FROTIUL DE SNGE

Executarea unui frotiu de snge constituie o tehnic de baz a microscopiei clinice. Un preparat hematologic este inutilizabil dac este realizat cu o tehnic necorespunztoare, care distruge morfologia elementelor celulare. Numai un frotiu corect executat permite o interpretare microscopic de calitate, util diagnosticului.Lamele pe care se execut frotiul trebuie s fie perfect curate i degresate, altfel nu se obin preparate bune.Tehnica executrii frotiului: Se pune o pictur de snge (capilar sau venos pe anticoagulant) pe captul din dreapta al unei lame care st pe masa de lucru. Lama de ntins (o lam lefuit la un capt) se aplic mai la stnga, ntr-un unghi de 45. Se aduce lama de ntins spre dreapta, pn ce atinge pictura de snge. Aceasta, datorit fenomenului de tensiune superficial, umple rapid unghiul format de lama ntins cu lama suport. Cu un gest uniform se mpinge acum lama de ntins de la dreapta spre stnga.

Frotiul este bine executat dac:- Nu acoper toat lama fiind mai n gust dect aceasta;- Are margini drepte i franjuri la extremitatea terminal;- Are grosimea potrivit elementele fiind distribuite uniform, fr a fi deformate sau distruse.Imediat dup ntindere, lama se agit puternic, pentru a obine o uscare rapid. Uscarea lent duce la ratatinarea celulelor.Se noteaz cu creionul pe frotiu identitatea preparatului.Coloraia cea mai frecvent utilizat este coloraia panoptic de tip May Grnwald-Giemsa (MGG) sau Wright, care permit o bun analiz cromatic i evidenierea tuturor detaliilor morfologice ale componentelor celulare, necesare identificrii lor.Coloraia May-Grnwald Giemsa. Este o coloraie panoptic care d numeroase detalii morfologice i de aceea este mult folosit n hematologia curent.Colorarea unui frotiu poate fi executat imediat dup ntinderea lui sau n primele 24 de ore de la preparare.Pentru a realiza o colraie cu cele mai frumoase nuane, trebuie folosit ap distilat neutr. lamele cu frotiurile se aeaz pe baia de colorare: se acoper cu soluie May-Grnwald i se las 3 minute, pentru fixare. se adaug o cantitate egal de apdistilat neutr i se las 1 minut i jumtate (diluat cu ap soluia May-Grnwald devine colorant) se scurge colorantul se acoper lamele cu soluie Giemsa diluat, preparat extemporaneu (1 pictur colorant la 1 ml de ap, dup calitatea colorantului, proporia poate varia de la 1 la 4 picturi la 1 ml de ap). Se las 15-20 de minute, timp care poate crete la 30-35 de minute n cazul unor preparate foarte bogate n elemente nucleate. splare sub jet de ap uscare la aer.Examinarea frotiului este macroscopic urmrind aspectul frotiului (subire i omogen, cu margini drepte , paralele i termonat cu franjuri) i culoarea (roz-violacee i omogen) i microscopic, cu obiectiv uscat i cu obiectivul cu imersie.Examinarea cu obiectiv uscat se realizeaz pentru orientare urmrind: coloraia corect (eritrocite roz-portocalii, nucleii leucocitelor albatrii-purpurii, granulaiile din citoplasma neutrofilelor roz-cafeniu, granulaiile eozinofilelor roii portocalii strlucitoare); dispoziia eritrocitelor normal, n rulouri sau agglutinate; densitatea celulelor nucleate i compararea cu cifra numrtotii directe; distribuia celulelor pe frotiu (dac pe marginea frotiului sunt de 3 ori mai multe celule dect n centrul acestuia, frotiul este inadecvat interpretrii); prezena de celule anormale sau imature, mai ales pe marginile i n franjurile frotiului; prezena de artefacte de uscare sau colorare; alegerea zonei adecvate pentru examinarea cu imersia, aproximativ ntre 1/3 medie i 1/3 terminal, aproximativ 25% din lungimea frotiului.Un frotiu impropriu pentru examinare prezint eritrocite suprapuse sau deformate, eritrocite cu contur dublu (lam nedegresat), zone ntinse cu eritrocitele mari, prea etalate, poligonale sau sferoidale, cu pierderea palorii centrale leucocite dstruse, zone rotunde necolorate etc.Examinarea cu obiectivul cu imersie permite cercetarea n amnunt a detaliilor morfologice ale celulelor sanguine, eritrocite, leucocite i trombocite.Studiul eritrocitelor urmrete: talia, concentraia i distribuia hemoglobinei, proprietile tinctoriale, forma, prezena de incluzii, distribuia pe frotiu.Talia: eritrocitele normale au dimensiuni aproape uniforme corespunznd unui diametru ntre 7,2-7,9 m (normocite), aproximativ aceeai mrime cu nucleul unui limfocit mic, normal.. Existena pe acelai frotiu a unor eritrocite cu dimemsiuni diferite se exprim ca anizocitoz care poate fi ca form uoar (+), moderat (++) sau marcat (+++). Un diametru mai mare de 9 m caracterizeaz macrocitele. Eritrocitele cu diametrul mai mic de 6 m se numesc microcite.Concentraia i distribuia hemoglobinei alturi de forma de disc biconcav determin culoarea caracteristic, roz-portocaliu, cu o arie central mai clar care nu trebuie sa reprezinte mai mult de 1/3 din suprafat celulei. O paloare central crescut sugereaz scderea concentraiei de hemoglobin (hipocromie), indicnd reducerea sintezei hemoglobinei. Creterea extrem a zonei palide poate determina aspectul de anulocit, eritrocitul rmnnd numai cu o ram subire de hemoglobin. Hematiile care apar intens colorate pierzndu-si aria central palid au grosime crescut prin modificarea formei sau mrimii lor (sferocite, megalocite). Unele eritrocite pot prezenta o distribuie anormal a hemoglobinei cu un disc central nconurat de dou cercuri concentrice, unul clar intermediar i altul marginal format din hemoglobin dnd acestora aspectul de semn de tras la int (acestea se ntlnesc mai frecvent n talasemie, postsplenectomie, hemoglobinopatia C).Proprietile tinctoriale determin n cazul eritrocitelor normale culoarea specific crmizie. Eritrocitele care prezint o tent violet se numesc policromatofile i dac au dimensiuni puin mai mari dec eritrocitele obinuite sunt reticulocite. Tot reticulocite dar foarte tinere au culoarea gri-albastr. Forma eritrocitelor normale este de disc biconcav. Modificrile de form sunt foarte variate i numeroase. Prezena acestora este indicat prin termenul general de poichilocitoz fiind neces precizarea tipului de modificare.

Tabelul nr. Modificrile de form ale eitrocitelor i strile de boal n care apar

TerminologieAspectStri i boli asociate

Eliptocit (ovalocit)Celul elipsoidal sau ovalarEliptocitoz ereditarTalasemieAnemie megaloblasticAnemie mieloftizic

Megalocit (macrocit ovalar)Eritrocit mare cu form de ou, fr paloare centralAnemii megaloblasticeDiseritropoez

Sferocit (microsferocit)Eritrocit rotund cu paloare central absent sau micSferocitoza ereditarAHAIPosttransfuzionalAH cu corpi HeinzHemoliza cu fragmentare cu form de sfer

Stomatocit (celul cu gur, disc uniconcav, celul ciuperc)Eritrocit cu form sferic cu o singur concavitate, cu o gropi mic, cu zona paloare central, ca o fisur.Sferocitoz ereitarStomatocitoza ereditarAlcoolism, cirozBoli obstructive hepaticeDefecte ale pompei de sodiu.

Codocit (clopot)Eritrocit cu aspect de semn de tras la intHemoglobinozaC, STalasemieBoli hepatice obstructiveAnemie feriprivPostsplenectomie

Acantocit (spur cell)Eritrocit cu spini neregulaiAlcoolismBoli hepaticePostsplenectomieMalabsorbieAbetalipoproteinemie

Echinocit (burr cell celul crenelat)Eritrocit cu spiculi mici, egali, distribuii uniform.UremieDeficit de piruvatkinazHipopotasemieCarcinom gastric i ulcer gastric sngerndPosttransfuzie imediat

Schizocit (celul fragmentat, celul n coif)Eritrocit rupt cu form de jumtate de disc cu 2-3 extremiti ascuite sau un mic fragment neregulatAH microangiopatic (PTT, CID, vasculit, glomerulonefrit, LED, rejecie de gref renal)Hemoliz, valv cardiac (proteze sau valve patologice)Arsuri severeHemoglobinurie de mar

Drepanocit (celul n secer, sickle cell)Form de semilun cu centru densDrepanocitozHemoglobinoz C-HarlemHemoglobinoz Memphis/S

Dacriocit (celul n lacrim, rachet de tenis)Celul cu o singur prelungire sau extremitate ascuitMMMTalasemieAnemie mieloftizic

Leptocit (celul n picot, celul subire)Eritrocit subtire plat cu hemoglobin la periferieTalasemieBoli hepatice obstructive (+/- deficit de fier)

Keratocit (celul cu corn)Spiculi rezultai din vacuol ruptCelula apare semilunar sau cu form de fusCIDProtez valvular

Prezena de incluzii n eritrocite este intotdeauna patologic

Tabelul nr. Incluzii n eritrocite i reticulocite

incluziiCompoziia lorTipul de celulAspectul n coloraia panopticSemnificaiaPrezente n:

Punctaii bazofilePrecipitate patologice de ribozomi (ARN residual)reticulocitGranule albastre dispersate cu numr i talie variabilAnomalii ale ribozomilorIntoxicaii cu PbTalasemieAnemii megaloblasticeDiseritropoieze

Corpi Hawell-JollyResturi nucleareCromozomi aberaniReticulocit i eritrocitUnice sau numeroase granule mici, sferice, dense, violaceeSplin absent sau ineficientHipersplenismPostsplenectomieAnemii hemoliticeAnemii megaloblasticeDiseritropoeze

Inele CabotRest din fusul mitoticreticulocitFilament subire inelar sau ca numrul 8Mitoze anormaleAnemii hemoliticeAnemii megaloblasticeDiseritropoeze

Corpi HeinzHemoglobin denaturatEritrocit rar reticulocitRar vizibiliDenaturarea hemoglobinei prin substane oxidantesau defecte ereditareAnemii hemoliticeHemoglobine instebileTalasemieSiclemie

Parazitul malarieiplasmodiumeritrocitInel cu pecete, rozet sau gameiMalarieMalarie

Distribuia pe frotiu n mod normal este uniform pe toat ntinderea frotiului. Apariia unor agregate n rulouri, asemntoare fiicurilor din monezi, separate de zone libere, indic o paraproteinemie, fie din mielom multiplu fie din macroglobulinemia Waldenstrm. Cnd rulourile sunt reale ele sunt distribuite pe toat suprafaa frotiului. Dac se ntlnesc doarn partea iniial groas a acestuia ele reprezint un artefact. Formarea de aglutinate pe frotiu poate semnifica o AHAI cu anticorpi la rece.Studiul leucocitelorLeucoccitele sunt reprezentate prin elemente granulocitare nesegmentate i segmentate (neutrofile, eozinofile i bazofile) i elemente mononucleate (monocite, limfocite i plasmocite). Exaninarea acestora pe frotiul de snge arat o distribuie neuniform, celulele mari, monocitele i polinuclearele avnd tendina s se concentreze pe marginea frotiului i n franjuri. Dup o examinare cu obiectiv uscat, pentru compararea rezultatelor obinute la numrtorile n hemocitometru sau la analizorul automat cu prezena lor pe frotiu, se trece la identificarea diverselor tipuri de leucocite innd cont de: mrimea celulei, caracteristici ale nucleului (poziia, forma, culoarea, structura cromatinian, membrana nuclear, prezena i aspectul nucleolilor), citoplasma (raportul nucleocitoplasmatic, culoarea, prezena haloului perinuclear, granulaiile numr, culoare, mrime, distribuie).Polinuclearul neutrofil: diametru 12-15; nucleu format din mai multe segmente unite prin puni de cromatin; structur cromatinian grosolan; citoplasma roz-palid cu granulaii numeroase, punctiforme, violacei.n sngele periferic normal apar i cteva neutrofile nesgmentate, cu nucleu n form de potcoav.Polinuclearul eozinofil: diametru 12-15 ; nucleu de obicei bilobat (n desag); citoplasma plin de granulaii mari, egale ntre ele, de culoare portocalie, refringente.Polinuclearul bazofil: diametrul 10-13; nucleu polilobat, cu lobi nucleari incomplet separai, mai palid colorat; citoplasma cu granulaii grosolane, inegale ca form i mrime, albstrui-negre, care acoper n parte i nucleul.Monocitul: cel mai mare dintre leucocite, cu diametrul ntre 15-25; nucleu mare central de form variabil- rotund, ovalar, reniform, n potcoav structur cromatinian fin caracteristic, pieptnat sau n tabl de ah; citoplasm abundent albastr- cenuie, cu granulaii foarte fine azurofile, ca un praf.Limfocitul: diametrul ntre 10-16 ( cu ct limfocitul este mai tnr diametrul este mai mare); nucleu rotund, de obicei excentric, intens colorat n violet, cu agregate dense de cromatin; citoplasma palid albastr (uneori conine cteva granulaii azurofile.Plasmocitul: celul rotund sau elipsoidal; nucleu excentric, rotund, n grmezi dense de cromatin; citoplasm intens bazofil, uor grunjoas uneori cu vacuole; halou perinuclear.

Formula leucocitar sau numrtoarea difereniat a leucocitelor const n diferenierea i clasificarea procentual a diferitelor tipuri de leucocite prezente pe frotiul de snge.Tehnic: se parcurge frotiul cu obiectivul cu imersie, deplasnd preparatul ntr-un singur sens i n zig-zag, surprinznd att elemente marginale ct i cele din mijlocul lamei. Pe msur ce se ntlnesc leucocite, ele se noteaz dup diversele tipuri celulare. Se examineaz n total 100 de elemente i se stabilete procentul fiecrui tip de leucocit. Exactitatea rezultatelor crete cu ct numrul elementelor examinate este mai mare. Dac n marginile frotiului sau n franjuri exist de 3 ori mai multe celule mari comparativ cu restul frotiului se renun la examinarea acestui frotiu pentru ca numrtoarea difereniat nu ar fi reprezentativ. Nesegmentatele i segmentatele pot fi raportate separat sau mpreun. Clasicele formule de clasificare a neutrofilelor, Arneth (dup numrul de lobi nucleari -1-5) i Schilling (mparte neutrofilele n nesegmentate -mielocite, metamielocite, nesegmentate- i segmentate)prezint mai mult interes istoric dect valoare practic n prezent utilizndu-se numai expresia de deviere la stnga pentru a exprima modificarea raportului ntre neutrofilele n favoarea elementelor tinere. Este valoroas separarea limfocitelor mici de limfocitele reactive sau atipice fr s fie necesar mprirea lor n limfocite mari, mijlocii i mici. n suta de celule numrate trebuie incluse toate leucocitele identificabile, normale sau anormale. Celulele ruptwe sau degenerate nu trebuie incluse n numrtoare. Celulele din alte serii (eritroblati, megacarioblati, fragmente de megacariocite) se noteaz separat i se exprim la 100 de leucocite identificabile. Orice cretere procentual a unui tip celular impune aflarea valorii sale absolute calculat din numrul total de leucocite i procentul tipului celular respectiv obinut la efectuarea formulei leucocitare. De exemplu: nr. leucocite = 9000/mm3 i limfocitele = 55%, nr. absolut de limfocite = 55 x 9000 : 100 = 4950/mm3. Tabelul nr. Valori normale relative i absolute ale leucocitelor

vrstaLeucociteX 103/lnesegmentatesegmentateeozinofilebazofilelimfocitemonocite

%Nr./l%Nr./l%Nr./l%Nr./l%Nr./l%Nr./l

La natere9 - 309,116505294002,24000,61003155005,81050

6 luni6 -17,53,84502833002,63000,4505968005,2600

1 an6-17,53,13502832002,53000,4506375004,6550

4 ani5,5-15,533703935002,62800,5505963005530

6 ani5-14,532504840002,82500,6505045005450

10 ani4,5-13,532405142002,42000,6503933004,2350

14 ani4,5-1332405342002,52000,5403830004,4350

16 ani4,5-1332305442002,52000,5403729004,7380

20 ani4,5-11,532305742002,72000,5403325005,0380

adult4,5-1132305742002,72000,5403325005,0380

n primele cteva zile dup natere predomin granulocitele neutrofile dar apoi scad i de la 2 sptmni pn la 4 5 ani limfocitele reprezint majoritatea leucocitelor. Dup 5 ani limfocitele scad treptat i la 20 de ani numrul lor este aproximativ jumtate din numrul de granulocite care devin i rmn tipul celular predominant pentru tot restul vieii adulte. n perioada neonatal exist o uoar monocitoza care dureaz primele 2 sptmni, dup care numrul absolut de mooncite scade meninndu-se relativ constant toat copilria. Fa de normal se pot nregistra modificri variate: neutrofilie sau neutropenie, limfocitoz sau limfopenie, monocitoz sau monocitopenie, bazofilie. Granulocitele neutrofile din snge reflect fidel starea funcional a mduvei osoase n strile reactive sau n cele maligne. Numrul limfocitelor i monocitelor nu reflect corect formarea acestora, informaia corect obinndu-se doar n urma punciei i biopsiei de mduv osoas, ganglioni sau splin.La pacienii cu leucopenie este necesar prepararea frotiurilor din concentrat leucocitar.Anomalii morfologice leucocitare: anomalii de talie: granulocite gigante sau poliploide (mielodisplazii, postterapie citostatic) anomalii nucleare: hipersegmentarea granulocitelor (deficit de catalizatori), absena segmentrii sau hiposegmentarea + condensare cromatinian anomalie Pelger-Huet (mielodisplazii, mieloproliferri acute sau cronice), celule limfoide cu nuclei convolui sau cerebriformi (limfoproliferri de tip T), nuclei picnotici, degenerai etc. Anomalii citoplasmatice: neutrofile hipo sau agranulare (infecii severe, mielodisplazii, mieloproliferri cronice)granulaii mari, intens colorate, numite granulaii toxice (septicemii, infecii severe) granulaii uriae n neutrofile, limfocite i monocite (anomalia Chediak- Higashi), prezena de incluzii albastre deschis n neutrofile- corpii Dohle (infecii, arsuri, sarcin, mielodisplazii) etcStudiul trombocitelor presupune: examinarea morfologiei i a eventualelor anomalii ale acesteia (anizocitoz trombocitar, modificri ale glomerulului, vacuolizri etc. evaluarea numeric aglutinabilitateaPe frotiul colorat MGG trombocitele sunt cele mai mici elemente, cu diametrul de 2-4 microni, forma sferic sau ovoidal i prezint central granulaii azurofile care sunt nconjurate de o zon de citoplasm albastr. Modificri morfologice intereseaz talia i/sau aspectul trombocitelor, modificri structurale ale hialomerului sau granulomerului. Trombocitele tinere sunt mai mari dact cele adulte i prezena lor n numr mare indic eliberarea acestora din rezerve precum i o regenerare medular activ. Megatrombocitele sunt trombocite eliberate prematur din mduv .Acestea sunt de obicei rotunde i conin granule multiple ntens colorate.Examinarea frotiului asigur i controlul numrtorii directe realizndu-se o estimare semicantitativ. Frotiurile de snge fr anticoagulant permit estimarea numrului de trombocite dup numrul i mai ales mrimea grupelor de trombocite. Gsirea pe margini i n franjuri a unor grupe de 15-30 de trombocite indic un numr normal. Prezena de trombocite izolate sau n grupe mici de 2-5-8 trombocite arat trombocitopenie, iar existena unor grupe mari de 80-100 trombocite arat un numr crescut. Estimrile numrului de trombocite se pot efectua i din sngele recoltat pe EDTA, cnd trombocitele nu agreg. n acest caz, dac n toate cmpurile microscopice ale examenului cu imersie se gsesc 8-15 trombocite, izolate sau n grupuri mici (un trombocit la fiecare 10-30 eritrocite) se consider un numr normal de trombocite. Un numr de 1-2 trombocite la cteva cmpuri arat un numr sczut. Dac pe fiecare cmp microscopic se afl 25-30 de trombocite, izolate sau aglutinate numrul lor este crescut. Prezena pe frotiul obinut din snge recoltat pe anticoagulant a trombocitelor agregate arat o tehnic incorect a venopunciei cu activarea trombocitelor naintea amestecului cu anticoagulantul. Acelai aspect se ntlnete ns i in cazul existenei de aglutinine plachetare n sngele examinat.