In caz ca trebuie s-o fortificati (ex. – teste FAPAS) va recomandam sa fortificati proba de 10 ori nivelul de contaminare.

6


Reportarea Rezultatelor7

Toate rezultatele trebuie raportate “parti per” si trebuie sa se tina cont de orice pierdere din timpul metodei pentru a raporta un rezultat corect. Va recomandam sa lucrati in paralel cu proba dvs. o proba de referinta de aceeasi natura cu proba dvs. si s-o treceti prin coloana de imunoafinitate. Recuperarea obtinuta cu proba fortificata poate fi utilizata pentru a corecta rezultatul obtinut pentru proba.

Ex.Valoarea probei de referinta este de 10 ppb, iar valoarea obtinuta de la HPLC este de 8 ppb. Asta inseamna o recuperare de 80 %. Pentru probele viitoare, similare cu standardul de referinta, puteti adauga 20 % la rezultat. Ex. Daca obtineti o valoare de 2 ppb si se stie ca recuperarea este de 80 %, se adauga la rezultat 20 % si inseamna ca proba are 2.5 ppb.

Legislatia in viguare afirma ca rezultatele sa fie acceptate, recuperarile trebuie sa intre in urmatoarele limite:

Produsele R-Biopharm Rhône sunt dezvoltate, fabricate, testate si expediate sub Sistemul de Management al Calitatii ISO 9001 si ISO 13485, garantand un produs sigur care indeplineste specificatiile CEN de recuperare cuprinse intre 70 -110 %.

Matrice Nivelul Total De Contaminare

Limita De Recuperare Acceptata

Toate Alimentele

<1.0 ppb 50 - 120 %

1 - 10 ppb 70 - 110 %

>10 ppb 80 - 110 %

21

Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente

Atunci cand se raporteaza un rezultat, acesta trebuie exprimat in “parti per”. Totusi, in majoritatea sistemelor HPLC rezultatul este exprimat in nanograme per injectie. De aceea, trebuie sa transformam nanograme in “parti per”. Pentru a face acest lucru trebuie sa stim echivalentul gramului din proba care a fost injectat in sistemul HPLC. De aici se poate calcula factorul de inmultire pentru a transforma nanograme per injectie in “parti per”.

Exemplu de rezultat HPLC:

Nr. Proba Numele Probei Timpul De Retentie

Minute G2 Fluorescenta

AriamV / *min

G2Fluorescenta

Inaltimea mV Fluorescenta

G2

Cantitatea Ng G2

Fluorescenta

1 STD 15 ng / ml

10.687 9.0839 18.98 0.2070

2 STD 210 ng / ml

10.340 11.7919 25.06 0.2687

3 STD 320 ng / ml

11.376 21.1858 42.71 0.4827

4 STD 440 ng / ml

10.987 43.6115 89.53 0.9937

5 unknown 10.139 5.1009 10.89 0.1162

6 unknown 9.998 4.2571 9.13 0.0970

Medie: 10.207 10.845 21.515 0.236

Dev. Std. Rel.: 6.222 % 127.789 % 125.188 % 127.789 %

In exemplul de mai sus s-au injectat 0.05 g proba care a produs o citire de 0.116 ng aflatoxina G2. Pentru a prezenta aceasta valoare ca ppb (nanograme per gram de proba) este necesar sa inmultim valoarea obtinuta pentru G2 (nanograme per 0.05 g proba injectat) cu un factor de 20 pentru a calcula cate nanograme ar fi prezente in 1 g proba. In acest caz, vom raporta contaminarea probei necunoscute ca 0.1162 x 20 = 2.324 ppb aflatoxina G2.

8


Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente

In urmatoarele paragrafe va sunt prezentate cateva exemple pentru determinarea factorului de inmultire pentru transformarea nanogramelor per injectie in parti per milion.

8.1 AFLAPREP® – Un exemplu

•50 g proba --> 500 ml tampon de extractie.•1 g proba <-- 10 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 2ml.•1 g proba --> 2ml.•0.05 g <-- 100 µl injectata in HPLC.

S-au injectat un total estimativ de proba de 0.05 g pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb, acest rezultat trebuie inmultit cu 20.

•1 ng / g = 1 ppb.•1 g / 0.05 g = factorul 20.•ng obtinute x 20 = ppb.

8.2 DONPREP® – Un exemplu •25 g proba --> 200 ml tampon de extractie.•0.25 g <-- 2 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 1.5 ml.•Se evapora la sec.•0.25 g proba --> se reconstituie in 1 ml.•0.025 g <-- 100 µl injectata in HPLC.


•1 ng / g = 1 ppb.•1 g / 0.025 g = 40.•ng obtinute x 40 = ppb.

8.3 EASI-EXTRACT® AFLATOXIN – Un exemplu •50 g proba <-- 100 ml tampon de extractie.•1 g proba <-- 2 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 3 ml.•1 g proba --> 3 ml.•0.033 g <-- 100 µl injectata in HPLC.



8.4 EASI-EXTRACT® T-2 & HT-2 – Un exemplu •25 g proba --> 200 ml tampon de extractie.•0.25 g <-- 2 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 1.5 ml.•Se evapora la sec.•0.25 g proba --> se reconstituie in 1 ml.•0.025 g <-- 100 µl injectata in HPLC.



8

23

8.5 EASI-EXTRACT® ZEARALENONE – Un exemplu •25 g proba --> 125 ml tampon de extractie.•4 g <-- 20 ml filtrat si diluat cu PBS.•1 g <-- 25 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 3 ml.•1 g proba --> 3 ml.•0.033 g <-- 100 µl injectata in HPLC.



8.6 FUMONIPREP® – Un exemplu

•25 g of sample --> 125 ml tampon de extractie.•2 g <-- 10 ml filtrat si adus la 50 ml.•2 g --> 50 ml.•0.4 g --> filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 3 ml.•0.4 g of proba --> 3 ml.•0.009 g <-- 70 µl proba pentru derivatizare.•0.009 g <-- 140 µl volum total dupa derivatizare.•0.006 g <-- 100 µl injectata in HPLC.

S-au injectat un total estimativ de proba de 0.006 g pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb, acest rezultat trebuie inmultit cu 166.67. •1 ng / g = 1 ppb.•1 g / 0.006 g = 166.67.•ng obtinute x 166.67 = ppb.

8.7 OCHRAPREP® – Un exemplu

Exemplul 1: •50 g proba --> 200 ml tampon de extractie.•1 g <-- 4 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 3 ml.•1 g proba --> 3 ml.•0.033 g <-- 100 µl injectata in HPLC.


•1 ng / g = 1 ppb.•1 g / 0.033 g = 30. •ng obtinute x 30 = ppb.

Exemplul 2:

•10 g proba --> 200 ml tampon de extractie.•0.25 g <-- 5 ml filtrat si trecut prin IAC.•Se elueaza in 3 ml.•0.25 g proba --> 3 ml.•0.0083 g <-- 100µl injectata in HPLC.


•1 ng / g = 1 ppb.•1 g / 0.0083 g = 40. •ng obtinute x 120 = ppb.

Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente8


Validarea Unei Metode

Pentru a valida o metoda este necesar utilizarea materialului de referinta pentru a determina recuperarea, precizia, repetabilitatea si reproductibilitatea. R-Biopharm Rhône recomanda utilizarea a minim 10 coloane pentru a valida o metoda.

9.1 Precizia

Precizia este calculata ca repetabilitate (r) si reproductibilitate (R).

9.2 Repetabilitatea (r)

Se exprima precizia sub aceleasi conditii de operare in decursul unui interval scurt de timp. Este astfel o masura de precizie utilizand:• Acelasi analist.• Acelasi aparat.• Timpi apropiati intre analizele replicatilor.• Aceiasi reactivi.• Acelasi laborator, etc.

Spre exemplu, validarea unei metode implica testarea a 10 coloane in aceasi zi.

9.3 Reproductibilitatea (R)

Exprima precizi dintre laboratoare diferite.Implica:• Analisti diferiti.• Laboratoare diferite.• Echipamente diferite.• Surse diferite de reactivi.

Spre exemplu, o validare implica testarea aceleiasi metode de catre mai multe laboratoare.

9

25

Imbunatatirea Recuperarii

Specificatiile CEN afirma ca recuperarile trebuie sa fie intre 70 - 110 %. Daca recuperarea dvs. este mai mica de 70 % va rugam sa urmati urmatorii pasi:

• Se verifica pH-ul probei, acesta ar trebui sa fie intre 7.0 – 7.8. Un pH in afara acestor limite poate afecta performantele anticorpului.

• Se verifica volumul trecut prin coloana. Trecerea probei prin coloana nu trebuie sa depaseasca 30 minute. Daca este necesar, se poate filtra sau centrifuga proba dupa dilutia cu PBS pentru a indeparta orice precipitat. Expunerea anticorpului la un volum scazut de solvent de-a lungul unei perioade lungi poate avea efecte adverse.

• Se verifica concentratia solventului care se trece prin coloana de imunoafinitate. Nu trebuie sa se depaseasca urmatoarele concentratii: • Aflatoxine metanol 30 % acetonitril 2.5 % • Ochratoxina acetonitril 5 % • Zearalenona acetonitril 15 % • Fumonisin metanol 5 % acetonitril 5 % • T-2 & HT-2 metanol 18 %

• Trebuie utilizate aplicatiile recomandate de catre producator pentru pregatirea probelor.

• Pentru aflatoxine se utilizeaza derivatizarea cu ajutorul KOBRA® CELL.

• Se utilizeaza standardele furnizate de catre R-Biopharm Rhône.

10


Imbunatatirea Cromatogramelor

11.1 Zgomot de fundal crescut

• Se opreste pompa.• Daca zgomotul dispare, pompa este cauza (sectiunea 12 sau contactati furnizorul sistemului HPLC).• Daca zgomotul persista, detectorul este cauza (sectiunea 12 sau contactati furnizorul sistemului HPLC).

11.2 Contaminarea fazei mobile

• Se mareste lungimea de unda a detectorului.• Daca curentul persista este o problema cu faza mobila.• Se pregateste faza mobila proaspata.

11.3 Contaminarea de la pompa

• Se indeparteaza instrumentul contaminat.• Daca linia de fundal se stabilizeaza, se curata instrumentul.

11.4 Reproductibilitatea scazuta a ariei varfurilor

• Daca reproductibilitatea timpului de retentie este normala nu este cauza pompei.• Cauza poate fi auto-sampler-ul.• Datorita deteriorarii probei.

11.5 Extinderea si impartirea varfurilor

Probleme cu rezolutia varfurilor indica:• Faza mobila necorespunzatoare (se ajusteaza faza mobila).• Deteriorarea coloanei.• Un tub infundat.• Injectarea excesiva a probei.

11

27

Imbunatatirea Cromatogramelor

11.6 Varfuri fantoma

Un varf fantoma este un varf care apare dintr-o injectie anterioara sau din cauza contaminarii aparatului sau a fazei mobile.

Cauza Metoda De Confirmare Ce Sa Facem

Contaminarea pompei sau a celorlalte componente din pompa

Se curata utilizand un acid sau solutie alcalinaAcid : acid nitric 4 - 6 NAlcalin : sodium hydroxide 5 - 10 %

Contaminarea fazei mobile Se folosesc solventi de puritate mai mare

Contaminarea auto-sampler-ului

Se urmaresc varfurile fantoma atunci cand se injecteaza faza mobila

Se curata echipamentul

11


Probleme La HPLC

12.1 Introducere

Criterii critice pentru o analiza HPLC de succes:

•Faza mobila corecta.•Coloana analitica si coloana “guard” in conditii bune (a se schimba la fiecare 2 - 3 luni).•Lampa detectorului in conditii bune (< 1000 ore de utilizare)

Odata ce conditiile analizei HPLC au fost optimizate urmatorul pas critic este pregatirea probei. Pentru a optimiza efectul de curatare prin coloana de imunoafinitate, toate probele trebuie analizate utilizand un protocol recomandat in manualul de aplicatii. Acest lucru este esential pentru probele cu un nivel mare de pigmenti ( condimente si fructe uscate).

Nota: R-Biopharm Rhône recomanda urmatoarea informatie ca ghid general in problemele cu sistemul HPLC. Pentru infromatii suplimentare va recomandam sa contactati producatorul HPLC-ului.

12

Stativ pentru solvent si rezervoare

Pompa

Auto-sampler

Cuptor de coloana si coloana

Detector

29

Probleme La HPLC

12.2 Cand se ajusteaza faza mobila

Trebuie sa se adauge mai multa apa:•Daca linia de baza dintre varfuri nu separa bine varfurile. Acest lucru va permite elutia completa a primei toxine inainte de inceperea elutiei celei de-a doua toxine. Tmpul de analiza va creste, dar separarea varfurilor este esentiala pentru cromatograme corecte.

•Daca toxinele sunt eluate prea repede si se contopesc cu solventul. Toxinele vor fi retinute pe coloana pentru mai mult timp si permit liniei de fundal sa se stabilizeze inainte de elutia toxinelor.

• Contaminarea varfului de matice.

Trebuie sa se adauge mai mult solvent:•Varfurile sunt prea late (incep sa se contopeasca).

•Timpul de retentie este prea mare.

•Contaminarea varfului de matice.

Ajustarea fazei mobile nu este intotdeanu de succes. Pregatirea probei si curatarea trebuie optimizate pentru a imbunatatii cromatografia HPLC.

12


Probleme La HPLC

12.3 Solventi si faza mobila

Solventi care nu se amesteca se vor separa rezultand indepartarea completa a solventului original din sistemul HPLC. Atunci cand se schimba faza mobila trebuie sa se foloseasca urmatoarea secventa de solventi:

Solutie Tampon sau Solutie de Sare

Solventi Aposi

Solventi Organici

Acetonitril sau Metanol

Etanol IPA (sau Acetona)

Apa

Cloroform sau Acetat de Etil

n-Hexan sau ISO-Octan

12

31

Probleme La HPLC

12.4 Pompa

Presiunea de operare anormala a pompei poate fi observata si poate fi: • Prea mare • Prea mica • Variabila

Presiunea Pompei Prea Mare

Cauza Metoda De Confirmare Ce Sa Facem

Partea de jos a pompei este infundata. Ex. In auto-sampler, coloana, filtru, tub, sigurante.

Se scoate si se examineaza instrumentul si / sau partile care pot fi infundate in sistemul de curgere.

Se apeleaza la manual.

Filtrul de linie este infundat (din spatele pompei).

Se lucreaza cu pompa fara a fi conectata la filtrul respectiv. Daca presiunea este 20 kg/cm patrat sau mai mare cand se pompeaza la 10 ml/minut, atunci filtrul este infundat.

Se inlocuieste filtrul.

Tuburile din pompa infundate.

Se indeparteaza filtrul din spate si solventul din pompa. Daca presiunea este 20 kg/cm patrat sau mai mare cand se pompeaza la 10 ml/minut, atunci filtrul este infundat.

Se apeleaza la persoanele de la servis.

12


Probleme La HPLC

Presiunea Pompei Prea Mica

Cauza Metode De Confirmare Ce Sa Facem

Capul pompei contine bule de aer.

Se indeparteaza parghia valvei si se indeparteaza bulele de aer.

Orificiul filtrului este blocat (utilizarea solutie tampon duce la blocari).

Atunci cand se deconecteaza solventul picura in loc sa curga fluent din orificiu.

Se inlocuieste filtrul.

Sigiliul sondei curge. Se strang suruburile capului pompei. Se inlocuieste sigiliul sondei.

Tubul interior de ajustare curge.

Se strang tuburile de la pompa.Consultati manualul.

Scurgeri la partea de jos a pompei ( auto sampler, coloana, sigurante).Deteriorarea capului pompei.

Se efectueaza testul presiunii ( se pune surubul in orificiul pompei, la 0.1 ml/min presiunea ar trebuie sa fie 500 kg/cm patrat).

Se curata capul pompei cu acid sau solutie alcalina.

Variatii in Presiunea Pompei

Cauza Metode De Confirmare Ce Sa Facem

Capul pompei contine bule. Se deschide valva si se indeparteaza bulele.

Filtrul de linie este infundat. Se inlocuieste filtrul.

Degazare insuficienta a solventului.

Se degazeaza solventul.

Tubul de fixare din interior curge.

Se strange tubul.

Sigiliul sondei curge. Se strang suruburile capului pompei.Se inlocuieste sigiliul sondei.

Deteriorarea capului pompei. Se efectueaza testul presiunii. Se curata capul pompei folosind acid sau solutie alcalina.

Miscare anormala a sigiliului. Se aude un zgomot de metal pe metal.

Se slabesc usor suruburile capului pompei.

12

33

Probleme La HPLC

12.5 Coloana si incalzirea coloanei

Se utilizeaza intotdeauna incalzirea coloanei pentru a prevenii:• Ingramadirea periodica a liniei de baza.• Marirea timpului de retentie.• Micsorarea timpului de retentie.• Reproductibilitatea scazuta a timpului de retentie.

12.6 DetectorZgomote:

Sursa Metode De Confirmare Ce Sa Facem

Bule in celula

Se monitorizeaza linia de fundal. Bulele provoaca linii de fundal anormal de mari cand nivelul de scurgere este schimbat.

1. Indepartati aerul din solvent folosind un degasser.

2. Instalati o coada de presiune.

Solutie in celula

Se foloseste o oglida pentru marire pentru a examina celula.Se verifica din nou linia de fundal.

Spalati celula: se spala sau se dezasambleaza.

Lichid care curge din celula

Se indeparteaza celula din instrument. Se examineaza celula si partea laterala a instrumentului.

1. Spalati si strangeti conectiunile.

2. Inlocuiti celula sticata.

Reducerea energiei

Daca diferenta este >0.4 V la 250 nm, s-au deteriorat lampa sau oglinda.

Se inlocuieste lampa (1,000 ore) sau oglinda (5,000 ore).

Absorbtia solventului sau contaminarea ferestrei celulei

1. Folositi solvent mai puternic.

2. Verificati lungimea de unda.

3. Spalati celula.

12


Probleme La HPLC

Zgomote electrice.

Se pune instrumentul jos.

1. Absobtia solventului.

2. Contaminarea ferestrei celulei.

1. Folositi solvent mai puternic.

2. Curatati celula.

3. Echilibrati coloana.

1. Cresterea bulelor.

2. Contaminarea coloanei.

3. Reducerea scurgerii solventului.

Folositi metoda de confirmare ca la 'Bule in celula'.

1. Eliminati aerul din solvent folosind un degasser.


3. Spalati / schimbati coloana.

4. Verificati pompa si / sau tuburile blocate.

Scaderea bulelor

Folositi metoda de confirmare ca la ‘Bule in celula‘.

1. Eliminati aerul din solvent folosind un degasser.


12

35

Probleme La HPLC

12.7 Indepartarea bulelor din celula de detectie

• Se mareste curgerea pompei. Daca bulele raman:• Se conecteaza partea de iesire a pompei direct la inlet-ul celulei si pompati la 2 ml/minute.

Daca bulele raman:• Se ataseaza un tub din otel la partea de iesire a celulei si acoperiti cu un tub de teflon.Bulele pot fi comprimate si trecute prin celula daca se aplica presiune in interiorul celulei. Se aplica presiune siringii si in mod continuu indoiti si reveniti tubul de teflon.Daca linia de fundal o ia in directia negativa marimea bulelor din celula scade. Continuati pana ce bulele au trecut prin celula.

12.8 Curatarea celulei de detectie fara dezasamblare

Contaminarea peretilor celulei poate fi indepartata trecand urmatorul solvent organic sau acid nitric puternic prin celula.Cand aceasta metoda nu da rezultatele dorite, dezasamblati si curatati celula.

Inlocuiti solventul din celula cu apa distilata.

Treceti acid nitric concentrat prin celula. (4 N, 1 ml/minute sau 30 min)

Treceti apa distilata prin celula. (1 ml/minute timp de 30 min)

Treceti acetona prin celula. (1 ml/minute timp de 30 min)

Treceti apa distilata prin celula. (1 ml/minute timp de 30 min)

Atentie: Se deconecteaza coloana inainte de a utiliza aceasta metoda.

12


Probleme La HPLC

12.9 Prevenirea bulelor de aer

• Aparitia bulelor poate fi prevenita folosind intotdeauna un degasser.

• Absobtia de solvent poate fi prevenita folosind intotdeauna solvent gradat de HPLC.

• Suspensiile si blocarea tuburilor poate fi prevenita spaland sistemul cu apa dupa ce s-a utilizat o faza mobila care continea sare.

• Cand se foloseste spalarea cu metanol inainte sau dupa o faza mobila care contine sare asigurati-va ca sarea este solubila in metanol. Daca nu sunteti siguri folositi apa inainte si dupa faza mobila.

• Un protocol de spalare bun este 30 minute apa la 1 ml/minut urmat de 30 minute metanol la 1 ml/minut.

• Cand aveti de-a face cu o faza mobila organica inlocuiti solventul din celula cu un solvent care se amesteca cu faza mobila organica sau cu apa. Nu amestecati lichide care nu pot fi amestecate. (ex. cloroform si apa). Folositi metanol ca solvent care se amesteca cu ambele.

12.10 Mentenanta detectorilor de fluorescenta

• Lampa trebuie schimbata la fiecare 1,000 ore. Acest lucru poate fi facut in laborator. Puteti chema si inginerul de servis.

• Inainte de schimbarea lampei programati aparatul la 400 nm extinctie si emisia la 500 nm, memorati valorile extinctiei si emisiei (V). Aceste valori trebuie sa creasca cand este instalata noua lampa.

• Filtrele de praf trebuie si ele schimbate odata cu lampa pentru a impiedica acumularea prafului in detector. Cand filtrele de aer sunt infundate eficienta racirii lampei este redusa, contribuind la deteriorarea lampei.

• Cel mai bun mod de curatare a prafului din interior este folosirea unei pompe de aer si suflarea prafului.Astfel se evita atingerea partilor componente si provocarea unor daune.

12

37

Glosar

Analist: O persoana care efectueaza analiza unei probe.

Analit: Substanta care trebuie separata in timpul cromatogramei.

Anticorp: Se gasesc in sange si sunt utilizati de sistemul imunitar pentru identifi-carea corpurilor straine.

Antigen: O substanta care promoveaza producerea anticorpilor si poate produce un raspuns imunitar.

Linie de baza: Este numele dat unei parti din cromatograma care reprezinta orice perioada de timp in care prin detector trece numai faza mobila.

Matrice: Substante precum cerealele, condimentele etc care trebuie testate.

Concentratie: Concentratia este masura care prezinta cat dintr-o anumita substanta este amestecata cu alta substanta.

Cromatograma: Este prezentarea vizuala a unei cromatograme. In cazul unei separari optime, varfuri diferite corespund cu anumite componente din amestecuri separate.

Cromatografie: Definitia IUPAC: “Cromatografia este o metoda fizica de separare, in care componentele care urmeaza sa fie separate sunt distribuite intre 2 faze, din care una este stationara in timp ce cealalta se misca intr-o directie bine definita.”

Zgomot de detector: Este o schimbare in linia de fundal care nu este asociata cu solutia eluata.

Extractie: Metoda de separare a componentelor.

Sistem gradient: Poate livra mai multi solventi in sistemul HPLC.

HPLC: Cromatografie lichida de inalta peformanta sau cromatografie lichida de inalta presiune – este o forma de cromatografie care aplica presiune foarte mare pentru a trece mai repede o solutie prin coloana.

Sistem izocratic: Sistem HPLC cu un solvent.

Matrice: Substante precum cerealele, condimentele etc care trebuie testate (marfa).

13


Glossary

Faza mobila: Faza care se misca intr-o directie bine definita transportand proba prin sistemul HPLC.

Micotoxine: Toxina produsa de fungi.

Contaminata natural: Toxina care se gaseste in mod natural in proba.

Pompa: Elibereaza un impuls continuu fazei mobile in injector, coloana si detec-tor.

Precizie: Caracterizeaza gradul de intelegere mutuala intre o serie de rezultate individuale.

Recuperare: Procentul de toxina detectat care poate fi calculat prin testarea unei probe cunoscute.

Repetabilitate: Variatia intre masuratorile efectuate de o singura persoana sau instrument pe acelasi produs si in aceleasi conditii.

Reproductibilitatea: Este abilitatea unui test sau experiment sa fie reprodus cu precizie, sau replicat, de altcineva lucrand in mod independent.

Timp de retentie: Timpul necesar unui anume analit sa treaca prin sistem (de la coloana la detector) in anumite conditii.

Proba: Substanta analizata in cromatograma. Poate fi constituita dintr-un singur component sau un amestec.

Solutie: Se refera la componentele probei.

Solvent: Lichidul care dizolva un solid sau solutie.

Proba fortificata: O proba care a fost contaminata cu o concentratie cunoscuta de toxina.

Solutie de fortificare: Solutie de concentratie cunoscuta care se adauga probei pentru a forma proba fortificata.

Curba standard: Este un instrument de cercetare cantitativ, o metoda de desenare a unor date de analiza utilizata in determinarea concentratiei unei substante.

13


R-Biopharm Rhône Ltd

Mycotoxin Technical Manual

August 2008

R-Biopharm Rhône LtdBlock 10 Todd CampusWest of Scotland Science ParkAcre Road, Glasgow G20 0XAPhone: +44 (0) 141 945 2924Fax: +44 (0) 141 945 2925www.r-biopharm.com

mycotoxin technical manual (romv2 - jan 12) low res

Documents