METODE DE TESTARE

A VITAMINEI D

Dr. Cristina Mambet

DETERMINĂRILE SERICE DE VITAMINA D

Motivele creşterii marcate în ultimii ani a testelor

de laborator care măsoară concentraţia serică

de 25-0H vitamina D:

→ preocuparea ↑ pentru dg. şi tratamentul osteoporozei

→ prevalenţa ↑ a deficitului de vitamina D în multe populaţii

→ descoperirea unor semnificaţii biologice noi dincolo de

rolul clasic în reglarea metabolismului mineral şi osos

Adaptare după Le Goff et al. Ann Biol Clin 2015

Schema simplificată a metabolismului vitaminei D

25 hidroxivitamină D3

Rinichi CYP24A1 Rinichi CYP27B1

24, 25 hidroxivitamină D3 1, 25 dihidroxivitamină D3

Şi alte ţesuturi în afară de rinichi au

posibilitatea să hidroxileze 25

hidrovitamina D3 în metaboliți dihidroxilați. Totuși factorii care

controlează aceasta sunt diferiți.

DBP: proteină carrier a vitaminei D; CM: chilomicroni; VLDL: lipoproteine de densitate foarte slabă; D3: colecalciferol; D2:

ergocalciferol; CYP: citocrom; Ca++: calciu ionizat; Pi: fosfat anorganic; FGF23: factor de creștere fibroblastică; PTH:

parathotmon.

D3

10%90%

D3 +D2

METABOLIŢII INACTIVI AI VITAMINEI D

1,25(OH)2D ↑ expresia CY24A1 care metabolizează 25(OH)D şi

1,25(OH)2D în metaboliţi inactivi hidrosolubili ce vor fi excretaţi urinar

şi biliar → se leagă de VDBP şi pot interfera cu unele teste de

determinare 25(OH)D

Zimmerman DR et al. Arch Biochem Biophys 2001

UTILITATEA DOZĂRII 25(OH)D

NIVELUL SERIC 25(OH)D – PARAMETRU DE ELECŢIE

PENTRU VERIFICAREA STATUSULUI VIT. D:

→ reflectă vit. D totală (D3 + D2) derivată atât din surse alimentare şi

expunerea la soare cât şi din conversia din depozitele adipoase

→ T ½ în circulaţie de 3-4 săptămâni (T ½ pentru 1,25 vit. D: 4 ore!)

→ concentraţie serică mai mare şi mai stabilă decât 1,25(OH)2D

→ studii epidemiologice: corelaţii între nivelul seric 25(OH)D şi

diverse boli

Aw TC et al. Proccedings of Singapore Healthcare, 2013.

NIVELUL OPTIM 25(OH)D

VALOAREA PRAG PENTRU UN STATUS NUTRIŢIONAL

ADECVAT = 30 ng/mL

Valorile > 30 ng/mL garantează o absorbţie intstinală optimă a calciului

Sub această valoare ↑ nivelul seric PTH

Se asigură un substrat suficient pentru conversia non-renală 25(OH)D în 1,25(OH)D

Se consideră că necesarul de 25(OH)D este similar la adult

şi copil

INSUFICIENŢA/DEFICIENŢA 25(OH)D

Valorile < 10 ng/mL indică deficienţa 25(OH)D

Valorile cuprinse între 10 şi 30 ng/mL sunt sugestive

pentru un nivel 25(OH) insuficient

Valorile > 150 ng/mL indică toxicitate

Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 2007.

RECOMANDĂRI DE TESTARE 25(OH)D

• Rahitism, osteomalacie

• Osteoporoză

• Boală cronică de rinichi şi hiperparatiroidism

• Sindroame de malabsorbţie

• Medicamente (antipileptice, antifungice)

• Boli granulomatoase, unele limfoame

• Adulţi vârstnici cu istoric de fracturi

• Obezitate

• Sarcină, lactaţie

Holick MF. Evaluation, treatment, and prevention of Vitamin D deficiency: an Endocrine Society Clinical Practice

Guideline.J Clin Endocrinol Metab 2011

EVOLUŢIA METODELOR DE LABORATOR

PENTRU TESTAREA 25-OH VITAMINA D

TESTE COMPETITIVE

PENTRU VDBP/ TESTE

IMUNOCHIMICE

METODE

CROMATOGRAFICE

METODE RADIOIMUNOLOGICE

MANUALE CU VIT. D TRITIATĂ

METODE COMPLET AUTOMATIZATE CU

DETECŢIE BAZATĂ PE CHEMILUMINISCENŢĂ

HPLC CU DETECŢIE UV

HPLC CUPLATĂ CU

SPECTROMETRIE DE MASĂ

(LC/MS)

PROBLEME ŞI SOLUŢII

Variabilitate ↑ a rezultatelor obţinute prin metode diferite

Armonizarea şi standardizarea metodelor cu scopul:

dezvoltării unor intervale de referinţe robuste pentru

diagnosticul insuficienţei vitaminei D

definirea mai precisă a rolului vitaminei D ca factor de

risc pentru boală

PROBLEME ŞI SOLUŢII

Necesitatea acurateţei mai mari a testelor imunochimice

Stabilirea unor materiale de referinţă

Propunerea unor 2 metode candidat LC/MS ca proceduri

de referinţă

DE CE REZULTATE DISCREPANTE?

• extracţie incompletă 25-OH vitamina D din VDBP → rezultate fals-

scăzute

• diferenţe în recunoaşterea cele 2 forme 25-(OH)D2 şi 25-(OH)D3

• interferenţă variabilă cu metaboliţi cu activitate ↓/inactivi: epimer C3-

25(OH)D şi 24,25(OH)2D → supraestimarea rezultatelor

EPIMER C3 25(OH)D

• Epimerul diferă doar prin aranjarea

asimetrică a unei grupări hidroxil în poziţia C3

• Epimerii pot contribui semnificativ la nivelul

seric 25(OH)D la copiii <1 an

• Epimerizarea este posibil consecinţa unui metabolism imatur

• Efectul biologic al epimerilor 1,25: legare ↓ de VDR; sunt alterate

efectele induse de Ca asupra metabolismului osos

Sing Rj et al. C3-epimers can account for a significant proportion of total circulating 25-

hydroxyvitamin D in infants, complicating accurate measurement and interpretation of vitamin D

status. 2006, J Clin Endocrinol Metab.

DETERMINARE 25(OH)D PRIN TEHNOLOGIA LC/MS

• metode automate de extracţie în fază solidă

• cromatografie de lichide cu detecţie prin spectrometrie de masă

• detecţia şi cuantificarea separată D3, D2

• tehnică laborioasă

25-OH VIT. D3 25-OH VIT. D2

STANDARDIZAREA TESTELOR

• Program iniţiat recent de consorţiul Office of Dietalry Supplements, CDC (Center for disease control and prevention), NIST (National institute of standards and technology) şi laboratorul de referinţă pentru determinarea vitaminei D (Ghent, Belgia)

• Etapa 1: calibrarea şi validarea concentraţiilor 25(OH)D2 şi 25(OH)D3 în 40 seruri prin LC/MS; producătorii de reactivi îşi pot recalibra metodele prin raportarea la aceste rezultate

• Etapa 2: verificarea recalibrării obţinute prin testări oarbe a 10 seruri timp de 3 luni

Sempos CT et al. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2012

DETERMINARE 25(OH)D PRIN TEST COMPETITIV ECLIA

• pretratarea probei: VDBP din probă este denaturată pt a elibera 25-OH

vitamina D

• se adaugă apoi VDBP marcată cu ruteniu şi apoi vit. D biotinilată

• semnalul generat este invers proporţional cu 25(OH)D din probă

• corelaţie foarte bună cu LC/MS

JCLA 2014 Wielders JPM

ÎN LOC DE CONCLUZII...

• 25-OH - testul recomandat atât pentru evaluarea deficitului de

vitamină D cât şi pentru monitorizarea tratamentului

• 25-OH are roluri biologice multiple → evaluarea concentraţiei

serice

• utilizarea unor teste de detecţie performante standardizate este

esenţială pentru obţinerea unor rezultate clinic relevante

VA MULŢUMESC PENTRU ATENŢIE!