DETERMINAREA MARKERILOR MOLECULARI AI CREIERULUI UMAN SNTOS I PATOLOGIC PRIN METODE MODERNE BAZATE PE SPECTROMETRIE DE MAS Loredana LupuUniversitatea de Vest din TimioaraLucrare de Licenta, 10.07.2014

Cuprins:Aspecte teoretice / Consideraii teoreticeMateriale i metode folositeRezultate i discuii Concluzii i perspective

Aspecte teoretice / Consideraii teoreticeGangliozidele sunt prezente i se concentreaz pe suprafeele celulelor, cu cele dou lanuri de hidrocarburi ale fragmentului de ceramid. Ele se gsesc n principal n sistemul nervos.n creierul uman, diferenele specifice, ale unei regiuni cerebrale, n compoziia, cantitatea i distribuia de gangliozide au fost demonstrate la nceput de cromatografia n strat subire (TLC), prin metode imunochimice i imunohistochimice.. Diferenele ale regiuni-specifice reflect cel mai probabil baza chimic a unei organizrii complexe, ridicate, a creierului i specializarea funcional a regiunilor. n lucrarea prezentat gangliozidele urmeaz s fie analizate pentru caracterizarea compoziiei lor privind carbohidrai i radicalii lipidici, modul lor de fixare/secven, modele de ramificare a legturilor. Sarcina spectrometrie de mas este de a identifica speciile moleculare deja cunoscute i pe cele necunoscute prin cartografiere i secveniere de-novo.

Glioblastomul multiformGlioblastomul multiform (GBM) reprezint un neoplasm primar al sistemului nervos central (SNC), grad IV conform clasificrii Organizaiei Mondiale a Sntii. Este cea mai comun i cea mai agresiv tumoare malign pe creier la om, care implic celule gliale. Unul dintre factorii care duc la eecul terapeutic n tratamentul glioblastom uman este infiltrarea extensiv a celulelor tumorale n esutul cerebral, ceea ce le face mai degrab inaccesibile metode de tratament. Soluia care se caut n prezent pentru gestionarea acestei afeciuni este legat de descoperirea de makeri moleculari ai tumorii ce ar premite diagnosticul ei precoce.

2. Materiale i metode folositeSpectrometria de mas aplicat pe gangliozideDintre lipide, gangliozidele sunt cel mai uor de analizat pentru c propietile lor se aseamn cel mai puin cu cele ale lipidelor. Metodele de extragere au fost gndite. Pentru o extragere cantitativ apoi mprite pentru a indentifica diferite forme moleculare. Printre aceste metode se numr cromatografia n strat subire i spectrometria de mas. n prezent se lucreaz cu spectrometria de mas n scopul analizei glicosfingolipidelor i a gangliozidelor din creierul uman. Aceste strategii ce utilizeaz spectrometria de mas au avut succes n descoperirea relaiei directe ntre nivelul de sialilare a gagliozidelor idiferitele stadii ale dezvoltrii creierului.

1)O simplificare general a msurtorilor cu ESI MS2) n ritm rapid automatizat3) Performan ridicat4) Vitez foarte mare de analiza si reproductibilitate5) Sensibilitate crescut considerabil6) Potenialul de a descoperi componente minore n amestecuri complexe7) Date de calitate ridicat8) Eficien de ionizare crescut9) Fragmentare n surs redus10) Flexibilitate i domeniu mare de aplicabilitate11) Costuri reduse de implementare i analiz12) Posibilitate pentru experimente nesupravegheate13) Lipsa de contaminare ncruciat i reportarea14) Flexibilitate pentru diferite configuraii i analize, modernizri i modificri15) Fr cerine speciale de infrastructur pentru o functionare optimCaracteristici generale ale dispozitivelor bazate pe chip pentru spectrometria de mas ionizare cu electrospray

Electrospray microfluidic neplanarCu infuzie robotizat(NanoMate Robot)

(chip) Electrospray microfluidic neplanar Cu infuzie robotizat( Robotul NanoMate)

Tip de pipet conductivCip de siliciu care poart o matrice 10x10 de 2.5 m ID orificii de pulverizare nanoOrificiu MSTenstiune mare850-1500 VProbele sunt introduse n Chip Inlet Folosind tipuri de pipete conductiveMonstra de analizat

O gangliozid este o molecul compus dintr-o glicosfingolipid (ceramide i oligozaharide) cu unul sau mai muli acizi sialici, legate pe lanul de zahr. Ele sunt organizate n microdomenii lipide ale celulelor de suprafa pentru a se putea asocia cu semnalele specifice ale moleculelor .Gangliozidele prezint specificitate de exprimare n diferite stri normale i patologice conform determinantului antigenic al carbohidrailorProbele de gangliozide analizate pentru lucrarea de fa, au fost extrase din lobul stng de la un brbat de 42 de ani. Acesta a fost diagnosticat cu gioblastoma multiform prin imagistic cu rezonan magnetic nuclear. Gangliozidele din creierul uman sntos au fost extrase tot din lobul stang de la un brbat de 42 de ani care a murit n accident de masin, dar creierul nu i-a fost afectat

Probele de gangliozide analizate

Neu5Ac3Gal4GlcCer GM3 GalNAc4(Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GM2 Gal3GalNAc4(Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GM1a Neu5Ac 3Gal3GalNAc4Gal4GlcCer GM1b Neu5Ac 8Neu5Ac 3Gal4GlcCer GD3 GalNAc4(Neu5Ac 8Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GD2 Neu5Ac 3Gal3GalNAc4(Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GD1a Gal3GalNAc4(Neu5Ac 8Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GD1b Neu5Ac 8Neu5Ac 3Gal3GalNAc4(Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GT1a Neu5Ac 3Gal3GalNAc4(Neu5Ac 8Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GT1b Gal3GalNAc4(Neu5Ac 8Neu5Ac 8Neu5Ac 3)Gal4GlcCer GT1c Neu5Ac 8Neu5Ac 3Gal3GalNAc4(Neu5Ac 8Neu5c 3)Gal4GlcCer GQ1bNomeclatura gangliozidelor

Nomeclatura ionilor fragmentNomenclatura ionilor fragment de carbohidrat Ioni fragment apardatorit transformrilor ionului molecular de origine. Numrul ionilor fragment depinde de condiioarea cinetic i de condiionarea termincApariia tehnicilor ESI i MALDI au fcut posibil fragmentarea i secvenierea polizaharidelor, glicoproteinelor i a glicolipidelor.

3. Rezultate i discuii

n vederea obineri unor rezultate ct mai exacte la analiza eantioanelor dinglioblastoma multiform, trebuie ca asupra sectrometrului s se efectueze un numr de experimente de optimizare. Pentru un spectru ct mai corect, interpretabil se utilizeaz o prob de material cunoscut, apoi se calibreaz aparatul.

n lucrarea acesta am folosit ionizarea prin electrospray bazat pe chip a spectrometrului de mas pentru a avea o eficien a ionizrii crescut. Acest eficien ofer detectarea componentelor minore din gangliozide, elemente care pot reprezenta biomarkeri moleculari .

Spectrul de mas cu infuzie prin robot NanoMate al extrasului nativ de gangliozide din creier uman adult normalConditii: Solvent Metanol. Concentratie proba 5 pmol/l. Tensiune pe contraelectrod 150 V. Numar de scanari 150. C. Mosoarca, L. Lupu, I. Malaescu, A.D. Zamfir, Austrian Mass Spectrometry Forum, Vienna, Feb. 17-22, 2014

Spectrul de mas cu infuzie prin robot NanoMate al extrasului nativ de gangliozide din esut tumoral de tip glioblastoma multiformConditii: Solvent Metanol. Concentratie proba 5 pmol/l. Tensiune pe contraelectrod 150 V. Numar de scanari 150. C. Mosoarca, L. Lupu, I. Malaescu, A.D. Zamfir, Austrian Mass Spectrometry Forum, Vienna, Feb. 17-22, 2014

Speciile gangliozidice identificate prin NanoMate MS n esutul de glioblastoma multiformC. Mosoarca, L. Lupu, I. Malaescu, A.D. Zamfir, Austrian Mass Spectrometry Forum, Vienna, Feb. 17-22, 2014

4. Concluzi i perspective

Scopul acestui studiu a fost cartografierea sistematic i detaliat MS gangliozida n glioblastomul multiform uman.

inta final realizat a fost analiza structural a structurilor asociate tumorii, care poate avea important n diagnosticarea precoce i n terapie.

Prin chipESI MS i tandem SM s-a constatat c numrul total de specii distincte de gangliozide individuale exprimate n proba din glioblastom analizat este semnificativ diferit dect n esutul cerebral normal i mai mare dect a fost evaluat anterior i raportat la alte exemplare de gliom .

Mai mult dect att, caracteristica unica de tandem MS de a furniza date structurale la sensibilitate ridicat a oferit posibiliattea de caracterizare a speciilor asociate din gliom propuse.

Datele obinute indic beneficiile de utilizare a metodelor ultra-sensibile i de nalt performan a spectrometria de mas n determinarea compoziie modificate de gangliozide din creier, precum i n descoperirea de noi structuri din esutul tumoral, n scopul de a furniza markeri biochimici specifici care au potenial util n diagnostic, prognostic i terapie.

*