,,--------------------------------"l

StructuralRegleaza presiunea osmoticaFavorizeaza schimburile cu mediulCatalizatori in reactii enzimatice - rol metabolicReglarea pH si potentialului redox

Curs III. Fiziologia bacteriană. Metabolismul bacterian

1. Compoziţia chimică a bacteriilor2. Nutriţia bacteriană. Cerinţe nutritive3. Factori ce influenţează ce influenţează creşterea bacteriană4. Metabolismul bacterian

1. Compoziţia chimică a bacteriilor

Compoziţia chimică a bacteriilor este controlată genetic. Totuşi. ea diferă îndiverse momente ale existenţei bacteriilor, în funcţie de relaţia dintre informaţia geneticăşi factorii de mediu. Acest aspect derivă din extraordinara capacitate de adaptare abacteriilor la condiţiile mediului ambient.

Principalele elemente constitutive ale bacteriilor sunt:a. Apa - constituie aprox. 80% din greutatea umeda a bacteriei

Forme:Apa liberaApa legata fizico-chimic (forma exclusivă la spori)

Rol:Mediu de dispersieReactivDerivat final al unor procese metabolice

b. Substanţele minerale - constituie 2-30% din greutatea uscată a bacterieiElemente:

Na, K, P, S, Ca, CI, FeOligoelemente: Cu, Zn, Mg - rol de catalizatori

Rol:

c. Glucidele - constituie 10-25% din greutatea uscată a bacteriei, funcţie de vârstă,specie, condiţii de mediuForme:

Glucide simplePolizaharide, glicopeptide

Rol:StructuralMetabolic - metabolismul glucidicImportanţă în identificarea biochimică

d. Proteinele - constituie 40% - 80% din greutatea uscată a bacteriei, funcţie devârsta, specie, condiţii de mediuForme:

Holoproteine - proteine simpleHeteroproteine - glicoproteine, cromoproteine, nucleoproteine

Rol:StructuralEnzime

Bacteriile pot sintetiza mii de enzime, implicate în procese metabolice complexe.Aceste enzime pot fi clasificate în funcţie de mai multe criterii:

• După locul de actiune:enzime intracelulare sau endoenzime;enzime ectocelulare - în membrana citoplasmatică; au rol înpermeabilitatea selectivă (permeaze, translocaze);enzime extracelulare sau exoenzime - eliberate în mediu (hidrolaze)

• Dupa reactia catalizată:hidrolaze (fosfataza, proteaza);transferaze (aminotransferaza);oxido-reductaze (catalaza, oxidaza, peroxidaza);izomeraze etc.

• După rol:constitutive - există întotdeauna în celulă indiferent de natura mediului;

- adaptative (inductibile) - gena care codifică sinteza se activează carăspuns la anumiţi compuşi din mediu (ex. penicilinaza, lactaza etc.).

Enzimele bacteriene au un rol natural în circuitul substanţelor organice şi au fostvalorificate într-o serie de procese biotehnologice, cum sunt: degradarea deşeuri lor,procese industriale, medicină

Enzimele bacteriene sunt utilizate de asemenea în taxonomia bacterianaă, pentruidentificarea biochimică a bacteriilor

Fosfolipide - ex. TreponemaLipidul A - component structural al membranei exteme la GramnegativiAcizi grasi, ceruri - reprezentate în special la mycobacterii

e. Lipidele - constituie 1-10% din greutatea uscată a bacteriei, cu variaţii în funcţiede vârsta, specie, condiţii de mediu; la mycobacterii proporţia lipidelor ajungepână la 40%Forme:

Rol:Structural (perete bacterian, membrane celulare)Substanţe de rezervă (vacuole)

f. Pigmenţii - componente prezente la bacteriile cromogenePot fi clasificaţi în funcţie de mai multe criterii:După localizarea pigmentului bacteriile pot fi:

cromofore, când pigmentul rămâne în citoplasmă;

2

"".

paracromofore, când pigmentul este prezent în perete sau în stratulmucos (Ex. S.aureus);cromopare, când pigmentul este difuzibil în mediu (Pseudomonas).

După natura lor chimică pigmentii pot fi:carotenoizi: Staphylococcus, Sarcina; .chinoinici: Mycobacterium;fenazinici: Pseudomonas etc.

Rol:Protectie faţă de raze UV, compuşi toxici de oxigen (ex. pigmentii carotenoizi)EnzimaticAntibiotic: Ex. Piocianina Pseudomonas aeruginosa fata de B. anthracis

g. Antibiotice - exemple:- Bacteriocine:

• Codificate plasmidic• Efect pe bacterii înrudite: colicine, megacine

- Antibiotice polipeptidice:• Polimixina - produs de Bacillus polimyxa• Bacitracina - produs de Bacillus liqueniformis etc.

h. Vitamine:- tiamina (vitamina B 1) sintetizată de E.coli, B.subtilis- biotina produsă de E.coli, B.anthracis- vitamine de grup B, K etc.

i. Factori de creştere :Metaboliti esentialiNecesari in cantitati miciCatalizatori (Ex. Factorii X si V la Haemophilus injluenzae)

2. Nutriţia bacteriană. Cerinţe nutritiveNutriţia bacteriană este procesul de asimilare de către bacterii a substanţelor

nutritive organice sau anorganice din mediul extern, necesare obţinerii energiei necesarevieţii, procesului de sinteză a elementelor constitutive necesare creşterii bacteriene,procesului de multiplicare, întregului metabolism energetic şi funcţional, catabolic,anabolic etc. al bacteriei.

Dintre procesele implicate în nutriţia bacteriană fac parte:• Solvirea - în cazul mineralelor, C02, 02;• Digestia extracelulară cu ajutorul hidrolazelor, cu obţinerea de compuşi simpli:

aminoacizi, monozaharide, acizi grasi si glicerol etc.• Traversarea membranei celulare:

prin difuziune simplă - dependentă de gradientul de concentraţiedifuziune facilitată (prin proteine carrier) - dependentă de gradientul deconcentraţietransport activ, contragradient, cu consum de energie (pompe)

Cerinţe nutritive ale bacteriilor:Pentru.supravieţuire, bacteriile au nevoie de o serie de elemente chimice, între care:

3

.:. Sulf, fosfor: intră în componenţa aminoacizilor, enzimelor, vitaminelor,fosfolipidelor etc .

•:. Minerale: Fe, care intră în componenţa unor enzime, pigmenţi etc.;bacteriile intră în competiţie cu gazda şi dispun de mecanisme deconcentrare şi fixare a fierului (ex.siderofori)

.:. Na, CI, Mg, K, Ca - importante în asigurarea echilibrului fizico-chimic şiacidobazic, în asigurarea mediului de reacţie pentru unele enzime(catalizatori - Mg, Ca etc.)

.:. Sursa de carbon si/sau azot.În funcţie de modul de raportare la aceste substanţe, bacteriile se clasifică în:

Auxotrofe (C02 sau azot anorganic). În funcţie de sursa de energie,acestea pot fi : fototrofe (energie luminoasă) sau chimiotrofe (energie dinreacţii de oxidoreducere); sunt bacterii saprofite, libere în naturăHeterotrofe (carbon organic, azot organic sau anorganic):

• Fixatoare de azot: carbon şi azot din surse organice sub formămoleculară - trăiesc în sol - Ex. Clostridium

• Carbon organic, azot anorganic: Ex. E. coli• Carbon şi azot organic complex: microorganisme care trăiesc în

cavităţile organismului uman, saprofite, dar şi patogeneMixotrofePrototrofe: cer compuşi complecşi (vitamine, aminoacizi etc.), suntbacterii fastidioaseParatrofe - bacterii care trăiesc numai în interiorul unei celule vii; nu secultivă pe medii artificiale (Rickettsia, Chlamydia, Mycobacteriumleprae) .

•:. Oxigen - în funcţie de relaţia cu oxigenul, microorganism ele pot fi:Strict aerobe: ex. Pseudomonas, Mycobacterium tubersulosisMicroaerofile: ex. Campylobacter piloriFacultativ anaerobe: majoritatea patogenilorStrict anaerobe: ex. clostridiile

Toleranţa la oxigen• 02 este un compus toxic pentru bacterii, dacă nu poate fi redus la H20 (prin

câştigarea a 4 electroni)• 02 "fură" electroni, pe care îi ataşează progresiv, formând radicalii liberi de 02

(02 -= superoxid; H202 = peroxid de H; OH-= hidroxil; H20 = apa)• Consecinţele acţiunii compuşilor toxici de oxigen:

Oxidarea compuşilor chimiei- Distrugerea moleculelor de ADN- Pierdere de energie

• Pentru inactivarea radicalilor toxici este necesar ca bacteria să dispună de unaparat enzimatic: catalaza, peroxidaza, superoxiddismutaza. În caz contrar, ele nupot supravieţui în prezenţa oxigenului

4

3. Factori ce influenţează ce influenţează creşterea bacterianăExistă o serie de factori fizici care influenţează creşterea bacteriană:

• pH neutru;• Temperatura în jurul celei fiziologice a organismului uman;• Presiunea osmotică izotonă

pH neutru:• Exceptia 1 - suportă pH acid:Helycobacter pylori (şi fungii - excepţie Candida albicans)Mecanisme

PMF (Proton Motive Force) = gradientul electrochimic al protonilor lanivelul membranei celulare - constă într-un gradient protonic si odiferenţă de potenţial electricH pylori creşte mai bine la pH neutru si NU supravietuieste la pH sub 4.0sau peste 8.2 in absenţa unor substanţe chimice, ca de exemplu ureea; dacăn-ar produce ureaza, s-ar comporta ca un microorganism obişnuit, carenecesită medii cu pH neutru)H pylori sintetizează cantităţi mari de urează dimeră (10 - 15% dincantitatea de proteină totală), cu optim de activitate la pH neutru. Ureazaasigură alcalinizarea mediului extra şi intracelular

• Excepţia 2 - suportă şi preferă pH a1calin:Vibrio• Celulele adaptate pentru mediu alcalin au rezistenţa crescută şi la alţi factori de

stress: caldură, crystal violet, acid deoxicolic, peroxid de hidrogenTemperatura: majoritatea patogenilor sunt mezofili; se utilizează temperaturi joasepentru conservare: liofilizare, stocare la - 80 o C

• Exceptia 1: Listeria - psichrofilă (iubeşte temperaturile joase);• Exceptia 2: Pseudomonas - psichrotropic (are tropism faţă de

temperaturile joase) - se multiplică la - 18 o C în zaharuri concentrate• Exceptia 3: Bacterii termofile: Termophilus aquaticus

Listeria poate invada organismul pe cale digestivă, prin alimente contaminateinsuficient preparate termic sau alimente care nu se prelucrează termic (ex. pâine),care au venit în contact cu suprafeţe pe care s-au tranşat alimente crude, contaminatecu Listeria. Ajunge în circulaţie, unde frecvent o găsim în interiorul celulelor.Produce toxine cu efect citotoxic.

Are tropism pentru SNC, mai ales la persoane imunodeficitare, putând cauzameningita sau encefalita. La gravide există susceptibilitate la infecţie; uneori esteafectat doar fătul, producându-se avort spontan, moarte intrauterină a produsului deconcepţie înainte de naştere sau septicemie a nou nascutului

Termophilus aquaticus trăieşte adaptat în izvoare fierbinţi: Taq polimerazaprovenită de la Termophilus aquaticus este utilizată în PCR, pentru că poate catalizareacţia de polimerizare a nucleotidelor la temperaturi înalte.Presiunea osmotica (mediu izo, hiper, hipotonic)

- Influenţată mai ales de concentraţia zaharurilor si NaCI-Exceptia 1: stafilococii sunt halotoleranţi (tolerează concentraţii înalte de Na CI-

până la 7,5%)

5

/

Excepţia 2: Vibrio parahaemolyticus este halofil;Excepţia 3: E. coli enterohemoragic - tolerează concentreţii înalte de sorbitol;

această proprietate este utilizată pentru a separa E. coli enterohemoragic dinamestecuri polimicrobiene (ex. fecale).4. Metabolismul bacterianMetabolismul bacterian poate fi definit ca totalitatea reacţiilor biochimice care au locîntr-o celulă bacterianăAceste reacţii biochimice îndeplinesc următoarele funcţii:

• Degradarea compuşilor complecşi proveniţi din mediu în substanţenutritive primare

• Eliberare şi stocare de energie• Obţinerea subunităţilor monomere necesare sintezei componenţilor

celulari, pornind de la substanţe le nutritive primare• Activarea subunitatilor monomere folosite pentru sinteza

constituentilor celulari macromoleculari, conform informaţiei geneticea celulei

• Formarea şi degradarea biomoleculelor necesare diferitelor funcţiicelulare

Schematic, putem descrie trei tipuri de căi metabolice majore:Calea catabolicăCalea anabolicăCalea amfibolică

Calea catabolică reprezintă degradarea compuşilor internalizaţi din mediu, însoţităde eliberarea şi/sau stocarea de energie.Catabolismul constă în:

Degradarea compuşi lor în molecule constitutive (aminoacizi, zaharuri etc.)Degradarea incompletă a moleculelor simple şi reactii de fermentaţie cuobţinere de alcool, acid lactic, butiric etc., in funcţie de specia bacterianăşi particularităţile metaboliceDegradare completă a compuşilor intermediari la CO2 şi H20 în cazulbacteriilor aerobe

Există căi metabolice particulare de degradare incompletă a glucidelor la bacterii,care caracterizează procesul de fermentaţie, în care acceptorul de electroni este unprodus intermediar al căii metabolice:• Calea Embden Meyerhoff sau calea hexozomonofosfatului - este o cale anaerobă

constînd dintr-o suita de reacţii, care duce la degradarea glucozei la 2 molecule depiruvaţi, cu sinteza a două molecule de adenozintrifosfat (ATP); este întâlnită şi laeucarioate.Lactobacilii reduc piruvatulla acid lactic (lactat); fungii reduc piruvatul la

etanol şi C02. La alte bacterii, produşii finali diferă în funcţie de specie, de tipulrespirator etc., putând fi un acid (formic, oxalacetic, propionic, acetic etc.) sau unalcool (etanol, isopropanol, butanol etc.).

Profilul de fermentare a zaharurilor este utilizat în diagnosticul microbiologiepentru identificarea biochimică a bacteriilor.

6

'" \

Alături de ciclul acizilor tricarboxilici, Calea Embden-Meyerhoff constitureprincipalele surse de energie şi metaboliţi intermediari care pot fi utilizaţi ulterior însinteza unor compuşi proprii: aminoacizi aromatici, acizi nucleici, vitamine etc.• Calea fosfoketolazei sau calea heterolactică, este legată de şuntul hexoză-pentoză,

compuşii finali fiind acidullactic şi etanolul, cu producerea unei singure moleculede ATP, ca urmare a fosforilării înainte de clivajul enzimatic.

• Calea Entner-Doudouroff se aseamănă cu Calea Embden - Meyerhoff ca produşifinali, dar fosforilarea ATP apare înainte de clivajul enzimatic, ca şi în cazul căiiheterolactice, ceea ce face ca energia obţinută să fie mai mică (doar 1 moleculă deATP). Furnizează rezerve de precursori, vitamine pentru sinteza ADN si ARN

În cazul respiraţiei, caracterizată prin degradarea completă a glucidelor la C02 şiH20 sunt necesare: funcţionarea ciclului acizilortricarboxilici, un sistem de transport alelectronilor asociat membranei celulare, precum şi un acceptor de electroni final, exteriorcelulei bacteriene.

În cadrul respiraţiei aerobe, acceptorul final de electroni este 02, în timp ce în cazulrespiraţiei anaerobe, acceptorul final de electroni poate fi: S02, S, N03 sau N02, alţicompuşi anorganici sau organ ici (ex. fumaratul).

La nivelul membranei există o ATP-ază, care catalizează sinteza ATP în procesul defosforilare prin transport de electroni (fosforilare oxidativă).

Dintre bacteriile care utilizează acceptori finali de electroni exteriori, cele carefolosesc H2, N02, H2S, S2, CO, etc., intervin în ciclul natural al materiei vii.

După modul de utilizare al diverselor căi de degradare a compuşilor glucidici,bacteriile pot fi::

Strict aerobe: Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, B.anthracis - nu pot trai in absenta oxigenuluiStrict anaerobe - procesul unic de degradare a glucidelor este fermentaţia:Clostridii, Bacteroides etc. - mor în prezenţa oxigenuluiAerobe, facultativ anaerobe: majoritatea bacteriilor patogene pentru om -funcţioneayă atât prin repiratie, cât şi prin fermentaţieMicroaerofile - preferă şi se dezvoltă mai bine în concentraţii de 02 maimici decât cea atmosferică: Neisseria, Brucella, CampylobacterAerotolerante - folosesc fermentaţia, dar se pot dezvolta în prezenţa 02

• Calea anabolică:Căile metabolice centrale, glicoliza şi ciclul acizilor tricarboxilici sunt parcurse în

sens catabolic sau anabolic. Astfel, atunci când sunt parcurse în sens anabolic, ele conducla sinteza precursorilor pentru biosinteza materialului celular.

Atunci când Calea Embden-Mezerhoff sau Ciclul acizilor tricarboxilicifuncţionează în aşa fel încât produc energie, dar şi produşi intermediar necesari sintezelorcelulare, vorbim despre "căi amfibolice".

Soarta compuşilor simpliCompuşii simpli rezultaţi din degradarea substanţelor nutritive din mediu sau din

procesele metabolice interne suferă transformări biochimice în sens catabolic sauanabolic, în funcţie de necesităţile de moment ale celulei bacteriene.

• Aminoacizii pot suferi procese de transaminare sau dezaminare. Dupădezaminare, ei pot intra în ciclul Krebs, putând fi degradaţi pâna la Co2 şi H20.

7

• Unicelular• Necompartimentat, datorită lipsei organitelor celulare• Plasticitate: adaptare la diferite tipuri de substanţe nutritive• Flexibilitate: utilizarea aceluiaşi substrat în mai multe căi distincte, dar intricate• Eficienţa maximă

• Bazele purinice si pirimidinice sunt degradate cu ajutorul endo şi exonucleazelor,fiind utilizate ca ca sursă de carbon; sinteza lor se face, în fazele anabolice, atomcu atom

• Glicerolul şi acizii graşi provenişi din lipide sub acţiunea lipazelor pătrund ânciclul Krebs, pentru a fi degradate la Co2 şi H20. În fazele anabolice, sintezaacizilor graşi se face sub acţiunea enzimelor Acetil-Coenzima A carboxilaza şiacid gras sintetaza.Biosinteza glucidelor compuse, a proteinelor şi a acizilor nucleici, sau

metabolismul intermediar sunt similare la toate organismele.În cazul glucide lor este vorba despre procese de polimerizare-complexare cu

fosfaţi, proteine etc.Aminoacizii necesari sintezei proteinelor provin din diferite surse, dintre care cele

mai importante sunt: acidul piruvic, acidul alpha-cetoglutaric şi acidul oxalacetic.Nucleotidele sunt sintetizate pornind dela ribozo-fosfat, iar acidul

adenozintrifosforic (ATP) şi Nicotin-Amin-Dinucleotidul (NAD) fac parte şi dinmetabolismul nucleotidelor. Triozo-fosfaţii sunt în acelaşi timp presursori ai glicerolului,iar Acetil-Coenzima A este principalul precursor allipidelor.

Vitaminele şi coenzimele sunt sintetizate în diferite căi derivate din metabolismulcentral.

Astfel, produsele intermediare pot participa la sinteza blocurilor de construcţie,monomerii, aşa cum se întâmplă cu: glucozo-6-P, pentozo-P, tetrozofosfaţii,triozofosfaţii, 3-fosfogliceratul, serina.

Monomerii sunt ulterior polimerizaţi, pentru a da naştere polimerilor: proteineleşi acizii nucleici pe matrice, iar lipidele şi carbohidraţii prin procese enzimatice.

Sinteza proteinelor se realizează pe matricea de ARNm, cu sprijinul ARNribozomal şi ARN de transfer. Lanţul polipeptidic creşte la nivelul situsului P al ARNm,în timp ce noul radical aminoacil este adăugat la nivelul situsului A al ARNm.

Ribozomii, prin diverse structuri ale subunităţilor lor sunt ţinta de acţiune a unoradintre antibiotice.

Polimerii suferă ulterior procese de autoasamblare.• O variantă particulară a metabolismului celulei bacteriene se realizează în condiţii

în care are loc o aprovizionare permanentă cu metaboliţi deficienţi. Această variantăpoartă numele de "cale anaplerotică".

Particularităţile metabolismului bacterian:

8