Enzimologie

Introducere

Apariţia enzimologiei poate fi atribuită lucrărilor lui Paion şi Perso, 1833, care au demonstrat că malţul termolabil cu alcool la precipitarea induce descompunerea amidonului. Aceasta se datorează amilazei (diastazei).

În 1898 Diuxlo a propus ca denumirea enzimei să provină de la denumirea substratului plus sufixul aza- DNA-aza. De oarece numărul enzimelor care catalizează transformarea aceluiaşi substrat este mare, s-a propus ca în denumirea enzimei să fie uneori introdusă şi denumirea procesului: Lactatdehidrogenaza. Glicooxidaza – ce catalizează oxidarea glucozei; glucozo-6-fosfataza , enzima ce catalizează hidroliza glucozo-6-fosfatullui; ureaza – catalizează hidroliza ureei. Uneori se utilizează nume comune pentru enzimele cu funcţii similare. De exemplu, kinazele – catalizează transferul fosfaţilor de la ATP, înlocuind numai formală de fosfotransferaze. Există şi unele excepţii din această regulă, mai ales pentru enzimele tracului digestiv – pepsina.

Fişer Emil 1894- specificitatea substratului – cheie – lăcat.

Dar să discutăm şi probleme mai generale. Se ştie că corpul omului conţine circa 100 trilioane de celule integrate armonios într-un singur întreg. Grandoarea organizării pare imposibilă din punct de vedere termodinamic se organizeze şi să se menţină într-o stare atât de perfect ordonată (organizată). Dimpotrivă în natură lucrurile se transformă dintr-o stare mai organizată într-o stare mai puţin organizată (soluţie în apă, descompunerea hârtiei etc.). Procesul invers este foarte improbabil. Corpul nostru nu se poate asambla spontan. Ce a dus la apariţia unei astfel de structuri complexe şi cum poate fi aceasta posibil?

Răspunsul la aceasta se bazează pe două componente: informaţia şi energia. Aşa structuri sunt posibile atunci când există şi este accesibilă suficientă energie şi informaţie. Informaţia este necesară pentru a determina ce fel de ordin trebuie de format, iar energia pentru a realiza reacţiile şi procesele ce duc la ordin. Ca concluzie putem menţiona că noi suntem improbabili din cauza că suntem extrem de complex organizaţi, dar ne cătând la aceasta, posibili datorită informaţiei din ADN şi a cantităţii mari de energie care o consumăm. Din cursurile de fizică Dumneavoastră cunoaşteţi că energia este definită prin capacitatea de a face un lucru. În cazul nostru noi o definim ca capacitatea de provoca schimbări specifice. Realmente informaţiile profunde privind informaţia şi energia voi le-aţi obţinut în cursurile respective.

1

Schimbarea energiei în timpul reacţiei determină mărimea dE şi semnul acestei schimbări. Ea arată dacă reacţia este posibilă şi câtă energie se obţine sau se investeşte. Totodată ea nu arată dacă reacţia este realizabilă în condiţiile actuale şi care va fi viteza. Pentru aceasta este necesar de a cunoaşte nu numai energetica reacţiei, dar şi ceva despre mecanismul şi viteza reacţiei. Aceasta ne aduce la cataliza enzimatică, sau la procese controlate de catalizatori proteici (în unele cazuri RNA) denumiţi enzime. În celule toate reacţiile care se petrec la un nivel sesizabil, sunt acelea, care sunt accelerate de o enzimă activă.

De ce reacţiile termodinamic spontane nu se petrec în la un nivel sesizabil în lipsa enzimelor?

C6H12O6 + 6O2 = 6CO2 + 6H2O + 686 kal/mol

ATP +H2O = ADP + P + 7,3 kal/mol

După reacţie produsul va avea o energie mai mică cu cifrele indicate mai sus (diapozitivul 4).

Aceste reacţii termodinamic posibile nu se petrec de la sine, spontan. Este necesar de depăşit energia de activare Ea (diapozitivul 5). Viteza reacţiei va depinde de fracţia de molecule care conţine energie egală sau mai mare de Ea. Aceasta poate fi realizată datorită creşterii temperaturii (sporind fracţia moleculelor ce depăşesc Ea, sau diminuând valoarea Ea cu ajutorul enzimelor). Enzima transmite o parte de energie moleculelor care interacţionează de aceia Ea scade şi rata reacţiei creşte. Majoritatea moleculelor importante au la temperatura corpului o energie cinetică cu mult mai mică decât Ea, de aceia ele sunt stabile. Ele sunt termodinamic instabile, dar cinetic stabile, energia de activare a lor fiind mai mare decât energia cinetică.

Aceste molecule se află în stare metastabilă. Energia mare de activare este importantă pentru a se menţine timp îndelungat la distanţă mare de la echilibru. Fără aceasta capacitate viaţa ar fi imposibilă. Cu alte cuvinte viaţa depinde de energia de activare înaltă.

Totuşi aceste bariere trebuiesc trecut în cazul când transformările sunt necesare. Ridicarea temperaturii este incompatibilă cu viaţa: sistemele biologice necesită temperaturi constante. Sunt necesare metode izotermice de rezolvare a problemei. În afara de aceasta ridicarea temperaturii activează concomitent mai multe reacţii, de aceia este lipsită de specificitate. Reglajul cu succes are loc

2

numai în cazul posibilităţii de activare a unei reacţii specifice, lăsând alte molecule metastabile în stare nealterată.

O cale alternativă este de a diminua energia de activare. Aceasta este posibil deoarece, spre deosebire de energia liberă, energia de activare in deosebi depinde nu numai de starea iniţială şi cea finală, dar şi de mecanismul reacţiei. Dacă reacţia depinde de coliziuni dintre molecule, apoi energia mai mare practic totdeauna accelerează reacţia. Dar în cazul când reactanţii pot fi ordonaţi foarte specific pe un tip de suprafaţă în aşa fel ca să aducă partea potenţial reactivă a moleculelor adiacente in poziţie apropiată de juxtapunere, de contact, interacţiunea dintre ele va fi favorizată în mare măsură, iar energia de activare redusă. Această funcţie o au catalizatorii. Catalizatorul realizează această problemă diminuând energia de activare. Catalizatorul nu intră în reacţie, mai bine de spus, nu se schimbă în urma realizării reacţiei dintre substraturi.

Proteinele enzimatice catalizează reacţia datorită interacţiunii lor cu substratul în zona site-ului activ. Site-ul activ, ca regulă reprezintă un şanţ, sau buzunar cu proprietăţi chimice şi structurale care acomodează substanţa destinată reacţiei cu o specificitate majoră (diapozitivul 5). Acizii aminici din site-ul activ de obicei nu se află unul lângă altul în lanţul polipeptidei,dar se află în zona lui datorită conformaţiei tridimensionale specifice a proteinei. Ei formează site-ul activ doar în structura tridimensională specifică. Acizii aminici din site-ul activ joacă un rol crucial în cataliză, ne cătând la faptul că zona activă acoperă doar circa 5% din suprafaţa totală a enzimei. Din cei 20 acizi aminici ce intră în componenţa proteinelor, doar câţiva intră în siturile active. Ei sunt cisteina, serina , gistidina, aspartatul, glutamatul şi lizina (diapozitivul 6 şi 7). Histidina, aspartatul şi glutamatul pot la fel servi ca donori sau acceptori de protoni.

Unele din enzime, în afară de una sau câteva polipeptide, în componenţa lor conţin la fel grupa non-proteică, grupa prostatică, care este o moleculă organică mică, sau ion al metalelor, cum ar fi Fe++ la catalază.

Acţiunea catalitică a enzimelor

Acţiunea catalitică a enzimei se determină în condiţii standard după sporirea vitezei reacţiei catalitice în comparaţie cu cea ne catalitică. De obicei, rata de reacţie indică o modificare a concentraţiei de substrat sau de produs pe unitatea de timp (mol / (L • s)). Deoarece activitatea catalitică nu depinde de volumul soluţiei, în care se realizează reacţia, activitatea enzimei este exprimat în Katale. 1 Katală - este cantitatea de enzimă care converteşte 1 mol de substrat pe 1 secundă. O altă

3

unitate de activitate este unitatea internaţională (E) - cantitatea de enzimă care converteşte un mmol de substrat în 1 min (1 E = 16,7 nkat).

Specificitatea enzimelor

Centrul activ este substrat specific. Conceptul de specificitate se referă nu numai la tipurile de reacţii catalitice (specificitatea reacţiei), dar de asemenea şi la natura de compuşi catalizaţi - substraturi (specificitatea substratului). Datorită la aceasta, enzimele deosebesc moleculele din celulă. În cazul în care enzima poate acţiona numai asupra unui substrat, se spune că enzima prezintă specificitate absolută pentru substrat. Menţionăm cazul succinat dehidrogenazei, care este specific pentru succinat, sau L-glutamat dehidrogenazei, specifice pentru glutamat. Una din cele mai specifice enzime este sucinat dehidrogenaza, care deosebeşte fumaratul de sterioizomerul său maleatul. HOOC-CH=CH-C00H ↔ HOOC-CH2-CH2-C00H(diapozitivul 8). Glucochinaza la fel este specifică .

Nu toate enzimele sunt aşa de specifice, de exemplu, cele ce degradează biopolimerii. Un bun exemplu poate fi carboxipeptidaza A. Fiecare celulă conţine câteva mii de enzime diferite. Enzimele foarte specifice scindează un singur substrat şi un singur tip de reacţie. Aceasta înseamnă că ele catalizează transformarea doar un substrat sau o familie de substraturi care sunt similare structural, catalizarea numai una dintre reacţiile posibile ale substratului., enzime cu specificitate la substrat, dar cu specificitate la tipul de reacţie şi enzime cu specificitate mică la substrat. În cazul în care se leagă de enzimă la unele substraturi înrudite structural, enzima prezintă specificitatea relativă pe substrat. Oxidaza acid L-aminoacizi, de exemplu, pot cataliza oxidarea diferitor aminoacizi din seria L, dar nu şi oxidarea acizilor D-amino. Această caracteristică a unor enzime este utilizată cu avantaje în unele situaţii clinice. De exemplu, pacienţii în stare de ebrietate cu metanol, etanol este folosit în tratamentul. Enzima alcooldehidrogenaza poate lega la oricare dintre cele două alcooli (specificitate relativă), dar are afinitate de 10 - 20 mai mare pentru etanol, astfel încât etanolul este metabolizat în loc de metanol. Evitarea de oxidare a metanolului pentru a favoriza eliminarea fără transformare, este foarte important, deoarece oxidarea metabolică de metanol produce în organism formaldehidei foarte periculos şi de acid formic.

Specificitate faţă de tip de reacţie. Specificitatea de acţiune se referă la faptul că enzima catalizează numai una dintre transformările posibile ale unui substrat. În cazul de glutamat, de exemplu, se poate experimenta diferite transformări, dar fiecare dintre ele necesită o enzimă diferite, de exemplu:Glutamat la: Recunosaşte legătura. Deosebeşte

4

 

Glutamina (fixare de amoniac): Glutamina sintetazei

GABA (decarboxilare): Decarboxyase glutamatul

Alfaketoglutarate: dehidrogenazei Gutamate

Descoperirea enzimelor şi nomenclatura

Astăzi sunt cunoscute aproximativ 2000 de enzime diferite. Sistemul de clasificare ţine cont de specificitatea de reacţie şi substrat a enzimelor. Toate enzimele sunt incluse în catalogul "enzimelor", cu numărul său de clasificare (CE), format din patru cifre. Prima cifră indică apartenenţa la unul dintre cele şase clase principale (diapozitiv). Următoarele două definesc subclasa şi sub-subclasa, iar ultimele cifre – numărul in această sub-subclasă. De exemplu, lactat dehidrogenazei . Are un număr de CE 1.1.1.27 (clasa 1, Oxidoreductases, Divizia 1.1, donator de electroni - CH-OH;

Denumirile uneori indică:

Substratul – endonucleaze, proteaze, amilaze

Funcţia - derhidrogenaza succinică, fosfoglucoizomeraza

Substratul sau funcţia – tripsine, catalaza, lizoţimul

Sistemul raţional de denumire a enzimelor.

Enzimele sunt divizate în 6 clase majore, în baza funcţiilor generale cu subgrupe pentru a preciza mai exact funcţiile.

5

1. Oxidoreductazele

Intră: dehidrogenaze, oxidaze, peroxidaze, reductaze, monoxigenaze, dioxigenaze

Ca exemplu, enzimele ce catalizează următorul tip de reacţii se consideră oxidoreductaze:

A– + B → A + B–

A – este reductor (donor de electroni) , B oxidant (acceptor de electroni) . În reacţiile biochimice acest tip de reacţii sunt mai greu de conceput. De exemplu, glicoliza:

2Pi + glyceraldehid-3-fosfat + NAD+ → NADH + H+ + 1,3-bifosfoglicerat

NAD+ - oxidant (acceptor de electroni), glyceraldehid -3-fosfat reductor (donor de electroni).

Nomenclatura

Proper names of oxidoreductases are formed as "donor:acceptor oxidoreductase"; however, other names are much more common. The common name is "donor dehydrogenase" when possible, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase for the second reaction above. Common names are also sometimes formed as "acceptor reductase", such as NAD+ reductase. "Donor oxidase" is a special case where O2 is the acceptor.

2. Transferazele

Intră: C1-transferaze, glicozotransferaze, aminotransferaze, fosfotransferaze.In biochemistry, a transferase is an enzyme that catalyzes the transfer of a functional group (e.g. a methyl or phosphate group) from one molecule (called the donor) to another (called the acceptor). For example, an enzyme that catalyzed this reaction would be a transferase:

A–X + B → A + B–X

In this example, A would be the donor, and B would be the acceptor. The donor is often a coenzyme.

Nomenclature Proper names of transferases are formed as "donor:acceptor grouptransferase." However, other names are much more common. The common names of transferases are often formed as "acceptor grouptransferase" or "donor

6

grouptransferase." For example, a DNA methyltransferase is a transferase that catalyzes the transfer of a methyl group to a DNA acceptor.

3. Hidrolazele

Intră: Esteraze, glicozidaze, peptidaze, amidaze

In biochemistry, a hydrolase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of a chemical bond. For example, an enzyme that catalyzed the following reaction is a hydrolase:

A–B + H2O → A–OH + B–H

Nomenclature

Systematic names of hydrolases are formed as "substrate hydrolase." However, common names are typically in the form "substratease." For example, a nuclease is a hydrolase that cleaves nucleic acids.

4. Liazele.

Intră: C-C- liaze, C-O- liaze, C-N- liaze, C-S- liaze

In biochemistry, a lyase is an enzyme that catalyzes the breaking of various chemical bonds by means other than hydrolysis and oxidation, often forming a new double bond or a new ring structure. For example, an enzyme that catalyzed this reaction would be a lyase:

ATP → cAMP + PPi

Lyases differ from other enzymes in that they only require one substrate for the reaction in one direction, but two substrates for the reverse reaction.

Nomenclature. Systematic names are formed as "substrate group lyase." Common names include decarboxylase, dehydratase, aldolase, etc. When the reverse reaction is more important, synthase may be used in the name

5. Izomerazele

Intră: Epimeraze, cis-trans-izomeraze, transferaze intramoleculare. In biochemistry, an isomerase is an enzyme that catalyzes the structural rearrangement of isomers. Isomerases thus catalyze reactions of the form

A → B

7

where B is an isomer of A.

Nomenclature

The names of isomerases are formed as "substrate isomerase" (for example, enoyl CoA isomerase), or as "substrate type of isomerase" (for example, phosphoglucomutase).

6. Ligazele

Intră: C-C- ligaze, C-O- ligaze, C-N- ligaze, C-S- ligaze

In biochemistry, ligase (from the Latin verb ligāre — "to bind" or "to glue together") is an enzyme that can catalyse the joining of two large molecules by forming a new chemical bond, usually with accompanying hydrolysis of a small chemical group dependant to one of the larger molecules. In general, ligase catalyses the following reaction:

Ab + C → A–C + b

or sometimes

Ab + cD → A–D + b + c

where the lowercase letters signify the small, dependant groups.

Sensibilitatea la temperatură

Important pentru organismele poichiloterme

Sensibilitatea la pH

Pepsina din stomac la pH2, iar din intestina subţire la pH 8. De obicei activitatea se extinde la patru unităţi pH.

Reacţii ne catalitice (în lipsa enzimelor)

А + В → С + D.

Agenţii A şi B în soluţie sunt înconjuraţi de un strat de molecule de apa (stratul de hidratare), care sub influenţa mişcării termice se schimbă la întâmplare. Ele pot reacţiona între ele numai atunci când se confruntă cu o orientare favorabilă, care este puţin probabilă şi se întâmplă rar. Pentru formarea de produse CD din seria A-B, care rezultă în urma coliziunii dintre moleculele trebuie să formeze o stare de tranziţie, care necesită, de regulă, o mare energie de activare Ea . Deoarece această energie poate obţine doar o mică parte a complexelor A-B, realizarea tranziţiei se

8

manifestă chiar mai rar decât apariţia de complexe. În soluţie, cea mai mare parte de energie de activare este cheltuită pentru depăşirea stratului de hidratare între A şi B, convergenţa de reactivi şi alte procese chimice în care aceste reactivi sunt implicaţi. Ca urmare, formarea de produse în absenţa unui catalizator este extrem de rară, iar viteza reacţiei este neglijabilă, chiar şi atunci când reacţia este termodinamic admisibilă, şi anume, ΔG <0

Cataliza enzimatică

Enzimele accelerează reacţiile de 108-1010 ori, iar catalizatorii neorganici de 103-104ori. Forţa de legătură a substratului la enzimă este de 3-12 kal/mol, ceia cei de 10 ori mai jos decât o legătură covalentă.

Enzimele leagă specific reagenţii (substraturile) la centru activ. În acelaşi substraturi moleculele sunt orientate astfel, încât să dobândească poziţia optimă pentru formarea statului de tranziţie. Orientarea specifică sporeşte în mod semnificativ probabilitatea producerii complexului AB. În plus, legarea de substrat în site-ul activ duce la îndepărtarea stratului de apă de pe substrat. .Ca urmare prin eliminarea moleculelor de apă în site-ul activ al enzimei în timpul cataliza se creează condiţii destul de diferite în comparaţie cu cele din soluţie.

Un alt factor important depinde de stabilizarea stării de tranziţie a substratului datorată interacţiunii dintre reziduurile de aminoacizi din proteine şi substrat. Astfel, starea de tranziţie, în cazul unei reacţii enzimatice necesită o energie de activare mai mică. În plus, numeroase enzime în timpul catalizei transportă grupuri specifice la substrat, sau de la substrat. Foarte adesea se transferă protonii. Această cataliză acido-bazică enzimatică este mult mai eficientă decât schimbul de protoni de la acizi şi baze în soluţie. Adesea, grupele chimice sunt covalent ataşate la enzime. Acest fenomen este numit cataliza covalentă.

Bazele catalizei enzimatice

În ciuda faptului că astăzi este dificil să se cuantifice efectele contribuţiei individuale asupra procesului catalitic, factorul decisiv este cel de stabilizare a stării de tranziţie în site-ul activ al enzimei. Cel mai important moment este nu legarea puternică a substratului, dar a stării de tranziţie a substratului. Spre deosibire de modelul cheia-lăcată a lui Fişer, în anul 1958 Koşland a propus modelul de inducere a corespunderii. El presupune că modificările conformaţionale în forma moleculei enzimatice au loc la legarea substratului şi configurarea centrului activ. Modelul a fost confirmat prin difracţia razelor X a enzimelor cristaline.

9

1. Schimbarea unei sau mai multor legături, duce la slăbirea legăturilor făcându-le mai susceptibile la atacul enzimatic.

2. Enzima acceptă sau donează protoni, sporind reactivitatea substratului, ceia ce este similar cu schimbarea pH.

3. Formarea legăturilor temporare dintre enzimă şi substrat, substituţie nucleofilică (electron deficient, sau electron bogat). Atacul nucleofilic a grupei OH a serinei a grupei sulfhidrilice a cisteinei sau a grupei indolice a histidinei.

Dimpotrivă poate fi substituţia electrofilică cu ajutorul grupelor electronegative ale substratului şi electropozitive ale enzimei. Enzimele cu atac electrofilic necesită numaidecât prezenţa grupei prostetice în site-ul activ, din cauza că nici un acid aminic nu este suficient de nucleofilic. Ionii metalelor sunt puternic electropozitici, de aceia servesc bine pentru acest rol. Necătând la faptul că poziţionarea reactanţilor este fundamentală pentru cataliza enzimelor, majoritatea enzimelor sunt supuse schimbărilor structurale în timpul când ele sunt legate cu substraturile. Un exemplu poate fi hexokinaza, care catalizează transferul grupeifosfatului de la ATP la glucoză

Cum acţionează enzimele

Se utilizează câţiva termeni pentru a descrie mecanismele reacţiilor enzimatice. Printre ei numim efectul de proximitate (1); cataliza general-acidă sau general-bază (2), efectele electrostatice (3), cataliza electrofilică şi nucleofilică provocată de grupele funcţionale ale enzimelor (4), şi flexibilitatea structurală (5). Toate enzimele utilizează cel puţin una din căile menţionate.

.

1. Efectul proximităţii: Enzimele aduc componenţii reactanţi aproape unul de altul

Este ştiut că reacţiile dintre doi componenţi legaţi împreună se petrece mai rapid. Aceasta se manifestă mai ales la reacţiile intramoleculare, care sunt mai rapide în comparaţie cu cele se petrec între moleculele independente.

10

Reacţia 1 se petrece mult mai rapid decât reacţia 2. Pentru a face ca viteza reacţiei 2 să fie egală cu viteza reacţiei 1 este necesar de avea substraturile le concentraţia 3x105M, ceia ce este imposibil. Legarea împreună duce la diminuarea entropiei de mişcare şi rotaţie. Enzimele dau avantaje datorite efectelor de proximitate legând reactanţii în apropiere de centrul activ în aşa fel ca grupele reactive sunt orientate favorabil pentru interacţiune.

2. Cataliza general bazică şi general acidă ajută la evitarea pH extrem de ridicat sau extrem de jos

Formarea sau ruperea legăturilor necesită migrarea electronilor. Grupele reactive funcţionează ca electrofili, sau nucleofili, respectiv deficienţi în electroni şi bogaţi în electroni. Ei interacţionează cu substanţe bogate şi sărace în electroni. Catalizatorul trebuie să sporească sau să diminueze starea respectivă a substratului. În majoritatea cazurilor pentru aceasta cea mai simplă cale este de a introduce un proton.

11

Apa este un nucleofil slab şi reacţia fără catalizator este extrem de lentă. La pH înalt ea este mai iute, atunci când OH- încărcată negativ va înlocui apa ca nucleofil reactiv. Oferind unul sau doi electroni protonilor apei, baza sporeşte densitatea electronilor la oxigenul apei (diapozitivul), care va interacţiona mai activ cu nucleofilul substratului. Terminul bază generală înseamnă orice substanţă care leagă protonul în soluţie apoasă. Enzimele utilizează diferite grupe funcţionale pentru acest rol. Doi factori fac ca grupele OH- să fie ne utilizabile pentru acest rol, şi necesită baza generală.1. Concentraţia grupelor OH- extrem de joasă la pH fiziologic. Această condiţie poate fi uşor recuperată de către proteine care pot servi in calitate de general baze care conţin aminoacizi ionizabili, s-au grupe terminale NH2 sau carboxi grupe la carboxilaţi. 2. Altă prioritate că aceste grupe se află în proximitate în site-ul activ. Proteinele conţin numeroase grupări OH- chiar în condiţii slab acide ( grupele NH2 aminoterminale).Aceste grupe se amplasează în vecinătate cu centrul activ, ceia ce este un avantaj. Grupele OH- libere sunt mult mai labile, de aceia acţionează mai slab. Unicul caz când grupele OH- acţionează direct ca catalizator în reacţiile enzimatice este atunci când ele se află strâns legate cu cationii metalelor.

Hidroliza eterilor poate fi catalizată de acizi. Acizii donează protonul oxigenului carbonuluii, sporind sarcina pozitivă a carbonului substratului. Termenul acid general se utilizează pentru referinţa oricărei substanţe care poate elibera un proton în soluţie, iar enzimele şi din nou utilizează aproape totdeauna acest donor de protoni cu preferinţă faţă de H+ sau H3O+, în formă liberă, posibil datorită

12

faptului că acidul general poate opera la pH moderate , ceia ce este uşor în poziţie fixată.

Este important de menţionat că unii din bază general sau acidul general acţionează şi asupra intermediatului catalizând descompunerea lui. La fel este de menţionat că acidul general şi baza generală nu sunt mutual exclusivi şi pot acţiona la aceiaşi etapă a reacţiei.

3. Interacţiunea electrostatică poate provoca iniţierea stării de tranziţie

Utilizarea frecventă a bazelor generale şi acizilor generali în enzime demonstrează principiul de bază al enzimelor de a stabiliza distribuţia sarcinii electrice în starea de tranziţie. Pentru a forma acest intermediat electronul se mişcă de la nucleofil prin carbon a grupei CO către oxigen. Este o mişcare pură a sarcinii negative de la nucleofil la substrat. În aşa fel el se mişcă de la nucleofiol către substrat. În lipsa unui acid general sau baze generale, sarcina apropiată de +1 apare la nucleofil şi de -1 la oxigenul C=O. Baza generală poate stabiliza această nouă distribuţie a sarcinii oferind electroni pentru nuclefil în aşa fel că sarcina pozitivă se mişcă către bază. Furnizând protonul oxigenului C=O, acidul general poate delocaliza sarcina negativă acolo. Dar enzimele au alte căi pentru stabilizare similară. Presupunem că site-sul activ include un aminoacid încărcat pozitiv, aşa ca lizina sau arginina, aflat în apropierea de atomul de oxigen al grupei C=O a substratului. Sarcina pozitivă a contribui la formarea unui intermediat tetrahedral. Sarcina negativă în regiune nuclofilului are un efect similar. Interacţiune acestor sarcini poartă denumirea de efecte electrostatice.

Interacţiunile electrostatice pot fi importante chiar între grupele ale căror sarcină curată este formal egal cu zero. Aceasta se întâmplă din cauza că distribuţia sarcinii în interiorul grupelor moleculare nu este uniformă ci variază de la atom la atom. În grupul OH al alcoolului, de exemplu, O are sarcină negativă aproximativ -0,4, iar hidrogenul aproximativ +0,4.

Îndată ce substratul se transformă în starea de tranziţie, schimbarea sarcinii ai atomilor săi interacţionează cu sarcinile moleculelor proteinelor şi apei din înconjur. Deferenţa energiei dintre starea iniţială şi cea de tranziţie în aşa fel depinde de specificul structurii proteinei.

4. Grupele funcţionale ale enzimei realizează cataliza nucleofilică şi electrofilică

Altă strategie pentru hidroliza eterilor sau amidelor constă în înlocuirea apei cu grupa nucleofilică mai puternică care este componentă a site-ului activ al enzimei. Grupa HOCH2- a serinei este frecvent utilizată în acest mod. În acest caz reacţia se divizează în două etape. În loc de a obţine imediat acidul carbonilic se obţine un eter, ataşat covalent la enzimă.

13

Intermediatul acetil enzima trebuie să fie supus hidrolizei în reacţia a doua, unde apa va deveni nucleofil. Enzimele proteolitice elastaza, pepsina şi tripsina lucrează pe această cale.

Grupele nucleofile ale enzimelor suplimentar la reacţiile de hidroliză participă şi în alte tipuri de reacţii. Un exemplu poate fi decarboxilazele care catalizeză reacţia:

Reacţia parcurge prin intermediatul denumit baza Shif, la care substratul este legat covalent cu €-aminiogrupa rezidiului lizinei din centrul activ. P

14

Protonarea azotului din baza Şif introduce sarcina pozitivă, ceia ce trage electronii de la legătura vecina C-C, ceia ce cauzează decarboxilarea.

Reacţiile menţionate ilustrează trăsătura de bază: cataliza nucleofilică a enzimelor implică formarea unei stări intermediare în care substratul este legat covalent la grupa nucleofilică a enzimei. În afară de grupa –CH2OH a serinei grupa –CH2SH a cisteinei este deseori utilizată ca nucleofil. Grupa carboxilă a glutaminei şi asparaginei şi cea imidazolică a histidinei poate juca un rol similar. Unele enzime au avantaje datorită legării coenzimelor, aşa ca tiaminul, biotinul, piridoxiaminul, sau tetrafolatuitului, pentru a obţine reagenţi nucleofilici suplimentari.

La fel există numeroase enzime care leagă ionii metalelor pentru a forma complexe cu substraturile. Metalele servesc c grupe electrofilice, mai degrabă decât hidrofile. Anhidraza carbnică conţine Zn+2, care se leagă la substrat, ionul de hidroxid a unui din substraturi servind ca ligand. Gruplul OH- legat se leagă de alt substrat, CO2. În alcool dehidrogenaza şi enzimele proteolitice termolizina şi carboxipeptidaza A, Zn2+ formează complex cu oxigenul carbonilic al substratului. Retragerea electronilor de către Zn+ sporeşte sarcina parţial pozitivă a complexului cu oxigenul carbonilului substratului, ceia ce duce la sporirea sarcinii parţial pozitive la carbonil carbon, în aşa fel promovând reacţia cu nuclefilul.

Flexibilitatea structurală poate spori specificitatea enzimelor

Procesul de inducere deseori este asociat cu formarea unor legături covalente temporare dintre substrat şi unul sau mai mulţi aminoacizi ai site-ului activ.

Când hexokinaza leagă glucoza, structura lor se schimbă în aşa fel că elementele site-ului activ se aduc împreună. Enzima acţionând ca fălcile supra substratului. Această rearanjare se menționează ca corespundere indusă.

Învăluirea substratului în aşa fel poate servi schimbării favorabile a schimbării entropiei asociate cu înlăturarea substratului hidrofobic de la apă, la fel controlând

15

efectele electrostatice care promovează formarea stării de tranziţie. Substratul este forţat să răspundă la câmpurile electrice direcţionate de la grupele funcţionale ale enzimelor, în locul câmpurilor dezordonătoare ale solventului.

Schimbările structurale contribuie la specificitatea unor reacţii enzimatice. În hexokinază, schimbările induse de glucoză promovează legare altor substraturi, ATP. ATP nu se leagă corect de enzimă până la includerea glucozei în site-ul catalitic. Dacă ATP se va lega în absenţa glucozei, enzima ar pute avea tendinţa de a cataliza transferul fosfatului de la ATP la apă, având ca rezultat pierderea inutilă a ATP.

1. Multe din reacţiile care sunt posibile din punct de vedere termodinamic n-au loc la o viteză apreciabilă din cauza necesităţii energii de activare. Ce înseamnă aceasta în termeni moleculari?

2. Ce însemnă în termini moleculari diminuarea energiei de activare provocată de enzime?

3. Care sunt avantajele utilizării enzimelor ca catalizatori în locul catalizatorilor chimici?

4. Energia de activare a reacţiei 2H2O2 =2H2O+O2 la 20oC este de kal/mol. în prezenţa platinei coloidale – 13 kal/mol, iar a enzimei catalaza – 7 kal/mol.

Faceţi schemele energetice ale reacţiei în cele trei cazuri

Enunţaţi prioritatea catalazei

Enunţatâţi altă cale de accelerare a descompunerii hidrogen peroxidului.

De ce catalaza este acumulată în peroxisome?

Proprietatea enzimei ca catilazator ©, proprietate a enzimei ca proteină (P) Nu este corect pentru enzimă (N)?Conţin circa 5% din suprafaţa centru activ –CAccelerează reacţia prin diminuarea energiei de activare ©Poate spori rata reacţiei exergonice şi nu endergonice (N)Complexe tranziente cu moleculele reactante ©Este sensibilă la variaţia pH-ului mediului ©Demonstrează un nivel mare de specificitate faţă de substrat ©Denaturează moleculele substratului, prin aceasta slăbind legăturile şi sporind probabilitatea ruperii lor (N)

16

De obicei este stabilă faţă de temperatură (N).De ce temperatura şi pH influenţează viteza reacţiilor enzimatice?Tripsina de obicei degradează diferite lanţuri polipeptidice, atunci când dehidrogenaza ca regulă este specifică absolut de fiecare substrat. Explicaţi?Subtilizina este o protează din bacterii care scindează orice legătură peptidică, atunci când tripsina scindează doar legăturile din partea carboxile a argininei şi lizinei. Care diferenţe pot fi aşteptate în site-ul activ al ambelor enzime.

Unele exemple despre activitatea enzimelor

Atenţia deosebită este pentru enzimele, pentru care a fost obţinută structura cristalină, datorită faptului că cele mai importante rezultate privind înţelegerea mecanismelor reacţiilor enzimatice au fost obţinute anume cu aceste enzime.

Proteazele serinice: Enzime ce utilizează resturile serinei pentru cataliza nuclofilică. Proteazele serine reprezintă o largă familie de enzime proteolitice, care ca mecanism cataliza nucleofilică cu restul serinei ca un activ nucleofil. Cei mai bine cunoscute sunt enzimele digestive cum ar fi: tripsina, hemotripsina, şi elastaza Ele se sinttizează în pancreasul mamiferelor în formă de precursori inactivi, denumiţi zimogene. În intestine ele sunt activate proteolitic. În sistemul digestiv, tripsina, himotripsina şi elastaza lucrează în ansamblu. Ele sunt endopeptidaze, dar fiecare preferă legături ale unor acizi aminici specifici. Tripsina preferă reziduurile de lizină şi arginină, himotripsina –părţile aromatice (fenilalanin, tirozin şi triptofan), iar elastaza – reziduurile mici monopolare, aşa ca alanina. Carboxipeptidazele A şi B , care nu sunt proteaze serine, scindează legăturile peptidice la capătul carboxilic. O pătrime din secvenţele celor trei enzime sunt similare, iar intre tripsină şi himotripsină – jumătate. Ele sunt foarte asemănătoare structural. Divergenţa unui comun predecesor.Subtilizina din Bacillus subtilis este complet diferită după structura primară şi formă şi poate fi exemplu al evoluţiei convergente. În centru activ intră His57, Asp102 şi Ser195 la himotripsină. Particularităţile au fost demonstrate cu ajutorul diferitor inhibitori.

Ribonucleaza A – Reglajul catalizei acid-Bază concertat

Hidrolizează RNA scindând legătura eterică P-O la 5’ carbonul ribozei, fiind specifică bazelor pirimidinice, citozinei şi uraţcilei la partea 3 a legăturii fosfate care se scindează. A fost prima enzimă sintetizată chimic, fiind activă. A doilea enzimă sicvenată în anul 1960 de More şi Stein. Conţine 124 acizi aminici.

17

Ribonucleaza A nu catalizează ADN, de oarece lipseşte grupa OH la C2, necesară pentru formarea intermediatului. În centrul activ intră His 12 şi His 119, fiind foarte importanţi. La fel ca şi lizina 41.

Sumar.Ca şi în cataliza chimică, enzimele interacţionează cu substraturile în mod specific, care diminuează Ea a stării de tranziţie.1.. Mecanismele tuturor reacţiilor enzimatice depinde de următorii cinci factori:a. Efectele de proximitate (enzimele ţin reactanţii aproape unul de altul în orientarea necesară).b. Cataliza general-acidă şi general bază (grupele acide sau baze dau sau iau protonul şi deseori realizează primul element, iar ulterior al doilea).c .efectele electrostatice (grupele cu sarcini sau polare ale enzimelor favorizează redistribuirea sarcinilor electrice care trebui să se realizeze pentru a converti substratul în starea de tranziţie).d. cataliza nucleofilică sau electrofilică (grupele funcţionale nuclofilice sau electrofilice ale enzimei sau a cofactorului reacţionează cu grupele complementare ale substratului pentru a forma legături covalente intermediare).e. Flexibilitatea structurală (schimbarea structurii proteinei poate mări specificitatea reacţiilor enzimatice asigurând formarea legăturilor sau realizarea reacţiilor în ordin obligatoriu şi sechestrând substratul legat în buzunare care sunt protejate de penetrarea solventului).2. Serin proteazele tripsina, himtripsina şi elastaza au o structură foarte similară, dar au buzunare (sufluri), care sunt asamblate pentru aminoacizi diferiţi din lanţul lăturalnic. Sit-ul activ al fiecărei enzime conţine aceiaşi aminoacizi activi, serina histidina şi asparagina, amplasaţi în aşa fel că grupa hidroxilă a serinei devine puternic nucleofilă pentru a reacţiona cu carbonul substratului din legătura peptidică. Această reacţie generează un intermediat acil-enzim. Formarea şi hidroliza lui, probabil, iniţiază interacţiuni electrostatice ce generează structuri tetraedrice a stării de tranziţie şi prin cataliza general—acidă sau general-bază.3. RNA-aza A hidrolizează RNA în sit-urile adiacente bazelor pirimidinice. Reacţia se petrece prin formarea intermediatului dieterului ciclic 2-3 fosfat. Probabil, hidroliza acestui eter este promovată prin corelarea catalizei general bazice şi general acide a două resturi ale histidinei, şi prin interacţiunile electrostatice cu două lizine. Aceste reacţii pot avea loc prin două intermediate pentavalente cu fosforul. Geometria acestor intermediate se aseamănă cu cea ale compuşilor vanadatului care acţionează ca inhibitori a enzimei.

18