IDENTIFICAREA GENURILOR Bacillus I Clostridium

LP 22. Identificarea bacililor gram pozitiviObiective. La sfritul lucrrii practice studenii vor fi capabili s: descrie etapele de identificare a principalelor specii din genul Bacillus i s diferenieze B. anthracis / bacili antracoizi;

descrie etapele de identificare a principalelor specii din genul Clostridium; descrie etapele de identificare a speciei Corynebacterium diphtheriae i s cunoasc etapele diagnosticului de laborator al anginei difterice.Bacili gram pozitivi:

sporulai: Bacillus spp., Clostridium spp. nesporulai: Corynebacterium spp., Listeria spp., Erysipelothrix spp.Genul BacillusReprezentani: - specie nalt patogen : Bacillus anthracis - specii oportuniste (bacili antracoizi) ex. B. cereus - alte specii ex. B.subtilisCaractere microscopice:

bacili gram-pozitivi mari cu extremitile tiate drept n frotiuri din cultur incubat n aerobioza (nu pot fi difereniate speciile de Bacillus)

sunt aezai n lanuri lungi

prezint spori ovali, centrali, cu dimensiuni mai mici sau egale cu diametrul bacilului (nu deformeaz corpul bacilului)

n frotiuri din produs patologic

sunt aezai n perechi sau scurte lanuri

B. anthracis prezint capsul n coloraia Gram apare ca un halou incolor n jurul bacteriilor

n coloraia cu albastru de metilen policrom capsula se coloreaz metacromatic n rozCaractere de cultivare:

aerobi, facultativ anaerobi nepretenioi nutritiv, se dezvolt la temperaturi ntre 12-40C

form de cultur R pe medii agarizate colonii cenuii, aplatizate, rugoase, cu aspect de sticl pisat i contur neregulat

n bulion nutritiv cresc sub aspectul unui depozit floconos, fr a tulbura mediul B. cereus (produce lecitinaz) formeaz colonii nconjurate de precipitat alb pe mediul Nagler (mediu cu glbenu de ou)Caractere de difereniere B. anthracis / bacili antracoiziBacillus anthracisbacili antracoizi (B. cereus)

- imobil - mobili

- colonii nehemolitice pe geloz-snge- colonii -hemolitice pe geloz-snge

- sensibil la penicilin- rezisteni la penicilin

- patogen pentru oarecele alb- nepatogeni pentru oarece

Genul ClostridiumReprezentani: Clostridium botulinum, C. difficile, C. septicum, C. perfringens, C. tetaniCaractere microscopice

bacili gram-pozitivi sporulai sporii au diametrul mai mare dect corpul bacilului, pe care il deformeaz

C. tetani spor sferic terminal, cu aspect de b de tob

C. perfringens nu sporuleaz n cultur i observm pe frotiuri din cultur ca bacili grampozitivi mari, nesporulai

Clostridium spp. spori ovalari, centrali, paracentrali sau subterminali, cu aspect de suveic, rachet de tenis Caractere de cultur

- bacterii anaerobe (atmosfer de hidrogen sau azot cu 10% CO2) nepretenioi nutritiv

pe geloz-snge majoritatea clostridiilor produc colonii hemolitice

cele mai multe clostridii coaguleaz i acidific laptele turnesolat

C. perfringens pe geloz-snge: detemin o dubl hemoliz o zon intern, ngust, -hemolitic i o zon extern, larg, -hemolitic pe mediu cu glbenu de ou: cultura este nconjurat de o arie alb de precipitare = producerea de lecitinaz testul de neutralizare a lecitinazei (test de identificare a C. perfringens) evideniaz absena precipitatului alb in jumtatea de mediu Nagler inundat cu ser ce conine anticorpi anti- lecitinaz Identificarea Corynebacterium diphtheriae

Caractere microscopice: bacilli gram pozitivi, fini, granulari, mciucai (n frotiul din produs patologic sau de pe mediul de cultur Leffler), aezai izolat sau n perechi, sub forma literelor unghiulare, litere chinezeti si palisade Caractere de cultivare:

- pretenios nutritiv;

- izolare din produsul patologic pe medii cu snge sau ser mediul Tinsdale (mediu selectiv prin adaos de telurit de potasiu): colonii negre nconjurate de un halou brun;

mediul Leffler (mediu electiv pentru bacilul difteric): cretere caracteristic n 10 18 ore de la nsmnare - colonii albe, lucioase, bombate (picturi de spermanet).

Identificarea biochimic: - diferenierea C. diphtheriae de alte specii Corynebacterium;

Demonstrarea toxigenezei:

1. in vitro testul Elek

2. in vivo: testul de neutralizare3. toxicitatea pe culturi de celule; 4. PCR pentru gena tox.Diagnosticul de laborator al anginei difterice

I. Prelevare: 3 tampoane cu exsudat faringian (TF);

un tampon cu exsudat nasofaringian.

II. Examen microscopic

TF 1: frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen alcalin Leffler

III. Cultivare:

TF 2: nsmnare pe:- mediu Tinsdale - dup 24 ore coloniile negre se repic pe mediul Leffler (mediu electiv pentru bacil difteric) pentru a obtine cultura pur - geloz snge: - evideniaz calitatea prelevrii

- prezena de colonii -hemolitice de S. pyogenes (uneori angina streptococic poate evolua cu false membrane mimnd angina difteric sau poate fi asociat acesteia).

TF 3: nsmnare pe:- mediul Leffler (mediu neselectiv care favorizeaz cultivarea bacilului difteric cu morfologia caracteristic), - mediul de mbogire O.S.T. (ou ser telurit); tamponul nasofaringian se descarc pe O.S.T.- dupa 24 ore se repic pe Tinsdale iar coloniile negre se vor repica pe mediul Leffler IV. Identificarea bacteriei izolat n cultur pur pe mediul Leffler (frotiu colorat Gram i identificare biochimic)V. Demonstrarea toxigenezein sal se gsesc:

frotiuri din cultur Bacillus spp., Clostridium spp., C. tetani, C. perfringens, C. diphtheriae colorate Gram

frotiuri din produs patologic cu B. anthracis colorate Gram i albastru de metilen policrom cultur de B. cereus pe geloz nutritiv, geloz snge, mediu Nagler i n bulion tuburi Weinberg inoculate cu C. histolyticum i C. sporogenes test de neutralizare a lecitinazei in vitro (C. perfringens) foto cu testul Elek2