1

Studiul morfologiei bacteriene

Coloratia simpla

Coloratia Gram

• Examinarile bacteriologice urmaresc

evidentierea si identificarea bacteriilor din

produse patologice.

• Dintre metodele folosite in acest scop,

studiul caracterelor morfologice este o

etapa foarte importanta.

• Bacteriile avind dimensiuni de

ordinul µm, nu pot fi vazute cu

ochiul liber, de aceea examinarea

lor se efectueaza cu ajutorul

microscopului.

2

Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a studiat bacterii si alte microorganisme la microscop

•

• Examenul microscopic se executa fie:

– direct din produsele patologice (examenmicroscopic direct),

– din culturi pure.

• Preparatele microscopice sint de 2 feluri:

– preparat nativ, cu germeni vii

– frotiu sau preparat colorat, cu germeni omoriti

3

• Examenul microscopic da indicatii asupra

prezentei microorganismelor in preparat si

asupra proprietatilor morfotinctoriale:

– forma (bacili, coci, spirili)

– marimea

– mobilitatea ( in preparatul nativ )

– existenta eventuala a formatiunilorneobligatorii ( cili, capsula, spori)

• asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-,

tetrade, etc)

• proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )

Examenul microscopic direct din produsele

patologice permit in unele infectii stabilirea

diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos,

stafilococ ) si constituie o etapa esentiala

in identificarea bacteriana.

Preparatul nativ ( cu germeni vii )

• Ex. microscopic al preparatului nativ

– examinarea directa intre lama si lamela a uneisuspensii de germeni vii

intr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu

de cultura lichid, precum si a produsului

patologic (singe, sediment urinar, lcr).

4

Preparatul nativ

• Examinarea prep. nativ

– are implicatii restrinse

– nu da informatii asupra tuturor

proprietatilor morfologice ale bacteriilor,

– este obligatorie completarea lui cu

examinarea preparatului colorat.

Examenul microscopic al unui

preparat colorat (frotiu)

• Proprietatile morfotinctoriale ale

bacteriilor pot fi studiate mai detailat

pe preparate fixate si colorate, cu

germeni omoriti . Mai rar se folosesc

coloratii vitale, spre ex. in reactia de

umflare a capsulei .

Timpii de executie a preparatului

colorat

• Timpi pregatitori:

– etalarea = intinderea frotiului

– uscarea

– fixarea ( procedee fizice - prin incalzire sichimice: cu alcool metilic, etilic, alcool -eter, acid acetic )

Fixarea

• Scopul fixarii este multiplu:

– microorganismele sint omorite=preparatneinfectios

– preparatul adera mai bine de lama

– prin omorirea microorganismelor se marestepermeabilitatea peretelui celular si se producmodificari ale citoplasmei, care crescafinitatea fata de coloranti = detalii fine de strucura

5

Coloratia

• Definitie:

– Procedeu fizico-chimic complex, in care colorantii se combina cu constituenti celulari, facindu-i vizibili la microscop.

– Colorantul se absoarbe, apoi se dizolva si difuzeazain continutul celular , unde are loc formarea uneicombinatii stabile.

– Colorarea se executa de obicei prin acoperireasuprafetei frotiului fixat cu colorant, care se lasa saactioneze un timp limitat, la cald sau la rece.

Tipuri de coloratii

• Coloratia simpla

– se executa cu un singur colorant

• Coloratia combinata

– se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a mai multor coloranti, fiecare colorant actionindindependent si fixindu-se pe anumite elemente

• - coloratii speciale:

– pentru formatiuni morfologice celulare siextracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula

Coloratia simpla

• - frotiul fixat

• - se acopera complet cu un singurcolorant: albastru de metilen sau fuxina, timp de 1-2 min.

• se spala cu apa si se usuca

• in coloratia cu albastru de metilen toateelementele se coloreaza in albastru

• in coloratia cu fuxina, toate elementele se coloreaza in rosu

Coloratia simpla

• Permite stabilirea unor proprietatimorfotinctoriale ca: – forma si marimea microorganismelor, precum

si existenta unor elemente celulare

• Este utila in diagnosticul prin ex. microscopic direct din produsul patologicin – gonoree, meningita cerebrospinala epidemica

etc

6

Coloratii combinate: coloratia Gram

• Larg utilizata in microbiologie,

pentru ca deosebeste germenii

gram pozitivi de cei gram negativi,

orientind cercetarea in directia

identificarii lor.

Hans Christian Gram (medic

danez)

Coloratia Gram

Tehnica de colorare

• Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2 min. (Se spală cu apă de la robinet ).

• Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2 min. (Se spală cu apă).

• Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu se mai dizolva colorant. (Se spală cu apă).

• Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se spala cu apa )

• Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.

7

• Germenii gram +

– rezista la decolorare si isi mentin

culoarea violet initiala;

• Germenii gram –

– se decoloreaza si se recoloreaza in rosu

cu fuxina/safranina.

Coloratia Gram Principiul coloratiei Gram

• Diferenta de comportament in

coloratia Gram se explica prin

structura si compozitia chimica

diferita a peretelui celular la

bacteriile gram+ si gram -.

8

Christian Gram recognized two different types of bacteria based on reaction to certain staining procedure.

Coloratia Gram permite constituirea

urmatoarelor grupe de bacterii:

• coci gram + :

– streptococi, stafilococi, pneumococi

• coci gram - :

– meningococ, gonococ

• bacili gram + :

– bacillus antracis ( bacilul carbunos), corynebacteriumdiphteriae ( bacilul difteric), listeria monocitogenes, clostridium botulinum ( bacilul botulinic), clostridium tetani ( bacilul tetanic)

• Bacili gram - :

– E. Coli ( bacilul coli ), Klebsiella,

Pseudomonas ( bacilul piocianic),

Salmonella typhi ( bacilul tific )

• Cococbacili gram - :

– Haemophilus influenzae, Bordetellapertusis, brucela

9

Coci Gram +, dispusi in gramezi Coci Gram+, dispusi in lanturi

Bacili Gram - Bacili Gram +

10

Coci Gram +

Cocobacili Gram + Coci Gram + si Cocobacili Gram +

11

Frotiu lcr colorat Gram

Trusa comerciala pt coloratia Gram

12