IZOLAREA I CONFIRMAREAENTEROBACTERIILOR

Enterobacteriile sunt bacterii nepatogene, slab patogene sau patogene care au ca biotop intestinul animalelor i a omului. Acesta reprezint un biotop complex, cu multiple variaii n funcie de substratul nutritiv oferit, ceea ce determin o variaie i o selecie continu a enterobacteriilor care-l populeaz.

Din acest motiv multe specii se subdivid n biotipuri, tipuri fagice, bacteriocinotipuri, antibioticotipuri, etc.

Enterobacteriile pot s piard foarte uor unele caliti sau pot ctiga altele noi, ceea ce induce migrarea din unele subuniti taxonomice n altele, deci largi posibiliti de recombinare.

METODA ORIZONTAL PENTRU DETECIA I ENUMERAREA ENTEROBACTERIACEAE SR ISO 21 528-1/2008

Partea 1 Detecia i enumerarea prin tehnica MPN cu prembogire.

Partea 2 Metoda de enumerarea a coloniilor.

METODA ORIZONTAL PENTRU DETECIA I ENUMERAREA ENTEROBACTERIACEAE SR ISO 21 528-1/2008Partea 1 Detecia i enumerarea prin tehnica MPN cu prembogire

Domeniu de aplicare:Produsele alimentare destinate consumului uman; Furaje pentru animale;Probe de mediu din zona de producia i de manevrare a alimentelor.

DEFINIIIEnterobacteriaceae microorganisme care formeaz colonii caracteristice pe agar cu cristal violet, rou fenol, bil, glucoz (VRBG), fermenteaz glucoza i prezint reacie oxidaz negativ.detectarea Enterobacteriaceae determinarea prezenei sau absenei acestor bacterii dintr-o cantitate specificat de produsenumerarea Enterobacteriaceae metoda de a determina numrul cel mai probabil pe mililitru sau gram de produs.

MOD DE LUCRU1. Prembogire pe mediu neselectivSe nsmneaz apa peptonat tamponat APT cu probade analizat i se incubeaz la 37C (sau 30C) timp de 18h +/- 2h;2. mbogire n mediu selectiv lichidPe bulionul EE (cu verde briliant, bil, glucoz) se inoculeaz cantiti cunoscute din cultura obinut la prembogire, dup o schem prestabilit i se incubeaz la 37C (sau 35C, 30C) timp de 24h +/- 2h;3. Izolare i selectare pentru confirmareDin bulionul EE se inoculeaz mediul selectiv VRBG i seincubeaz la 37C (sau 35C, 30C) timp de 24h +/- 2h, se verific prezena coloniilor presupuse dup caracteristicile lor.

4. ConfirmareColoniile prezumtive de Enterobacteriaceae suntrensmnate pe mediu neselectiv i confirmate cuajutorul analizelor de fermentare a glucozei iprezena oxidazei.

ENUMERARE PRIN TEHNICA MPNMod de lucru1. Prembogire pe mediu neselectivSe adaug x g prob pentru analiz n 9 x mlAPT, se omogenizeaz. Se prepar una sau mai multe diluii 1 la 10, nfuncie de nivelul de contaminare estimat, n APT.

Se transfer cote pri -10ml- din diluia iniial n trei eprubete. Apoi se adaug 3x1 ml din diluia iniial la 9 ml APT i 3x1 ml din fiecare diluie ulterioar la 9 ml APT. Aceste eprubete se incubeaz la 37C (sau 30C) timp de 18h +/- 2h;2. mbogire n mediu selectiv lichidSe inoculeaz eprubetele cu bulionul EE cu cultur, din fiecarea eprubet obinut dup mbogire, cel puin 3x3 eprubete i se incubeaz la 37C (sau 30C) timp de 18h +/- 2h;

3. Izolare i selectare pentru confirmareSe insmneaz mediul selectiv VRBG cu ajutorul unei anse cu fiecare din diluiile dup mbogire cu bulion EE. Se incubeaz la 37C (sau 30C) timp de 24h +/- 2h, se verific.4. ConfirmareColoniile prezumtive de Enterobacteriaceae sunt rensmnate pe mediu neselectiv i confirmate cu ajutorul analizelor de fermentare a glucozei i prezena oxidazei.

Calculul Numrul cel mai probabil de Enterobacteriaceae pe mililitru sau gram de prob analizat se calculeaz din numrul de eprubete pozitive confirmate, utiliznd tabelul MPN.

METODA ORIZONTAL PENTRU DETECIA I ENUMERAREA ENTEROBACTERIACEAE SR ISO 21 528-1/2008Partea 2 Metoda de enumerarea a coloniilor

Mod de lucru Se prepar o singur serie de diluii zecimale din proba pentru analiz dac produsul este lichid sau din suspensia iniial pentru produse solide. Se transfer cte 1 ml din prima diluie (10-1), n dou plci Petri sterile. Se transfer cte 1 ml din urmtoarea diluie (10-2), n alte dou plci Petri sterile. Se repet modul de lucru pentru urmtoarele diluii. Se toarn n fiecare plac Petri aprox. 10 ml mediuVRBG care a fost preparat i rcit la 44C.

Timpul scurs ntre depunerea inoculului i turnarea mediului nu trebuie s depeasc 15 minute.Se omogenizeaz inoculum cu mediul de cultur prin micri orizontale dirijate in cel puin 3 direcii. Se las la solidificat.Dup solidificare se mai toarn un strat de VRBG de 12-15 ml pentru a se crea condiii de semianaerobioz i a limita dezvoltarea coloniilor la suprafaa mediului, uurnd astfel citirea.

Dup solidificarea celui de al doilea strat, se inverseaz plcile i se pun la incubat. Se vor incuba la 37oC , timp de 24 ore +/- 2h.ENUMERAREA COLONIILORSunt considerate caracteristice coloniile care roz spre rou sau purpuriu, cu sau fr halouri precipintante.Se aleg plcile care au mai puin de 150 colonii caracteristice, se numr aceste colonii din toate plcile cu cretere microbian, apoi se aleg la ntmplare 5 colonii i se rensmneaz, testeaz pentru confirmare biochimice.

ATENIE!Dac mai mult de jumtate din plac este invadat cu colonii se va renuna a se face citirea, nu se va lua n calcul placa respectiv. Dac exist plci cu mai puin de plac invadat, se numr coloniile de pe 1/2 clar, n care coloniile se individualizeaz.

Unele Enterobacteriaceae pot cauza decolorarea coloniilor sau a mediului, n acest caz se vor alege colonii albicioase pentru confirmare.RENSMNAREA COLONIILOR SELECTATESe depune fiecare colonie pe cte un sector de agar nutritiv, se incubeaz la 37C timp de 24h +/- 2h.ANALIZE BIOCHIMICE ConfirmareaReacia oxidazei Cu ajutorul unei anse sau a unei baghete de sticl, se preleveaz o colonie izolat sau o poriune din zona nsmnat i se depune pe hrtie de filtru umectat cu reactiv pentru oxidaz.

ATENIE !Nu se utilizeaz ans de nichel/crom.CITIREA REACIEI Reacia oxidaz pozitivProducerea unei coloraii negre in timp de aprox. 10 sec.Reacia oxidaz negativHrtia de filtru -i pstreaz culoarea.Se selecteaz coloniile care au dat testul oxidazei negativ i se supun testului de fermentaie.

TESTUL DE FERMENTAIESe identific coloniile care au avut reacia oxidazei negativ i se transfer fiecare colonie n cte un tub cu agar cu glucoz.Se incubeaz la 37C timp de 24h +/- 2h.Reacia pozitiv fermentarea glucozeiDac apare culoare galben a mediului din tot coninutul eprubeteiReacia negativ nefermentarea glucozeiCuloarea mediului agar glucoz este nemodificat.

REZULTATColoniile cu rezultat negativ la reacia oxidazei i pozitive la testul fermentrii glucozei sunt considerate ENTEROBACTERIACEAE.