Planul sectorial pentru cercetare‐dezvoltare din domeniul agricol şi de dezvoltare rurală al Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, pe anii 2015‐2018, "Agricultură şi Dezvoltare

Rurală ‐ ADER 2020“

Contractor: Staţiunea de Cercetare Dezvoltare pentru Creşterea Bovinelor Dancu, Iaşi

Obiectivul general:7. Eficientizarea sistemelor de exploatare a animalelor de fermă

Obiectivul specific 7.2. Îmbunătățirea indicatorilor de reproducere la animalele de fermă prin utilizarea biotehnologiilor specifice

Numărul /codul proiectului: 64 / ADER 7.2.1.Contract de finanțare 7.2.1./03.11.2015Anul începerii 03.11.2015Anul finalizării 15.12.2018Durata (luni): 39

Denumirea proiectului:Îmbunătățirea potențialului productiv în fermele de vaci pentru lapte din N-E României prin producerea de embrioni in vitro folosind donatoare de ovocite înalt productive și material seminal (sexat și nesexat) provenit de la tauri testați.

Persoana de contact (Directorul proiect): BORȘ Silviu Ionuț

Date contact (tel/fax, e-mail): 0232272465, 0726399084 e-mail: bors.ionut@yahoo.com

Faza II. ADER 7.2.1. Colectarea si crioconservarea materialului biologic

Faza II. ADER 7.2.1. Colectarea și crioconservarea materialului biologic

Activitatea 2.1. Pregătirea spaţiilor necesare crioconservării şi achiziţia de echipament

Pentru realizarea crioconservarea gameților s-a dotat un laboratorul de embriologieîn cadrul S.C.D.C.B. Dancu Iași unde se realizează etapele premergătoare acestuiproces.

Pentru ca, gameții femeli bovini să poată fi crioconservați aceștia trebuiescrecoltați fie prin secționarea ovarelor provenite de la vacile din abatoare sau prinmetoda Ovum Pick Up.

Recoltarea gameților s-a efectuat prin două metode: din ovarele provenite de lavacile sacrificate în abatoare, în cadrul laboratorului de embriologie a S.C.D.C.B.Dancu pe un banc special amenajat (figura 1) și de la vacile din biobazazootehnică a S.C.D.C.B. Dancu Iași prin puncție transvaginală ecoghidată afoliculilor ovarieni din zona corticală a ovarelor, in vivo, metoda Ovum Pick Up(metoda OPU, figura 2) .

Figura 1. Banc pentru secționarea ovarelor în vederea recoltării gameților femeli la specia bovină

Figura 2. Spațiul special amenajat pentru realizarea puncției foliculare transvaginale ecoghidate (dreapta), cu ajutorului dispozitivului OPU (stânga)

Identificarea gameților ce vor fi crioconservați se va realiza sub hotă unde seregăsesc, de la stânga spre dreapta, plită pentru încălzirea spațiului destinatidentificării gameților, microscop cu câmp inversat prevăzut cu plită încălzitoarela 37 0C și plită suplimentară pentru depozitatrea plăcilor cu mediu decrioconservare și/sau de maturare a gameților (figura 3).

Figura 3. Spațiu destinat identificării și selectării gameților femeli la specia bovină în cadrul laboratorului de embriologie a S.C.D.C.B. Dancu Iași

După recoltare urmează etapa finală deconservare a gameților prin criocongelare cuajutorul dispozitivului CryoPreservation SystemCL 8800i (Figura 4) achiziționat prin proiectulADER 7.2.1.

Figura 4. Dispozitiv congelare lentă a embrionilor CryoPreservation System CL 8800i

Echipamentele achiziționate prin proiectul ADER 7.2.1. sunt reprezentate de dispozitivul pentru congelarea lentă a embrionilor CryoPreservation Systems CL 8800i (figura 4), kitul pentru transport embrioni (figura 5) și de incubatorul portabil pentru embrioni (figura 6).

Figura 5. Kit pentru transport embrioni Figura 6. Incubator portabil pentru embrioni

Activitatea 2.2. Colectarea şi crioconservarea gameţilor

Colectarea gameților femeli s-a realizat prin două metode: Recoltarea exitus din ovarele provenite de la vacile sacrificate în abatoare; Recoltarea in vivo prin puncție transvaginală ecoghidată (metoda OPU) a foliculilor ovarieni

de la vaci.

1. Recoltarea gameților femeli din ovarele provenite de la vacile sacrificate în abator

Recoltarea a fost făcută dintr-un abator din județul Botoșani, după sacrificarea vacilor(RO240001042890, RO505000112376, RO241001042864, RO502000112335, RO 242001058679,RO 246000218528) conform rigurozităților din abator, în recipiente sterile (figura 7).

Pentru fiecare vacă sacrificată a fost asigurat câte un recipient cu soluție de NaCl 0,9% +10% PENSTREP ject (Dopharma, Olanda).

Figura 7. Recipientele destinate transportului ovarelor din abator spre laborator ce conțin ovarele vacilor sacrificate, scufundate în soluție NaCl 0,9% cu 10% PENSTREP Ject (Dopharma, Olanda)

După recoltare ovarele conținute în recipientele cu soluție de transport au fostdepozitate într-un termos și ținute la temperatura de 28-30 0C, pe toată duratatransportului până în laboratorul de embriologie din cadru S.C.D.C.B. Dancu Iași;

Următoarea etapă a fost reprezentată de secționarea ovarelor cu ajutorul lameibisturiului pentru a facilita deschiderea foliculilor ovarieni din zona corticală aovarelor și revărsarea lichidului folicular împreună cu ovocitele conținute în mediulde recoltare. Mediul de recoltare a fost reprezentat de OPU recovery medium(Minitube, Germany)(figura 8);

Pentru a facilita eliberarea ovocitelor din foliculii secționați s-a realizat spălareaovarelor cu mediu de recoltare utilizând o seringă încărcată cu același mediuprevăzută cu ac (figura 8);

Pe tot parcursul realizării secțiunii ovarelor recipientul cu mediul de recoltare afost poziționat pe o plită setată la temperatura de 37 0C pentru a preveni aparițiașocului termic ca urmare a scăderii temperaturii sub această valoare.

Figura 8. Secționarea foliculilor ovarieni din zona corticală a ovarelor (sus) și spălarea acestora cu ajutorul unui jet format din mediul de recoltare (jos)

2. Recoltarea in vivo prin puncție transvaginală ecoghidată (metoda OPU) a foliculilor ovarieni de la vaci

S-au selectat 4 vaci pentru lapte din cadrul fermei zootehnice a S.C.D.C.B. Dancu Iași avândurmătoarele numere matricole: RO2470001744322, RO503002730703, RO508000954090,RO509001166316 (figura 9).

Figura 9. Sesiuni OPU realizate în cadrul SCDCB Dancu Iași la vacile pentru lapte cu următoarele numere matricole: RO503002730703, RO509001166316, RO508000954090, RO2470001744322

Vacile selectate au fost supuse biotehnicii OPU de două ori pe săptămână urmărindu-senumărul de foliculi puncționați (figura 10), numărul de gameți femeli recuperați șicalitatea acestora.

Figura 10. Imagini ecografice cu foliculii ovarieni în timpul puncției ecoghidate

Etapa următoare a constat în identificarea ovocitelor din mediul de recoltare(figura 11), clasificarea acestora iar apoi spălarea prin trei treceri succesiveprin mediul TCM 199 simplu sau suplimentat cu ser de vacă în estru;

Prima spălare s-a efectuat în mediul TCM 199, a doua spălare în mediul TCM199 plus 10 % ser vacă în estru iar a treia spălare s-a realizat prin depozitareaacestora în mediul format din 50 % TCM 199 plus 10 % ser vacă în estru și 50 %mediul congelare (BoviFreeze, Minitube, Germany)(figura 12);

După finalizarea celor trei spălări ovocitele au fost trecute în mediul pentrucongelare (BoviFreeze, Minitube, Germany), s-a realizat aspirarea în paietelepentru depozitare (figura 13) iar după echilibrarea timp de 10 minute latemperatura camerei (figura 14) acestea au fost congelate cu ajutorulCryoPreservation System CL 8800i (figura 15).

Congelarea presupune scăderea temperaturii în 3 etape: Menținere pentru stabilizare timp de 10 minute la temperatura de -60C; Scăderea temperaturii cu 0,3 grade/minut până la temperatura de -320C; Menținere pentru echilibrare 10 minute la temperatura de - 320C, după care se realizează scufundarea

paietelor cu ovocite în azot lichid la temperatura de -1960C.

Figura 11. Identificarea gameților femeli din lichidul de recoltare

(stânga), imagine microscopică (dreapta)

Figura 12. Plăci Petri cumedii pentru spălareagameților femeli bovini(stânga), aspectmicroscopic din timpulspălării (dreapta)

Figura 14. Echilibrarea paietelor cu gameții femeli bovini la temperatura camerei timp de 10 minute

Figura 13. Aspirarea gameților femeli împreună cu lichidul pentru criocongelare în paietele de 0,25 ml

Figura 15. Aspect din timpul criocongelării gameților femeli bovini

Tabel nr. 1. Situația centralizată privind activitate de colectare a gameților femeli la speciabovină Faza II, ADER 7.2.1.

Recoltare gameți femeli din ovarele provenite de la vacile sacrificate în abator

Nr. matricol vaca

Nr. Foliculi (media ± deviația

standard)

Nr. gameți femeli recuperați

RO240001042890 - 16 RO505000112376 - 18 RO241001042864 - 20 RO502000112335 - 14 RO242001058679 - 25

RO 246000218528 - 5

Recoltare gameți in vivo de la vaci pentru lapte prin metoda OPU

Nr. matricol vaca

Nr. Foliculi (media ± deviația

standard)

Nr. gameți femeli recuperați

(media ± deviația standard)

Dimensiunea foliculilor în momentul aspirării 3-4 mm 5-6

mm ≥ 7 mm

RO503002730703 6 ± 0,2 2 ± 0,1 3 ± 0,1 1 ± 0,2 2 ± 0,3 RO509001166316 8 ± 0,4 3 ± 0,3 3 ± 0,1 3 ± 0,2 2 ± 0,1 RO508000954090 10 ± 0,9 4 ± 0,1 6 ± 0,3 2 ± 0,3 2 ± 0,1

RO2470001744322 7 ± 0,3 2 ± 0,1 4 ± 0,2 1 ± 0,2 2 ± 0,1

 

În urma aplicării celor două metode de recoltare s-au obținut în medie 16,34gameți femeli recoltați de la vacile sacrificate în abator și de 2,75 gameți prinmetoda OPU.

Verificarea activităților de recoltare și crioconservare s-a realizat prindecongelarea unei paiete cu gameți femeli bovini (temperatura 37 0C, 1 minut)urmată de trecerea acestora în soluție TCM 199 și vortexarea lichidului pentrudesprinderea celulelor din complexul cumulus. Acest lucru a determinatevidențierea zonei pelucide și a citoplasmei în vederea evaluării.

După vortexare s-au observat gameți femeli bovini cu citoplasmă normală și zonăpelucidă integră (Figura 16).

Figura 16. Imagini microscopice cu gameții femeli bovini după decongelarea paietelor și depozitarea acestora în soluție TCM199 înainte de vortexare (stânga) și după vortexare (dreapta)

Rezultate preconizate:

În faza II a proiectului ADER 7.2.1. se vor ordona echipamentele necesare desfășurăriiactivităților privind fertilizarea in vitro la specia bovină într-un flux ce permite realizarea acestuideziderat;

În următoarea activitate a fazei II din proiectul ADER 7.2.1. vor fi recoltați gameți femeli dinovarele provenite de la vacile sacrificate în abatoare și de la vacile supuse biotehnicii Ovum PickUp din cadrul S.C.D.C.B. Dancu Iași. Vor fi cuantificați numărul de folicului puncționați prinbiotehnica OPU precum și rata de recuperarea a ovocitelor din acești folicului;

Totodată se vor cuantifica numărul de gameți obținuți de la o vacă sacrificată în abator. O partedin gameții obținuți vor fi congelați în vederea conservării și utilizării ulterioare pentruproducerea de embrioni prin biotehnica FIV.

Rezultate obținute:

- organizarea laboratorului de FIV prin dotarea cu echipamentele necesare desfășurării activitățilorprivind fertilizarea in vitro la specia bovină într-un flux ce permite realizarea acestui deziderat;

- recoltarea de gameți femeli din ovarele provenite de la vacile sacrificate în abatoare și de lavacile supuse biotehnicii Ovum Pick Up din cadrul S.C.D.C.B. Dancu Iași;

- cuantificarea numărului de foliculi puncționați prin biotehnica OPU precum și a ratei derecuperarea a ovocitelor din acești foliculi;

- cuantificarea numărului de gameți obținuți de la o vacă sacrificată în abator;

- congelarea unui număr de gameti obținuti de la vaci sacrificate în abator în vederea conservării șiutilizării ulterioare pentru producerea de embrioni prin biotehnica FIV.

CONCLUZII

În urma desfăşurării activităţilor fazei II/2016 s-au realizat obiectivelepropuse pentru această perioadă din proiect.S-a pregătit un laborator de embriologie în cadrul SCDCB Dancu Iași cu logisiticanecesară realizării etapelor următoare din proiectul ADER 7.2.1.

S-au implementat și dezvoltat tehnicile de recoltare a gameților femeli laspecia bovină, identificare și manipulare a acestora precum și biotehnica deprezervare prin criocongelare.

Propunerile pentru continuarea proiectului

Se propune continuarea proiectului, conform planului de activități stabilitpentru fiecare fază a proiectului, recoltarea de ovocite de la vaci donatoare,aplicarea biotehnicii FIV menţionată anterior în cadrul staţiunii S.C.D.C.B. DancuIaşi pentru obţinerea de embrioni din rasa Holstein Friesian.