Modul de recoltare, prelucrare, transport si stocare a probelor de sangePentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:

Pregatirea pacientului

Este foarte important ca pacientului sa i se explice procedura la care va fi supus si sa se obtina

intreaga lui complianta.

1. Recoltarea probelor se face cu pacientul in conditii bazale, inaintea oricarei proceduri diagnostice

sau terapeutice (ideal intre orele 7 si 9 dimineata, in conditii ”à jeun”- pe nemancate); pentru

evaluarea metabolismului lipidic se recomanda ca recoltarea sa se efectueze dupa 12 ore de la

ultima masa.

2. Cand probele de sange nu sunt recoltate in conditii bazale, trebuie tinut seama de efectele

aditionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar si efortul fizic moderat poate determina o

crestere a glucozei, acidului lactic, proteinelor serice, CK), precum si a starii emotionale sau ritmului

circadian care poate afecta anumiti parametri.

3. Recoltarea probelor biologice se poate face sub forma unei probe unice (de exemplu, pentru

determinarea glicemiei bazale) sau sub forma probelor multiple (de exemplu, testul de toleranta la

glucoza sau recoltarea urinii din 24 ore).

4. Asigurati-va ca pacientul sta intr-o pozitie comoda (in pozitie sezanda sau in decubit dorsal).

5. Verificati cu mare atentie ca toate datele demografice ale pacientului sa fie corect scrise pe

formularul cu care este insotit acesta la punctul de recoltare a sangelui si etichetati corect

recipientul de recoltare.

Vom descrie in continuare procedurile de recoltare a sangelui venos si a celui capilar.

Flebotomia

In laboratoarele Synevo, pentru recoltarea sangelui venos se folosesc 2 sisteme inchise de tip

vacutainer:

A. S-Monovette, Sarsted;

B. cu holder, Becton-Dickinson.

A. Pentru sistemul S-Monovette exista 2 tehnici diferite de recoltare:

1. sistem seringa: prin controlul vitezei de recoltare nu exista riscul de colabare a venei;

2. sistem vacuum: tubul este vidat in momentul imediat anterior recoltarii, eliminandu-se riscul

pierderii de vid; proportia de sange recoltat-aditiv ramane constanta, fapt ce conduce la rezultate

corecte.

1. Instructiuni (sistem seringa):

-  Inainte de punctionarea venei, introduceti acul in tubul de recoltare, fixati-l prin rotire usoara in

sensul acelor de ceasornic.

-  Punctionati vena, slabiti garoul si trageti incet pistonul, pana la oprirea fluxului sanguin.

-  Scoateti tubul din ac rotindu-l in sens invers acelor de ceas; acul ramane in vena!

-  Pentru recoltarea mai multor probe, fixati tubul urmator in ac si procedati conform instructiunilor

de mai sus.

- ATENTIE: Intai se scoate tubul din ac, apoi acul din vena!

   

2. Instructiuni (sistem vacuum):

-  Fixati pistonul la baza tubului, apoi indepartati-l.

-  Inaintea inceperii recoltarii, acul trebuie sa fie in vena.

-  Slabiti garoul si fixati tubul in acul aflat deja in vena, rotindu-l in sensul acelor de ceasornic.

-  Asteptati oprirea fluxului sanguin.

-  Scoateti tubul din ac rotindu-l in sens invers acelor de ceasornic; acul ramane in vena.

-  Pentru recoltarea mai multor probe, fixati tubul urmator in ac si procedati conform instructiunilor

de mai sus.

- ATENTIE: Intai se scoate tubul din ac, apoi acul din vena!

   

 

B. Probele de sange sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:

 

Inaintea recoltarii sangelui, desfaceti acul prin rasucirea capacului sigilat. Inlaturati capacul si

expuneti partea filetata (1), avand grija sa nu indepartati teaca sterila in care se gaseste acul (2).

Asamblati acul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fi acum umplute unul dupa altul in concordanta

cu instructiunile de mai jos:

a. Aplicati un garou pe antebratul pacientului si intepati pielea din plica cotului, ajutandu-va de

degetul mare si indexul mainii drepte.

b. Inversati pozitia mainilor cat mai curand posibil dupa ce acul a penetrat vena; apasati

vacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul si degetele mijlocii sustinandu-l.

c. Sangele este atras de vacuumul din vacutainer si curge in tub cu viteza proprie; eliberati garoul

din jurul bratului pacientului imediat ce sangele a aparut in vacutainer, ajutandu-va cu mana

stanga, sustinand in continuare holderul.

d. Retrageti vacutainerul cu mana dreapta, apasand usor cu degetul mare pe una dintre marginile

holderului.

e. Pentru a asigura optima omogenizare a sangelui cu anticoagulantul, efectuati 8-10 miscari de

inversiune a tubului.

f. Daca se recolteaza mai mult de un vacutainer, inserati cel de-al doilea tub si repetati pasii

descrisi mai sus (a-e).

     

     

Indiferent de sistemul de recoltare folosit, respectati urmatoarele manevre:

- utilizati manusi sterile, de unica folosinta pentru fiecare pacient caruia i se recolteaza probe;

- evitati punctionarea in zonele in care exista leziuni cutanate;

- dezinfectati zona aleasa pentru punctionare cu ajutorul unui tampon steril imbibat in solutie

apoasa de izopropanol 70%, prin miscari circulare, din interior spre exterior, pentru a indeparta

contaminantii;

- dupa tamponare, lasati sa se usuce zona inainte de a trece la punctionare (daca zona este umeda,

poate fi indusa hemoliza probei);

- la sfarsitul punctionarii, aplicati imediat un tampon compresiv pentru a asigura hemostaza si a

evita formarea hematomului (durata recomandata a compresiei  5 mininute); la sfarsit acoperiti

zona cu un pansament steril;

- acul de punctie nu va fi reintrodus in teaca (pentru a evita inteparea), indoit sau taiat, ci va fi

depus intr-un container de plastic rezistent la reziduuri intepatoare sau taietoare.

Aditivi

Pentru a impiedica procesul de coagulare a sangelui integral, unele vacutainere contin substante

anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA, citrat), fie prin inhibarea

trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudina).

Pentru a nu exista nici o confuzie in identificarea tubului de recoltare, capacele vacutainerelor sunt

colorate diferit, in functie de aditivul folosit.

Codurile de culoare pentru substantele anticoagulante sunt descrise in ISO/DIS 6710:

1. Capac mov/roz - foloseste ca anticoagulant EDTA-ul si are utilitate in hematologie, biologie

moleculara, unele teste imunochimice (ex. ACTH).

2. Capac bleu/verde - contine Citrat 9+1 si se foloseste pentru analiza coagularii.

3. Capac negru/mov - contine Citrat 4+1 si se foloseste pentru VSH.

4. Capac verde/portocaliu - contine Heparinat si se utilizeaza plasma pentru testele de chimie.

5. Capac rosu/incolor - este un tub fara anticoagulant. Serul este folosit pentru testele de chimie,

imunologie si serologie.

Unele vacutainere destinate obtinerii serului contin un activator de coagulare (care accelereaza

formarea cheagului) si un gel separator, care permite mentinerea serului dupa centrifugare in 

tuburile primare, in cursul fazei preanalitice (transport catre laborator), analitice si postanalitice

(stocarea probelor in laborator).

Tuburile de recoltare folosite in laboratoarele Synevo sunt:

1. Tuburi Beckton- Dickinson:

- capac mov - EDTA;

- capac rosu - tub simplu, fara anticoagulant sau gel separator;

- capac incolor - tub fara anticoagulant, cu gel separator;

- capac bleumarin - EDTA (pentru metale);

- capac negru - citrat 4+1;

- capac bleu - citrat 9+1.

2. Tuburi Sarsted:

- capac roz - EDTA;

- capac incolor - tub simplu, fara anticoagulant sau gel separator;

- capac maron - tub fara anticoagulant, cu gel separator;

- capac portocaliu - heparinat de litiu (pentru metale);

- capac mov - citrat 4+1;

- capac verde - citrat 9+1.

Ordinea recoltarii tuburilor

In cazul in care este nevoie sa se obtina mai multe probe dintr-o singura flebotomie, se recomanda

sa se respecte urmatoarea ordine de recoltare a tuburilor:

1. recipientele pentru hemocultura;

2. tuburile fara aditivi;

3. tuburile ce contin citrat;

4. tuburile ce contin heparina;

5. tuburile ce contin EDTA.

Volumul optim de proba

Una din erorile cel mai des intalnite este trimiterea la laborator a unei cantitati insuficiente de

proba. Pentru a va asigura ca exista un volum adecvat de proba, recoltati intotdeauna sange intr-o

cantitate de 2 ori si jumatate mai mare decat volumul necesar efectuarii unui anumit test (la fiecare

test este precizat volumul minim de ser sau plasma necesar procesului analitic).

In acelasi timp, trebuie sa se evite recoltarea excesiva de sange, in special la varstnici, copii mici,

pacienti internati in sectiile de terapie intensiva.

In cazurile frecvente, in care pacientilor le sunt indicate mai multe teste, tineti cont de urmatoarele

volume de sange recomandate in cazul folosirii analizoarelor automate actuale:

- 4-5 mL sange pentru efectuarea unui profil de investigatii biochimice uzuale;

- 1 mL sange pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.

Recoltarea sangelui capilar

Este utila in special in cazul pacientilor pediatrici si pentru efectuarea frotiurilor de sange. Cele

doua locuri de electie pentru recoltare sunt suprafata palmara a falangei distale a degetului si

suprafata plantara laterala sau mediala a calcaiului. Se obtine un amestec de sange provenit din

arteriole, venule si capilare care la randul sau poate fi diluat cu lichid interstitial si intracelular.

Compozitia relativa a sangelui depinde de fluxul sanguin existent in patul vascular cutanat in

momentul recoltarii; astfel, incalzirea locului de punctionare inaintea recoltarii faciliteaza

arterializarea sangelui din teritoriul cutanat respectiv.

!Nu se va recolta niciodata din pulpa degetului la nou-nascuti deoarece exista riscul de a leza osul

falangei.

Exista o relatie direct proportionala intre volumul de sange recoltat si adancimea incizei efectuate.

Astfel tipul lantetei trebuie ales in functie de locul punctionarii si cantitatea de sange necesara.

Adancimea inciziei constituie un element critic la nou-nascuti; daca aceasta depaseste 2,4 mm

exista riscul de a leza osul calcaneu.

Riscul de a efectua o incizie prea adanca poate fi evitat prin utilizarea unor lantete semiautomate

de unica folosinta.

Instructiuni:

- dezinfectati locul punctionarii cu ajutorul unui tampon steril imbibat in solutie de alcool si asteptati

sa se usuce zona inainte de a efectua incizia (trebuie evitata folosirea altor dezinfectanti deoarece

acestia pot induce valori fals crescute pentru acid uric, fosfor sau potasiu);

- prindeti ferm zona adiacenta locului punctionarii si efectuati rapid incizia, apasand pe butonul

lantetei;

- indepartati  prima picatura de sange cu ajutorul unei mese de tifon, deoarece aceasta poate

contine lichid interstitial;

- prin miscari de apasare usoara, fara a masa zona din jur, colectati picaturile de sange care curg

liber intr-un microtainer etichetat;

- daca picaturile nu curg liber in microtainer, percutati usor tubul;

- in cazul microtainerelor care contin anticoagulant, efectuati 8-10 miscari usoare de inversiune a

tubului pentru a asigura amestecul optim al sangelui cu anticoagulantul;

- la sfarsitul recoltarii aplicati un tampon steril compresiv care va fi mentinut pana la oprirea

sangerarii; nu aplicati bandaje adezive la copii, deoarece pe langa faptul ca pot produce iritatii,

exista riscul de a fi inghitite atunci cand se largesc;

- depuneti lanteta intr-un container rezistent la punctionare.

Prelucrarea probelor de sange dupa recoltare

Componentele sangelui:

In medie, un adult de 70 kg are aproximativ 4,75 - 5,6 L sange, din care aproximativ 60% sunt

plasma si 40% celule sanguine.

Celulele sanguine (hematii, leucocite si trombocite) sunt suspendate in plasma (formata din apa si

constituenti dizolvati: hormoni, anticorpi, enzime, ce sunt transportate catre tesuturi, iar produsii lor

de excretie sunt transferati apoi catre plamani si rinichi).

Prin centrifugare se pot separa atat plasma, cat si ser. Diferenta dintre plasma si ser este ca plasma

retine fibrinogenul, care  este inlaturat din ser.

Sangele pacientului, recoltat intr-un tub fara substante anticoagulante, cu sau fara gel separator,

este lasat sa sedimenteze/sa coaguleze, dupa care va fi centrifugat si se separa serul, care contine

2 tipuri de proteine: albumina si globuline.

Plasma este obtinuta din sangele recoltat intr-un tub cu anticoagulant si apoi centrifugat.

Anticoagulantul inhiba formarea coagulului. Plasma contine trei tipuri de proteine: albumina,

globuline si fibrinogen.

Pentru anumiti analiti exista diferente semnificative intre rezultatele obtinute la testarea din ser si

cea din plasma: potasiu, magneziu, fosfor, proteine totale, lactat etc.

Diferentele dintre valorile obtinute din ser si din plasma se datoreaza unor factori ca:

- analitul poate fi consumat in timpul procesului de coagulare: fibrinogen, trombocite, glucoza;

- analitul poate fi eliberat din celule in timpul coagularii: potasiu, LDH, fosfor, lactat;

- anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare in cazul GGT, Li.

Plasma Versus Ser

1. Avantaje:

- Procesare accelerata: etapa formarii coagulului este eliminata; timpul de centrifugare se poate

scurta prin cresterea vitezei de rotatie.

- Cantitate mai mare: dintr-o proba de sange se obtine aprox.15-20% mai multa plasma decat ser.

- Lipsa interferentelor legate de coagularea post-centrifugare: in ser se mai pot produce coaguli

dupa o centrifugare precoce; acest lucru nu apare niciodata in plasma.

- Rezultatele obtinute la testarea analitilor din plasma exprima mai fidel statusul in vivo al

pacientului comparativ cu cele din ser.

- Risc mai mic de aparitie in plasma a hemolizei si trombocitolizei decat in ser.

2. Dezavantaje:

-  Electroforeza proteinelor este alterata in plasma de prezenta fibrinogenului (pseudo-peak in

regiunea g, ce poate mima un component M).

- Anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare.

- Interferenta cationica: cand se foloseste plasma heparinizata, litiul sau amoniul din anticoagulant

pot interfera cu metodele de determinare a acestora.

Faza precentrifugare

Serul sau plasma trebuie separate fizic de celulele sanguine cat mai repede posibil, pentru a nu

exista riscul producerii unor rezultate eronate; se recomanda astfel o limita maxima de 2 ore din

momentul recoltarii probei.

Un contact mai redus cu celulele sanguine (<2 ore) este recomandat pentru potasiu, ACTH, cortizol,

catecolamine, acid lactic si homocisteina.

Studiul efectuat de Laessig si colaboratorii sai a indicat faptul ca 17 analiti nu au fost afectati de un

contact prelungit al serului cu celulele sanguine (timp de 48 ore la temperatura camerei): albumina,

fosfataza alcalina, ALT, bilirubina, calciu, colesterol, CK, creatinina, magneziu, fosfor, proteine

totale, trigliceride, T3, T4, uree, acid uric. Pe de alta parte, rezultatele au fost semnificativ alterate

in cazul urmatorilor analiti:

- timp de contact ~ 2 ore: glucoza (scade), potasiu (creste), LDH (creste);

- timp de contact ~ 8 ore: sideremie (creste).

Intr-un studiu mai recent, Zhang si colaboratorii sai au evaluat stabilitatea a 63 analiti in serul care

a ramas timp de 24 ore in contact cu celulele sanguine. S-a stabilit ca serul trebuie separat in 3 ore

pentru glucoza, potasiu si fosfor si in 6 ore pentru albumina, bicarbonat, clor, peptid C, HDL

colesterol, sideremie si proteine totale. Ceilalti analiti au fost stabili timp de 24 ore in serul separat.

Acest studiu demonstreaza faptul ca laboratoarele trebuie sa revizuiasca stabilitatea analitilor

testati, pentru a reduce numarul respingerilor nenecesare de probe, in cazurile in care transportul

de la punctele de recoltare este prelungit.

Refrigerarea probelor de sange inhiba metabolismul celulelor sanguine si stabilizeaza anumiti

constituenti termolabili. Nu se recomada ca probele de sange integral sa fie refrigerate decat daca

exista recomandari specifice in acest sens. Astfel, este contraindicata refrigerarea in cazul probelor

pentru determinarea potasiului, deoarece temperatura scazuta inhiba glicoliza si favorizeaza

eliberarea potasiului din celule, obtinandu-se astfel rezultate fals crescute. Pe de alta parte, probele

din care se vor testa ACTH, PTH, acid lactic, catecolamine si gastrina vor fi racite prin plasarea intr-

un recipient ce contine un amestec de apa cu gheata.

Centrifugarea

Centrifugarea probei in vederea obtinerii serului trebuie efectuata numai dupa ce se constata ca

sangele a coagulat complet. In mod normal coagularea se produce dupa cca. 30 minute, insa in

cazul pacientilor care primesc tratament anticoagulant sau prezinta defecte de coagulare aceasta

se produce cu intarziere.

Centrifugarea probelor pentru obtinerea de ser sau plasma se efectueaza in general la 3000 g timp

de 5 minute. Pentru obtinerea unei plasme deplachetate este nevoie ca proba sa fie centrifugata

timp de 15-30 minute la 2000-3000 g.

Dupa separarea serului sau plasmei, probele nu vor mai fi recentrifugate (pentru a obtine un volum

suplimentar de proba); de asemenea este contraindicata recentrifugarea in cazul probelor recoltate

in vacutainere cu gel separator.

Transferul probelor in tuburi secundare trebuie efectuat cu mare atentie, pentru a evita contactul

cu un material potential infectant.

Programul de intretinere al centrifugilor include verificarea periodica, cu ajutorul unui tahometru, a

vitezei de centrifugare obtinute in urma unei setari specifice.

In cazul tuburilor cu gel se va verifica obligatoriu integritatea acestuia la sfarsitul centrifugarii.

Anumite teste (ex.: hemoglobina glicozilata, plumb) necesita o proba de sange anticoagulat si

neseparat; in aceste cazuri probele nu vor fi centrifugate.

Transportul probelor

Timpul de transfer al probelor catre laborator poate fi:

- scurt, cand locul de recoltare/clinica este in acelasi loc cu laboratorul;

- mediu, cand locul de recoltare/clinica este in aceeasi localitate cu laboratorul, dar nu in acelasi

loc;

- lung (24 ore sau mai mult), cand locul de recoltare/clinica este in alta localitate decat laboratorul

si se trimit probele prin posta sau curieri. Aceasta situatie se intalneste mai des in cazul trimiterii

probelor pacientilor de la studiile clinice, cand toate probele se colecteaza intr-un  laborator de la

pacientii situati in centre diferite, localizate geografic diferit.

Exista mai multe tipuri de transport al probelor, in functie de natura produsului si de stabilitatea

analitilor care trebuie testati:

- transport in conditii ambientale;

- transport la rece (probe refrigerate);

- transport in gheata carbonica (probe congelate).

Reguli generale:

- in cazul unui timp de transfer scurt sau mediu, toate probele de sange vor fi transportate

ambiental in containere sau pungi speciale (daca nu exista recomandari specifice de refrigerare a

probelor);

- in cazul transferului la distanta, in special prin curieri sau posta, trebuie evitat a fi transportat

sange integral;

- probele transportate ambiental trebuie protejate de temperaturi extreme, prin ambalarea in

materiale izolante (containere de polistiren);

- probele refrigerate trebuie plasate in apropierea pungilor cu gheata si nu direct pe acestea;

- in cazul probelor congelate se va verifica daca dimensiunile containerului permit sa fie introdusa o

cantitate suficienta de gheata carbonica care sa reziste pe durata transportului;

- vor fi folosite dispozitive de monitorizare a temperaturii pe durata transportului.

S-a demonstrat ca anumiti parametri biochimici, ca electrolitii sau enzimele, nu sunt afectati de

transportul prin posta sau curier, care poate dura de la 24 ore la 4 zile. Este valabil si pentru

concentratia hemoglobinei sau numarul eritrocitelor. Diferente majore se observa insa in cazul

hematocritului, volumului eritrocitar mediu (VEM) sau bilirubinei. Foarte important este ca

prepararea frotiului de sange venos sa fie facuta in maximum 3 ore de la recoltarea sangelui. De

asemenea sangele recoltat pe citrat (pentru testele de coagulare) la pacientii care nu sunt

heparinizati este stabil timp de 8 ore la temperatura camerei pentru determinarea timpului de

protrombina, timpului de trombina, APTT, proteinei C si factorului V al coagularii. Nu este valabil

insa pentru determinarea factorului VIII si proteinei S care au o stabilitate mult mai redusa.

In cazul  pacientilor heparinizati sangele poate fi pastrat la temperatura camerei sau la frigider timp

de 4 ore din momentul recoltarii probelor. Daca acest lucru nu este posibil, probele se stocheaza la

–20ºC.

Transportul la distanta al plasmei, in vederea efectuarii testelor de coagulare, se va face numai in

gheata carbonica; decongelarea probelor in cursul transportului genereaza rezultate eronate.

Stocarea probelor in laborator

Dupa incheierea procesului analitic, o parte din probe vor fi pastrate o anumita perioada de timp, in

conditii bine stabilite, astfel incat sa permita confirmarea rezultatelor, verificarea identitatii probelor

sau efectuarea unor teste suplimentare.

Reguli generale:

- procedura de stocare a probelor trebuie sa tina cont de stabilitatea analitilor;

- probele trebuie intotdeauna sa fie pastrate in tuburi inchise (pentru a evita evaporarea acestora);

- probele pot fi arhivate in frigidere in tuburile primare, cu conditia ca acestea sa contina gel

separator;

- in congelatoare probele sunt pastrate de obicei in tuburi secundare; este posibila arhivarea si in

tuburile primare care contin gel, daca producatorul specifica acest lucru;

- se va evita pe cat posibil stocarea sangelui integral; oricum sangele integral destinat obtinerii

serului/plasmei nu trebuie pastrat in frigider;

- intervalul de pastrare a probelor este cu atat mai mare cu cat temperatura de arhivare este mai

scazuta (exceptii: probele pentru electroforeza lipoproteinelor si determinarea de apolipoproteine

A1 si B nu trebuie pastrate la congelator);

- dupa decongelare proba trebuie omogenizata prin miscari de inversiune a tubului, fara a se

produce spuma; evitati decongelarea – recongelarea.

In laboratorul Synevo exista urmatoarea procedura de arhivare a probelor:

1. Probele pentru hematologie contin sange pe EDTA, pot fi arhivate 24 ore la 2-4º C;

2. Probele pentru biochimie si imunochimie (exceptie fac probele mentionate mai jos) contin ser, se

pastreaza 1 saptamana la 2-4º C;

3. Probele pentru determinarea PSA contin ser si se pastreaza 2 saptamani la -20º C;

4. Probele pentru screeningul prenatal al anomaliilor fetale, profil TORCH, serologie sifilis la care s-

au obtinut rezultate pozitive contin ser si se pastreaza 1 luna la -20º C;

5. Probele alergologice si cele pentru boli autoimune contin ser si se pastreaza 2 saptamani la -20º

C.

Probele de plasma destinate determinarii incarcaturii virale B si C, precum si probele de toxicologie

(metale) sunt consumate de obicei aproape integral in procesul analitic, de aceea nu vor mai putea

fi disponibile pentru retestari (se va solicita repetarea recoltarii)