Este necesară aplicarea unor tehnici de bază care să asigure anaerobioza În toatemomentele diagnosticului de laborator:

Curs XXIV. C/ostridium, Bacillus, Legionella

Genul C/ostridium

Bacteriile din Genul Clostridium sunt bacili anaerobi, majoritatea sporulaţi,majoritatea mobili, majoritatea producători de exotoxine

Bacterii anaerobe. Generalităţi şi precizări de termeni

Bacteriile anaerobe stricte sunt bacterii hipersensibile faţă de oxigen, care NU SEPOT MULTIPLICA ŞI NU POT TRĂI IN PREZENŢA AERULUI ATMOSFERIC.

Cauzele acestui comportament sunt:1. Absenta enzimelor care inactiveaza derivaţii toxici de oxigen: peroxidaza,

catalaza, superoxiddismutaza (uneori au, dar in cantitati foarte mici)2. Absenta oxidazelor, fără de care anaerobii nu pot incorpora oxigen molecular în

citoplasmă3. Absenţa citocromilor (sau prezenţa lor în cantităţi foarte mici) - ceea ce face

ca transportul electronilor să nu se realizeze către oxigen, ca acceptor final de electroni,cu pierderea toxicităţii prin reducere la H20. În consecinţă, energia rezultă din reacţii defermentare, cu acceptori finali de electroni diferiţi de oxigen. Aceşti acceptori sunt celmai frecvent organici, dar pot fi şi anorganici, la bacteriile autotrofe.

Capnofilia este proprietatea unor bacterii de a se dezvolta mai bine in prezenţaunor concentraţii de C02 superioare celei atmosferice. Mulţi anaerobi sunt capnofili.

Microaerofilia este proprietatea unor bacterii de a se dezvolta mai bine in prezenţaunor concentratii de 02 mai mici de 21 %, cât este concentraţia 02 în aerul atmosferic.

Aerotoleranţa este proprietatea unor bacterii anaerobe de a creşte în prezenţa a21% 02, dar fără a utiliza oxigenul. Unele dintre bacterii le clasificate ca anaerobe pot fiaerotolerante.

Datorită caracterelor metabolice ŞI m special a relaţiei lor cu oxigenul,diagnosticul microbiologie al infecţiilor cu anaerobi prezintă o serie de particularităţi.

• Anaerobii pot fi considerati o "lume paralela" fata de restul bacteriilor. Existăbacili Gram + si Gram -, precum şi coci Gram + si Gram - anaerobi

• Tehnicile de izolare, cultivare, testare a sensibilităţii la antibiotice sunt complexesi costisitoare

• Succesul diagnosticului depinde de respectarea strictă a specificaţiilor tehnicecare indică limitarea la minimum a contactului cu aerul atmosferic în fiecare fazăa diagnosticului

• Pentru recoltare şi transport• Pentru culturi

1

• Daca este posibil, pentru manipulări• Daca este posibil, pentru medii:

• PRAS = Prereduced Anaerobically Sterilised• Medii prereduse prin fierbere şi alte proceduri de eliminare a oxigenului

Pentru succesul izolării anaerobilor, există o serie de cerinţe care se aplică încădin momentul recoltării. Acestea sunt:

• Asepsie pentru evitarea contaminării• Se prefera recoltarea cu seringa; se evita recoltarea cu tamponul, iar daca nu este

posibil se prefera tampoanele cu alginat de calciu• Pentru hemocultură se utilizează un sistem Vacuteiner• Pentru boala periodontală se utilizează sisteme speciale de prelevare, care să

asigure recoltarea din sacul periodontal, cu evitarea contaminării cu floră aerobăşi, în măsura posibilităţilor, evitarea sângerării

• Reducerea la maximum a intervalului de contact cu oxigenul atmosferic• Utilizarea unui mediu de transport preredus• Utilizarea unor sisteme de transport în anaerobioză: jar anaerob, sac de plastic cu

amestec reducător• În cazul în care nu sunt disponibile astfel de sisteme, se poate utiliza o seringă cu

care se aspiră prelevatul, după care se elimină tot aerul şi se astupă orificiulsenngn

Realizarea anaerobiozei se face într-o incintă închisă, urmărindu-se obţinerea uneiatmosfere total lipsită de oxigen, cu 4+5% H2. Se pot utiliza catalizatori care stimuleazăproducerea de radicali de hidrogen reactivi , care vor fixa resturile de oxigen, cu formarede H20. Captarea apei se face cu hîrtie de filtru sau agenţi de deshidratare. Ca sursă deamestec gazos pot fi utilizate flacoane de gaz cu supapă de presiune.

Compoziţia amestecului gazos în volume este H2 : C02 : N2 = 5 : 15 : 80 sau 5 :10: 85.

Pentru eficienţa izolării şi cultivării anaerobilor contactul mediu de cultură -amestec gazos este absolut necesar. De aceea nu trebuie udate marginile cutiilor Petri,pentru că în acest fel accesul gazelor din incintă la mediul de cultură nu mai este posibil.Există cutii cu capace speciale, care facilitează contactul atmosferei din incinta anaerobăcu mediul de cultură.

lncintele utilizate pentru realizarea anaerobiozei pot fi: hote, cutii ("jar"-uri),pungi sigilate etc.

Există şi o precedură simplă de obţinere a anaerobiozei direct în placa Petri încare se face însămânţarea, cu ajutorul unui plic cu amestec reducător plasat în interiorulplăcii. Placa se etanşeizează cu ajutorul parafinei solide.

Procedurile de izolare propriu-zisă trebuie să ţină seama de următoarele aspecte:• Să se asigure condiţii stricte de anaerobioză• Să se utilizeze medii adecvate, preferabil prereduse; cu suplimente şi selective în

cazul izolarii din produse cu contaminare mixtă• Să se demonstreze caracterul anaerob prin cultivarea în paralel pe medii aerobe.

Dacă bacteria se dezvoltă şi pe mediile aerobe, atunci nu este anaerobă!• Să se efectueze controlul purităţii culturii izolate.

2

Pentru identificare se aplică un algoritm etapizat, după cum urmează:• Confirmarea caracterului anaerob• Identificarea categoriei microscopice (bacil, coc etc. - uneori dificil);• Diferenţiere în cadrul categoriei microscopice (ex. Clostridii Gram

pozitive, Bacili Gram Negativi etc)Rezultatele identificării se comunica etapizat.

Prezentăm mai jos date sintetice privind caracterele generale şi diagnosticulmicrobiologie al infecţiilor cu Clostridii. .

Cuvinte cheie: Bacili Gram pozitivi, anaerobi, majoritatea sporulaţi, majoritateaproduc exotoxine, majoritatea mobili; tetanos, gangrenă gazoasă, botulism,enterocolită postantibiotice; metabolism activ, miros putrid, mediu Nagler - C.perfringens; mediu VF, mediu cu thioglicolat, lapte turnesolat; sensibilitate la betalactamine, Vancomicina (c. difficile)

1. Minidefiniţie

Genul Clostridium include bacili Gram pozitivi anaerobi, majoritatea sporulaţi,unii cu aspect microscopic caracteristic, majoritatea mobile (excepţie C. perfringens),majoritatea producători de exotoxine, care pot cauza afecţiuni de natură infecţioasă sautoxiinfecţioasă grave, cu aspect specific sau nespecific.

II. Încadrare taxonomică

Domeniu: BacteriaPhylum: FirmicutesClasa: ClostridiaOrdin: ClostridialesFamilie: ClostridiaceaeGen: Clostridium

III. Habitat

Clostridiile pot popula orice nişă ecologică care intruneşte condiţii nutritive şi deanaerobioză: cavităţile naturale ale omului şi animalelor, unde se pot întâlni camicroorganisme comensale, care se elimină în mediul înconjurător, contaminândalimente (conserve în cutie, conserve obţinute în gospodărie ca de ex.: carne conservatăîn untură, legume şi fructe etc.), surse de apă, solul etc.

În căile respiratorii superioare, vagin, unităţi pilosebacee pot fi reprezentaţi înproporţie de 10- 100: 1 faţă de aerobi, iar în colon, proporţia este de 1000: 1. În intestinuluman există peste 100 specii de Clostridium.

3

IV. Implicare în patologia umană

Infecţiile cauzate de Clostridii pot îmbrăca următoarele aspecte clinice:- septicemia (postabortum, neoplasm digestiv, postinfecţie intestinală, de cauză

necunoscută): e. perfringens, e. difficile, e. septicum- infecţie localizată închisă (gangrenă gazoasă, celulită, infecţie intestinală,

enterocolita postantibiotice): e. perfringens, e. septicum, e. oedematiens A (C. novyi),e. histolyticum, e. sordeli, e. difficile

- infecţie chirurgicală (grefe, proteze articulare etc.): e. perJringens etc.- infecţie localizată minimă după inţepatură, muscatură, injecţie: e. tetani, e.

perfringens, e. botulinum etc.- toxiinfecţie alimentară: e. perfringens tip A enterotoxigen, e. botulinum

(toxine botulinice tip A, B, F, E)Dintre infecţiile cu tablou clinic particular amintim: tetanosul, botulismul, şi

gangrena gazoasă, (Fig. ] -3).Tetanosul şi botulismul sunt boli cauzate de toxina tetanică, respectiv toxinele

botulinice (Vezi capitol toxine bacteriene). Toxina tetanică blochează eliberareainhibitorilor neurotransmiţătorilor, la nivelul sinapsei, motiv

Toxina botulinică, o neurotoxină considerată cea mai puternică otravă,dimpotrivă, blochează eliberarea neurotransmiţătorului acetil-colina, ceea ce determinăimposibilitatea contracţiei şi paralizie musculară progresivă, cu pericolul stopuluirespirator.

Clostridiile gangrenei gazoase se multiplică la locul de inoculare, cu produceremasivă de gaz, fenomene locale de obstrucţie a vaselor sanguine (Fig. 4), producere detoxine, necroză locală, anemie hemolitică şi alterarea gravă a stării generale, cu deces înproporţie de până la 80% din cazuri, în caz că tratamentul este întârziat.

Clostridium difficile este implicat în etiologia enterocolitei postantibiotice (Fig.3). C. difficile se multiplică la nivelul mucoasei intestinale, cu apariţia de focare însubmucoasă, sângerare, eliberare de enterotoxină şi toxine citopatice, alterarea stăriigenerale. Această infecţie apare frecvent ca infecţie nosocomială, în legătură cuadministrarea de antibiotice care distrug flora aerobă intestinală.

4

Fig. 1. a. Contractură musculară generalizată la un soldat cu tetanus: risussardonicusb. Copil cu tetanos

Fig. 2. a. Botulism la gâşte; botulism la copil, prin colonizare digestivă

5

Fig. 3. Colită post-antibiotice cu C. difficile

Fig. 4. Gangrenă gazoasă

Enumerăm câteva aspecte clinice particulare, care pot sugera o infecţie cu anaerobi:• Prezenţa de gaz în ţesuturi, scurgeri fetide, sânge înnegrit (Fig. 4, 5)• Examen direct pe frotiu colorat gram cu morfologie caracteristică (ex.

Clostridium tetani)• Fluorescenta rosie in UV a scurgerilor purulente

6

Fig. 5. Fasciită necrozantă la o pacientă cu neoplasm de colon - scurgeri fetide

V. Microbiologie - principalele caractere şi implicaţii în patogeneza şidiagnosticul microbiologie

Clostridiile sunt bacili gram pozitivi, sporulaţi, strict anaerobi, majoritatea mobili(excepţie C. perjringens).

Majoritatea au morfologie microscopică caracteristică: Clostridium tetani areaspect de băţ de tobă sau rachetă de tenis, datorită endosporului cu localizare terminală;Clostridium botulinum formează un endospor subterminal. Dezvoltă colonii translucide,beta-hemolitice pe mediu cu sânge, iar pe mediu cu gălbenuş de ou produce un precipitatdatorită eliberării de lecitinază. Clostridium perfringens nu formează spori în culturi.

Clostridiile sunt foarte active metabolic, cu producerea finală de acid butiric, acidacetic, butanol, acetonă şi compuşi urât mirositori din aminoacizi şi acizi graşi. Formeazăgaz în cantităţi mari, respectiv C02 şi H2, prin fermentarea zaharurilor.

VI. Factori de patogenitate

Clostridiile posedă o serie largă de factori de patogenitate, cum sunt: toxine(tetanică - tetanospasmina, neurotoxinele botulinice, enterotoxina perfringens, toxinele A- enterotoxina şi B - toxina citopatică ale C. difficile etc.), enzime (proteaze, lipaze,colagenaze, hialuronidaze, adezine, capsula).

VII. Patogenie

În prezenta unor factori favorizanti, care afecteaza schimburile de oxigen, cuscăderea potentialului electric tisular, bacteriile anaerobe provenite din mediul exteriorsau din flora endogenă a pacientului se multiplică la nivelul nişei ecologice create în

7

IX. Noţiuni de epidemiologie şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

organismul gazdei. Această nişă poate lua naştere în situaţii traumatice, în cursul unorboli metabolice cu hipoxie tisulară sau în situaţii care favorizează flora anaerobă prinpresiunea selectivă a antibioticelor inactive pe germeni anaerobi. Dintre aceste posibilităţienumerăm:

• Plagă profundă sau evoluţie in situs anatomic în vecinatatea cavităţilormasiv colonizate cu anaerobi

• Plăgi muşcate de om• Distrucţii tisulare: tumori, traumatisme, chirurgie complexă• Diabetlacidoza• Pneumonii de aspiratie; endocardite• Terapie cu antimicrobiene inactive pe anaerobi (Aminoglicozide,

Quinolone, Sulfamide)Multiplicarea clostridiilor este însoţită de exprimarea factorilor de patogenitate

somatici (adezine, capsula etc.) şi/sau eliberaţi în mediu (toxine, enzime). etc.

VIII. Răspunsul imun

Trecerea naturală prin boală nu produce imunizare nici la o doză letală detetanospasmină sau toxină botulinică. Se pot produce îmbolnăviri repetate, mai ales încazul botulismului, în care nu se face imunizare datorită numărului redus de cazuri.

Anticorpii protectori pot fi sintetizaţi faţă de antigene somatice şi/sau faţă deantigene extracelulare: anatoxine, administrate profilactic. Pentru botulism există unvaccin pentru cei care sunt expuşi profesional, dar nu se practică vaccinare în masă.

Căile de contaminare cu anaerobi pot fi: digestivă, respiratorie, oculară (mai alespentru C. botulinum), cutanată (C tetani, clostridiile gangrenei gazoase etc.)

Costridium tetani se multiplică la poarta de intrare, unde poate ajunge în caz decontaminarea accidentală a plăgilor cu pamânt, contaminarea bontului ombilical etc.

Prevenirea îmbolnăvirilor se face prin aplicarea protocolului corect de tratamentîn cazul plăgilor sau intervenţiilor cu risc crescut de îmbolnăvire de tetanus: excizie largăa zonelor cu distrugeri tisulare, toaleta corectă a plăgii cu apă oxigenată, rapel cuanatoxină în cazul scăderii titrului de anticorpi sub cel protector.

Profilaxia prin imunizare se poate face activ, prin vaccinare cu anatoxină tetanică,care intră în componenţa trivaccinului DTP (Diftero-Tetano-Pertussis) şi DT. VaccinulDTP conţine anatoxinele tetanică şi difterică şi corpi bacterieni inactivaţi de Bordetellapertussis. Imunizarea iniţială se face prin trei inoculări succesive la doua luni interval,după vârsta de două luni, apoi se fac rapeluri după un an şi la intrarea în şcoalaelementară.

Botulismul se poate manifesta în urma consumului de toxină eliberată în alimentecontaminate cu C. botulinum, sau în urma multiplicării C. botulinum la nivelulintestinului, în special la copii mici, sau prin contaminarea plăgilor cu C. botulinum.

În cazul botulismului se recomandă manipularea şi prepararea corectă aalimentelor. Fierberea in activează toxinele botulinice. Conservele bombate sau alimentelesuspecte organoleptic nu trebuie consumate.

8

lncubarea mediilor însămânţate se face timp de 24 de ore, la 36 ± 10 C.Aspectele sugestive pentru o infecţie cu Clostridii sunt:

• Absenta creşterii in aerobioză a unor microorganisme vizibile pe frotiu• Creşterea numai in zona anaerobă a unui mediu solid sau semisolid• Creşterea anaerobă pe medii selective cu Kanamicină sau neomicină 75-100

ug/rnl

Terapia cu ser hiperimun trebuie făcută cât mai repde după expunerea la toxinabotulincă, întrucât fixarea toxinei la terminaţiile nervoase este ireversibilă.

Gangrena gazoasă poate să apară ca urmare a inoculării transcutane de Clostridiidin pâmânt, praf etc. sau poate fi de origine endogenă.

Terapia gangrenei gazoase se făcea clasic prin administrare de ser de calhiperimun, dar terapia modernă apelează la terapia hiperbară, adică administrarea de aerîmbogăţit în oxigen pe mască, la marii traumatizaţi şi după intervenţii chirurgicale înzone intens colonizate cu anaerobi.

X. Diagnosticul de laborator:

Etapele schemei de diagnostic microbiologie sunt urmărite în cazul diagnosticuluide laborator al infecţiilor cu Clostridii, cu aplicarea particularităţilor menţionate încapitolul introductivş în ceea ce priveşte recoltarea, transportul, examenul diorect şiînsâmânţarea pe medii de cultură.

La examenul direct, reţinem aspectele macroscopice caracteristice: necroză, mirosde putrefacţie, singe lizat, cu culoare închisă, modificată. Pe frotiu se observă bacili Grampozitivi, care în cultură veche de cel puţin 48 h apar sporulaţi terminal în cazul C. tetani,cu aspect caracteristic de băţ de tobă, Uneori poate prezenta spori subterminali şi C.botulinum, iar C. difficile prezintă spori centreli sau subterminali (Fig. 6, 7, 8).

Însămânţarea se face obligatoriu pe medii prereduse pentru anaerobioză şipe medii pentru cultivarea aerobilor.

Dintre metodele speciale pentru distrugerea formelor vegetative si retinereasporilor: se pot folosi încălzirea in baie de apa, timp de de 10 minute, la 80 o C, aprodusului insamantat, adaugarea de volume egale de alcool etilic de 95 o, cu agitare etc.

Dintre mediile pentru anaerobi sunt utilizate: bulionul VF (Viande-Foie = carne-ficat), bulionul pentru anaerobi cu thioglicolat ca agent reducător, mediile cu sângeselective, cu ados de antibiotice pentru inhibarea bacteriilor aerobe. Controlul păstrăriipotenţialului redox corespunzător se face cu diverse substanţe care îşi schimbă culoareaprin oxidare, cum sunt: albastrul de metilen, sau resazurina, care îţi modifică culoarea înalbastru, respective roşu, în prezenţa oxigenului. Tuburile cu mediu lichid care seoxigenează la suprafaţă trebuie regenerate prin fierbere, pentru eliminarea oxigenului.

Pentru evidenţierea C. perJringens se utilizează mediul Nagler, cu gălbenuş deou.

9

Fig. 6. Clostridium tetani - Spori terminali, aspect în băţ de tobă

Fig. 7. Clostridium botu/inum - Spori subterminali

10

Fig. 8. Clostridium perfringens. Bacili Gram pozitivi, uneori in diplo, uneori dispuşi înlitere majuscule sau mici palisade. Nu se observă spori

Fig. 9. Clostridium difficile. Spori centrali

IdentificareIdentificare morfologică:

• Microsopică: Prezenta sporilor pe frotiu Gram din cultură veche de cel puţin 24 h.Stimularea sporulării se poate face prin cultivare pe mediu Nagler, iniţial la 36 ±lOC, apoi la temperatura camerei.

• Macroscopică:- Aspect frecvent hemolitic pe medii cu sange (C perfringens - hemoliza dubla)

- Fig. 10

11

- Aspect în umbrelă pe medii semisolide însămânţate la suprafaţă sau aspect pufosal coloniilor pe medii însămânţate în profunzime

Fig. 10. Hemoliză dublă pe agar cu ados de sânge la C.

Identificare biochimică şi enzimatică

Se efectuează o baterie largită de teste pentru cercetarea spectrului metabolic alclostridiilor, cum sunt: fermentarea zaharurilor, producerea de fosfolipaza-lipaza,degradarea aminoacizilor si proteinelor (ureaza, indoI, gelatinaza), degradarea lapteluiturnesolat (proteoliza + fermentarea lactozei), reducerea nitratilor la nitriţi, catalaza etc.

Clostridiile dezvoltă aspecte caracteristice după inoculare în lapte turnesolat, deexemplu C. perfringens formează un cheag alveolar.

C. perfringens produce lecitinaze şi lipaze, care dau un aspect caracteristic deprecipitat pe mediul Nagler, cu gălbenuş de ou. Testele de neutralizare a formăriiprecipitatului prin ser antiperfringens confirma identitatea bacteriei.

Teste de identificare rapidă

- Pentru orientare se pot folosi galerii (kit-uri) de primă generaţie, cu incubare înanaerobioză sau de a doua generatie, cu incubare in aerobioză (4 h).

- Gaz lichid cromatografia are ca principiu detectarea produşilor finali demetabolism, utilizând un detector de variaţie ionică.

- Tehnicile moleculare nu necesita izolare si identificare prin tehnici clasice.Presupun utilizarea sondelor moleculare si amplificarea acizilor nucleici prin PCR

• Dezavantajele tehnicilor rapide moleculare• Nu furnizeaza date privind viabilitatea

12

Genul Bacillus cuprinde bacili Gram pozitivi aerobi, care formează endospori.

• Nu furnizeaza date privind expresia genelor detectate• Importanta:

• Orientare rapida a diagnosticului• Studii de taxonomie• Identificare gene de virulenta, rezistenta la antibiotice, gene ce codifică

toxine etc.• Studii epidemiologice• Studii ecologice

Testarea sensibilităţii la antibiotice

Pentru Clostridii un este necesara efectuarea antibiogramei!Sunt în general sensibile la beta-Iactamine, Vancomicina (C. difficile).

Teste speciale

Aceste teste se efectuează doar în laboratoare de referinţă şi vizează punerea înevidenţă a toxinelor (tetanospasmina în culturi de Clostridium tetani pe şoarece; toxinebotulinice în aliment, fecale, ser, medii de cultură - test pe şoarece sau prin tehnicaELISA, care permite şi titrarea toxinei), diagnosticul serologie la om (ex. ELISA),evidenţierea C. difficile în fecale etc.

Genul Bacillus

1. Minidefinitie

II. Incadrare taxonomică

Domeniu: BacteriaPhylum: FirmicutesClasa: BacilliOrdin: BacillalesFamilie: BacillaceaeGen: Bacillus

Din anul 2004, taxonomia Genului Bacillus s-a diversificat, asfel incât o partedintre specii au trecut familii şi genuri distincte. Principalele specii patogene pentru omsunt: B. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis s.a.

III. Habitat

Bacilii din Genul Bacillus se multiplică în intestinul bovideelor, ovideelor etc., deunde sunt eliminate pe sol. Aici sporulează, iar sporii din praf şi de pe sol sunt reingeraţişi suferă din n ou un ciclu de multiplicare.

13

IV. Implicare în patologia umană şi/sau importanţă în bacteriologia medicală:O B. anthracis este agentul etiologie al antraxuluiO Alte specii (ex.B.cereus, B. subtilis, B. licheniformis) pot cauza infecţii cu alte

localizări: abcese, bacteriemie/septicemie, infecţii ale plăgii şi infecţii la arşi,infecţii otice, endocardite, meningite, infecţii oculare, osteomielită, peritonită,infecţii de tract respirator şi urinar.

O B.stearothermophylus (din 2004 Geobacillus stearothermophilus) este utilizatpentru controlul biologic al sterilzării.

O B. thuringiensis şi alte specii - sunt utilizate ca insecticide (ex. combatereaţânţarilor)

O Unele specii produc substanţe cu proprietăţi antibiotice: bacitracina, polimixina

De pe sol şi din praf sporii pot ajunge în contact cu omul pe cale cutanată saurespiratorie şi/sau cu produse alimentare, de unde pot fi ingeraţi.

AntraxulO Forme clinice:

• Antraxul cutanat (carbunele) - se manifestă cu escare cu edem, prinmanipularea materialului infectat - peste 95% din cazuri; incubare 1-3zile; stadiul initial - papula, stadiu tardiv - escara; edem intens in jur;istoric de expunere la animale sau la produsele lor (Fig. 1)

Fig. 1. Antrax cutanat

T.e. Dixon. et al. New England Journal of Medicine, 341:815-826 (1999)

• Antrax intestinal, prin ingestie de carne infectata• Antrax pulmonar, prin inhalare de material infectat (praf cu spori)

14

VII. PatogenieEtapele acţiunii toxinei B. anthracis sunt:

o Faze clinice:• Faza initiala: Simptome absente sau usoare: stare de rau, febra usoara

simptome gastrointestinale in boala gastrointestinala• Faza de multiplicare - producere de toxina in gangionii regionali si splina,

cu afectarea functiei gastrointestinale; Toxina eliberata cauzeazainsuficienta acestor organe, in special splenica

• Insuficienta organica cauzeaza debutul brusc al bolii hiperacute cu:dispnee, cianoza, febra inalta, dezorientare, soc, coma si moarte in catevaore. Faza este inalt bacteriemica, dar uneori la om hemocultura poate finegativa

V. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza sidiagnosticul microbiologie

Bacteriile din Genul Bacillus sunt bacili Gram pozitivi, care pot deveni Gramnegativi in culturi imbatranite, de dimensiuni mari, mobili prin flageli peritrichi (B.anthracis imobil), sporulati, cu sau fara capsulă (B. anthracis are capsulă), aerobi,facultativ anaerobi, catalaza +, unele specii sunt hemolitice, activi pe diverse substraturiorganice. Majoritatea speciilor sunt saprofite, formează endospori rezistenţi la condiţiiostile fizice şi chimice.

Au proprietati fiziologice care le confera capacitatea de supravietuire in mediinefavorabile: nisipuri desertice, soluri arctice, ape dulci, sediment marin.

Unele specii sunt termofile, altele sunt psichrofile, acidofile, alcalifile,halotolerante, şi halofile - gama larga de temperaturi, pH, concentratii de NaCI la carepot supravietui.

VI. Factori de patogenitatePrincipalii factori de patogenitate ai B. anthracis sunt:- Capsula polipeptidica (acid poliglutamic), care conferă protecţie antifagocitară- Toxina produsa in faza logaritmica de crestere, formată din 3 proteine:

a. antigenul protector (PA),b. factorulletal (LF),c. factorul edematiant (EF)

În cazul B. cereus, factorii de patogenitate cu importanţă în patogenia bolii sunt:- Proteina complexa care cauzeaza:

• Necroza cutanata si a mucoasei intestinale• Acumulare de lichid in intestin (diaree in toxiinfectii alimentare severe)• Actiune toxica letala

- Doua hemolisine: cereolisina - toxina necrotica si letala si o alta hemolizina cumecanism putin cunoscut- Fosfolipaze - factor de exacerbare prin degradarea membranelor celulare

15

o Activarea antigenului protector (PA) de catre proteazele gazdei aflate in sange sipe suprafata celulelor eucariote, prin taierea unui fragment si expunerea situsuluide legare pentru factorul letal (LF) si factorul edematiant (EF)

O Complexul PA + LF sau PA +EF este internalizat prin endocitozaO Factorul edematiant (EF) este responsabil de edemul caracteristic din antrax, fiind

o adenilat ciclaza dependentă de calciu (Fig. 2)

Fig. 2. Mecanisme patogenice în antrax

Cutansoua Pulrnonarv

1.0w-t'1!V'1!1 germ ination andgrowtl1 at onesite lead to local

edema anei necrotic lesion.

Low-level germ ination atone site leeds te rnassjve

effusicn, 111 ucosalederna, anei necrotic lesion.

oW Q

o

~~spore

MaCrOPhage---~ ~,

Bacillus ~). l' {'I

Bacterial vi rlilence"fac~4c8pSllle-------j

ExotoxinsOthertacrors

Regional Iymph node

Regional hernorrhaqic lvrnphadanltis

.~ l.vrnphatic OI'

".", hernatoqe nousMenlngitis spread

;1:' ""=-.~

Septicemia. toxsmie

ShockDeath Death

Efectele acţiunii factorului edemaţiant (adenilatciclaza):

./ Cresterea nivelului [cAMP]

./ Perturbarea functiilor celulelor imune efectoare

./ Perturbarea fagocitozei

16

Ederna toxin Lethal toxin

••ATP rvlAPKKP or others)I

cArvlP

Toxsrnla

TNF-a+interleukin-l{3+othsr cytokines

~[+ k~'l0G.··..tDeath

Pulmonsrvlvmphatic blockage

Pulrnonarvederna

Death

./ Perturbarea raspunsului chemotactic

./ Perturbarea producerii de citokine

Factorulletal acţionează ca o kinază a MAP kinazelor din organismul gazdei.MAP kinaze = Mitogen Activated protein kinaze = protein-kinaze specifice carerăspund la stimuli extracelulari (mitogeni, stress osmotic, şoc termic şi citokineproinflamatorii) şi reglează diferite activităţi celulare, cum sunt: expresia genelor,mitoza, diferenţierea celulară, proliferarea şi supravieţuirea celulelor/apoptoza. Toateaceste procese suferă dereglări cu consecinţe grave asupra funcţionării proceselorcelulare normale.

VIII. Raspunsul imun

În antrax, pentru obţinerea imunităţii protectoare este necesară prezenţaanticorpilor impotriva componentelor toxice, in special a antigenul protector.

Aceşti anticorpi pot fi obţinuţi prin administrarea de vaccinuri acelulare pentruom, respectiv vaccinuri cu spori vii pentru animale.

Capsula poli-D-glutamica a B. antracis este slab imunogena. Anticorpii anti-polizaharid si a altor componente ale peretelui celular nu sunt protectori

Raspunsul imun in forma digestiva este putin cunoscut. Nu s-au dezvoltatvaccinuri, fiind forme rare

IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie

• Antraxul este cauzat de Bacillus anthracis.• Modul de transmitere: contact direct cu ierbivore infectate sau prin produsele lor;

animalele ierbivore, gazdele primare ale B. anthracis, contracteaza infectia priningestia sporilor de pe plantele furajere (Fig. 3); sporii provin din sol sau praf sausunt depusi pe plante de insecte care au consumat carne dintr-o carcasa infectata

• Grupe la risc: persoane care vin in contact cu animale infectate sau cu produselelor

17

~~-~~~~~~~

lvlultiplication .of bacilU4 Germination \.

. t.~.:.'~.;.~.l..e"S-Layer

'Stres~, Jbtl,'Ii.;:I..!

Fig. 3. Ciclul natural al B. anthracis

Q Q (iOilO {)

SpoeesM. Mock, A. Fouet, Annu. Rev.Microbio: 55: 647-671 (2001)

• Episoadele de toxiinfectie cu B. cereus apar sporadic dupa ingestie de alimentecontaminate in care bacteria se multiplica abundent in conditii de stocareincorecta a alimentelor

• Majoritatea apar ca infectii secundare sau mixte la indivizi imunodeficienti sauimunocompromisi (alcoolism, diabet), dar pot sa apara si la indivizi sanatosi

X. Diagnosticul de laborator

Principalele prelevate sunt: secretii din leziuni cutanate, ganglioni regionali,sputa, materii fecale, alimente suspecte, LCR, probe necroptice, sange etc. Pentrucreşterea şanselor de izolare se pot aplica tehnici asemănătoare cu cele de la clostridii,cum sunt Încălzirea sau tratamentul cu alcool de 95 o C.

o Examen microscopic direct• Frotiuri din prelevate se colorează cu AM policrom (coloratie M'Fadyean):

bacili caracteristici, Gram pozitivi, cu capetele taiate drept, de dimensiunimari, (1-1,5 Jlm/3-10 urn), formand lanturi lungi; incepe procesul desporogeneza (sporul este oval, situat central, mai mic decat grosimeabacilului respectiv) - Fig. 4

18

Fig. 4. Frotiu prelevat cobai decedat cu antrax, col. M'Fadyean albastru de metilenpolicrom) capsula ia culoare roz in jurul bacililor albastru inchis (C) Capete taiate drept.

o Cultivare - teste de identificare:O Aspect colonii:

• pe geloza -sange la 37 o C: colonii R, cenusii sau albe,nehemolitice, cu aspect de sticla pisata; cel putin 3 mmdiametru, uneori aspect de coada, coama sau medusa (Fig.5)

• Medii selective (PLET = Polimixina, Lizozim, EDTA,acetat de Thaliu): colonii S, mici; tratare cu alcool sautratare termica pentru separare din amestecuri

O Aspect microscopicO Catalaza +O Sensibilitate la fagul gammaO Sensibilitate la Penicilina (desi au aparut si tulpini rezistente)O Patogenitate: Formarea capsulei - agar nutritiv cu bicarbonat de

sodiu in mediu anaerob- coloratie AM policrom; patogenitate pesoarecele alb

O Identificare biochimica:O Catalazo-pozitivO Testullecitinazei pozitivO Sensibil la penicilina ( R: B. cereus, B. subtilis)

O Teste moleculare

19

Fig. 5. aspect de cometă al coloniilor de B. anthracis pe geloză-sânge

In Parker MT, Duerden BI (eds):Systematic Bacteriology. Topley and Wilson's Principles ofBacteriology,Virology and Immunity. VoI. 2. Edward Arnold, Sevenoaks, England,1990, with permission.)

Teste de patogenitate: in vitro (capsulogeneza) sau in vivo, pe soareceTestarea sensibilităţii la antibiotice:

O De regula sensibil la Penicilina, Eritromicina, TetraciclinaO Nu se face antibiograma, de obiceiO Pot sa apara forme rezistente la Penicilina la B. anthracis

Diagnosticul retrospectiv al antraxului la animale se face prin reacţia Ascoli, carepune în evidenţă prezenţa antigenului extras din organe de animal decedat cu suspiciunede antraxcu ajutorul anticorpilor specifici din serul anticarbunos (vezi lucrări practice -reacţia de precipăitare în inel)

Genul Listeria

1. Minidefinitie

Bacteriile din Genul Listeria care pot deveni patogene pentru om fac parte dinGrupul II de specii încadrate în Genul Listeria şi sunt cocobacili Gram-pozitivi.

Listeria monocytogenes, specia tip, este facultativ intracelulară, cu dispoziţie înlanturi scurte. Difera de alti Gram pozitivi, deoarece contine o molecula chimic sibiologic similara lipopolizaharidului clasic, lipopolizaharidullisterian. Este implicată înafecţiuni digestive uşoare sau în afecţiuni invazive la persoane cu imunitate scăzută. Celmai afectat este embrionul sau fătul, în cazul în care gravida contractează boala în timpulsarcmu.

20

V. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza sidiagnosticul microbiologie

II. Incadrare taxonomică

Domeniu: BacteriaPhylum: FirmicutesClasa: BacilliOrdin: Bacil/alesFamilie: ListeriaceaeGen: Listeria

Speciile care pot deveni patogene pentru om,încadrate în grupul II de specii carefac parte din Genul Listeria sunt: Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeriaivanovii, mai rar Listeria selingeri.

III. Habitat

L. monocytogenes este ubiquitara. Se poate izola din sol, vegetatie, apa, tractulgastrointestinal al animalelor.

IV. Implicare in patologia umana

Îmbolnăvirea se produce prin ingestia de alimente contaminateşi poate fi urmatăde avort fără simptome de boală la gravidă sau boala la indivizi cu imunitate scăzută.

Categoriile cele mai expuse la risc sunt: fatul, nou-nascutul, pacienti cu neoplazii,gazdele imunocompromise.

Listerioza neonatala poate îmbrăca 2 forme:cu debut precoce = granulomatosus infantiseptica - abcese organicemultiple, frecvent avort (transmitere transplacentara)cu debut tardiv (transmitere la nastere sau imediat dupa) - meningita saumeningoencefalita cu sepsis in 2-3 saptamani

Boala la adult: simptome respiratorii pseudogripale si/sau tulburaregastrointestinala usoara. Frisoane si febra datorate bacteriemiei; la imunosupresatipoate produce boala severa, (ex. meningita la pacienti cu cancer, transplant renal)

Cocobacili Gram pozitivi, facultativ anaerobi, mobili la temperatura camerei,formeaza colonii beta-hemolitice pe geloza-sange si colonii albastre-verzui translucidesau incolore pe medii solide fără sânge.

Microorganismele se dezvoltă în condiţii optime la 30 o C, dar pot creste la 4°C,astfel că replica rea continua in alimentele aflate la frigider (psichrofilie). Izolarea inlaborator poate utiliza o tehnica de imbogatire la rece.

21

Listeriolizina o are activitate de hemolizină şi facilitează supravieţuireaintrafagocitară aL. monocytogenes.

Alţi factori de patogenitate sunt: proteina M Streptococcus-like, lecitinaza,fosfolipaza C.

VI. Factori de patogenitate

VII. PatogenieDupa infectarea celulelor macrofage sau parenchimatoase, scapa din vacuole sau

fagozomi (prin acţiune a Listeriolizinei O), si se divide rapid in citoplasma, dupa carecapata o capsula formata din filamente scurte de actina. Aceste filamente sereorganizeaza sub forma unei cozi lungi, care se extinde dintr-unul din capetele bacteriei.Coada faciliteaza miscarea bacteriei prin citoplasma, la suprafata celulei. La periferiacelulei se pot forma protruzii, care penetreaza celulele vecine si le invadeaza. Astfelmicroorganismele evita expunerea la agenti antibacterieni umorali (e.g. complement,anticorpi etc.). - Fig. 1

Sunt distruse de macrofagul activat.

VIII. Raspunsul imun

Imunitatea este mediată cellular.

IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie

22

x. Diagnosticul de laborator

Boala se transmite prin alimente contaminate. Cele mai frecvente surse sunt:branza, varza, laptele, carnea. Listeria se multiplică şi în alimentele păstrate la frigider.

Tratamentul si cotrolul îmbolnăvirii în caz de suspiciune de expunere la alimentecontaminate se face cu beta+lactamine (ampicillină) în monoterapie sau în combinaţie cugentamicina.

Prelevatle pot fi: secretii faringiene, nazale, uneori produse recoltate din leziuniextrarespiratorii, sange si/sau LCR, lichid amniotic, placenta, tesut fetal, materii fecale,secretii genitale, alimente, probe din mediul extern

Cea mai gravă formă de boală la adult este meningita. La examenul LCR seobservă hematii şi monocitoză.

La examenul direct din prelevate, pe frotiuri colorate: Gram şi AM se observăcoco-bacili gram pozitivi, de dimensiuni mici, izolaţi sau în lanţuri scurte, intra şiextrace 1ular.

Microorganismul se izolează uşor, pe medii uzuale, la temperatura optimă de 30 oC. Pentru produse contaminate se pot utiliza medii selective cu antibiotice (ac. nalidixic)sau îmbogăţirea la rece.

Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, caracterelor de cultură(miros de lapte acidulat, colonii S cu aspect de picături de rouă, hemoliza pe agar-sânge,psichrofilie), precum şi pe baza caracterelor biochimice (test CAMP cu tulpină de S.aureus pentru 1. monocytogenes, catalază pozitiv, API-Listeria, API-Strep) şi antigenice(serotipare).

Patogenitatea se poate determina in vivo pe iepure sau cobai (sac conjunctival),şoarece, ou embrionat.

În scop epidemiologic se poate efectua tipizare bacteriofagică, moleculară.Antibiograma este indicată mai ales în infecţiile grave, invazive. Pentru meningite

este necesară testarea prin metode de determinare a CMI.

23