Cuprins

Motivația și planul experimentelor ...................................................................................2

A. Clonarea genei ssdh în vectorul pH6EX3 ........................................................................3 Principiul metodei .......................................................................................................................................... 3 Materiale necesare: ........................................................................................................................................ 3 Mod de lucru: ................................................................................................................................................. 5

Rezultate obținute: .................................................................................................................. 6

Întrebări: ................................................................................................................................. 6 A.1 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a genei ssdh? ............................................................ 6 A.2 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a fragmentului de ADN clonat în vectorul pH6EX3? 6 A.3 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a vectorului recombinat pH6EX3orf39? .................. 6

B. Stabilirea condițiilor optime de supra-expresie pentru obținerea proteinei SsDH în cantități cât mai mari .......................................................................................................7

Principiul metodei: ......................................................................................................................................... 7 Materiale necesare: ........................................................................................................................................ 7 Mod de lucru: ................................................................................................................................................. 8

Rezultate obținute ................................................................................................................... 8

Întrebări: ................................................................................................................................. 9 B.1 Folosind aplicația ProtParam disponibilă la adresa https://web.expasy.org/protparam/, calculați masa moleculară a proteine native SsDH. Care este valoarea acesteia în kDa? ........................................... 9 B.2 Folosind aceeași aplicație, calculați masa molară a proteinei recombinate ce va fi exprimată în E. coli. Care este valoarea acesteia în kDa? ............................................................................................................... 9 B.3 Apare o diferență între aceste valori? Dacă da, de ce? ........................................................................... 9

Bibliografie pentru părțile A și B ............................................................................................... 9

C. Separarea electroforetică a proteinelor ....................................................................... 10

Electroforeza proteinelor în condiții denaturante (SDS-PAGE) ................................................. 10 Principiul metodei ........................................................................................................................................10 Materiale necesare: ......................................................................................................................................12 Mod de lucru ................................................................................................................................................13

Colorarea gelurilor folosind Comassie Brilliant Blue R-250 ...................................................... 19 Principiul metodei: .......................................................................................................................................19 Materiale necesare: ......................................................................................................................................19 Mod de lucru ................................................................................................................................................19

Rezultate obținute, combinate pentru partea B și C ................................................................ 20

Întrebări: ............................................................................................................................... 20 C.1 Ținând cont de răspunsul la întrebarea B2, care credeți că este concentrația gelului de separare recomandată pentru a evidenția proteina recombinată ORF39 în extractele de E.coli preparate conform indicațiilor din partea B? ..............................................................................................................................20 C.2 Priviți fotografia gelului. Care este raționamentul după care identificați care dintre benzi este proteina SsDh? Nominalizați cel puțin 2 indicații/observații care să vă permită să identificați proteina SsDH. .............................................................................................................................................................20 C.3 Care este momentul optim de stopare a culturi E.coli pH6EX3orf39 pentru a obține cantitatea cea mai mare de proteina SsDH? .......................................................................................................................20

Bibliografie pentru partea C ................................................................................................... 21

1

D. Purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate față de metale ........................ 22 Principiul metodei ........................................................................................................................................22 Materiale necesare: ......................................................................................................................................22 Mod de lucru: ...............................................................................................................................................23

Rezultate obținute ................................................................................................................. 25

Întrebări: ............................................................................................................................... 26 D.1 Analizând figura de mai sus, care este raționamentul după care concluzionăm că am obținut proteina SsDH pură? Prezentați cel puțin 2 indicații/observații care să vă permită să trageți concluzia. .................26 D.2 La ce concentrație de imidazol (mM) eluează proteina SSdH de pe coloana de Ni-Sepharose? ..........26 D.3 Cum puteți motiva migrarea proteinei purificate orf39 sub forma a două benzi în figura de mai jos?26

Bibliografie pentru partea D ................................................................................................... 26

2

Motivația și planul experimentelor

Una din problemele esențiale cu care se confruntă toate domeniile ce au ca studiu

proteinele este variabilitatea foarte mare în ceea ce privește abundența moleculelor proteice și

proprietățile acestora. Parcurgerea etapelor experimentale prezentate au ca scop supra-

exprimarea unei proteine necunoscute notate SsDH în bacteria Eschericha coli și purificarea

sa prin cromatografie de afinitate pentru metale. Preparatul enzimatic obținut poate fi mai apoi

utilizat pentru caracterizarea proteinei necunoscute prin studii funcționale (activitate

enzimatică) sau structurale (identificare PTMs prin spectrometrie de masă (MS), stabilirea

structurii secundare, terțiare și cuaternare).

Proteina necunoscută țintă SSdH a fost notată inițial ORF39 este codificată de gena

notată de asemena orf39 de pe plasmidul pAO1 din Paenarthrobacter nicotinovorans,

GenBank ID AJ507836.1. Notațiile ssdh și orf39 sunt deci echivalente și se referă la acceași

genă. Secvența genei este mai jos, codonii START și STOP fiind marcați:

>gena orf39 din Paenarthrobacter nicotinovorans, 35897 – 37273

35897 atggcaatcg cgaccatcga ccccaccacg ggcatcaccc tgaa

35941 aaccttcgac gcccatacgc ccgaagaggt agaaaaccgg atcgcccgtg cggaagcagc

36001 attccggtca ctgcagaaca cctcctttga agaacgtgcc cgctggatgc ataaggccgc

36061 tgacatcctc gaaagcgaag ccgacgaagt ggcccgtctc atcgccaccg agatgggcaa

36121 aaccttaacg acagcaaagt acgaggccct caaatcagcc accggcatgc ggcacttcgc

36181 cgatcacgcc cagcgctacc ttagcccgga aaccccggtc ccggcgtccg aggtcaacgc

36241 ctccaacctc cacgtacaat tcgacccgtt aggcgtcgtt ttggccgtta tgccctggaa

36301 ttaccccctt tggcaggccg tccgcttcgc cgcccccgca ctaatggcgg gcaacacggg

36361 gctcctcaag cacgcctcaa acgttcctca atgtgcgctg tacctgggag acctcttcgc

36421 ccgcggcggt tttcctgaag gcgcgtttca gacactgctg gttgaaggca aagacgttat

36481 tcccctcgtg gatgacgcaa ggatcagggc ggtcaccctg accggctccg tcgctgccgg

36541 ttccgccatt gctgaagcag ccggcaggaa catcaaaagg agtgtcctgg aactgggagg

36601 catggatgtc tttatcgtca tgccctcggc cgatattgaa aaggccgctg cccaggcagt

36661 aatcgcacgc cttcaaaact cggggcagtc ctgcatcgcg gccaagcgct tctacgttca

36721 cgaagatgtc tacgaccgct ttgaacatct gttcgttaca ggtatggccg aagcagttgc

36781 cggtgacccc ttggacgaaa gcaccagctt tggccccctg gccacggagc gaggacgcca

36841 ggacgttcat gaactggtta gggacgcccg cgaaaaaggg gcagcagttc agtgtggagg

36901 agaaataccg gaaggggagg gctggtacta cccggcgact gtcctcacag gcgtaacaga

36961 ggacatgcgc atctaccggg aagaatgctt cggccccgtg gcttgcctct acaaagtgtc

37021 atcactccag gaagccatcg ctctcagcaa cgactctgat tttggtttga gctcaagcgt

37081 gtggaccaat gacgagaccg aagcgaccga agcagctcga tcaatcgagg ccgggggcgt

37141 cttcatcaac ggtctgacgg cgtcattccc ggcggtgcct ttcggcggcc tcaaagactc

37201 cggctacgga cgtgagctct ccgcctatgg aatccgggag ttcgtaaaca tcaagacggt

37261 ctggacctcc tga

Secvența de aminoacizi a proteinei SSdH obținută prin traducerea cu ajutorul

calculatorului a genei de mai sus este următoarea:

>proteina necunoscută orf39

MAIATIDPTTGITLKTFDAHTPEEVENRIARAEAAFRSLQNTSFEERARWMHKAADILESEADEVARLIATEMGK

TLTTAKYEALKSATGMRHFADHAQRYLSPETPVPASEVNASNLHVQFDPLGVVLAVMPWNYPLWQAVRFAAPALM

AGNTGLLKHASNVPQCALYLGDLFARGGFPEGAFQTLLVEGKDVIPLVDDARIRAVTLTGSVAAGSAIAEAAGRN

IKRSVLELGGMDVFIVMPSADIEKAAAQAVIARLQNSGQSCIAAKRFYVHEDVYDRFEHLFVTGMAEAVAGDPLD

ESTSFGPLATERGRQDVHELVRDAREKGAAVQCGGEIPEGEGWYYPATVLTGVTEDMRIYREECFGPVACLYKVS

SLQEAIALSNDSDFGLSSSVWTNDETEATEAARSIEAGGVFINGLTASFPAVPFGGLKDSGYGRELSAYGIREFV

NIKTVWTS

Planul experimental este:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/25169022

3

A. Clonarea genei ssdh într-un vector care să permită expresia acesteia în E. coli și care să faciliteze purificarea ulterioară;

B. Stabilirea condițiilor optime de supra-expresie pentru obținerea proteinei SsDH în cantități cât mai mari;

C. Separarea și evidențierea proteinelor pe geluri de electroforeză; D. Purificarea proteinei SsDH prin cromatografie de afinitate pentru metale IMAC.

A. Clonarea genei ssdh în vectorul pH6EX3 Principiul metodei Fragmentul ADN este clivat în mod specific cu enzime de restricție și ligat în vectorul

de expresie pH5EX3. Amestecul de ligare este în continuare folosit pentru transformarea

celulelor competente de E. coli. Celulele ce conțin vectorul recombinat sunt selectate pe baza

rezistenței dobândite pentru ampicilină.

Avantaje: 1. clonarea unor fragmente cu dimensiuni de până la 5 kb;

2. dacă genele clonate sunt amplasate în cadrul de citire specific al plasmidului, ele pot fi exprimate sub forma unor proteine recombinate cu coada poli-His.

Limitări: – vectorul este utilizabil doar în E. coli; pentru clonare în alte organisme gazdă trebuie

selectat un alt vector.

Materiale necesare: 1. vector plasmidial pH6EX3 purificat – purificarea se poate realizare prin utilizarea

protocolului specific folosit la anterior. Harta genică a plasmidului este prezentată în

figura de mai jos, structura situsului multiplu de clonare fiind precizată în detaliu:

4

2. fragment ADN de clonat – acesta trebuie să conțină situs-urile de restricție pentru

enzimele de restricție ce urmează să fie utilizate; acesta a fost izolat prin PCR din

plasmidul pAO1. Gena ssdh a fost amplificată prin PCR cu perechea de oligonucleotide

amorsă având secvența: 5´-CAG CCA TCG TGA TCA GCA ACA AGG-3´ și 5´-GTT

GAA GGG TCG ACG CTG AGG GTT AG-3´. Aceste oligonucleotide amorsă

flanchează o porțiune de ADN care începe cu poziția 35861 și se termină cu poziția

37329 și, prin modificarea nucleotidelor A35876 în T, A35877 în G, A35879 în T,

C37317 în T, C37320 în A, au introdus situs-uri de restricție pentru BclI înainte cu 15

nucleotide de codonul START și SalI la 45 de nucleotide după codonul STOP.

>gena ssdh amplificată cu primerii indicați

35861 ccctaccagc catcgTGaTc

35881 agcaacaagg agcatcatgg caatcgcgac catcgacccc accacgggca tcaccctgaa

35941 aaccttcgac gcccatacgc ccgaagaggt agaaaaccgg atcgcccgtg cggaagcagc

36001 attccggtca ctgcagaaca cctcctttga agaacgtgcc cgctggatgc ataaggccgc

36061 tgacatcctc gaaagcgaag ccgacgaagt ggcccgtctc atcgccaccg agatgggcaa

36121 aaccttaacg acagcaaagt acgaggccct caaatcagcc accggcatgc ggcacttcgc

36181 cgatcacgcc cagcgctacc ttagcccgga aaccccggtc ccggcgtccg aggtcaacgc

36241 ctccaacctc cacgtacaat tcgacccgtt aggcgtcgtt ttggccgtta tgccctggaa

36301 ttaccccctt tggcaggccg tccgcttcgc cgcccccgca ctaatggcgg gcaacacggg

36361 gctcctcaag cacgcctcaa acgttcctca atgtgcgctg tacctgggag acctcttcgc

36421 ccgcggcggt tttcctgaag gcgcgtttca gacactgctg gttgaaggca aagacgttat

36481 tcccctcgtg gatgacgcaa ggatcagggc ggtcaccctg accggctccg tcgctgccgg

36541 ttccgccatt gctgaagcag ccggcaggaa catcaaaagg agtgtcctgg aactgggagg

36601 catggatgtc tttatcgtca tgccctcggc cgatattgaa aaggccgctg cccaggcagt

36661 aatcgcacgc cttcaaaact cggggcagtc ctgcatcgcg gccaagcgct tctacgttca

36721 cgaagatgtc tacgaccgct ttgaacatct gttcgttaca ggtatggccg aagcagttgc

36781 cggtgacccc ttggacgaaa gcaccagctt tggccccctg gccacggagc gaggacgcca

36841 ggacgttcat gaactggtta gggacgcccg cgaaaaaggg gcagcagttc agtgtggagg

36901 agaaataccg gaaggggagg gctggtacta cccggcgact gtcctcacag gcgtaacaga

36961 ggacatgcgc atctaccggg aagaatgctt cggccccgtg gcttgcctct acaaagtgtc

37021 atcactccag gaagccatcg ctctcagcaa cgactctgat tttggtttga gctcaagcgt

37081 gtggaccaat gacgagaccg aagcgaccga agcagctcga tcaatcgagg ccgggggcgt

37141 cttcatcaac ggtctgacgg cgtcattccc ggcggtgcct ttcggcggcc tcaaagactc

5

37201 cggctacgga cgtgagctct ccgcctatgg aatccgggag ttcgtaaaca tcaagacggt

37261 ctggacctcc tgacccaccc gaaacggggc ggcgctggcc ctactaaccc tcagcgTcgA

37321 cccttcaac

3. apă distilată sterilă; 4. enzimele de restricție BclI + SalI, pentru digestia fragmentului conținând gena ssdh și

BamHI + SalI pentru digestia plasmidului pH6EX3, precum și tampon lor specific de

reacție. Enzimele BamHI și BclI produc capete coezive compatibile.

5. albumină serică bovină 10 µg/µl; 6. celule competente de E.coli XL1Blue – pot fi obținute în laborator folosind metoda cu

CaCl2 descrisă de Sambrook (12) sau kit-ul Roti®-Transform, (Roth, Germania); există

de asemenea numeroși distribuitori (Roth, NEB) care pun la dispoziție tulpini de E. coli

înalt competente;

7. kit de ligare – rapid DNA ligation Kit (Roche) sau echivalent; 8. plăci cu mediu LB suplimentat cu ampicilină 50 mg/ml; 9. hotă sterilă cu flux de aer laminar.

Mod de lucru: 1. în două microeprubete Eppendorf se prepară amestecurile de reacție în vederea

digestiei fragmentului de clonat și a vectorului plasmidial pH5EX3, urmând

indicațiile de mai jos:

Reactiv Volum

Tampon de reacție specific, livrat cu enzima de

restricție

2,5 µl

Albumină serică bovină 10 µg/µl 2,5 µl

Soluție ADN (fragment de clonat sau vector, după caz) 10-20 µl

Enzimă 1* 1 µl

Enzimă 2* 1 µl

Apă sterilă până la 25 µl

* în cazul în care cele două enzime au condiții optime de reacție diferite, se realizează o digestie secvențială; după acțiunea primei enzime,

fragmentul tăiat este purificat prin electroforeză în gel de agaroză și este supus unei noi reacții de restricție cu cea de-a doua enzimă.

2. se incubează amestecul de reacție timp de patru ore la temperatura indicată de producător

(în general, 37oC);

3. se separă fragmentul de clonat și respectiv vectorul liniarizat din amestecul de reacție prin

electroforeză în geluri de agaroză - prin utilizarea protocolului specific folosit la LP SMMI;;

4. urmând indicațiile producătorului trusei de reactivi pentru ligare Rapid DNA ligation Kit

(Roche), se realizează ligarea fragmentului în vector; este indicat ca raportul dintre concentrația

fragmentului de clonat și a vectorului să fie de 1:3;

5. după ligare, amestecul de reacție poate fi utilizat direct pentru transformare; astfel, 200 µl

celule preparate după indicațiile producătorului (Roti®-Transform, Roth, Germania) se

combină cu 10 µl amestec de ligare și se incubează pe gheață timp de 30 minute;

6. amestecul de transformare se etalează pe plăcile cu mediu LB și ampicilină preîncălzite la

37oC; după uscarea completă a mediului în exces, se incubează peste noapte la 37oC; prezența

plasmidului pH6EX3 va determina rezistența microorganismului la antibioticul mai sus

menționat, astfel încât doar celulele care poartă plasmidul se vor dezvolta;

6

7. coloniile obținute se verifică prin secvențiere pentru a confirma prezența fragmentului inserat

în mod corect în situsul multiplu de clonare.

Rezultate obținute:

Figura 1. Fragmentul conținând gena ssdh (orf39) și

vectorul pH5EX3 linearizat utilizate în ligare:

1. marker, NEB 1kb DNA lader, 0,8 microl

2. ssdh (orf39)rezultat în urma digestiei cu , 3 microl

3. vectorul tăiat cu BamHI și SalI, 3 microl

4. marker, NEB 1kb DNA lader, 0,8 microl

Figura 2. Harta genetică a plasmidului recombinat pH6EX3orf39

Întrebări:

A.1 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a genei ssdh?

A.2 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a fragmentului de ADN clonat în vectorul pH6EX3?

A.3 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a vectorului recombinat pH6EX3orf39?

7

B. Stabilirea condițiilor optime de supra-expresie pentru obținerea proteinei SsDH în cantități cât mai mari

Principiul metodei: Tulpina purtând vectorul de expresie recombinat este cultivată până în faza de creștere

exponențială, după care se adaugă IPTG în mediu pentru inducerea expresiei genei clonate. La

intervale de 1 oră se prelevează consecutiv probe, se separă celulele prin cetrifugare și se

lizează în soluție tampon de încărcare SDS-PAGE. Proteinele celulare eliberate sunt apoi

analizate prin electroforeză SDS-PAGE.

Avantaje: 1. permite evaluarea nivelului de supraexpresie a unei proteine recombinate; 2. permite evaluarea solubilității unei proteine recombinate în condiții de cultivare date.

Limitări: – sistemul de detecție descris în metoda prezentată nu este aplicabil pentru proteine al

căror nivel de expresie este extrem de scăzut (proteina recombinată nu este vizibilă pe geluri

SDS-PAGE); în acest caz se recomandă utilizarea unui alt sistem de detecție – de exemplu

tehnica Western-Blot.

Materiale necesare: 1. placă Petri conținând tulpina E. coli ce conține plasmidul recombinat pH6EX3orf39.

Prin clonarea genei ssdh folosind metoda descrisă în partea A, aceasta a fost pusă sub

controlul promotorului tac din pH6EX3 (notat Ptac pe harta plasmidului pH6EX3 de

la pagina 4). De asemenea, clonarea a dus la adăugarea înaintea codonului start nativ al

genei ssdh a unui fragment suplimentar de ADN cu o lungime de 63 de nucleotide și

care conține un nou codon START la capătul 5’. Acest fragment conține cele

nucleotidele dintre codonul START din pozitia 258 de pe pH6EX3 și situsul de clivare

al enzimei BamHI (secvența este vizibilă pe pe harta plasmidului pH6EX3 de la pagina

4), plus nucleotidele dintre situsul de clivare al BglI de pe fragmentul amplificat și

codonul start nativ al genei ssdh (fragment vizibil pe secvența genei amplificate de la

pagina 4). Promotorul tac este activat în prezența IPTG-ului și duce la sinteza unei

molecule de ARNm modificate (fragmentul adăugat + secvența orf39) care codifică o

proteina SsDH recombinată cu secvența:

>proteina orf39 recombinată

MSPIHHHHHHLVPRGSATRSIMAIATIDPTTGITLKTFDAHTPEEVENRIARAEAAFRSLQNTSFEERA

RWMHKAADILESEADEVARLIATEMGKTLTTAKYEALKSATGMRHFADHAQRYLSPETPVPASEVNASN

LHVQFDPLGVVLAVMPWNYPLWQAVRFAAPALMAGNTGLLKHASNVPQCALYLGDLFARGGFPEGAFQT

LLVEGKDVIPLVDDARIRAVTLTGSVAAGSAIAEAAGRNIKRSVLELGGMDVFIVMPSADIEKAAAQAV

IARLQNSGQSCIAAKRFYVHEDVYDRFEHLFVTGMAEAVAGDPLDESTSFGPLATERGRQDVHELVRDA

REKGAAVQCGGEIPEGEGWYYPATVLTGVTEDMRIYREECFGPVACLYKVSSLQEAIALSNDSDFGLSS

SVWTNDETEATEAARSIEAGGVFINGLTASFPAVPFGGLKDSGYGRELSAYGIREFVNIKTVWTS

Aminoacidul M marcat îngroșat reprezintă aminoacidul metionină codificat de

codonul start nativ al genei ssdh.

2. mediu LB steril cu ampicilină 50 mg/ml, 2 flacoane Erlenmayer de 500 ml cu câte 100 ml mediu și o eprubetă de 50 ml cu 10 ml mediu;

3. IPTG 1 M steril – se cântăresc 2,38 g IPTG și se dizolvă în 10 ml apă distilată; soluția se sterilizează prin filtrare, se împarte în volume de câte 1 ml și se păstrează la

temperatura de -20oC;

8

1. Soluție tampon de încărcare SDS-PAGE 4x - TRIS-HCl 200 mM (pH 6,8), albastru de bromfenol 0,4%, glicerol 40%, SDS 8% DTT 0,4 M – pentru prepararea a 10 ml soluție

tampon se dizolva 0,04 g albastru de bromfenol și 0,8 g SDS în 1 ml apă distilată, se

adaugă 2 ml tampon TRIS-HCl 1 M pH 6,8 (pentru gelul de concentrare),

4 ml glicerol și 1 ml DTT 1 M; soluția se poate păstra la temperatura camerei sau la

frigider;

2. hotă sterilă cu flux de aer laminar;

3. incubator termostatat cu agitare, GFL Mini Incubator – 4010 sau echivalent;

4. centrifugă cu răcire; 5. spectrofotometru și cuve de spectrofotometrie.

Mod de lucru: 1. se inoculează cei 10 ml mediu LB care conține ampicilină 50 mg/ml cu o singură

colonie de E. coli de pe placa Petri;

2. eprubeta cu mediu inoculat se incubează peste noapte la 37oC sub agitare (190 rpm);

3. 1 ml din cultura bacteriană obținută se folosește pentru inocularea celor două flacoane Erlenmeyer cu 100 ml mediu LB suplimentat cu ampicilină 50 mg/ml; flacoanele se

incubează la 37oC și 190 rpm până când densitatea optică a culturii la 600 nm atinge o

valoare cuprinsă în intervalul 0,7-1; în general, această condiție este îndeplinită după 2-

3 ore de cultivare;

4. se induce expresia proteinei clonate prin adăugarea în unul din flacoane a 100 μl IPTG 1 M; cantitatea de IPTG poate varia, fiind unul dintre parametrii care trebuie stabiliți

pentru optimizarea expresiei; cel de-al doilea flacon rămâne neindus și reprezintă

controlul procesului de expresie;

5. flacoanele se incubează timp de 1-4 ore la 35oC și 190 rpm; timpul de incubare și temperatura și viteza de agitare pot fi variate pentru îmbunătățirea expresiei proteinei;

6. la intervale de 1 h se determină densitatea optică la 600 nm a culturi și se notează valoarea. Simultan, se preia o proba de 1 ml cultură care se centrifughează la 4000

rpm/10 min.

7. depozitul obținut se resuspendă într-un volum de soluție tampon de încărcare SDS-PAGE 1x în așa fel încât 20 microL din lizatul final să conțină 0,25 unități de densitate

optică măsurate la 600 nm;

8. suspensia obținută se încălzește la 95oC pentru 10 min pentru liza celulelor;

9. lizatul celular se analizează prin SDS-PAGE pentru cuantificarea nivelului de expresie a proteinei supraexprimate; pentru detalii privind SDS-PAGE consultați partea C a

acestui document.

Rezultate obținute Pentru înțelegerea rezultatelor obținute este necesară parcurgerea părții C a acestui document.

De aceea, rezultatele vor fi prezentat și comentate la finalul părții C.

9

Întrebări:

B.1 Folosind aplicația ProtParam disponibilă la adresa https://web.expasy.org/protparam/, calculați masa moleculară a proteine native SsDH. Care este valoarea acesteia în kDa?

B.2 Folosind aceeași aplicație, calculați masa molară a proteinei recombinate ce va fi exprimată în E. coli. Care este valoarea acesteia în kDa?

B.3 Apare o diferență între aceste valori? Dacă da, de ce?

Bibliografie pentru părțile A și B 1. Terpe, K. (2003) – Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical

fundamentals to commercial systems., Applied microbiology and biotechnology, 60,

523-33.

2. LaVallie, E. R. (2001) – Production of recombinant proteins in Escherichia coli in Current

Protocols in Protein Science (John E. Coligan Ed.), Wiley,

3. Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R. A., Nordheim, A., Stunnenberg, H. G.

(1991) – Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by

recombinant vaccinia virus., Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 88, 8972-6.

4. Knapp, J. E., Carroll, D., Lawson, J. E., Ernst, S. R., Reed, L. J., Hackert, M. L. (2000) –

Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic

domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase., Protein Science,

9, 37-48.

5. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. (1975) – Metal chelate affinity

chromatography, a new approach to protein fractionation, Nature, 258, 598-599.

6. Twyman, R. (1999) – Advanced Molecular Biology: A Concise Reference, p 499. BIOS

Scientific Publishers.

7. Griffiths, A. J., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. (2000) – An

Introduction to Genetic Analysis, p 250-375. W. H. Freeman.

8. Reece, R. J. (2004) – Analysis of Genes and Genomes, p 490. Wiley.

9. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M. P., Zipursky, L.,

Darnell, J. (2003) – Molecular Cell Biology, p 361-380. W. H. Freeman.

10. Twyman, R. (1998) – Advanced molecular biology: a concise reference. Bios Scientific

Publishers, Oxford UK.

11. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. (2003) – NEBcutter: a program to cleave DNA with

restriction enzymes, Nucleic Acids Research, 31, 3688-3691.

12. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) – Molecular Cloning - A Laboratory Manual,

p 1.21-1.53. Cold Spring Harbour Laboratory Press.

13. de Boer, H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983) – The tac promoter: a functional hybrid

derived from the trp and lac promoters., Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 80, 21-5.

14. Makrides, S. C. (1996) – Strategies for achieving high-level expression of genes in

Escherichia coli., Microbiological reviews, 60, 512-38.

15. Gottesman, S. (1996) – Proteases and their targets in Escherichia coli., Annual review of

genetics, 30, 465-506.

16. Higgins, S. J., Hames B.D. (1999) – Protein Expression: A Practical Approach (Practical

Approach Series), p 304. Oxford University Press, USA.

17. Creighton, T. E. (1999) – Encyclopedia of Molecular Biology (Wiley Biotechnology

Encyclopedias), p 2878. Wiley-Interscience.

18. Khan, R. H., Rao, K. B., Eshwari, A. N., Totey, S. M., Panda, A. K. – Solubilization of

recombinant ovine growth hormone with retention of native-like secondary structure and

https://web.expasy.org/protparam/

10

its refolding from the inclusion bodies of Escherichia coli., Biotechnology progress, 14,

722-8.

19. Hansen, L. H., Knudsen, S., Sorensen, S. J. (1998) – The Effect of the lacY Gene on the

Induction of IPTG Inducible Promoters, Studied in Escherichia coli and Pseudomonas

fluorescens, Current Microbiology, 36, 341-347.

20. Blackwell, J. R., Horgan, R. (1991) – A novel strategy for production of a highly expressed

recombinant protein in an active form, FEBS Letters, 295, 10-12.

21. Studier, F. W. (2005) – Protein production by auto-induction in high density shaking

cultures., Protein expression and purification, 41, 207-34.

22. Mihasan, M., Ungureanu, E., Artenie, V. (2007) – Optimum parameters for overexpression

of recombinant protein from tac promotors on autoinducible medium, Romanian

Biotechnological Lettters, 12, 3473-3482 .

23. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. (1988) – A simple salting out procedure for

extracting DNA from human nucleated cells., Nucleic acids research, 16, 1215.

24. Ozaita, A., Olmos, G., Boronat, M. A., Lizcano, J. M., Unzeta, M., García-Sevilla, J. A.

(1997) – Inhibition of monoamine oxidase A and B activities by imidazol(ine)/guanidine

drugs, nature of the interaction and distinction from I2-imidazoline receptors in rat liver.,

British Journal of Pharmacology, 121, 901-12.

25. Li, M., Su, Z.-G., Janson, J.C. (2004) – In vitro protein refolding by chromatographic

procedures., Protein expression and purification, 33, 1-10.

26. Singh, S. M., Panda, A. K. (2005) – Solubilization and refolding of bacterial inclusion body

proteins., Journal of bioscience and bioengineering, 99, 303-10.

27. Tsumoto, K., Ejima, D., Kumagai, I., Arakawa, T. (2003) – Practical considerations in

refolding proteins from inclusion bodies, Protein Expression and Purification, 28, 1-8.

28. Williams, A., Hagel, L. (1999) – Column Handbook for Size Exclusion Chromatography

in Column Handbook for Size Exclusion Chromatography (Chi-san, W., Ed.), p 27-74.

Elsevier.

29. Hagel, L. (2001) – Gel-filtration chromatography., Current protocols in protein science,

John E. Coligan et al.Chapter 8, Unit 8.3.

30. Scopes, R. (2000) – Protein Separation in Encyclopedia of Separation Science - Level II:

Methods and Instrumentation (Wilson, I., Ed.), p 405-410. Academic Press.

31. Ranadive S.A., Pipkin J.D., Varia S.A., N. H.C., Barry E.P., Porubcan M., Unger S.E.,

McCormick T.J. (1995) – Formation, isolation and identification of oligomers of

aztreonam, European Journal of Pharmaceutical Sciences. Elsevier 3, 11.

32. Dondos, A. (2006) – Applicability of the modified universal calibration of gel permeation

chromatography on proteins., Journal of chromatography, 1127, 183-6.

C. Separarea electroforetică a proteinelor

Electroforeza proteinelor în condiții denaturante (SDS-PAGE)

Principiul metodei Metoda de separare electroforetică în condiții denaturante propusă este una derivată de la

sistemul de separare discontinuu al lui Ornstein și Davis. În acest sistem de separare se foloseste

un gel alcătuit din 2 porțiuni ce diferă prin pH și concentrația de acrilamidă. Procesul de

separare a proteinelor în sistemul discontinuu are loc în două etape, corespunzătoare celor două

zone:

1. Etapa de concentrare a fracțiilor proteice sau etapa de izotachoforeză (1)

11

Probele reprezentate de soluția proteică sunt plasate în porțiunea din gel numită “gel de

concentrare”, al cărui pH este de 6,8. La această valoare a pH-ului, glicina (punctul izoelectric,

pI=6,7) este practic lipsită de sarcină electrică, iar clorul este încărcat negativ. La aplicarea

curentului electric, glicina va avea o mobilitate redusă (datorită lipsei sarcinii) iar clorul va

avea mobilitate maximă. Proteinele cu punctul izoelectric (pI) diferit de 6,8, cu grade diferite

de încărcare vor avea mobilități intermediare, plasându-se între frontul glicinei și cel al clorului,

realizând legătura între aceste două fronturi. Apare astfel o zonă în care moleculele proteice se

grupează, se concentrează și se ordonează în funcție de sarcină. În această zonă apar grupe de

proteine ce diferă una de cealaltă prin sarcină, aceste grupe fiind însă strâns legate una de

cealaltă și formând așa-numitul „tren de ioni” (1). Între grupele de proteine nu pot apărea

goluri, deoarece aceste goluri ar duce la întreruperea circuitului electric. Ca urmare a acestui

fapt, în etapele târzii ale procesului toate moleculele migrează cu aceeași viteză, de unde și

denumirea de izotachoforeză (izo – egal, tacho – viteză). Când acest tren al ionilor ajunge în

zona de contact dintre gelul de concentrare și cel de migrare, rezistența datorată porilor mici ai

gelului de migrare crește, ceea ce duce la concentrarea proteinelor sub forma unei singure benzi

foarte fine.

2. Etapa de separare a fracțiilor proteice.

În poțiunea din gel numită “gel de separare”, la pH 8,8, glicina este încărcată negativ și,

datorită masei moleculare mici, continuă să migreze împreună cu frontul clorului cu o viteză

relativ mare, depășind frontul proteic întârziat la intrarea în acest gel. Proteinele se desprind

din trenul ionilor și se separă în funcție de masa moleculară și sarcina electrică.

Electroforeza proteinelor în condiții denaturante (SDS-PAGE) a fost introdusă pentru prima

dată de Laemmli (13) și are caracteristic faptul că proteinele sunt supuse denaturării prin

acțiunea dodecil-sulfatului de sodiu (SDS), β-mercaptoetanolului și temperaturii. SDS-ul este

un detergent încărcat negativ care are proprietatea de a se lega de catenele polipeptidice într-

un raport de 1,4 g detergent / 1 g proteină (11). Acest sistem de separare mai este cunoscut și

sub numele de Glicină-SDS-PAGE.

Sub acțiunea temperaturii, SDS-ului și β-mercaptoetanolului, structura tridimensională

a moleculelor proteice este alterată. Astfel, proteinele sunt transformate în catenele liniare de

aminoacizi. SDS-ul se fixează pe catenele polipetidice într-o cantitate proporțională cu

lungimea lor și ecranează sarcinile datorate încărcării aminoacizilor. Toate proteinele vor fi,

prin urmare, încărcate negativ, dimensiunea sarcinii fiind direct proporțională cu cantitatea de

SDS fixată, adică cu lungimea catenei. În această situație separarea se realizează în funcție de

un singur parametru și anume de dimensiunea catenelor polipeptice.

Avantaje: Metoda este utilizată în scopuri analitice calitative (în vederea aprecierii gradului de

puritate a unui preparat), dar și cantitative (cu o bună standardizare). Aplicația cea mai

cunoscută este însă aprecierea maselor moleculare ale proteinelor. În acest caz trebuie făcute

următoarele precizări:

1. pentru aprecierea masei moleculare este necesar ca amestecul de proteine marker (cu mase moleculare cunoscute) să fie supus electroforezei simultan cu proba de analizat;

2. separarea proteinelor în funcție de masa moleculară nu este una liniară, de aceea se pot aprecia corect masele moleculare doar pentru proteinele din zona centrală a gelului;

3. masa moleculară relativă a proteinelor poate varia în funcție de starea de reducere a legăturilor disulfidice; prezența legăturilor disulfidice nereduse duce la scăderea masei

moleculare relative cu 2-4 kDa (14), iar prezența legăturilor incomplet reduse duce la

apariția a două benzi apropiate ca masă; analiza comparativă a aceleiași proteine tratate

12

și netratate cu agenți reducători poate oferi informații legate de prezența punților

disulfidice.

Limitări: Folosind acest sistem de separare, glicoproteinele migrează foarte încet. Această

comportare se datorează faptului că partea glucidică din structura glicoproteinelor leagă foarte

slab SDS-ul. Pentru îmbunătățirea vitezei de separare se poate folosi sistemul tampon propus

de Poduslo (1981), care folosește Tris-borat-EDTA ca tampon de migrare (15).

Sistemul de separare al lui Laemmli (Glicină-SDS-PAGE) permite separarea

proteinelor cu masă moleculară mai mare de 15 kDa. Pentru proteinele cu masele moleculare

mai mici decât această limită este indicată utilizarea sistemului Tricină-SDS-PAGE descris

de Schagger (2006) (14).

Materiale necesare: 1. soluție stoc de acrilamidă – se prepară prin dizolvarea a 29 g acrilamidă și 1 g N-N'-

metilen-bisacrilamidă (puritate pentru electroforeză) în 100 ml apă distilată; se verifică

pH-ul soluției care trebuie să fie mai mic de 7 și se păstrează în sticle brune, la întuneric,

la temperatura de 4oC; este indicat, de asemenea, ca soluția să fie degazificată sub vid,

în vederea eliminării oxigenului solvit; soluțiile preparate în laborator au o durată de

viață limitată, deoarece acrilamida și bisacrilamida se dezaminează și formează acizii

corespunzători, procesul fiind catalizat de lumină și alcalii; Prezența acidului acrilic în

soluția de acrilamidă duce la diminuarea rezoluției și apariția unor benzi difuze. Soluția

de acrilamidă preparată în laborator se poate folosi timp de câteva luni, după care

trebuie refăcută (11); soluția stoc de acrilamidă poate fi achiziționată gata preparată de

la producători precum Biorad, Amersham-Biosciences, Roth; aceste soluții reduc

pericolul contaminării cu poliacrilamidă și au o mai mare stabilitate în timp datorită

aditivilor pe care îi conțin (un an flaconul nedesfăcut, 6 luni flaconul desfăcut) (12).

Acrilamida și bisacrilamida monomere se absorb prin

piele și sunt neurotoxine deosebit de puternice, fiind de

asemenea suspectate de efecte cancerigene. Cântărirea și

prepararea soluțiilor se realizează cu atenție, manevrarea

făcându-se cu mănuși și purtând mască de protecție. Deși

poliacrilamida este considerată inofensivă, este indicat ca

manipularea gelurilor să se realizeze tot cu mănuși

datorită resturilor de acrilamidă nepolimerizată.

2. tampon TRIS 1,5M, pH 8,8 – se dizolvă 18,166 g Tris-bază în 80 ml apă distilată și se ajustează pH-ul la 8,8 cu HCl, după care se completează la 100

ml cu apă distilată;

3. tampon TRIS 1 M, pH 6,8 – se dizolvă 12,114 g Tris-bază în 80 ml apă distilată și se ajustează pH-ul la 6,8 cu HCl, după care se completează la 100

ml cu apă distilată; nu este recomandată utilizarea TRIS-HCl sau Trisma datorită

conținutului mare de săruri ceea ce conduce la obținerea unor benzi difuze (11); soluția

se păstrează în sticle bine închise, la temperatura camerei;

4. TEMED – N,N,N',N'- tetrametiletilendiamină;

5. persulfat de amoniu 10% (APS) – se prepară prin dizolvarea a 0,1 g persulfat de amoniu în 1 ml apă distilată; soluția se poate păstra la temperatura de

13

4oC timp de o săptămână; persulfatul de amoniu se descompune lent în soluție, motiv

pentru care se recomandă utilizarea soluției proaspăt preparate;

6. tampon de electroforeză Tris-Glicină-SDS (Tris-bază, 25 mM glicină 250 mM, SDS 0,1%) – se prepară prin dizolvarea a 3,02 g Tris-bază, 18,8 g glicină, 10 ml SDS 10%

în 1000 ml apă distilată; în cazul utilizării frecvente se pot prepara soluții de până la

10X mai concentrate, acestea necesitând diluare înainte de folosire;

7. soluție 10% SDS; aceasta se prepară prin dizolvarea a 10 g SDS în 90 ml apă distilată; pentru dizolvare completă poate fi necesară încălzirea; soluția se păstrează la

temperatura camerei;

SDS-ul se prezintă sub forma unei pulberi fine, ușor antrenată de curenții

de aer. Inhalată, pulberea produce iritarea mucoasei nazale, din acest

motiv cântărirea și manipularea acestui compus trebuie să se realizeze

numai purtând masca de protecție.

8. soluție tampon pentru probe 4X – TRIS-HCl 200 mM (pH 6,8), albastru de bromfenol

0,4%, glicerol 40%, SDS 8%– pentru prepararea a 10 ml soluție tampon se dizolva 0,04

g albastru de bromfenol și 0,8 g SDS în 4 ml apă distilată, se adaugă 2 ml tampon TRIS-

HCl 1 M pH 6,8 (pentru gelul de concentrare) și

4 ml glicerol; soluția se poate păstra la temperatura camerei sau la frigider;

9. soluție stoc ditiotreitol (DTT) 1 M – se dizolvă 0,154 g DTT în 1 ml apă distilată; soluția se păstrază la congelator; în calitate de agent reducător se

poate utiliza și beta-mercaptoetanol în aceeași concentrație.

Mod de lucru A. Turnarea gelului de poliacrilamidă presupune parcurgerea mai multor etape.

1. asamblarea plăcilor din sticlă în vederea turnării gelului de poliacrilamidă se

realizează urmând indicațiile producătorului cuvei de electroforeză (Biorad, Apelex etc.). Este

necesar să se cunoască volumul de gel necesar și dacă acesta nu este indicat de producătorul

cuvei poate fi determinat prin măsurarea cantității de apă dintre plăcile din sticlă montate în

vederea turnării gelului.

Într-un pahar Erlenmeyer curat se prepară volumul necesar de gel de migrare urmând

indicațiile din Tabelul 1. Concentrația gelului de separare se alege în funcție de dimensiunea

proteinei de interes, urmând indicațiile din Tabelul 2. De precizat că rezoluția în limitele

superioară și inferioară este redusă.

14

Tabel 2. Dependența dintre concentrația gelului de separare și masele proteinelor posibil a fi

separate (după Ausubel, 2002) (16)

Concentrație gel de separare

(%)

Limite mase proteine

(kDa)

6 60 -200

8 30-95

10 16-70

12 12-60

15 12-45

Componentele trebuie adăugate în ordinea înscrisă în Tabelul 2 pentru a împiedica

polimerizarea accidentală a acrilamidei. Conținutul flaconului se agită după care se trece la

etapa următoare.

2. acrilamida se toarnă cu atenție în spațiul dintre cele 2 plăci din sticlă. Nivelul de

umplere se stabilește în așa fel încât pieptenul să poată fi introdus, iar de la capătul acestuia să

rămână un spațiu de 1 cm pentru gelul de concentrare. Peste soluția de acrilamidă proaspăt

turnată se adaugă cu grijă etanol, care are rolul de a elimina eventualele bule de aer care se pot

forma la suprafața soluției de acrilamidă, de a asigura formarea unei margini superioare drepte

și de a nu permite difuzia oxigenului în soluția de acrilamidă (oxigenul inhibă procesul de

polimerizare);

3. după polimerizare (procesul durează aproximativ 30 minute sau mai mult dacă APS-

ul nu este are calitatea corespunzătoare), se elimină etanolul din partea superioară a gelului, se

spală cu apă distilată spațiul dintre plăcile de sticlă și se îndepărtează apa în exces cu hârtie de

filtru.

4.într-un pahar Erlenmeyer se prepară volumul necesar de gel de concentrare urmând

indicațiile din Tabelul 2, exceptând soluția de SDS. Componentele se amestecă și se trece la

punctul 5; etapa de mogenizare a componentelor nu trebuie să dureze foarte mult timp,

deoarece polimerizarea gelului de concentrare are loc mult mai repede decât în cazul gelului

de separare.

5. soluția se toarnă cu atenție peste gelul de separare și imediat se inserează pieptenii;

aceștia trebuie introduși în așa fel încât să nu apară bule de aer; polimerizarea este completă

după aproximativ 30 minute. Gelurile pot fi utilizate imediat după expirarea acestui interval.

Înainte de utilizare se scoate pieptenul, se spală godeurile pentru probe cu apă distilată și se

elimină apa în exces. Plăcile din sticlă între care se află gelul se asamblează în cuva de

electroforeză urmând indicațiile producătorului iar cuva se umple cu soluție tampon de migrare.

B. Pregătirea probelor

Cantitatea de proteine ce pot fi separate pe un gel depinde de dimensiunile acestuia. Ca

punct de reper, pe un gel în format mini, cu dimensiunile de 8 x 10 cm și grosimea de 0,1 cm

se pot separa amestecuri de proteine cu un conținut de până la 25-30 μg și proteine purificate

cu un conținut de până la 5 μg.

Într-o microeprubetă Eppendorf se repartizează 5 μl tampon pentru probe 4X în care se

adaugă soluția de analizat conținută într-un volum X (de maximum 15 μl). Se completează

amestecul cu 2 μl soluție DTT 1 M și apă distilată până la volumul final de 20 μl, după care se

încălzește la 95oC timp de 5 minute. După răcire probele se încarcă cu o seringă Hamilton, în

godeurile din gel.

15

C. Separarea electroforetică propriu-zisă

Cuva de electroforeză se conectează la o sursă de curent și se setează intensitatea

curentului ca parametru constant. Valorile variază în funcție de dimensiunile gelului utilizat.

Pentru un gel în format mini, se aplică 10 mA/gel până când frontul colorantului atinge limita

de separare dintre cele două geluri, după care se aplică 15 mA/gel până când frontul

colorantului atinge limita inferioară a gelului.

După finalizarea migrării, plăcile din sticlă se scot din cuvă, se așează pe o foaie de

hârtie de filtru și se desfac cu atenție, în vederea recuperării gelului. Acestuia i se marchează

colțul din dreapta jos în vederea orientării ulterioare. Gelul se scoate dintre plăcile din sticlă,

se clătește cu apă distilată și se prelucrează în vederea detecției proteinelor separate prin metoda

descrisă în continuare. Pericolul ruperii gelului la mutarea lui de pe placa de sticlă în vasul de

colorare este mult diminuat dacă operația se realizează prin antrenarea gelului cu un jet de apă

dintr-o pisetă.

16

TABEL 1. Componentele necesare preparării gelului de separare utilizat în electroforeza nativă sau în SDS -PAGE

(după Sambrook et al.1989 ) (11)

Concentrația finală a

gelului

Componentă Volumul fiecărei componente (ml) pentru obținerea volumului final

de:

5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml

6%

Apă distilată 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5

Acrilamidă 30% 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0

Tris 1,5M pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

SDS 10%* 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

APS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 0,024 0,032 0,04

8%

Apă distilată 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2

Acrilamidă 30% 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3

Tris 1,5M pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

SDS 10%* 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

APS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03

Apă distilată 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8

17

Concentrația finală a

gelului

Componentă Volumul fiecărei componente (ml) pentru obținerea volumului final

de:

5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml

10% Acrilamidă 30% 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7

Tris 1,5M, pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

SDS 10%* 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

APS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

12%

Apă distilată 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5

Acrilamidă 30% 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0

Tris 1,5M pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 20,0

SDS 10%* 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

APS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

15%

Apă distilată 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5

Acrilamidă 30% 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0

Tris 1,5M pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10 12,5

SDS 10%* 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

18

Concentrația finală a

gelului

Componentă Volumul fiecărei componente (ml) pentru obținerea volumului final

de:

5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml

APS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

*–componentă care trebuie eliminată dacă se are în vederea realizarea unei electroforeze native

TABEL 2. Componentele necesare preparării gelului de concentrare utilizat în electroforeza nativă sau în SDS-

PAGE (după Sambrook et al.1989) (11)

Componentă Volumul fiecărei componente (ml) pentru obținerea volumului final de:

1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 10 ml

Apă distilată 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8

Acrilamidă 30% 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7

Tris 1 M pH 6,8 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25

SDS 10%* 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1

APS 10% 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1

TEMED 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01

*–componentă care trebuie eliminată dacă se are în vederea realizarea unei electroforeze native

19

Colorarea gelurilor folosind Comassie Brilliant Blue R-250

Principiul metodei: Colorarea cu Comassie Brilliant Blue R-250 este cea mai utilizată metodă de evidențiere

a proteinelor pe gelurile de poliacrilamidă datorită simplității sale. Proteinele sunt simultan

fixate și colorate utilizând o soluție metanolică de Comasssie Briliant Blue R-250 (colorant

textil cunoscut sub numele comercial de Acid Blue 38 (11). Colorantul are proprietatea de a se

lega specific de moleculele proteice, astfel încât acestea vor apărea colorate în albastru pe un

fond transparent. Colorantul se leagă de toate proteinele colorându-le uniform.

Materiale necesare: 1. soluție pentru colorare – se prepară prin dizolvarea a 0,25 g Comassie Brilliant Blue

R250 în 100 ml amestec metanol:acid acetic:apă distilată 45:10:45 (v/v). colorantul se

dizolvă în metanol după care se adaugă apa și acidul acetic;

Metanolul este deosebit de toxic pentru organismul uman. Ingestia,

inhalarea sau absorbția cutanată a unei cantități de metanol (> 20 mg%)

determină simptome primare precum depresia sistemului nervos central,

cefalee, vertij, greață, pierderea echilibrului, confuzie, scăderea acuității

vizuale etc., iar după aproximativ zece ore apar distrugerea nervului optic

și acidoza. Doza letală este de 1-2 ml metanol pur/kg corp.Pentru a se evita

intoxicarea cu metanol se recomandă manipularea cu grijă a acestuia,

utilizând echipamente de protecție (halat, mănuși, mască de protecție).

2. soluție pentru decolorare – metanol:acid acetic: apă 45:10:45 (v/v); 3. soluție pentru fixare – acid acetic 10%; 4. agitator orbital de laborator; 5. vas de colorare cu capac, din material plastic sau sticlă.

Mod de lucru Dupa separarea electroforetică, gelul de poliacrilamidă este clătit, dacă este cazul, cu

apă distilată pentru îndepărtarea SDS-ului, după care este plasat într-un vas cu aproximativ 5

volume de soluție pentru colorare (sau o cantitate suficientă pentru a acoperi complet gelul). Se

incubează sub agitare timp de aproximativ două ore, după care se îndepărteazăcolorantul. Gelul

se clătește cu apă distilată pentru îndepărtarea excesului de colorant, după care se imersează în

soluția de decolorare unde se menține timp de 4-8 ore. În acest timp, soluția de decolorare se

schimbă de 3-4 ori, după ce devine puternic colorată. Decolorarea este considerată finalizată

când fundalul devine transparent. Uneori, după decolorare, benzile pot fi ușor difuze, iar

fundalul ușor colorat. Menținerea gelului în soluția de fixare timp de 10-20 ore conduce la

rezolvarea acestor probleme. Timpii de incubare variază în limite destul de largi în funcție de

dimensiunea gelului, valorile menționate fiind valabile pentru un gel de format mini.

Odată decolorarea finalizată, gelul poate fi supus analizei prin fotografiere, scanare,

densitometrare sau poate fi păstrat în soluția de fixare pentru perioade mari de timp. O

modalitate mai simplă de păstrare a gelurilor este uscarea lor, folosind dispozitive specifice.

Prin uscare rezoluția gelului scade, motiv pentru care este indicat ca gelul sa fie mai întâi

fotografiat și apoi uscat.

Viteza de decolorare poate fi mărită prin:

a. folosirea unei soluții de metanol 30% și acid acetic 10%; menținerea prelungită a

gelurilor în această soluție duce la scăderea intensității benzilor corespunzătoare fracțiilor

proteice;

20

b. încălzirea soluției de decolorare la temperaturi mai mari de 45oC; operația trebuie să

se realizeze însă cu atenție deosebită datorită prezenței metanolului inflamabil și toxic.

Un protocol alternativ de decolorare, care elimină necesitatea utilizării metanolului,

folosește pentru colorare o soluție de Comassie Brillant Blue R-250 0,25% în isopropanol:acid

acetic:apă 25:10:65 (v/v) iar pentru decolorare etanol:acid acetic:apă 10:10:80 (v/v).

Rezultate obținute, combinate pentru partea B și C

O cultura de E.coli conținând plasmidul recombinat pH5EX3 a fost cultivată pe mediul

LB conform instrucțiunilor din partea B. După 3 ore de la inoculare, în cultură s-a adăugat IPTG

de concentrație finală 1 mM. Pe tot parcursul cultivării, de la inoculare (0 ore) timp de 21 ore

au fost prelevate probe de celule din oră în oră. Probele au fost prelucrate conform

instrucțiunilor din partea B, și apoi separate pe geluri denaturante SDS-PAGE de concentrație

8%. După migrare, gelul a fost colorat cu Commassie Blue. Gelul a fost fotografiat, fotografia

acestuia fiind prezentată mai jos.

Întrebări:

C.1 Ținând cont de răspunsul la întrebarea B2, care credeți că este concentrația gelului de separare recomandată pentru a evidenția proteina recombinată ORF39 în extractele de E.coli preparate conform indicațiilor din partea B?

C.2 Priviți fotografia gelului. Care este raționamentul după care identificați care dintre benzi este proteina SsDh? Nominalizați cel puțin 2 indicații/observații care să vă permită să identificați proteina SsDH.

C.3 Care este momentul optim de stopare a culturi E.coli pH6EX3orf39 pentru a obține cantitatea cea mai mare de proteina SsDH?

Ore de cultivare 0 2 3 4 5 6 7 8 9 21

S-a adăugat IPTG 1 mM în cultură

55

45

Marker de masă

molară Sigma

Wide Range

(Da)

66

97

116

36

29

24

21

Bibliografie pentru partea C 1. Westermeier, R. (2005) – Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications

of DNA and Protein Separations (Westermeier, R., Ed.). Wiley-VCH.

2. Kunkel, H. G., Tiselius, A. (1951) – Electrophoresis of proteins on filter paper., The Journal

of General Physiology, 35, 89-118.

3. Kohn, J. (1957) – An Immuno-electrophoretic Technique, Nature, 180, 986-987.

4. Smithies, O. (1955) – Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum

proteins of normal human adults., The Biochemical Journal, l61, 629-41.

5. Scherz, H. (1990) – Thin-layer electrophoretic separation of monosaccharides,

oligosaccharides and related compounds on reverse phase silica gel., Electrophoresis,

11, 18-22.

6. Dennison, C. (1999) – A Guide to Protein Isolation, p 122-133. Springer.

7. Ornstein, L. (1964) – Disc electrophoresis I. Background and theory, Annals of the New York

Academy of Sciences, 121, 321-49.

8. Davis, B. J. (1964) – Disc electrophoresis II. Method and application to human serum

proteins., Annals of the New York Academy of Sciences, 121, 404-27.

9. Chrambach, A., Jovin, T. M. (1983) – Selected buffer systems for moving boundary

electrophoresis on gels at various pH values, presented in a simplified manner,

Electrophoresis, 4, 190-204.

10. Niepmann, M., Zheng, J. (2006) – Discontinuous native protein gel electrophoresis.,

Electrophoresis, 27, 3949-51.

11. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) – Molecular Cloning - A Laboratory Manual,

p 18.47-18.58. Cold Spring Harbour Laboratory Press.

12. Gerstein, A. S. (2001) – Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide (Gerstein,

A. S., Ed.), p 331-373. Wiley-Liss.

13. Laemmli, U. K. (1970) – Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head

of Bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685.

14. Schägger, H. (2006) – Tricine-SDS-PAGE., Nature protocols, 1, 16-22.

15. Poduslo, J. F. (1981) – Glycoprotein molecular-weight estimation using sodium dodecyl

sulfate-pore gradient electrophoresis: comparison of tris-glycine and tris-borate-EDTA

buffer systems., Analytical Biochemistry,114, 131-9.

16. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J.,

Struhl, K. (2002) – Short Protocols in Molecular Biology, p 10.1-10.31. John Wiley &

Sons.

17. Manchenko, G. P. (2002) – Handbook of Detection of Enzymes on Electrophoretic Gels,

Second Edition. CRC Press.

18. Westermeier, R., Naven, T., Hamppker, H. R. (2008) – Proteomics in Practice: A Guide to

Successful Experimental Design (Westermeier, R., Ed.), p 19-27. Wiley-VCH.

19. Sammons, D. W., Adams, L. D., Nishizawa, E. E. (1981) – Ultrasensitive silver-based color

staining of polypeptides in polyacrylamide gels, Electrophoresis2, 135-141.

20. Schoenle, E. J., Adams, L. D., Sammons, D. W. (1984) – Insulin-induced rapid decrease of

a major protein in fat cell plasma membranes., The Journal of Biological Chemistry, 259,

12112-6.

21. Abramoff, D. M., Magelhaes, J. P., Ram, J. S. (2004) – Image processing with ImageJ,

Biophotonics International, 11, 36-42.

22. Garfin, D. (1990) – One-dimensional gel electrophoresis, Methods in Enzymology, 182,

425-441.

22

D. Purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate față de metale

Principiul metodei Proteinele recombinate conținând 6-8 resturi consecutive de histidină la unul din capete

(C sau N terminal) sunt supra-exprimate în Escherichia coli și purificate folosind un suport

cromatografic ce conține ioni Ni2+ imobilizați.

Avantaje: − permite purificarea unor cantități de proteină de ordinul miligramelor;

− permite obținerea unui nivel de puritate foarte mare (90-95%) prin aplicarea unei

singure etape de cromatografie;

− proteinele purificate au structura tridimensională nativă și funcția intacte.

Limitări: 1. pentru a mări afinitatea cozii poli-His față de Ni2+, faza mobilă are un conținut

relativ mare de NaCl ceea ce poate duce la precipitarea unor proteine solubile prin

fenomenul de salting-out (23);

2. eluția se realizează cu imidazol în concentrații relativ mari (200-500 mM) ceea ce poate duce la precipitarea proteinei izolate; de asemenea,

imidazolul este un puternic inhibitor al unor enzime precum monoamin-oxidazele

(24); datorită capacității sale de absorbție la 280 nm, imidazolul nu permite

măsurarea concentrației proteinelor prin spectrofotometrie

UV-VIS.

Materiale necesare: 1. placă Petri conținând tulpina E. coli BL21 în care a fost introdus plasmidul pH6EX3 cu

gena clonată;

2. mediu LB steril suplimentat cu ampicilină 50 mg/ml, două flacoane Erlenmayer de 5L cu 1000 ml mediu și o eprubetă de 50 ml cu 10 ml mediu;

3. IPTG 1 M steril – se cântăresc 2,38 g IPTG și se dizolvă în 10 ml apă distilată; soluția se sterilizează prin filtrare, se împarte în volume de câte 1 ml și se păstrează la

temperatura de -20oC;

4. soluție tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; pentru prepararea unui litru de soluție tampon, într-un cilindru gradat de 1L se dizolvă în 500 ml apă distilată 9,52 g

HEPES și 29,2 g NaCl; se ajustează pH-ul la 7,4 după care se aduce la 1000 ml cu apă

distilată; se păstrează la 4oC timp nelimitat;

5. hotă sterilă cu flux de aer laminar; 6. incubator termostatat cu agitare GFL Mini Incubator – 4010 sau echivalent; 7. sonicator Sonics Vibra Cell V505 sau echivalent; 8. centrifugă cu răcire; 9. spectrofotometru și cuve de spectrofotometrie; 10. suport cromatografic Ni-NTA Fast Flow sau High Performance Ni Sepharose

(Amersham Biosciences); suportul se păstrează sub forma unei suspensii 50% în etanol

20%. În general, suportul cromatografic este livrat de producător gata de utilizare

(culoare verde) și poate fi reutilizat de câteva zeci de ori; înainte de reutilizare, este

recomandată eliminarea completă a ionilor de nichel și reîncărcarea cu nichel

(regenerarea suportului cromatografic); unii distribuitori pun la dispoziție coloane

cromatografice pre-împachetate care pot fi utilizate fie manual, fie cuplate la sisteme

23

FPLC de genul AKTA (Amersham Biosciences, Germania);

11. soluții pentru regenerarea și încărcarea suportului cromatografic cu Ni: – soluție EDTA 0,05 mM, NaCl 0,5 M – se dizolvă 1,4 g EDTA și 2,92 g NaCl în apă

distilată și se aduc la 100 ml într-un balon cotat;

– soluție NaCl 0,5 M – se dizolvă 2,92 g NaCl în apă distilată și se aduc la 100 ml într-

un balon cotat;

– soluție NaCl 1 M – se dizolvă 11,6 g NaCl în apă distilată și se aduc la 100 ml într-

un balon cotat;

– soluție NaOH 1 M – se dizolvă 4 g NaOH în apă distilată și se aduc la 100 ml într-un

balon cotat;

– soluție NiCl2 150 mM – se dizolvă 1,95 g NiCl2 (sau 3,5 g

NiCl2 x 6H2O) în apă distilată și se aduc la 100 ml într-un balon cotat;

1. colonițe din plastic sau sticlă pentru cromatografie; 2. soluție stoc imidazol 1 M în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4 – se dizolvă 6,87 g

imidazol în 50 ml HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; se corectează pH-ul dacă este

necesar și se aduce la 100 ml cu HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4;

3. soluții pentru spălări și eluție imidazol 10 mM, 40 mM, 80 mM, 200 mM și 500 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4 – soluțiile pot fi preparate

în prealabil, dar și extemporaneu, urmând indicațiile de mai jos:

Concentrație

imidazol

(mM)

Volum soluție

imidazol 1 M

(ml)

Volum HEPES 40

mM, NaCl 500 mM,

pH 7,4.

(ml)

Volum final

(ml)

10 0,6 59,4 60

40 2,4 57,6 60

80 4,8 55,2 60

200 0,8 9,2 10

500 5 5 10

− facultativ – pompă peristaltică sau seringi din plastic de volum mare (25-50 ml).

Mod de lucru: I. Obținerea extractului proteic acelular:

− se inoculează cei 10 ml mediu LB, 50 mg/ml ampicilină cu o singură colonie de E. coli

de pe placa Petri;

− eprubeta se incubează peste noapte la 37oC și 190 rpm;

− cultura bacteriană obținută se folosește pentru inocularea flaconului Erlenmayer cu 1L

mediu LB, (50 mg/ml ampicilină); flaconul se incubează la 37oC și 190 rpm până când

densitatea optică a culturii la 600 nm atinge o valoare cuprinsă între 0,7-1; în general

această condiție este îndeplinită după 2-3 ore de cultivare;

− se induce expresia proteinei clonate prin adăugarea în unul din flacoane a 1 ml IPTG 1

M (sau cantitatea stabilită în partea B a acestui suport de LP);

− flaconul se incubează timp de 1-4 ore la 35oC și 190 rpm sau folosind condițile optime

stabilite în partea B a acestui suport de LP;

− celulele se separă din mediul de cultură prin centrifugare la

4400 x g timp de 10 minute la 4oC, după care se resuspendă în

50 ml soluție tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; dacă celulele nu sunt

24

procesate imediat, ele pot fi păstrate la temperatura de -20oC pentru o perioadă

nedeterminată;

− celulele se lizează prin sonicare de două ori câte 2 minute, puls o secundă, pauză o

secundă, putere 40%; adăugarea în etapa anterioară a DN-azei I sau a benzoazei (1

μg/ml) în soluția tampon de resuspensie diminuează foarte mult vâscozitatea lizatului

celular;

− lizatul celular obținut se clarifică prin centrifugare la 14.000 rpm,

30 min, 4oC; supernatantul clar obținut reprezintă extractul proteic acelular.

II. Pregătirea coloanei cromatografice

Coloana cromatografică este reprezentată de o coloniță din plastic sau sticlă în care este

amplasat suportul cromatografic. În general, colonița are dimensiuni mult mai mari decât

volumul de suport cromatografic. Spălările coloanei și separarea cromatografică propriu-zisă

se pot realiza sub influența câmpului gravitațional sau, mai rapid, prin conectarea la capătul de

evacuare a coloniței a unei pompe peristaltice sau a unei seringi. Pentru pregătirea coloanei

cromatografice se parcurg următoarele etape:

− se pipetează în colonița din sticlă sau plastic un volum de 2 ml apă și se marchează

nivelul; volumul de 2 ml reprezintă volumul coloanei cromatografice (CV, engl.

Column Volume). Capacitatea de legare a Ni-NTA este de 5-10 mg proteină/ ml Ni-

NTA, deci un volum de 2 ml permite purificarea unei cantități de până la 20 mg proteină;

− după evacuarea apei, se pipetează un volum de suspensie de rășină Ni-NTA suficient

pentru ca, după scurgerea etanolului 20%, rășina să se afle la nivelul marcat în etapa

anterioară;

− dacă rășina Ni-NTA este reutilizată, aceasta trebuie regenerată prin spălări succesive cu

reactivii specificați în schema următoare:

Soluție Volum

EDTA 0,05 M, NaCl 0,5M* 10 x CV (20 ml)

NaCl 0,5M 2-3 x CV (4-6 ml)

NaCl 1 M** 1 x CV (2 ml)

NaOH 1 M 10 x CV (20 ml)

Etanol 70% 10 x CV(20 ml)

Apă distilată 10 x CV (20 ml)

NiCl2 150 mM 4 x CV (8 ml)

*suportul cromatografic trebuie să devină alb

**această soluție este menținută în contact cu coloana timp de 15-20 minute la temperatura camerei

***suportul cromatografic trebuie să devină verde-albăstrui la finalizarea acestei etape

1. după regenerare sau dacă rășina este nouă, aceasta se spală cu un volum de 10 x CV (20 ml) apă distilată și se echilibrează cu aceeași soluție tampon în care au fost resuspendate

celulele.

III. Separarea cromatografică propriu-zisă:

1. este indicat ca toate operațiile descrise în cele ce urmează să fie realizate la temperatura de 4oC. Dacă acest lucru nu este posibil, soluțiile utilizate pentru purificare și cele ce

conțin proteina de purificat vor fi menținute pe gheață.

2. extractul proteic acelular se pipetează în colonița din plastic, peste rășina Ni-NTA; viteza de curgere prin coloană trebuie să fie redusă și de aceea, dacă se utilizează o

25

pompă peristaltică, aceasta se deconectează;

3. coloana se spală pentru eliminarea proteinelor legate nespecific urmând indicațiile din schema următoare:

Soluție Volum

HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4 30 x CV (60 ml)

Imidazol 10 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500

mM, pH 7,4

30 x CV (60 ml)

Imidazol 40 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500

mM, pH 7,4

30 x CV (60 ml)

Imidazol 80 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500

mM, pH 7,4*

10 x CV (20 ml)

*este indicată colectarea și fracționarea efluentului din această etapă deoarece unele proteine mai slab legate sunt

eluate la această concentrație de imidazol

4. eluarea proteinelor se realizează prin spălarea cu 10 x CV imidazol 200 mM și apoi 500 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; Efluentul se colectează în fracțiuni de

câte 1 ml și se analizează în vederea determinării conținutului de proteine prin SDS-

PAGE.

În mod obișnuit o spălare cu imidazol 200 mM este suficientă pentru a elua majoritatea

proteinelor recombinate cu coadă poli-His. Pentru a preîntâmpina precipitarea și a facilita crio-

conservarea probelor, este indicată adăugarea în eprubetele de colectare glicerol într-o

concentrație finală de aproximativ 1%. Dacă proteina purificată este instabilă la concentrații

mari de săruri, imidazolul și NaCl din soluția tampon pot fi eliminate prin dializă, utilizând

dispozitive centrifugale de tip Centricon, sau cromatografie de filtrare prin gel. De asemenea,

este indicat ca pe parcursul purificării să fie prelevate probe pentru a fi evaluate prin

SDS-PAGE.

Rezultate obținute O cultura de E.coli conținând plasmidul recombinat pH5EX3ssdh a fost cultivată pe

mediul LB și procesată conform instrucțiunilor din D. Probele prelevate au fost apoi separate

pe geluri denaturante SDS-PAGE de concentrație 8%. După migrare, gelul a fost colorat cu

Commassie Blue. Gelul a fost fotografiat, fotografia acestuia fiind prezentată mai jos.

26

Gradul de puritate al preparatului enzimatic

obţinut prin IMAC.

M – Marker molecular de masa Sigma Wide Range

(kDa).

1 – Lizat celular (25 microg proteină).

2 – Lizat celular clarificat prin centrifugare (CFE, 30

microg proteină).

3, 4, 5 - Fracţii obţinute prin eluţia cu 80, 100 şi

respectiv 200 mM imidazol (10 micrograme

proteină).

Întrebări:

D.1 Analizând figura de mai sus, care este raționamentul după care concluzionăm că am obținut proteina SsDH pură? Prezentați cel puțin 2 indicații/observații care să vă permită să trageți concluzia.

D.2 La ce concentrație de imidazol (mM) eluează proteina SSdH de pe coloana de Ni-Sepharose?

D.3 Cum puteți motiva migrarea proteinei purificate orf39 sub forma a două benzi în figura de mai jos?

Modul de migrare diferit al proteinei orf39 purificate în lipsa β-mercaptoetanolului

(A) şi în prezenţa acestuia (B) în soluțiile tampon de încărcare în gel.

Bibliografie pentru partea D 1. Terpe, K. (2003) – Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical

fundamentals to commercial systems., Applied microbiology and biotechnology, 60, 523-

33.

2. LaVallie, E. R. (2001) – Production of recombinant proteins in Escherichia coli in Current

Protocols in Protein Science (John E. Coligan Ed.), Wiley,

3. Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R. A., Nordheim, A., Stunnenberg, H. G.

(1991) – Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by

27

recombinant vaccinia virus., Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 88, 8972-6.

4. Knapp, J. E., Carroll, D., Lawson, J. E., Ernst, S. R., Reed, L. J., Hackert, M. L. (2000) –

Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic

domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase., Protein Science,

9, 37-48.

5. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. (1975) – Metal chelate affinity

chromatography, a new approach to protein fractionation, Nature, 258, 598-599.

6. Twyman, R. (1999) – Advanced Molecular Biology: A Concise Reference, p 499. BIOS

Scientific Publishers.

7. Griffiths, A. J., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. (2000) – An

Introduction to Genetic Analysis, p 250-375. W. H. Freeman.

8. Reece, R. J. (2004) – Analysis of Genes and Genomes, p 490. Wiley.

9. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M. P., Zipursky, L.,

Darnell, J. (2003) – Molecular Cell Biology, p 361-380. W. H. Freeman.

10. Twyman, R. (1998) – Advanced molecular biology: a concise reference. Bios Scientific

Publishers, Oxford UK.

11. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. (2003) – NEBcutter: a program to cleave DNA with

restriction enzymes, Nucleic Acids Research, 31, 3688-3691.

12. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) – Molecular Cloning - A Laboratory Manual,

p 1.21-1.53. Cold Spring Harbour Laboratory Press.

13. de Boer, H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983) – The tac promoter: a functional hybrid

derived from the trp and lac promoters., Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 80, 21-5.

14. Makrides, S. C. (1996) – Strategies for achieving high-level expression of genes in

Escherichia coli., Microbiological reviews, 60, 512-38.

15. Gottesman, S. (1996) – Proteases and their targets in Escherichia coli., Annual review of

genetics, 30, 465-506.

16. Higgins, S. J., Hames B.D. (1999) – Protein Expression: A Practical Approach (Practical

Approach Series), p 304. Oxford University Press, USA.

17. Creighton, T. E. (1999) – Encyclopedia of Molecular Biology (Wiley Biotechnology

Encyclopedias), p 2878. Wiley-Interscience.

18. Khan, R. H., Rao, K. B., Eshwari, A. N., Totey, S. M., Panda, A. K. – Solubilization of

recombinant ovine growth hormone with retention of native-like secondary structure and

its refolding from the inclusion bodies of Escherichia coli., Biotechnology progress, 14,

722-8.

19. Hansen, L. H., Knudsen, S., Sorensen, S. J. (1998) – The Effect of the lacY Gene on the

Induction of IPTG Inducible Promoters, Studied in Escherichia coli and Pseudomonas

fluorescens, Current Microbiology, 36, 341-347.

20. Blackwell, J. R., Horgan, R. (1991) – A novel strategy for production of a highly expressed

recombinant protein in an active form, FEBS Letters, 295, 10-12.

21. Studier, F. W. (2005) – Protein production by auto-induction in high density shaking

cultures., Protein expression and purification, 41, 207-34.

22. Mihasan, M., Ungureanu, E., Artenie, V. (2007) – Optimum parameters for overexpression

of recombinant protein from tac promotors on autoinducible medium, Romanian

Biotechnological Lettters, 12, 3473-3482 .

23. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. (1988) – A simple salting out procedure for

extracting DNA from human nucleated cells., Nucleic acids research, 16, 1215.

24. Ozaita, A., Olmos, G., Boronat, M. A., Lizcano, J. M., Unzeta, M., García-Sevilla, J. A.

(1997) – Inhibition of monoamine oxidase A and B activities by imidazol(ine)/guanidine

28

drugs, nature of the interaction and distinction from I2-imidazoline receptors in rat liver.,

British Journal of Pharmacology, 121, 901-12.

Motivația și planul experimentelorA. Clonarea genei ssdh în vectorul pH6EX3Principiul metodeiAvantaje:Limitări:

Materiale necesare:Mod de lucru:Rezultate obținute:Întrebări:A.1 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a genei ssdh?A.2 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a fragmentului de ADN clonat în vectorul pH6EX3?A.3 Care este dimensiunea, în perechi de nucleotide, a vectorului recombinat pH6EX3orf39?

B. Stabilirea condițiilor optime de supra-expresie pentru obținerea proteinei SsDH în cantități cât mai mariPrincipiul metodei:Avantaje:Limitări:

Materiale necesare:Mod de lucru:Rezultate obținuteÎntrebări:B.1 Folosind aplicația ProtParam disponibilă la adresa https://web.expasy.org/protparam/, calculați masa moleculară a proteine native SsDH. Care este valoarea acesteia în kDa?B.2 Folosind aceeași aplicație, calculați masa molară a proteinei recombinate ce va fi exprimată în E. coli. Care este valoarea acesteia în kDa?B.3 Apare o diferență între aceste valori? Dacă da, de ce?

Bibliografie pentru părțile A și B

C. Separarea electroforetică a proteinelorElectroforeza proteinelor în condiții denaturante (SDS-PAGE)Principiul metodeiAvantaje:Limitări:

Materiale necesare:Mod de lucru

Colorarea gelurilor folosind Comassie Brilliant Blue R-250Principiul metodei:Materiale necesare:Mod de lucru

Rezultate obținute, combinate pentru partea B și CÎntrebări:C.1 Ținând cont de răspunsul la întrebarea B2, care credeți că este concentrația gelului de separare recomandată pentru a evidenția proteina recombinată ORF39 în extractele de E.coli preparate conform indicațiilor din partea B?C.2 Priviți fotografia gelului. Care este raționamentul după care identificați care dintre benzi este proteina SsDh? Nominalizați cel puțin 2 indicații/observații care să vă permită să identificați proteina SsDH.C.3 Care este momentul optim de stopare a culturi E.coli pH6EX3orf39 pentru a obține cantitatea cea mai mare de proteina SsDH?

Bibliografie pentru partea C

D. Purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate față de metalePrincipiul metodeiAvantaje:Limitări:

Materiale necesare:Mod de lucru:Rezultate obținuteÎntrebări:D.1 Analizând figura de mai sus, care este raționamentul după care concluzionăm că am obținut proteina SsDH pură? Prezentați cel puțin 2 indicații/observații care să vă permită să trageți concluzia.D.2 La ce concentrație de imidazol (mM) eluează proteina SSdH de pe coloana de Ni-Sepharose?D.3 Cum puteți motiva migrarea proteinei purificate orf39 sub forma a două benzi în figura de mai jos?

Bibliografie pentru partea D