TEMA :Metoda cromatografiei gaz-lichide i aplicarea ei n analiza chimico-toxicologic Material informativ

Efectele cromatografice au fost cunoscute din cele mai vechi timpuri. nc pe timpul lui Aristotel oamenii dedurizau apa de mare, filtrnd-o prin anumite pmnturi.

Metoda cromatografic, ca metod tiinific de separare i analiz a substanelor, a fost elaborat de savantul rus M.S.vet, n anul 1903. Cu ajutorul acestor metode vet a stabilit, c pigmentul verde al plantelor clorofila, care se consider omogen, este ntr-adevr alctuit din cteva substane. Trecnd extractul frunzei verzi printr-o coloan umplut cu praf de cret i splndu-l cu solveni organici vet a obinut cteva zone colorate, fapt care mrturisea incontestabil despre prezena n extract a ctorva substane. Ulterior acest fapt a fost confirmat i de ali cercettori. Aceast metod a fost numit cromatografie (grec chromatos - culoare) dei nsui autorul a demonstrat posibilitatea separrii i a substanelor incolore.

n 1941 Martin i Synge bazndu-se pe fenomenul deja cunoscut ei ncearc separarea aminoacizilor, folosind o coloan umplut cu silicagel saturat cu ap, iar faz mobil folosesc cloroform amestecat cu adausuri din ce n ce mai mari de alcool n-butilic. Astfel apare cromatografia de separare pe coloan.

n 1944 Gordon i Martin pun bazele cromatografiei pe hrtie. Tehnica de lucru simpl face, ca cromatografia pe hrtie s se dezvolte i s se aplice la separarea amestecurilor de substane organice i ulterior la cele anorganice.

Datorit rapiditii aceast metod ofer informaii printr-un efort minim.

Cromatografia de gaze s-a dezvoltat datorit perfectrii detectorilor, folosirii diferitelor faze staionare i mobile noi.

Clasificarea metodelor cromatografice

Metodele cromatografice de separare fac parte din metodele de separare, bazate pe echilibrul ntre faze. n aceste metode este valorificat diferena ntre proprietile de separare a componenilor amestecului ntre dou faze de contact i nemescibile. Clasificarea general a metodei cromatografice este n funcie de natura fazelor (I), procesele, care au loc la separare (II) i modul de efectuare (III)(fig.1). Metodele de separare i analiz cromatografic nu sunt specifice. n procesul de analiz cromatografic se ia n consideraie natura fazelor, ce urmeaz a fi folosite, prezena compuilor care interfer cu compuii analizai. n alte cazuri este necesar izolarea unor compui necunoscui n vederea caracterizrii lor ulterioare, sau analiza complet a unui amestec complex, necunoscut, prin separarea componenilor, urmat de analiz de structur i determinrii cantitative.

Tehnicile de separare au fost create n funcie de proprietile amestecurilor n limite extrem de mari), volatilitate i alte proprieti.

Complexitatea tehnicilor de separare este corelat cu proprietile componenilor de separat. n cazul izomerilor optici separarea lor poate fi realizat cu tehnici speciale. n alte cazuri proprietile sunt att de diferite nct separarea poate fi realizat printr-o tehnic simpl (distilare).

Dup ce componenii din amestec au fost separai se poate alege metoda adecvat de determinare. Clasificarea metodelor cromatografice

Fig. 1. Schema clasificrii metodelor cromatografice

Dinamica proceselor cromatografice

Determinarea parametrilor de retenie

Separarea cromatografic se bazeaz pe distribuia diferit a componenilor unui amestec ntre dou faze nemescibile, dintre care una este staionar i poate fi lichid, solid sau n forma de gel, iar alt este mobil i poate fi n stare gazoas sau lichid. Distribuia componenilor amestecului de analizat ntre cele dou faze se realizeaz, n general, prin diverse procese fizice (sorbie-desorbie, excluziune steric), fizico-chimice (repartiie, dizolvare-eliminare), chimice (schimb ionic, precipitare, complexare, oxido-reducere etc.). Cantitativ repartiia componenilor amestecului analizat, ntre cele dou faze e determinat de raportul dintre cantitatea de component n faza staionar i mobil i se numete constant de distribuie a componentului n sistemul dat:

CS

K =

(1)

Cmunde: K constanta de distribuie:

CS i Cm concentraia (sau cantitatea) total a tuturor formelor unui component analizat, prezent la echilibru n faza staionar i mobil respectiv.

n funcie de procesul predominant la separare, cnd componentul analizat e prezent numai ntr-o anumit form n ambele faze deosebim constant de repartiie constanta de adsorbie etc. n acest caz procesele secundare sunt neglijabile. Aceste constante se noteaz i se calculeaz analogic constantei de distribuie, iar CS i Cm reprezint concentraia (sau cantitatea) de component ntr-o anumit form n ambele faze.

K depinde de natura fazelor, t0 , pH, fora ionic a soluiei (dac faza mobil este lichid) etc.

Substana este introdus pe coloan cu faza mobil. Ea se transport (se reine) n faza staionar total sau parial, fie prin adsorbie, repartiie, excluziune, reacie chimic etc. Tot odat substana reinut deja n faza staionar contacteaz ncontinuu cu noi porii de faz mobil i total sau parial se transfer din nou n faza mobil. Faza mobil deplaseaz ncontinuu substanele analizate pe un sector nou unde iari din nou se realizeaz acelai act elementar de echilibru.

Fie c urmeaz s separm, pe o coloan cromatografic, un amestec din doi componeni A i B. Cantitatea de substan n faza mobil i staionar va fi corespunztor: [A]m, [B]m i [A]S, [B]S. Din momentul introducerii amestecului pe coloan, la interfaa dintre cele dou faze nemescibile n conformitate cu legea echilibrului chimic, se stabilesc echilibre dinamice pentru fiecare component. Pentru fiecare component A i B vom avea coeficientul de distribuie KA i KB, respectiv (fig.2).

Fig.2. Coloana cromatografic. Schema de formare a zonei de component n metoda de eluie i repartiyarea sub stanei n zona de component

Cu ct componentul se reine mai mult ntr-o faz cu att i concentraia lui va fi mai mare n aceast faz i mai mic n cealalt faz, i invers. De exemplu, dac componentul A se reine mai mult n faza staionar dect componentul B, atunci, coeficientul respectiv de distribuie vor ndeplini relaia: KA > KB.

Orice separare cromatografic se caracterizeaz prin factorul de retenie (sau retenia) R, care este raportul dintre viteza de migrare a componentului (VZ) i viteza de migrare a fazei mobile (eluentului) (V) n faza staionar dat:

VZ

R =

(2)

V

Valoarea numeric a lui R este subunitar (0 < R < 1). n condiii extreme, dac VZ = 0, atunci R = 0 i substana este totalmente reinut pe coloana dat. Dac VZ = V, atunci R = 1 i substana este purtat de faza mobil fr a interaciona cu faza staionar.

Retenia depinde de coeficientul de distribuie a substanei date. Dac R reprezint fracia moleculelor componentului ce se afl n faza mobil, atunci 1-R va reprezenta fracia moleculelor aflate n faza staionar la echilibru. Prin urmare se poate scrie:

CS 1 R

1

K =

= R =

(3)

Cm R

K + 1

Din expresiile (2) i (3) obinem:

V

VZ =

(4)

K + 1

De aici rezult, c factorul de retenie i viteza de migrare a substanei prin coloan sunt invers proporionale cu constanta de distribuie a ei.

Viteza de migrare a substanei prin coloan poate fi definit ca raportul dintre lungimea coloanei parcurs de substana dat (L) i timpul de reinere a substanei (tR) pe coloana dat:

L

VZ =

(5)

tRLund n consideraie expresia (4) obinem:

L (K+1)

tR =

(6)

V

Deoarece lungimea coloanei i viteza fazei mobile n condiiile date sunt mrimi constante, timpul de reinere este direct proporional cu constanta de distribuie i fiind uor msurabil, servete ca parametru de retenie n analiza calitativ cromatografic i se numete timp de retenie.

Timpul de retenie poate fi definit ca timpul n care substana dat a eluat (s-a deplasat) prin coloana de la momentul introducerii i pn la detecia concentraiei maxime la ieirea ei din coloan.

Alt parametru de retenie utilizat n cromatografie este volumul de retenie (reinere) total (V2), care poate fi definit ca volumul de eluent msurat de la introducerea probei pe coloan i pn la ieirea concentraiei maxime a componentului de pe coloan.

Volumul de retenie (VR) e proporional cu timpul de retenie (tR):

VR = tR ( F (7)

unde F este viteza volumetric a gazului purttor.

Parametrii de retenii (tR, VR) depind de natura fazelor, de presiunea fazei mobile, masa fazei staionare, pH, t0, parametrii geometrici ai coloanei etc. Dar asupra acestor mrimi pot influena i diferii factori ocazionali.

Pentru componenii A i B parametrii de retenie se vor afla n urmtoarele relaii:

KA > KB

VA < VB

tR (A) > tR (B)

(8)

VR (A) > VR (B)

Prin urmare, componenii amestecului analizat, avnd coeficieni de distribuie diferii se vor deplasa n procesul eluiei cu diferite viteze i vor avea un timp de reinere diferit, n condiiile date. n rezultat se va realiza separarea componenilor pe coloana dat.

Constanta de distribuie este factorul principal, care determin separarea substanelor pe coloana cromatografic. Cu ct mai mare va fi diferena dintre valorile constantelor de distribuie, cu att mai efectiv va fi separarea cromatografic n condiiile date.

Cromatografia poate fi definit ca un proces dinamic bazat pe realizarea multipl a actelor de echilibru la distribuia componenilor amestecului n cele dou faze nemescibile ce vin n contact.

n cromatografia de gaze separarea componentelor dintr-un amestec complex se realizeaz ntre o faz mobil gazoas i o faz staionar solid (CGS) sau lichid (CGL). Mecanismul separrii poate fi un proces de adsorbie (CGS) sau de repartiie (CGL).

CG permite att separarea substanelor volatile (stabile la temperatura lor de volatilizare) ct i a celor care n urma unor reacii chimice (derivatizare) pot fi transformate n derivai volatili i stabili.

Faza mobil este constituit dintr-un gaz inert: He, Ar, Ne, H2, numit i gazul vector (purttor), care antreneaz substanele de determinat.

Faza fix (staionar) este format dintr-un adsorbent (CGS) sau dintr-un suport inert granulos (0,15-0,18 mm) impregnat cu un lichid de impregnare - puin volatil sau lichid selectiv (CGL). Faza fix se gsete tasat n coloan sau depus pe pereii unor coloane capilare.

Aparatul i principiile de lucru

n figura 3 este prezentat schema de principiu a unui cromatograf de gaze de tipul Crom-5. Componentele eseniale ale cromatografului cu gaz purttor, care are rolul de faz mobil (1); reductor de presiune (2); usctor purificator (3); blocul de control fin (4); debitmetru (5); dispozitiv de injectare pentru introducerea probei (6); dou coloane montate paralel (7); detectorul (8) i imprimanta (11). Dispozitivul de injectare, coloanele i detectorul sunt amplasate n cuptoare cu reglare i control automatizat al temperaturii.

Fig. 3. Schema de principii a cromatografului de gaze

ntr-un cromatograf gazul vector care provine de la sursa de gaz reglat la un anumit debit de reglatorul de debit traverseaz camera de injectare a probei i antreneaz substanele volatile spre coloana cromatografic. Volumul cuprins ntre capul de injectare i captul coloanei trebuie s fie ct mai mic posibil. O metod mai nou const n injectarea direct n coloan, la 1-2 cm umplutur. Din coloan curentul de gaz este introdus n detector. Detectorul transform diferena unei proprieti fizice dintre componentele probei i gazul purttor ntr-un semnal electric, proporional cu concentraia componenilor din faza gazoas i se produce un semnal, care se nregistreaz cu ajutorul unui integrator, ordinator . nregistratorul traseaz o curb n form de clopot. Reprezentarea grafic a semnalelor detectorului n funcie de timp, poart denumire de cromatogram (fig.4).Picul cromatografic.Parametrii de baz i mrimile derivate Picul este seciunea cromatogramei semnalizat de detector la apariia componentului n gazul purttor; n cazul separrii incomplete, n acelai pic pot aprea mai multe componente. n gaz-cromatogram se definete linia de baz a cromatogramei seciunea de cromatogram, care se nregistreaz cnd din coloan iese numai gazul purttor.

Baza picului este distana BD dintre limitele sale extreme. Aria (S) a picului reprezint suprafaa mrginit de curb i de baz. nlimea (h) a picului este distana dintre maximul picului i baz, msurat paralel cu axa pe care se nregistreaz semnalul detectorului. Limea B1D1 a picului este distana dintre interseciile tangentelor duse n punctele de inflexiune cu baza. 0,5 - reprezint lrgimea curbei la jumtatea nlimii piculu.

Componentele probei se separ din coloan i o prsesc una dup alta ntr-o anumit ordine, dup intervale de timp determina

Factorii care condiioneaz separarea gaz-cromatografic sunt:

1. natura izotermei de repartiie;

2. volumul i principiile de injectare n coloan a probei de analizat;

3. natura gazului vector;

4. programarea temperaturii i a debitului de eluant;

5. natura fazelor;

6. tipul de detector.

Forma picului cromatografic depinde de tipul izotermei de adsorbie. La temperatur constant adsorbia se mrete la creterea presiunii gazului ori concentraiei soluiei.

Izoterma de adsorbie este dependena cantitii substanei adsorbite de presiunea gazului purtrrttor sau concentraia soluiei la temperatur constant. (fig.6)

Fig.6.Diferite tipuri de iz oterme

Faza mobil gazul purttor. n mod obinuit n cromatografia de gaze drept faz mobil se folosete heliu sau azot. Aceste gaze sunt folosite n majoritatea cazurilor, deoarece ndeplinesc urmtoarele condiii:

faza mobil trebuie s fie inert

faza mobil trebuie s aib un pre de cost redus, deoarece se folosesc cantiti mari.

faza mobil trebuie s permit ca detectorul s rspund ntr-un mod adevrat.

n calitate de rezervor pentru faza mobil se folosete o butelia pentru gaze rezistent la presiune nalt. La ea se ataaz un regulator de presiune pentru a reduce i controla curgerea gazului prin coloan i un debitmetru, pentru a controla debitul de gaz.

Natura gazului vector are un rol nsemnat, ea poate influena timpii reteniei a componentelor sau, prin adsorbia acestuia pe suprafaa fazei staionare, i modific proprietile. Alegerea eluantului se face n funcie de sensibilitatea detectorului, de interaciunea acestuia cu componentele de separat, cu faza staionar.

n cromatografia cu gradient de temperatur componentele se distribuie n coloan pe direcia gradientului n funcie de volatilitatea lor (cele mai puin volatile la intrare, cele mai volatile la ieire).

n cromatografia cu programare de temperatur o temperatur constant pe toat lungimea coloanei variaz n timp dup o funcie liniar sau neliniar.. Faza staionar solid n CGS este constituit din adsorbeni de tipul: silicagel, crbune activ, site moleculare. Separarea se bazeaz pe un proces de adsorbie. Eficacitatea separrii crete prin impregnarea adsorbantului cu mici cantiti de lichid nevolatili (siliconi) sau cu gaze care se adsorb ireversibil (CO2, H2O, H2S). Mai recent se utilizeaz coloane mplute cu polimeri organici cu porozitate mare, sub form de perle, de exemplu din seria Porapak (etilvinilbenzen-divinilbenzen). Acetia servesc n special la analiza apei, alcoolilor, gazelor cu masa molecular mic i amestecurilor lichide.

n scop analitic se utilizeaz coloane de 1-1,5 m lungime i 3-6 mm diametru, care pot fi confecionate din metal, sticl sau material plastic i au form de U sau de spiral.

Dintre suporii utilizai amintim cei de tip diatomit (Chromosorb P) Kieselgur (Chromosorb G,W, Sterchamol) polifluoretilena (Fluoropak-80, perle de sticl). n cazul coloanelor capilare, rolul suportului l joac pereii capilarelor, pe care se depune un strat subire de suport solid, care ulterior va fi impregnat cu faza lichid.

Capacitatea de separare a fazei staionare lichide, n cazul amestecurilor depinde de raportul tensiunilor de vapori a componenilor ct i de tria legturilor ce apar ntre moleculele componentelor i cele ale fazei staionare. Deosebim legturi ionice, Van der Waals, legturi de hidrogen sau cu transfer de sarcin.

Pentru separarea componentelor cu puncte de fierbere foarte diferite, se pot utiliza combinaii de dou sau mai multe coloane n serie sau n paralel, cu un singur, respectiv cu doi detectori (ex. Coloana cu faz lichid nepolar Squalan i una polar Carbowax).

Detectori. n cromatografia de gaze, pentru depistarea componentelor, care ies de pe coloan se folosesc detectorii. n funcie de proprietatea msurat deosebim:

detectori de ionizare (detectori de ionizare n flacr, detectori cu captur de electroni);

detectori care msoar o proprietate fizic de volum (detector de conductibilitate termic);

detectori optici (flamfotometru, spectrofotometru);

detectori electrochimici. Clasificai n alt mod, detectorii pot fi: universali, selectiv, specifici.

Condiiile generale pentru detectori sunt: sensibilitatea, stabilitatea, fiabilitatea i emiterea unui semnal liniar pentru anumit domeniu de concentraie a probei.

Detectorul de conductibilitate termic (DCT) sau catarometrul are cel mai rspndit domeniu de utilizare (fig10). El face parte din categoria detectorilor universali. Este un detector nedestructiv i poate fi utilizat i n cromatografia preparativ.

Principiul de funcionare se bazeaz pe msurarea diferenei de conductibilitate termic ntre component i eluent. n acest scop se folosete un montaj electronic, cu dou sau patru celule de conductibilitate termic. n figura 12 este redat schema unui montaj cu patru celule. Dou din celule sunt splate continuu cu gaz purttor (R1 i R4 celule de referin), celelalte dou sunt splate de amestecul binar care iese din coloan (R2 i R3 celule de msur). Constructiv celulele nu pot fi realizate identice. Pentru echilibrarea iniial a punii se folosete poteniometrul 4. Filamentele detectorului sunt confecionate dintr-un material a crui rezisten electric variaz foarte mult n funcie de temperatur. n timpul funcionrii, filamentele sunt nclzite de trecerea unui curent continuu stabilizat, de la o surs de curent 1. Stabilirea curentului de lucru se face cu un poteniometru 2 i se msoar cu miliampermetrul 3.

Temperatura detectorului, n procesul de lucru trebuie s fie mai nalt dect temperatura coloanei. Att timp ct la ieirea din coloana cromatografic va aprea numai gazul purttor, rezistenele celulelor vor fi aceleai, puntea va fi echilibrat i instrumentul de msur montat va indica 0.

n registrtorul 5 va fi trasat linia zero. Prezena unui component n eluentul, care circul prin celula de msur modific conductibilitatea termic a mediului gazos din aceast celul. n rezultat se modific rezistena electric a filamentelor R2 i R3, care provoac dezichilibrul punii. Intensitatea curentului nregistrat la dezichilibrarea punii este proporional cu concentraia componentului care iese din coloan.

Mrimea semnalului detectorului depinde de diferina dintre conductibilitatea termic a componentului i eluentului. Conductibilitatea termic a substanelor depinde de masa molecular ei. Hidrogenul, heliul i azotul, avnd mase moleculare mici posed conductibiliti termice ridicate. Aceste gaze sunt ideale pentru a fi folosite ca gaze purttoare n cromatografia de gaze.

Sensibilitatea detectorului depinde de factorul geometric al celulelor (dimensiunile, raza, lungimea filamentului) i de valoarea curentului de alimentare a punii. Sensibilitatea crete la mrirea curentului n punte.

Creterea curentului peste o anumit valoare poate duce la distrugerea filamentelor i de aceea valoarea lui este limitat de natura gazului purttor i de temperatura de lucru a detectorului.

Linia zero este sensibil la variaiile debitului de gaz purttor i al temperaturii Ppentru ca variaiile temperaturii s fie ct mai mici blocul metalic al detectorului trebuie s aib o mas ct mai mare, iar celulele s fie dispuse simetric n detectori.

Detectorul de ionizare n flacr (DIF) este un detector universal, stabil i simplu n construcie. Principiul de funcionare a detectorului cu ionizare n flacr de hidrogen const n msurarea conductibilitii electrice a unei flcri de hidrogen n prezena unui compus organicDeterminri calitative

Aprecierea calitativ a unei gaz-cromatograme care prezint un numr de picuri se face n mod obinuit prin:

1) examinare vizual, n comparaie cu gaz-cromatograma unei probe etalon;

2) compararea timpului (tR) sau a volumului de reinere (VR) a probei de determinat cu a etalonului-pur, cromatografiat n condiii identice, sau cu datele menionate n literatur pentru compusul respectiv;

3) compararea cromatogramei amestecului de determinat cu cromatograma aceluiai amestec, la care s-a adugat substana etalon care se bnuiete a fi prezent n prob. Dac picul unui component apare mrit pe a doua cromatogram, acesta este un indiciu al prezenei, n amestec, a substanei adugate probei; n caz contrar, substana adugat d un pic nou pe cromatograma a doua;

4) identificarea componentelor se mai poate realiza cu ajutorul detectorilor specifici; DCE se utilizeaz pentru identificarea compuilor cu afiniti diferite pentru electroni (alcooli, eteri, esteri, derivai carbonici, derivai halogenai). Spectrometrul de mas nregistreaz spectrul de mas (SM) al componentelor prezente n fraciunea de eluant introdus n sursa de ioni a spectrometrului, cu nregistrarea concomitent a cromatogramelor obinute prin trecerea celeilalte fraciuni printr-un detector universal (CT);

5) identificarea prin sorbie sau reacie selectiv se realizeaz prin intercalarea ntre injector i coloana de separare a GC a unei coloane umplute cu adsorbant, sau absorbant specific unei anumite clase de substane, sau a unui microreactor n care are loc transformarea sau reinerea prin reacie chimic a unui component.

Timpul de retenie (reinere) brut (tR), exprimat n secunde sau minute, este timpul care se scurge ntre momentul introducerii probei n injector i timpul cnd picul atinge maximul.

Timpul relativ (tR) este timpul de retenie al unui component (i) n raport cu al unui component etalon (e) : tRi / tRe.

Timpul de retenie corectat este dat de diferena dintre timpul de retenie brut (tR) i timpul la care se separ eluantul sau un component nereinut pe coloan (ideal) i al componentului respectiv: Rx= tR /tRx. Factorul de retenie are valori cuprinse ntre 0,01-0,9, n cazul unei separri optime, cnd valoarea se apropie de 1, nseamn c acel component X, prsete coloana odat cu eluantul.

De aici se definete i factorul de separare, pentru doi componeni A i B:

tR(A)

(AB) = --------- , care trebuie s aib valori 1 (11)tR(B)Eficacitatea coloanei

O importan deosebit n prezentarea teoretic a procesului cromatografic de separare o au dou teorii. Teoria Talerului teoretic i teoria cinetic.

Teoria talerului teoretic a fost propus de Martin i Synge. Conform acestei teorii coloana cromatografic se mparte imaginar ntr-un ir de segmente elementare talere i se presupune, c pe fiecare taler se realizeaz un act elimentar de echilibru la distribuia substanei n faza staionar i faza mobil. Fiecare porie nou de faz mobil purttoare (gaz sau lichid) provoac o deplasare a acestui echilibru, n urma cruia o parte de substan se deplaseaz pe urmtorul taler, pe care la rndul su, se stabilete un nou echilibru distributiv i are loc trecerea substanei pe urmtorul taler. n urma acestor procese substana supus cromatografiei se distribuie pe cteva talere. Concentraia substanei pe talere din mijloc este maxim n comparaie cu talerele invecitate.

Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din coloana cromatografic n care se realizeaz un echilibru elementar complet de distribuie a componentului dintre cele dou faze nemiscibile, care vin n contact n procesul separrii cromatografice.

Talerul teoretic din coloana cromatografic este analogic talerului teoretic dintr-o coloan pentru distilare fracionat. Deosebirea const n aceea, c componena amestecului, care ese de pe coloana cromatografic ncontinuu se schimb dar n procesul de extracie ori distilare se poate de obinut pe parcursul ntregului proces una i aceeai substan.

Numrul talerelor teoretice pentru componentul dat i pentru lungimea coloanei date difer de numrul talerelor teoretice pentru ali componeni n aceleai condiii. Numrul talerelor teoretice este direct proporional cu lungimea i diametrul coloanei.

Numrul de talere N este un numr adimensional i se numete eficiena coloanei cromatografice, H i n parametrii teoretici, care caracterizeaz eficacitatea de separare a coloanei cromatografice i determin dispersia zonelor de component.

Cu ct coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de lungime i cu ct nlimea echivalent unui taler teoretic va fi mai mic, cu att mai efectiv va fi coloana pentru separare n condiiile date. Aa dar, condiiile eficacitii de separare pe coloana cromatografic sunt :

H s obin valori ct mai mici i N ct mai mari.

Dac vom raporta lungimea stratului de faz staionar (L) n care s-a produs separarea amestecului de substane la nlimea talerului teoretic, vom obine numrul de talere teoretice (N) necesare pentru separarea amestecului dat de coloana dat (formula 12).

L

N=

H

Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului cromatografic n trepte, dar n realitate procesul decurge incontinuu. Aceast teorie ne permite s se calculeze parametrului cantitativi importani pentru caracterizarea procesului cromatografic de separare. Aceti parametri i menin importana i n teoria cinetic a cromatografiei, care ine cont de viteza de migrare a substanei, difuzie i ali factori cinetici, care caracterizeaz cantitatea procesului.

Analiza cantitativ n cromatografie se bazeaz pe stabilirea unei relaiei dintre mrimea semnalului dat de detector i cantitatea de compus prezent n prob. Semnalul detectorului este msurat prin nlimea sau aria picului. Aria picurilor poate fi calculat conform relaiilor).

s = h(0

s = h(0

s = h(0,5

s = 2,507 h (Aria picului poate fi msurat cu ajutorul planimetrului, poate fi apreciat dup greutatea fiilor de hrtie tiate dup conturul picurilor. n prezent n acest scop se folosesc integratoare electronice i microcomputere, care nregistreaz foarte rapid i exact orice mrime de pe cromatogram.

Metodele principale n analiza cromatografic cantitativ sunt:

a) metoda standardului intern, n prob cu o compoziie cantitaiv necunoscut se introduce preventiv o cantitate exact de substan cunoscut, care nu se conine n amestecul dat, nu interacioneaz chimic cu componentele amestecului i este stabil la temperatura la care se efectueaz analiza. Proprietile fizico-chimice ale substanei adugate (standardului intern) trebuie s fie asemntoare proprietilor componentelor amestecului cercetat. Partea de mas (XI) a fiecrui component (n %) se determin din relaia:

Si ( r

Xi = ( 100

Sstunde Si i Sst sunt ariile picurilor componentului analizat i standardului, corespunztor; r raportul masei standardului intern ctre masa probei:

masa standardului

r =

masa amestecului de analizat fr standard

b) metoda normrii ariilor. Aceast metod presupune, c suma tuturor ariilor picurilor corespunztoare componentelor amestecului cercetat constituie 100 %. Partea de mas (Xi) a componentului i (in %) se determin din urmtoarea relaie:

Si

Xi = n=i ( 100 % (41)

( Sic) metoda etalonrii absolute. Se prepar i se cerceteaz o serie de soluii standard. Se determin experimental dependena nlimii sau suprafeei picului de concentraia substanei i se traseaz curba de etalonare. Apoi se determin aceeai parametri ai picurilor ai amestecului de analizat i din curba de etalonare se determin concentraia substanei analizate. Aceast metod simpl i exact este principal metod de determinare a microimpuritilor. Metoda nu necesit o separare a tuturor componenilor amestecului, dar se limiteaz la analiza componentului studiat n amestecul concret.

. La baza determinrilor cantitative st relaia de proporionalitate ntre aria de sub picul cromatografic i cantitatea componentului eluat. Cheia acestor metode const n msurarea ariei i stabilirea acestei proporionaliti.

1) Msurarea ariei se poate face pe mai multe ci:

Msurarea ariilor este nlocuit uneori cu msurarea integral a nlimii picului (h), sau a jumtii ei (h/2) (figf. 7).

n cazul picurilor simetrice aria se msoar prin metoda produsului dintre limea picului (determinat la nlimii picului) i nlimea lui (perpendicular cobort din vrf pe linia de baz) (fig.7) sau din aria triunghiului format de linia de baz cu tangentele duse n punctele de inflexiune ale picului:

h y

A = --------

2

Aria este proporional cu masa picului decupat i cntrit, cu condiia ca grosimea hrtiei s fie uniform.

Ariile se mai pot determina automat, utiliznd n acest scop un integrator mecanic sau un computer.

2) Corelarea datelor obinute cu compoziia cantitativ a probei. Dintre metodele care stabilesc relaiile pentru transformarea i corelarea corect a ariilor cu concentraia componentelor, amintim:

a) Metoda standardului extern: se realizeaz ntr-un mod asemntor curbei de etalonare din spectroscopie. Cantiti cunoscute de prob-etalon se cromatografiaz; se msoar ariile corespunztoare picurilor i se ntocmete curba de etalonare, care are nregistrat n ordonat valoarea ariilor (mm2) i n abscis concentraia.((g).

b) Metoda standardului intern const n introducerea unui standard, (substan de referin) n cantitate cunoscut, n proba de analizat. Drept standard intern se poate utiliza o substan pur, care s se elueze cu o rezoluie bun, cu un timp de reinere apropiat de al componentelor de determinat i care s nu interacioneze cu acestea. Cunoscnd concentraia standardului intern n prob (Cs) i msurnd ariile picurilor corespunztoare componentei de determinat (Ax) i ale standardului (As) se poate calcula concentraia necunoscut (Cx). n acest scop se ntocmete o curb de etalonare sau se calculeaz factorul de corecie al ariilor pentru compusul de determinat (fx).

Curba de etalonare se realizeaz prin cromatografierea a trei soluii de concentraii exacte din componenta de determinat (C1, C2, C3), prin dizolvarea ei n soluia standardului intern (Cs). Se determin, n fiecare caz n parte, raportul ariilor: A1/As; A2/As; A3/As. Se nscriu aceste valori n ordonata i concentraiile C1, C2, C3 n abscisa unui sistem de coordonate i se traseaz curba de etalonare.

Factorul de corecie al ariilor (fx) se poate calcula astfel:

Se face media aritmetic (Vx) a valorilor rapoartelor obinute mai sus:

V1 + V2 + V3

A1/As = V1; A2/As = V2; A3/As = V3; ---------------- = Vx

3

Pentru fiecare concentraie (C1, C2, C3) se calculeaz raportul: C1/Vx; C2/Vx; C3/Vx; Media aritmetic a valorilor obinute pentru aceste trei concentraii, reprezint factorul de corecie mediu, fx, care intervine n formula de calcul.

Cx (mg/ml) = fx Vx

c) Metoda normrii ariilor. Aceast metod se bazeaz pe faptul c raportul existent ntre aria corespunztoare picului unui anumit component SA i suma ariilor tuturor componentelor prezente ( S) este egal cu procentul de component prezent n amestec. SA

A % = --------------------- 100.

SA + SB + SC + ...

Relaia de mai sus este valabil numai n cazul n care sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate componentele probei, n caz contrar se recomand ca etalonarea s se fac n prealabil cu ajutorul unor factori de corecie.

Concentraia se calcul dup curba de etalonare ori dup formula:

Setilnitrit

C = ------------ F R 100,

Spropilnitritn care:

C concentraia

S ariile corespunztoare a picurilor

F factorul de corecie a ariilor ori a nlimii picurilor, ce se determin n raport cu standardul n condiiile experimentului (faza staionar, to injectorului, to termostatului, detectorului; viteza gazului vector)

F (factorul) se calcul dup formula:

SstF = ------ C %; 'n care: Sx Sst aria picului standardului

Sx aria picului substanei de analizat

ori

hstF = ------ C %; n carehxSst nlimea picului standardului

Sx nlimea picului substanei de analizat.

C % - concentraia substanei de analizat.

Se calcul F pentru cteva concentraii i apoi se i-a media:

masa standardului

R = -----------------------------------------------------

masa amestecului de analizat fr standard.Cromatografie (C)

Cromatografie de lichide (CL)

Cromatografie de gaze (CG)

Cromatografie gaz solid (CGS)

Cromatografie lichid solid (CLS)

Cromatografie gaz lichid (CGL)

Cromatografie lichid lichid (CLL)

Cromatografie prin excluziune steric

Cromatografie e bazat pe interaciunea cu cmpul: electroforez

Cromatografie de absorbie

Cromatografie de repartiie

Cromatografie bazat pe procese chimice: schimb ionic, complexare, precipitare, oxido-reducere

Cromatografie capilar

Cromatografie pe strat subire

Cromatografie pe coloan

Fig.7 Forma picului n funcie de tipul

izotermei de adsorbie