33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale. (Gabriela Loredana Popa)33. 1. Definiie. ncadrareFamilia Enterobacteriaceae cuprinde un numr foarte important de genuri i specii de microorganisme semnificative din punct de vedere medical. Aceast familie reprezint probabil cea mai larg reprezentat grupare taxonomic, intens studiat, att din punct de vedere al microbiologiei fundamentale ct i datorit implicaiilor practice, clinice.Numele acestei familii a fost propus n anul 1937, dar Serratia marcescens a fost descris i a primit acest nume n 1823. Este adevrat c tulpinile de S. marcescens, productoare de pigment caracteristic de culoare roie, sunt uor de identificat i n acelai sens se estimeaz c prezena lor a fost luat n discuie cu circa 3 secole nainte de Hristos. Salmonella typhi a fost descris n 1884, iar Yersinia pestis, dup nc 10 ani.Dac n 1974, familia includea 12 genuri i 36 de specii, iar n 1994, 30 de genuri i 107 specii, n momentul de fa familia Enterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de microorganisme semnificative din punct de vedere medical i peste 150 de specii (n cazul n care nu lum n considerare clasificarea genului Salmonella n peste 2.390 de specii) (vezi i A.6.5.1. i capitolele 37-42).

33. 2. Caractere generale

33. 2. 1. HabitatEnterobacteriile se pot gsi n ap, pe sol, pe plante sau pot coloniza n mod normal intestinul omului i animalelor. Totui trebuie reinut c peste 90% din flora intestinal normal uman este format de germeni anaerobi.Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru om, n timp ce altele (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus etc) cuprind specii saprofite sau condiionat patogene (cu excepia anumitor tulpini, patogene) i se gsesc n flora normal gastrointestinal, sau de ex. n flora tractului respirator superior.Cnd se utilizeaz termenul de bacterii enterice, unii autori includ i alte genuri precum Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia Enterobacteriaceae.

33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii avnd o dimensiune de aproximativ 2-3 / 0,6m), cu capete rotunjite, care nu se pot diferenia prin microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp, Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella spp., Yersinia pestis, Klebsiella spp.), nesporulai; unele specii pot prezenta capsul (ex. Klebsiella pneumoniae).

33. 2. 3. Caractere biochimice i caractere de culturSunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidaz-negativi, catalaz-pozitivi, reduc nitraii la nitrii, se pot cultiva pe medii obinuite formnd colonii de tip S, R (vechi) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau nu lactoza (ex. Salmonella spp., Shigella spp.). De altfel, caracterele biochimice sunt foarte importante n identificarea enterobacteriilor. n Tratatul de Microbiologie i Infecii Microbiene (Topley and Wilsons, 2005), nu mai puin de 11 pagini de tabele (1.319-1.329) sunt dedicate caracterelor biochimice ale enterobacteriilor (de menionat c aceast prezentare reprezint o simplificare i prescurtare privind acest subiect).

33. 2. 4. Structura antigenic33. 2. 4. 1. Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este format din:- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxic, format din uniti dizaharidice de glucozamin fosforilat de care se ataeaz acizi grai cu lan lung de atomi de carbon (ex. acidul -hidroximiristic cu 14 atomi de carbon), care este prezent la toate enterobacteriile i care se gsete n natur numai n aceast structur particular, lipidul A. De lipidul A se ataeaz:- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative i o serie de uniti terminale repetitive care difer de la specie la specie (antigenul O). Antigenul O este termostabil, rezistent la alcool. Poate fi detectat prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice. Antigenul O este asimilat cu termenul de endotoxin. Formele R sintetizeaz un LPZ care nu conine elementele repetitive ale polizaharidului O, caracteristice culturilor S.Fa de antigenul O apar n special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde antigene O specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de exemplu:- pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella;- pot exista reacii ncruciate ntre E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella;- anumite structuri antigenice O de la E. coli reacioneaz ncruciat cu structuri antigenice izolate de la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte antigene de suprafa de la celulele animale.33. 2. 4. 2. Antigenul H este de natur proteic; denaturat de alcool (50) i de temperatur (70C). Este localizat la nivelul flagelilor (nu exist la speciile imobile). Are antigenicitate mai mare dect antigenul O (dominant); de aceea, pentru a putea aprea combinaia cu antigenul O, n anumite situaii, antigenul H trebuie denaturat n prealabil. Antigenul H poate fi detectat prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice (n special cu anticorpi din clasa IgG).Anticorpii anti-H imobilizeaz bacteria, atenund virulena microorganismelor mobile, fiind probabil cauza apariiei variaiei de faz la Salmonella. Variaia de faz este proprietatea bacteriei de a altera exprimarea unui anumit tip de antigen flagelar.33. 2. 4. 3. Antigenul K se situeaz extern fa de antigenul O, la bacteriile capsulate. Este un antigen polizaharidic, parial stabil la temperatur. Dac este organizat o structur capsular, aglutinarea cu antigenul O va fi inhibat. Au fost identificate i structuri asemntoare antigenului tipic capsular; spre ex. la E. coli exist antigenul K1. Antigenul K este implicat i n patogenitate, favoriznd rezistena la fagocitoz a bacteriei i contribuind la invazivitate.33. 2. 4. 4. La Salmonella typhi exist n mod suplimentar antigenul Vi (de virulen) care face parte din antigenele de nveli ale acestei bacterii, are structur polizaharidic i este implicat n scderea complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagic. Poate masca antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice.Clasificarea antigenic a enterobacteriilor indic adesea prezena fiecrui antigen specific, de exemplu E. coli O55:K5:H21 etc.33. 2. 4. 5. Unele enterobacterii elaboreaz i exotoxine, spre exemplu toxina shiga produs de Shigella dysenteriae tipul 1, verotoxina produs de E. coli O157:H7 etc.33. 2. 4. 6. Majoritatea enterobacteriilor prezint fimbrii, de natur proteic (exist 6 tipuri de fimbrii); unele enterobacterii prezint i proteine filamentoase (ex. E. coli) care par s aib rol n patogenitate.

33. 2. 5. Caractere de patogenitateAdezinelePractic toate bacteriile Gram-negative prezint fimbrii (pili), indispensabili pentru aderarea de mucoase, acesta fiind primul pas n vederea colonizrii i multiplicrii iniiale.Toxinelea). Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella i la unele tulpini de E. coli), toxina LT (termic labil) la E. coli (asemntoare cu exotoxina vibrionului holeric) etc. Ar mai fi de menionat existena unor citotoxine produse de E. coli care sunt alfa-hemolizine (exotoxine); beta-hemolizinele rmn legate de celul i inhib fagocitoza i chemotaxia leucocitelor.b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse n peretele tuturor germenilor Gram-negativi, putnd determina n cazul unei eliberri masive (distrugerea brutal a unui numr mare de bacterii) ocul endotoxic. Administrarea experimental a lipopolizaharidului la animal determin febr, leucopenie, trombocitopenie, CID (coagulare intravascular diseminat), activarea sistemului complement i eliberarea de substane vasoactive proinflamatorii.Achiziia de fierO serie de enterobacterii sintetizeaz o component care are capacitatea de a chela fierul (siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de ctre bacterie (de exemplu, aerobactina de la E. coli).Structurile capsulareAntigenele de tip K ale E. coli au structur proteic i sunt importante n colonizare; diminu opsonizarea i fagocitoza. Antigenul K1 este un polimer al acidului N-acetil-neuraminic. Este similar cu structuri proprii gazdei i este slab imunogen.Klebsiella prezint un antigen K (i respectiv o capsul) bine reprezentat.Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoper (mascheaz) antigenul O i are importan n invazivitate.PlasmideleSunt importante pentru faptul c transmit att informaii genetice legate de rezistena la antibiotice (factor R) ct i pentru virulen.33. 3. Povestire adevratUn pacient de sex masculin, n vrst de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de leucemie acut promielocitar de circa 1,5 ani; se interneaz pentru administrarea tratamentului chimioterapic i pentru realizarea unui transplant de celule stem.La circa 3 ore de la administrarea profilactic de imunoglobuline pe cale i.v., pe un cateter fixat anterior, pacientul devine febril (temperatur 39,5C).S-a recoltat snge pentru hemoculturi i dup aceasta s-a administrat o asociere ntre o cefalosporin de generaia a 3-a i gentamicin. Sngele a fost nsmnat n bulion snge, cu trecere oarb dup 18 ore, pe geloz-snge i pe un mediu care coninea eozin i albastru de metilen. Dup nc 24 ore, apar culturi (de tip S/M) pe ambele medii, se apreciaz c este vorba de colonii lactoz-pozitive, iar examenul microscopic al coloniilor izolate relev prezena unor bacili Gram-negativi.Se realizeaz teste biochimice pe medii multi test, microorganismul fiind glucoz-pozitiv i lactoz-pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil, indol-negativ, ureaz-negativ. Analiza preliminar orienteaz spre o enterobacterie, dar, se face testul oxidazei care este pozitiv. Efectund i alte testri, diagnosticul final a fost: infecie cu Agrobacterium radiobacter la un pacient cu imunodepresie. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a recomandat continuarea tratamentului cu imipenem.Evoluia a fost favorabil, iar la 3 sptmni de la episodul acut s-a putut realiza tratamentul chimioterapic i pacientul a fost pregtit pentru transplantul cu celule stem.DiscuieNu orice bacil Gram-negativ, glucoz-pozitiv i lactoz-pozitiv este o enterobacterie. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a revelat o tulpin rezistent la majoritatea medicamentelor testate, prezentnd sensibilitate numai la ticarcilin, imipenem i ciprofloxacin. Avnd n vedere faptul c a fost vorba de o infecie la o gazd imunodeprimat, diagnosticul bacteriologic i testarea sensibilitii le medicamentele antibacteriene sunt strict necesare.28. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de enterobacterii. Coprocultura.Familia Enterobacteriaceae cuprinde un important numr de genuri de microorganisme semnificative din punct de vedere medical (28) i numeroase specii (peste 100, n cazul n care nu lum n considerare clasificarea genului Salmonella n peste 2000 de specii). Dintre genurile incluse n aceast vast familie, vom aminti urmtoarele: Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Edwarsiella, Enterobacter, Morganella, Providencia i Serratia. n capitolele urmtoare vom discuta numai despre diagnosticul n infeciile produse de microorganismele aparinnd primelor 6 genuri enumerate. Enterobacteriile sunt bacili gram negativi care nu se pot diferenia prin microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp., Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella, Yersinia, Klebsiella), nesporulai; unele specii prezint capsul (ex. Klebsiella pneumoniae).Sunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, catalazo-pozitivi, reduc nitraii. Formeaz colonii de tip S, R (n cazul culturilor vechi) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (ex. Escherichia coli, Klebsiella) sau sunt lactozo negativi (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia). Pentru izolarea speciilor de enterobacterii putem folosi medii selective, difereniale i selectivo-difereniale. Exist medii cu selectivitate mai redus care inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive i permite dezvoltarea tuturor enterobacteriilor (ex. mediul Mac Conkey cu sruri biliare n concentraie mic; se poate aduga i cristal violet), medii cu selectivitate medie care inhib multiplicarea enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. mediul ADCL cu dezoxicolat, citrat i lactoz, mediul Shigella-Salmonella cu sruri biliare i verde briliant sau mediul XLD cu xiloz, lizin i dezoxicolat, preferat n multe dintre rile Uniunii Europene) i medii cu selectivitate nalt (ex. mediul Wilson-Blair cu verde briliant n concentraie crescut).Caracterele biochimice sunt eseniale pentru identificarea enterobacteriilor. Dup examinarea caracterelor de cultur (pe mediile selectivo-difereniale se poate identifica i comportamentul enterobacterian n ceea ce privete fermentarea lactozei), prin repicarea coloniilor suspecte pe medii potrivite (TSI, MIU / MILF, Simmons etc), n ziua urmtoare se pot examina diferite caractere biochimice (fermentarea zaharurilor, evidenierea unui anumit metabolit, metabolizarea unui anumit substrat, utilizarea citratului ca unic surs de carbon, identificarea unor enzime etc) sau alte caractere fenotipice (ex. motilitatea). n momentul de fa exist baterii de teste i sisteme comerciale care permit examinarea unei game extinse de caractere biochimice (ex. galeriile API). Dorim s menionm c pentru fiecare test fenotipic exist o serie de variaii care sunt prezentate procentual n tabele special dedicate.Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea caracterelor antigenice folosind seruri cunoscute (preparate pe animale de laborator), cu ajutorul diferitelor reacii Ag-Ac (vezi i capitolele 15-20). Toate enterobacteriile dein Ag O. Enterobacteriile mobile dein Ag H. Enterobacteriile capsulate dein Ag K. Salmonella typhi prezint i Ag Vi, Yersinia pestis prezint Ag F1 etc.Infeciile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizenterie i sindroame asemntoare dizenteriei, sindroame asemntoare holerei, toxi-infecii alimentare etc), la nivelul tractului urinar, la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sistemului nervos. Infeciile enterobacteriene pot avea i alte localizri sau pot fi generalizate (de ex. n febra tifoid, febrele paratifoide, pest).n majoritatea infeciilor produse de enterobacterii diagnosticul este bacteriologic, direct. n febra tifoid diagnosticul poate fi att bacteriologic ct i imunologic (serologic).Datorit faptului c n multe dintre aceste infecii produsul patologic este reprezentat de ctre materiile fecale, n continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale.Coproculturan multe dintre infeciile produse de enterobacterii, care se manifest prin sindrom diareic, utilizm coprocultura. n cele ce urmeaz vom discuta coprocultura n general, nu numai din punctul de vedere al unei infecii enterobacteriene.Boala diareic acutBoala diareic acut (BDA) a fost i rmne o entitate patologic foarte rspndit la nivel mondial. Spre exemplu, n ara noastr n ultimii ani, numrul de cazuri de boli diareice acute a fost de 85.055 n anul 2000, 81.268 n anul 2001 i respectiv 97.317 n anul 2002, cu o inciden de 446,5 0/0000 n 2002. n aceeai perioad de timp, n fiecare an au decedat datorit BDA circa 100 de pacieni.Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune n 24 de ore iar scaunele au consistena diminuat (pn la emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a pn la 20-30 litri / zi n holer). Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos, mucos, purulent, sanguinolent etc), culoare modificat, miros particular etc. De regul sindromul diareic asociaz i alte semne i simptome digestive (dureri abdominale, tenesme, grea, vrsturi etc) sau generale (febr, stare general alterat etc). Foarte important i obligatoriu de reinut este c BDA duce la pierderi de ap i electrolii iar intervenia cea mai important care trebuie avut n vedere este reechilibrarea hidroelectrolitic.Ageni etiologiciBoala diareic acut poate fi de etiologie infecioas i neinfecioas. n continuare vom discuta pe scurt etiologia infecioas n general, nu numai cea bacterian sau fungic. Este de menionat c marea majoritate a BDA infecioase au etiologie viral.Etiologia bacterian include: Salmonella spp. Shigella spp. Escherichia coli (EPEC / enteropatogen, ETEC / enterotoxigen, EHEC / enterohemoragic, EIEC / enteroinvaziv, EAEC / enteroagregant, DAEC / aderent difuz) Klebsiella spp. alte enterobacterii (Yersinia enterocolitica, Citrobacter spp., Proteus spp. etc) Vibrio cholerae i ali vibrioni ali bacili gram negativi (Aeromonas spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp. etc) Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens, Clostridium difficile Clostridium botulinum Staphylococcus aureus etcEtiologia fungic include: Candida albicans (la pacieni cu SIDA) etcEtiologia parazitar include: Giardia lamblia Entamoeba hystolitica i Entamoeba coli Trichinella spiralis Cryptosporidium parvum Strongyloides stercoralis etcEtiologia viral include: rotavirusurile virusurile Norwalk i asemntoare virusurilor Norwalk calicivirusurile astrovirusurile coronavirusurile enterovirusurile adenovirusurile etc.Gruparea agenilor etiologici n funcie de mecanismul patogenicAtt din punct de vedere diagnostic ct i pentru tratament poate fi important elucidarea tipului de mecanism implicat. Astfel, BDA ar putea fi produse prin: mecanism neinflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel nu se evideniaz leucocite (ex. BDA produse de Vibrio cholerae, ETEC, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Giardia lamblia, rotavirusuri, virusuri Norwalk, Cryptosporidium parvum etc) mecanism inflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel se evideniaz leucocite polimorfonucleare (ex. BDA produse de Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio parahaemolyticum, Entamoeba hystolitica etc) mecanism de penetrare, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel se evideniaz leucocite mononucleare (ex. BDA sau sindrom diareic produs de Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica etc).Dup cum se poate remarca, simpla recoltare a produsului patologic urmat de realizarea unui preparat nativ (vezi capitolul 7) i examinarea microscopic a acestuia pot da informaii importante cu privire la etiologia probabil precum i atitudinea terapeutic de urmat. Este evident c ntr-o BDA pentru care agenii etiologici sunt virali sau mecanismul patogenic include aciunea unei toxine este contraindicat administrarea de antibiotice sau chimioterapice antibacteriene.Indicaiile coproculturii n bacteriologie atunci cnd este suspicionat o infecie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipurile patogene), Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmonella spp. n special la pacieni cu vrste extreme sau imunodepresie dup circa 1 sptmn de la debutul febrei tifoide etc atunci cnd BDA prezint riscul extinderii la nivelul unei colectiviti (cree, grdinie, tabere, uniti de alimentaie public, staii de distribuie a apei potabile etc) atunci cnd BDA apare la pacieni care au fost tratai cu antibiotice iar sindromul diareic persist i dup ntreruperea antibioticoterapiei atunci cnd sindromul diareic persist mai mult de o sptmn sau are loc o recdere n scopul verificrii strii de sntate a persoanelor care lucreaz n uniti de alimentaie public (conform normativelor stabilite de ctre ministerul sntii) n scop de cercetare etc.Recoltarea i transportul materiilor fecaleSe vor respecta recomandrile menionate n capitolul 6, n special faptul c recoltarea p.p. trebuie s se realizeze nainte de administrarea de medicamente antimicrobiene. Se pot recolta i examina: scaunul emis spontan reprezint produsul patologic utilizat cel mai frecvent. Defecaia are loc ntr-un recipient de carton sau ntr-un container din material plastic de unic ntrebuinare (care poate fi apoi decontaminat i eliminat fr probleme). n acelai timp efectum i examinarea macroscopic a p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii sau aspectului. Utilizm pentru prelevare linguria recoltorului alegnd poriuni care permit cu o mai mare ans izolarea agentului patogen (fragmente mucopurulente, poriuni cu snge, flocoane riziforme etc) sau poriuni diferite dintr-un scaun n care nu se remarc aspectele menionate anterior. Prelevm o cantitate de aproximativ 1 gram pe care o suspensionm n mediul de transport (minim 2 ml n cazul scaunelor apoase). tamponul rectal este recomandat n cazul unei infecii cronice cu Shigella spp., atunci cnd suspicionm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se introduce cu blndee i se preleveaz secreiile de la nivelul mucoasei rectale, prin rotire, pentru a recolta material din criptele rectale. Apoi introducem. tamponul n mediul de transport. Pentru a putea nchide recoltorul, tiem n mod corespunztor tija tamponului. sonda Nelaton se poate utiliza atunci cnd urmrim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid. Introducem cu blndee sonda pn la nivelul dorit (circa 10-12 cm la copil i respectiv circa 15-20 cm la adult), adaptm la cellalt capt al sondei o sering i aspirm p.p.de la nivel sigmoidian. Introducem p.p. n mediul de transport.n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm un mediu de transport, transportul la rece (+4 C) sau transportul n mediu de transport meninut la 4 C. Cel mai frecvent utilizm mediul Cary-Blair (vezi capitolul 9). Acest mediu asigur supravieuirea enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore, inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie. Atunci cnd este suspicionat infecia cu V. cholerae, apa peptonat alcalin servete n acelai timp drept mediu de transport i mediu de mbogire.Examinarea materiilor fecaleMateriile fecale sunt examinate macroscopic i microscopic. Din punct de vedere microscopic, de fiecare dat se vor realiza preparate native (ntre lam i lamel). Materiile fecale sunt suspensionate ntr-o pictur de lugol sau de albastru de metilen 1% iar preparatul se va examina iniial cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul 40. Spre exemplu, evidenierea a peste 40 PMN / cmp, nsoite de macrofage i hematii, conduce la suspicionarea unei dizenterii bacteriene. Frotiurile colorate pot fi utile n suspicionarea diagnosticului de enterocolit cu Campylobacter spp. sau al colitei pseudomembranoase, post antibioticoterapie.Cultivarea materiilor fecalen mod obinuit, pentru cultivare vom utiliza 3 medii diferite, respectiv o eprubet cu bulion selenit acid de sodiu i 2 plci Petri, una cu mediu cu selectivitate sczut (ex. Mac Conkey) i alta cu mediu cu selectivitate medie (ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selective sunt n acelai timp i medii difereniale.Alegem fragmente caracteristice din p.p. (mucus, puroi etc) i nsmnm 2-3 anse n mediul cu bulion selenit (mediu de mbogire n special pentru Salmonella spp.). Realizm o suspensie omogen n mediul lichid. Prelevm o ans (sau o pictur) din suspensie i o depunem pe mediul MacConkey. Modul de nsmnare difer de cel prezentat n capitolul 10. ntindem p.p. n striuri paralele pe o jumtate de plac, pn aproape de marginile plcii fr s le atingem. Fr s sterilizm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri i dispersm p.p. n alte striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumtate din mediul disponibil, pn aproape de marginile plcii fr s le atingem. Atingnd din nou ultimele 3-4 striuri, dispersm p.p. n mod similar pe mediul nc nensmnat. Incubm timp de 18-24 de ore la 35-37 C.n ziua urmtoare, pornind de la tubul cu bulion selenit nsmnm aa cum am menionat mai sus o plac cu MacConkey i o plac cu ADCL (sau XLD); incubm aceste plci timp de 18-24 de ore la 35-37 C. Examinm plcile nsmnate precedent n vederea selectrii coloniilor suspecte.Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt roii, pot prezenta un halou opalescent, de regul sunt de tip S dar pot fi i de tip M. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt transparente, de regul sunt de tip S.Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate; pot aprea tardiv colonii de dimensiuni mai mici, roii, de tip S. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt semitransparente, de tip S; dac produc H2S centrul coloniei este de culoare neagr.De regul urmrim apariia coloniilor lactozo-negative, iar pentru etapele de identificare vom repica (fr a atinge mediul de cultur) 3 colonii n cazul n care pacientul este copil i 3-5 colonii n cazul n care pacientul este adult. n cazul n care nu exist colonii lactozo-negative, pentru identificare vom repica (fr s atingem mediul de cultur) 10 colonii la copil i respectiv 10 colonii la adult (dac se consider c identificarea este necesar, de ex. n izbucniri epidemice de BDA).Aadar, dup apariia coloniilor izolate pe mediile selectivo-difereniale trecem la identificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriale, de cultur (vezi capitolul 11), biochimice (vezi capitolele 11 i 12), antigenice (vezi capitolele 11-20, n special capitolul 17), de patogenitate, pe baza sensibilitii la bacteriofagi i eventual pe baza unor caractere moleculare. Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile n tratatele de specialitate sau recomandrile productorilor n cazul utilizrii unor sisteme comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza studiul sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metode difuzimetrice (antibiograma difuzimetric standardizat, comparativ, E test).Alte aspecte particulare urmeaz a fi prezentate n capitolele urmtoare.

34. Genul Escherichia. Escherichia coli (Gabriela Loredana Popa, Codrua Usein, MI Popa)34. 1. Definiie. ncadrareGenul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae, cuprinde germeni comensali care se gsesc ubicvitar (n ap, pe sol, etc). La nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz). Sunt bacili Gram-negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactoz pozitivi.Sunt grupai n ase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris i E. albertii. Cu excepia speciei E. blattae, izolat de la insecte, toate celelalte specii de Escherichia au fost izolate din prelevate umane.Specia tip, reprezentat de Escherichia coli, i-a cptat numele n 1919, n memoria lui Theodor Escherich care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o din materii fecale denumind-o Bacterium coli commune34. 2. Caractere generale34.2. 1. HabitatE. coli se gsete n intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind considerat component a florei intestinale normale. Acest rezervor primar a fcut ca E. coli s fie selectat de Organizaia Mondial a Sntaii ca indicator de poluare fecal (1). Studii ntreprinse n ultimii ani indic ns o mult mai mare complexitate a populaiei genului Escherichia, ai crui membri pot circula i persista autonom, n afara tractului gastrointestinal, fiind prezeni n rezervoare secundare din mediul ambiant (2).34.2. 2. Caractere morfotinctorialeSunt bacili Gram-negativi drepi sau uor incurbai, cu capete rotunjite i dimensiuni cuprinse ntre 2-5m / 0,5-1m (pot avea uneori aspect filamentos, pot exista i forme cocobacilare). n majoritate sunt mobili, prin prezena flagelilor (n preparatele native). Unele tulpini prezint capsul (antigene capsulare de tip K).34.2. 3. Caractere de culturSe dezvolt bine pe medii simple de cultur; pe geloz se pot dezvolta colonii de tip S, lactoz pozitive, convexe, umede, cu suprafa lucioas, margini netede, uor emulsionabile n soluie salin fiziologic sau colonii de tip R, uscate, cu marginile crenelate, care se emulsioneaz greu i neuniform n soluie salin fiziologic; exist forme intermediare ntre coloniile S i R, dup cum exist i colonii mucoide de tip M.34.2. 4. Caractere biochimiceGermenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvolt n limite largi de temperatur i pH. Asemenea celorlalte enterobacterii, specia E. coli este catalaz pozitiv, oxidaz negativ i fermenteaz glucoza. Capacitatea majoritii tulpinilor de E. coli de a fermenta lactoza este util n diferenierea de alte enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. coli testate pe medii de identificare biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H2S, produc indol i lizindecarboxilaz, dar nu ureaz si fenilalanindezaminaz. n plus, E. coli nu poate crete pe un mediu care are ca unic surs de carbon citratul (caracter metabolic important pentru diferenierea de alte enterobacterii).Tulpinile EHEC/VTEC, de regul, nu fermenteaz sorbitolul.34.2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimiciGermenii supravieuiesc n mediul extern (sol, ap) luni de zile. E. coli este distrus prin expunere la 60C n 30 minute. Este sensibil la aciunea antisepticelor i dezinfectantelor uzuale.

34.2. 6. Structur antigenicCa i n cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafaa tulpinilor de E. coli servesc aa numitei serotipizri, metod util n epidemiologia infeciilor cauzate de aceste microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacii serologice antigen-anticorp (ex. reacia de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar) i antigenul K (capsular). Antigenul O (LPZ) a fost descris la caracterele generale ale enterobacteriilor i definete serogrupul (numerotarea grupului antigenic este de utilitate epidemiologic; ex. serotipurile O55 i O111 sunt implicate n izbucniri epidemice de meningit neonatal). Exist peste 170 de variante de Ag O.n cadrul unui serogrup O, pe baza diversitii antigenelor H (prezente numai la tulpinile mobile, care posed flageli) i K (prezente la tulpinile care posed capsul) se definesc serotipuri. Serogrupurile i serotipurile se noteaz printr-o combinaie de litere i cifre (ex. O55:K59:H6). Structurile de suprafa pot masca prezena antigenului somatic O.n majoritatea cazurilor, tipizarea serologic a tulpinilor de E. coli se rezum la identificarea antigenelor O i H (ex. O157:H7).Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie menionat c nu antigenele de suprafa confer virulen bacteriei. Cu toate acestea, definirea serotipului poate fi sugestiv pentru identificarea unor clone virulente (ex. serotipul E. coli O157:H7, marker pentru subgrupul EHEC din patotipul VTEC).Datorit faptului c au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de tipuri de antigen H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K i o serie de tipuri antigenice fimbriale (antigene F), prin combinaiile acestora rezult peste 1.000 de tipuri antigenice de Escherichia coli.Unele dintre tulpinile de E. coli elaboreaz exotoxine (vezi 37.2.8 i 37.3). Acestea pot fi, la rndul lor, structuri antigenice identificate in vitro prin reacii antigen-anticorp.

34.2. 7. Rspuns imunApare un rspuns imun umoral care nu are semnificaie nici n ceea ce privete protecia fa de boal i cel mai adesea nici n diagnostic. De reinut ns c, un titru nalt al anticorpilor anti O157, detectat la pacienii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul indirect (imunologic) al infeciei cu E. coli O157:H7 (3).

34.2. 8. Caractere de patogenitateTulpinile de E. coli domin microflora facultativ anaerob a colonului la individul sntos, marea majoritate ntreinnd cu aceasta relaii de simbioz benefice ambilor. Ele pot produce infecii n condiiile n care gazda este imunodeprimat sau cnd depesc bariera intestinal i ajung n zone normal sterile. Exist ns i tulpini de E. coli care au o virulena intrinsec, putnd declana variate procese infecioase la indivizii imunocompeteni. Tulpinile patogene de E. coli sunt clasificate n aa numite patotipuri. Ele genereaz simptomatologii similare prin mecanisme de patogenitate comune. n prezent sunt descrise ase patotipuri de E. coli implicate n sindromul diareic (patotipuri intestinale) (4) i un patotip implicat n infecii extraintestinale (ex. infeciile tractului urinar, meningite, septicemii, etc.) i denumit E. coli cu patogenitate extraintestinal (ExPEC) (5). Patotipurile intestinale sunt: E. coli enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxigen (ETEC), E. coli enteroinvaziv (EIEC), E. coli productor de verotoxine (VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC) i E. coli cu aderen difuz (DAEC). n cadrul patotipului VTEC se distinge, pentru a se sublinia n principal asocierea cu manifestri clinice severe (ex. colita hemoragic), subgrupul de tulpini de E. coli enterohemoragic (EHEC), care are ca prototip serotipul O157:H7.Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulen, care afecteaza variatele procese desfurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcia citoscheletului, diviziunea celular, secreia de ioni, funcia mitocondriilor, apoptoza etc.). Aceti factori de virulen sunt codificai de structuri genetice localizate n cromozom sau pe plasmide i intervin n mecanismele de patogenitate folosite de bacterie pentru a nvinge sistemele de aprare ale gazdei.Adezinele sunt structuri de aderen aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile de E. coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la suprafaa membranei externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezint factori de virulena importani, care permit bacteriei s colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subire, tract urinar, vagin), in care nu rezid n mod normal.Toxinele sunt o alt categorie de factori de virulen. Endotoxinele fac parte din structura membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) i sunt invariabil prezente la toate bacteriile Gram negative, nu numai la E. coli, indiferent de potenialul lor de patogenitate. Eliberate n urma distruciei peretelui bacterian i manifest efectele toxice, fiind implicate n apariia febrei i ocului toxic din septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate i secretate n cursul metabolismului bacterian, fiind specifice nu numai speciei, ci diverselor patotipuri de E. coli. n prezent se cunosc structura si funciile a numeroase toxine responsabile de patogenitatea tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabil i termostabil produse de tulpinile ETEC, verotoxinele 1 i 2 sintetizate de tulpinile VTEC, enterotoxina termostabil enteroagregativ 1 a tulpinilor EAEC, etc.).Multe dintre tulpinile ExPEC implicate n producerea meningitei neonatale sau a infeciilor urinare prezint capsul, o alt component important pentru patogenitatea speciei. Rolul principal al capsulei este de a inhiba aciunea complementului seric i fagocitoza, conferind astfel rezisten bacteriei. Antigenul polizaharidic capsular K1 este prezent n 80% din tulpinile de E. coli izolate din cazuri de meningit neonatal (6). 29. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia coli. Urocultura.Dup ce o serie de date sugerau asemnarea din punct de vedere molecular ntre speciile genurilor Escherichia i Salmonella, cunotinele actuale pledeaz pentru o grupare a speciilor din genurile Escherichia i Shigella. Cu toate acestea, vom prezenta n continuare separat diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganismele aparinnd genurilor clasice. Genul Escherichia cuprinde germeni comensali care se gsesc ubicvitar (n ap, pe sol, etc) iar la nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz). Sunt bacili gram negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactozo pozitivi. Specia tip este reprezentat de Escherichia coli.Cu toate c majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiionat patogene (fiind implicate n infecii oportuniste cu localizri n afara tractului digestiv, spre ex. peritonite, colecistite, infecii ale plgilor, endometrite, pneumonii etc) exist i anumite tulpini dotate cu caractere patogenice particulare. Dintre aceste tipuri de E. coli (patotipuri) se disting trei grupri mai importante: tipuri patogene implicate n boli diareice acute (BDA) E. coli enteroagregativ (EAggEC) implicat n apariia unei BDA apoase, persistent, cu mucus, n special la sugari E. coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul O157:H7, care elaboreaz dou citotoxine i este implicat n apariia unei BDA apoas, care poate deveni sever i se poate nsoi de o complicaie grav, sindromul hemolitic uremic E. coli enteroinvaziv (EIEC) care elaboreaz una sau mai multe enteroxine producnd un sindrom dizenteriform E. coli enteropatogen (EPEC) care determin diaree la copilul mic, uneori de gravitate maxim (ex. diaree malign la nou nscut) E. coli enterotoxigen (ETEC) care elaboreaz dou enterotoxine (termolabil i termostabil) i produce un sindrom holeriform E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoas, persistent, la copii n vrst de 1-5 ani tipuri (grupuri) patogene implicate n infecii ale tractului urinar (ITU) tipul patogen implicat n infecia meningeal la nou nscut.Indiferent de localizarea infeciei, diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct.Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare digestiv1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de scaunul diareic dar am putea recolta i lichid de vrstur sau un anumit aliment incriminat. Materiile fecale se examineaz macroscopic i se trimit ctre laborator aa cum am menionat n capitolul precedent. n continuare vom discuta diagnosticul unei infecii produs de EHEC (ex. O157:H7) dar, subliniem faptul c n practica medical, pornind de la p.p. reprezentat de materiile fecale, putem izola orice microorganism implicat etiologic n BDA, dup caz. Materiile fecale pot avea aspect hemoragic iar la examinarea macroscopic a p.p. putem observa prezena unor lambouri de mucoas epitelial. Transportul se va realiza aa cum am menionat n capitolul nr. 28.2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea preparatului nativ, ntre lam i lamel; remarcm prezena hematiilor i leucocitelor PMN.3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi capitolul nr. 28). n vederea izolrii EHEC, pe lng mediile menionate n capitolul precedent se recomand utilizarea mediului MacConkey cu D-sorbitol, deoarece spre deosebire de majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC nu fermenteaz sorbitolul (sau l fermenteaz tardiv). n acest sens, coloniile suspecte, repicate (fr a atinge mediul) n vederea identificrii vor fi necolorate, cu dimensiuni de 1-3 mm, de regul de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor avea o culoare roz).4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi. Caractere de cultur: Produc colonii de tip Scu caracterele menionate mai sus. Caractere biochimice (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrului de referin; procesarea unor culturi n care este prezent EHEC necesit msuri suplimentare de siguran): Fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu fermenteaz (sau fermenteaz tardiv) sorbitolul, nu produc H2S Pot produce indol, sunt ureaz-pozitivi, mobili (dar exist i tulpini imobile) etc. Se pot folosi mediile multi-test convenionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test API 10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau alte variante Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor: Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacii de aglutinare sau latex aglutinare (se pot utiliza i seruri monovalente anti O157 i respectiv anti H7); toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA, latex aglutinare, latex aglutinare pasiv inversat (VET-RPLA), sau prin seroneutralizarea efectului citotoxic pe celule Vero Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolit hemoragic letal la purcel; se poate studia efectul citopatic pe celule Vero Teste de biologie molecular (PCR, detectarea genelor de patogenitate pornind de la p.p. sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).5. Antibiograma este recomandat de regul numai pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz prin metode difuzimetrice.UroculturaTractul urinar este n mod normal necontaminat, n schimb uretra distal poate prezenta o flor microbian foarte variat, fiind contaminat cu microorganisme provenind din zona genital sau de la nivelul colonului. Dintre aceste microorganisme putem izola de la nivelul uretrei distale stafilococi coagulazo-negativi, E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., bacili difteromorfi, enterococi, streptococi, neisserii saprofite, Mycoplasma spp., Ureplasma spp. sau Fusobacterium spp. La acelai nivel ar putea fi identificate i tulpini de Candida spp., Clostridium spp., diferii coci gram pozitivi sau gram negativi anaerobi, lactobabili, mycobacterii netuberculoase, stafilococi aurii etc. Colonizarea microbian a uretrei distale explic motivul pentru care n marea majoritate a cazurilor vom realiza urocultura cantitativ.Cu toate c indiferent de grija cu care vom recolta p.p. (urina) acesta va fi contaminat, prin aprecierea cantitativ a numrului de uniti formatoare de colonii n urina proaspt recoltat, din mijlocul jetului, putem s precizm dac pacientul are sau nu infecie urinar. Mai multe studii au artat c atunci cnd se demonstreaz prezena a 105 bacterii / ml, aceasta indic o infecie a tractului urinar (ITU) n aproximativ 80% dintre cazuri n timp ce o valoare de 104 bacterii / ml indic ITU n mai puin de 30% dintre cazuri.Datorit acestor rezultate, n practica medical se consider c ne aflm n situaia unei ITU atunci cnd numrul de bacterii / ml urin este 105 / ml.Cu toate acestea, dorim s subliniem c interpretarea rezultatului nu trebuie realizat mecanic i decizia final n ceea ce privete identificarea bacteriei, efectuarea testrii sensibilitii la antibiotice i respectiv redactarea buletinului de analiz ar trebui s fie luat avnd n vedere aspectul macroscopic al urinii (ex. purulent), rezultatul examenului microscopic al sedimentului urinar (ex. prezena de PMN), numrul de uniti formatoare de colonii / ml urin i elemente clinice (ex. disurie, miciuni mai frecvente, febr), cu alte cuvinte colaborarea ntre clinic i laborator este esenial. Spre exemplu, n cazul unor elemente sugestive, chiar dac numrul de bacterii este de 104 / ml, putem lua decizia s repetm urocultura iar izolarea aceleiai bacterii poate indica prezena ITU. Pe de alt parte, izolarea a peste 104 uniti formatoare / ml n cazul stafilococilor sau levurilor este luat n considerare iar prezena n urin a Listeria monocytogenes la femeile nsrcinate sau prezena n urin a Salmonella typhi sunt semnificative indiferent de numrul UFC / ml.Pentru a sublinia nc o dat importana etapei de recoltare i transport a urinei amintim faptul c urina reprezint un foarte bun mediu de cultur pentru majoritatea bacteriilor care pot contamina p.p. iar o prob de urin care are iniial (n momentul recoltrii) 103 bacterii / ml, dup 2 ore la temperatura camerei va conine 105 bacterii / ml.Clasificarea ITU se poate face dup mai multe criterii. ITU joase includ cistita dar dup unii autori i uretrita, prostatita i epididimita. ITU nalte includ pielonefrita acut, necroza papilar (complicaie a pielonefritei acute sau care poate aprea n absena infeciei), abcesul renal sau pielonefrita cronic (dup unii autori). Invazia tractului urinar poate avea loc pe cale ascendent, limfatic sau hematogen.Exist o serie de factori care favorizeaz apariia ITU, dintre care amintim: obstruciile care duc la staz urinar (adenom sau carcinom de prostat, tumori de vecintate, stricturi uretrale sau ale colului vezical, compresiune uretral n timpul sarcinii, corpi strini, calculi urinari, cateterizare urinar etc), refluxul vezico-ureteral, ali factori funcionali.Ageni etiologiciMicroorganismele mai frecvent implicate n producerea unei infecii a tractului urinar sunt n ordine descresctoare E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Enterococcus faecalis, stafilococii coagulaz-negativi. Adenovirusurile pot determina cistite hemoragice la copii. Mai rar, n ordine descresctoare etiologia ITU poate fi reprezentat de Staphylococcus aureus, Acinetobacter calcoaceticus, streptococi b-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella morgani, Providencia rettgeri, P. stuartii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Candida albicans, Salmonella spp., Corynebacterium urealyticum. Cu privire la E. coli, cel mai frecvent microorganism implicat n ITU, exist anumite grupuri uropatogene, spre ex. O1, O2, O7 etc. n mod cert, exist diferene n ceea ce privete etiologia ITU pe grupe de vrst, n funcie de sex sau la pacienii spitalizai n comparaie cu pacienii pentru care se solicit urocultura n ambulatoriu.Realizarea uroculturiiRecoltarea i transportul produsului patologicn ITU se pot recolta urin, snge (ex. n pielonefrita acut) sau chiar i LCR. n continuare vom discuta despre recoltarea i transportul urinei.n afar de recomandrile generale menionate anterio, trebuie s subliniem unele aspecte particulare n cazul n care nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat pentru recoltare 3-4 ore dup miciune Recoltarea se realizeaz dup splarea cu ap i spun a organelor genitale i a perineului; exist recomandri specifice pentru sexul feminin i masculin i respectiv pentru copilul mic Este preferabil ca recoltarea s aib loc ntr-un spaiu corespunztor n apropiere de laborator iar personalul medical trebuie s explice i eventual s asiste recoltarea Este contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar prelungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor, aa cum am menionat mai sus); dup recoltare, n cazul n care urina nu este prelucrat imediat (sau n cel mult 30 de minute dup recoltare), p.p. trebuie meninut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4 C De regul se recolteaz urina din mijlocul jetului; dup splarea organelor genitale i a perineului, prin miciune se elimin circa 100 ml urin (ndeprtnd astfel o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) i abia apoi se recolteaz 20-50 ml (preferabil 50 ml) urin n recipientul steril, dup care miciunea continu Exist i alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare uretral, cu riscurile respective).Examinarea macroscopic i microscopic a urineiRealizm iniial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate prezenta un anumit miros etc. n vederea examenului microscopic al urinei omogenizm urina prin rsturnare, de 2-3 ori. Punem o pictur de urin pe lam, acoperim cu o lamel i examinm cu microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de faz). n cazul n care identificm prezena a cel puin unei bacterii pe fiecare cmp, n fiecare dintre 5 cmpuri succesive, putem cu o bun aproximaie s considerm c avem o bacteriurie de 105 bacterii / ml. Alternativ se poate utiliza preparatul colorat Gram. Este necesar s apreciem concomitent i prezena piuriei (peste 10 leucocite / mm3 de urin). Au fost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea piuriei i bacteriuriei, spre exemplu testul Griess (detectarea nitriilor n urin), detectarea esterazei leucocitare, teste bioluminiscente etc. Piuria i bacteriuria trebuie interpretate n contextul clinic.Examenul sedimentului urinar permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc), celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali, granulari etc), cristale urinare, levuri (eventual nmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este foarte util i trebuie realizat de fiecare dat.Cultivarea urinein mod obinuit, pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite. Din motive de economie am putea nsmna o jumtate de plac cu mediu MacConkey (fr cristal violet), o jumtate de plac cu geloz-snge i cte un sector de plac cu mediu agar telurit i respectiv agar cu eozin i albastru de metilen (EMB) n cazul n care examenul microscopic al urinei este pozitiv. Dac examenul microscopic este negativ, nsmnm doar o jumtate de plac Petri cu mediu MacConkey.O variant de nsmnare pentru mediile MacConkey i geloz-snge este utilizarea unei anse calibrate de 1 l cu ajutorul creia prelevm urin prin atingerea suprafeei p.p. dup omogenizare. nsmnm iniial un striu pe centrul jumtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele, perpendiculare pe primul striu. n final fr sterilizm ansa ntindem p.p n striuri paralele n unghi de 45 fa de striurile precedente. Dup o incubare de 18-24 ore la 35-37 C, nmulind cu 1000 numrul de UFC dezvoltate, putem aprecia care este numrul de bacterii / ml de urin.Frecvent este utilizat nsmnarea urinei dup diluare (ex. 1/100) cu ajutorul pipetei gradate. nsmnm de ex. pe o plac cu mediu MacConkey 0,1 ml de urin diluat 1/100, incubm n condiiile cunoscute i dup apariia coloniilor calculm numrul de bacterii / ml prin nmulirea numrului de UFC inversul diluie inversul volumului nsmnat.Interpretarea rezultatelor uroculturii cantitative Izolarea unei bacterii cu o concentraie de peste 105 / ml de urin confirm ITU la brbat sau la femeie (cu simptome caracteristice); n cazul c pacienta este asimtomatic, certificarea ITU este dat de izolarea aceleai bacterii n a doua prob de urin Izolarea a dou bacterii diferite, fiecare cu o concentraie de peste 105 / ml de urin, impune repetarea recoltrii i nsmnrii; n cazul n care rezultatul este similar i pentru a doua prob de urin este posibil ITU mixt (n caz contrar este o foarte probabil contaminare) Izolarea a trei bacterii diferite, chiar i n cazul n care concentraiile pentru fiecare n parte depesc 105 / ml de urin, impune repetarea analizei; extrem de probabil este vorba de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp n urm i meninut la temperatura camerei i nu la frigider Izolarea unei bacterii cu o concentraie de 104 / ml de urin conduce la recomandarea repetrii analizei (exist i unele excepii, n care rezultatul este considerat pozitiv, spre ex. pentru levuri n concentraie de peste 104 / ml de urin, stafilococii coagulazo-negativi n concentraie de peste 5104 / ml de urin etc) Lipsa multiplicrii bacteriene sau dezvoltarea de UFC n concentraie de 103 / ml de urin reprezint o urocultur negativ Dorim s subliniem din nou c rezultatul microbiologic trebuie s fie analizat n contextul clinic i corelat cu rezultatul microscopiei iar n cazul anumitor bacterii (ex. Salmonella typhi) rezultatul este pozitiv indiferent de concentraia UFC / ml de urin.n cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolat se identific (pe baza caracterelor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, alte caractere) i se testeaz sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metoda difuzimetric (vezi capitolul 14).Exist o serie de ncercri pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv abordarea unor tehnici miniaturizate. Dintre acestea vom aminti metoda imaginat n Institutul de boli infecioase Matei Bal (prof. Florin Cruntu), metoda Uriline etc. Spre exemplu ultima dintre metode utilizeaz o lam de plastic acoperit pe ambele pri cu mediu de cultur, protejat ntr-un tub de plastic.Principiu:Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient agar) are culoare verde i permite numrarea coloniilor bacteriene (indirect a numrului de UFC / ml urin) i identificarea prezumtiv. Concentraia sczut de electrolii inhib invazia Proteus spp. Mediul MacConkey fr cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare roz; inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive.Tehnica de lucru:Deurubm capacul i extragem lama fr s atingem suprafaa agarului. Imersm lama n proba de urin recoltat (dac urina nu este suficient cantitativ, repartizm p.p. pe cele 2 pri ale lamei cu ajutorul unei pipete Pasteur). ndeprtm excesul de urin pe ohrtie de filtru curat i punem la loc n dispozitiv lama nsmnat. Incubm n poziie dreapt, timp de 18-24 ore la 35-37C. A doua zi citim rezultatele, comparnd numrul de colonii aprute pe mediul CLED cu modelul productorului.Interpretare:n cazul n care numrul de UFC / ml este mai mare de 105 realizm teste suplimentare pentru identificare i respectiv antibiograma. Alte elemente privind interpretarea au fost prezentate anterior.Control de calitate: Pregtim o suspensie bacteriann soluie salin fiziologic steril cu 105-106 bacterii pe ml din fiecare dintre tulpinile de referin Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Proteus mirabilis ATCC 12453 Inoculm suspensiile astfel pregtite pe suprafaa mediilor de cultur Uriline, iar dup 18-24 ore incubare citim i interpretm rezultatele Staphylococcus aureus: apar colonii doar pe mediul CLED. Fermentarea lactozei este indicat de prezena culorii galbene n jurul coloniilor dezvoltate. Escherichia coli: apar colonii galbenepe CLED i colonii roz pe MacConkey. Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastr; pe Mac Conkey apar colonii incolore

35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, A Muntean)35. 1. Definiie. ncadrareMicroorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate printr-o intens activitate metabolic asupra hidrailor de carbon pe care i hidrolizeaz cu producerea de acizi i uneori de gaz. Glucoza este degradat cu producere de gaz.Specia tip a fost descris n 1885 sub numele de Bakterium lactis aerogenes. Numele actual dateaz din 1954 fiind atribuit n onoarea microbiologului german Edwin Klebs. Klebsiella pneumoniae este cunoscut i sub numele de Bacillus Friedlnder.Exist mai multe specii de exemplu K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis iK. oxytoca, aceste tulpini fiind i cele mai des implicate n patologia uman. n ultima perioad se consider K. ozaenae i K. rhinoscleromatis drept subspecii ale K. pneumoniae.Recent, civa membri ai genului Klebsiella au fost reclasificai pentru a forma un nou gen, Raoultella, pe baza informaiilor din studii genetice. Membrii acestui nou gen pot fi implicai i n patologia uman, iar denumirea a fost adoptat la nivelul comunitii tiinifice internaionale [1].35. 2. Caractere generale35. 2. 1. HabitatKlebsiella pneumoniae este larg rspndit n natur (sol, ap), dar i n intestinul omului i animalelor; n mediul spitalicesc se selecteaz tulpini multirezistente ce pot coloniza tractul urinar sau respirator la adult sau tractul intestinal la copil, mai ales dup terapia prelungit cu antibiotice cu spectru larg.Mai multe studii au urmrit pattern-ul de colonizare cu cu Klebsiella pneumoniaea indivizilor, cu scopul de a determina factorii de risc pentru infecii. S-a demonstrat astfel c aproximativ o treime din persoanele testate prezint portaj de Klebsiella n fecale. Spitalizarea i folosirea de antibiotice a crescut numrul celor colonizai de bacterii din genul Klebsiella, ct i numrul acestor bacterii per gram de fecale. Personalul medical prezint Klebsiella pe mini dup ce ngrijesc pacieni (ntr-un studiu, 17% din asistentele unei secii de terapie intensiv; rate i mai mari au fost nregistrate n cursul unui focar epidemiologic activ 30 % [2]).

35. 2. 2. Caractere morfotinctorialeKlebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulai (capsula are dimensiuni de 2-3 ori mai mari dect diametrul bacteriei), imobili, nesporulai. Se pot dispune n diplo, n special n organismul uman.35. 2. 3. Caractere de culturSe cultiv cu uurin pe medii uzuale fr cerine nutritive speciale. Pe medii gelozate s-au descris mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M): colonii mari, opalescente, uneori cenuii, cu suprafaa umed care dup o incubare prelungit prezint tendin la confluare i curgere pe suprafaa mediului. Pe medii lactozate sunt lactoz-pozitive. Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. S-a raportat apariia unor tulpini ce dezvolta colonii hipermucoide, aceste tulpini avnd i o virulen crescut [3].35. 2. 4. Caractere biochimicePe mediile multitest germenii au urmtorul comportament enzimatic: pe mediul TSI sunt glucoz-pozitivi i uneori fermenteaz glucoza cu producere de gaz, sunt lactoz-pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol-negativi i ureaz-pozitivi; pot crete pe medii avnd citratul drept unic surs de carbon. Sunt germeni catalaz pozitivi, oxidaz negativi.35. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimiciSunt puin rezisteni la cldur (distrui n 5-7 minute la 100C); pe sol, n alimente rezist un mare numr de zile. Dezinfectantele obinuite i distrug n intervale de timp cuprinse ntre 30 de minute i 2 ore.35. 2. 6. Structur antigenicParticularitile morfologice ale klebsiellelor se reflect n structura antigenic. Au fost descrise antigene somatice O (LPZ) specifice de grup i antigene capsulare polizaharidice K, specifice de tip. Exist peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin reacia de umflare a capsulei i (prin analize serologice sau de microbiologie molecular).35. 2. 7. Caractere de patogenitateKlebsiella pneumoniae este un microorganism condiionat patogen, care poate fi implicat n patologia uman prin multiplicare i invazivitate.Factorii de patogenitate sunt reprezentai de capsula (antigenul K) care i confer rezisten fa de fagocitoz i de endotoxina (antigenul O) eliberat dup distrugerea bacteriei.Sideroforii membranari sechestreaz Fe2+ n focarul infecios, pentru a asigura un nivel adecvat creterii bacteriene. Dei nu reprezint un rol central n patogenitate, ntr-un model murin de peritonit, s-a demonstrat creterea virulenei tulpinilor de Klebsiella prin introducerea genei care codific sideroforul aerobactin.Biofilmul reprezint o matrice extrem de bine organizata ce nconjoar bacteriile. Ele favorizeaz aderarea bacterian pe suprafaa cateterelor.Adezinele cele mai ntlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul 1 i 3. Exist o interrelaie ntre adezinele exprimate i cantitatea de biofilm produs [4].35. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produseConsiderat iniial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit c numai 1-3 % din pneumonii sunt produse de Klebsiella pneumoniae, dar aceste pneumonii pot fi extrem de grave (pneumonii necrotice i hemoragice), n special la pacieni cu un sistem de aprare deficitar.Klebsiella pneumoniae poate fi implicat ntr-o mare varietate de boli precum toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc. Din ce n ce mai frecvent acest microorganism apare n infecii nosocomiale (de spital), la fel ca i Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae a fost izolat din mucoasa nazal a pacienilor cu ozen (atrofie progresiv a mucoasei cu pierderea mirosului) iar Klebsiella rhinoscleromatis s-a izolat de la pacieni cu rinosclerom (granulom distructiv al nasului i faringelui).Tulpini aparinnd serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar, hepatic, cerebral. Dintre acestea o tulpin de Klebsiella pneumoniae deosebit de virulent a fost izolat n special n rile asiatice, aceast tulpin produce majoritatea abceselor hepatice primare bacteriene [5-7]. ntr-un model murin, secvena de evenimente ce a condus la constituirea unui abces bacterian primar dup inoculare oral a fost: colonizare intestinal (la 12 ore), diseminare extraintestinal (ntre 12 i 24 ore), replicare hepatic (la 36 ore), metastazare septic (dup 48 ore).S-a tentat identificarea unor gene care favorizeaz producerea abcesului hepatic [8-10].n ultima vreme tulpini de Klebsiella productoare de -lactamaze sunt tot mai des responsabile de infecii nosocomiale mai ales la pacieni iimunocompromii. De o importan particular sunt enzimele cu activitate -lactamazic cu spectru extins (Extended Spectrum Beta Lactamaze, ESBL); tulpinile de Klebsiella productoare de ESBL sunt recunoscute n patologia uman datorit dificultii tratamentului curativ.Tratamentul de prim linie pentru tulpinile de K. pneumoniae productoare de ESBL a fost reprezentat de carbapeneme. n 1996 s-a identificat pentru prima oar n SUA o tulpin productoare de carbapenemaze (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase - KPC).35. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de KlebsiellaDiagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).Cu toate c nu este cea mai reprezentativ entitate clinic pentru acest gen, vom discuta n continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include elemente clinice, paraclinice (ex. examenul radiologic) i de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util n stabilirea etiologiei i tratamentului antibiotic corespunztor.Diagnosticul bacteriologic (direct) include etapele cunoscute.1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientul s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, etc.). n infeciile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urin, snge, puroi, etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i anexa nr. 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate avea un aspect mucoid, de culoare rou nchis, n jeleu de coacze.2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena bacililor Gram-negativi, de dimensiuni relativ mari, ncapsulai (nconjurai de o capsul voluminoas). Examinarea microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i anexa nr. 6). n coloraia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou n jurul klebsielelor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacia de umflare a capsulei (vezi i anexa nr. 2).3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Se prefer utilizarea unor medii de cultur slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formeaz colonii lactoz-pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin de confluare. Se poate realiza i inocularea la animale de laborator sensibile, oarecele alb (vezi i anexa nr. 2).Exist medii de cultur selective/difereniale care pot ajuta n diagnosticul rapid al infeciilor cu Klebsiella sau aducnd informaii epidemiologice de valoare (izolarea de tulpini productoare de ESBL, datorit rezistenei la o doz de antibiotic inclus n mediu). Valorile de sensibitilitate i specificitate a acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie s fie folosite cu pruden, pentru a nu oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni posibili implicai n procesul patogenic. [11]4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulai, capsula fiind voluminoas, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai. n mediul de cultur pot pierde capsula. Caractere de cultur: produc colonii lactoz-pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin la confluare. Pe mediul MacConkey coloniile apar roii (fermenteaz lactoza, cu producerea de gaz). Caractere biochimice: Klebsiella este un microorganism lactoz-pozitiv, ceea ce se poate evidenia nc din etapa de izolare pe mediul MacConkey (vireaz culoarea mediului n rou); alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi- test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi-test comerciale de tip API; Klebsiella pneumoniae este glucoz-pozitiv (cu producere de gaz), lactoz-pozitiv, nu produce H2S, imobil, ureaz-pozitiv, indol-negativ, care se dezvolt folosind citratul ca unic surs de carbon; K. oxytoca e indol-pozitiv acesta fiind un caracter ce poate fi folosit n schema de diagnostic de laborator diferenial. produce acetoin din glucoz, caracter evideniat prin reacia Voges-Proskauer (adugarea de hidroxid de potasiu duce la virarea n rou a unei culturi bacteriene n care se afl acetoin, n prezena unui indicator de pH precum alfa-naftol). Caractere antigenice: se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare, ELISA [12], Western Blot sau latex aglutinare. Exist peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiella pneumoniae. Aceste reacii se practic n laboratoare de referin. Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi i anexa nr. 2). Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot utiliza (n centre de referin): testarea sensibilitii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite n Institutul Cantacuzino); gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice; bacteriocinotipie; caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu identificarea plasmidelor implicate n virulen etc.).5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul 7). Klebsiella pneumoniae reprezint unul dintre microorganismele cu o rezisten remarcabil fa de antibiotice i chimioterapice. Cnd sunt detectate, tulpinile productoare de -lactamaze i carbapenemaze necesit teste moleculare pentru a determina cu exactitate substratul rezistenei.36. Genul Proteus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)36. 1. Definiie. ncadrareGenul Proteus este format din germeni pleomorfi, foarte mobili, Gram-negativi, care nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, sunt nesporulai, necapsulai. Exist 2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris (P. morganii a devenit Morganella morganii, iar P. rettgeri a devenit Providencia rettgeri); celelalte 3 specii sunt P. myxofaciens, P. penneri i P. hauseri.Majoritatea tulpinilor din genurile nrudite (Proteus, Morganella, Providencia) au anumite caractere comune (ex. mobilitatea, rezistena la KCN, producerea de indol).36. 2. Caractere generale36. 2. 1. HabitatGermenii din genul Proteus sunt rspndii n natur ubicvitar, se pot identifica n materiile organice n putrefacie, n alimente. Fac parte din flora intestinal uman.36. 2. 2. Caractere morfotinctorialeSunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde i numele, derivat din mitologia antic), pe frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 50-80 m. Prezint un mare numr de cili peritrichi care le confer mobilitatea caracteristic (dar exist i tulpini aciliate). Sunt necapsulai i nesporulai.36. 2. 3. Caractere de culturCresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui miros caracteristic de putrefacie. Suport mari variaii de temperatur i de pH. Pe mediile difereniale (cu lactoz) nu se pot obine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie (migrare). Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii (sau tubului) n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de sruri biliare, tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide, neomicin, crbune activat etc.Dac pe o plac cu mediu solid se cultiv 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, acestea se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaie).Cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie vertical, va conduce (n cazul n care n produsul patologic exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorit mobilitii acestor microorganisme (fenomenul de crare).36. 2. 4. Caractere biochimiceSunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab i moderat selective pe care fenomenul de migrare a fost inhibat, speciile de Proteus dezvolt colonii de tip S, lactoz-negative (vezi 36. 4.). Microorganismele din genul Proteus sunt glucoz-pozitive, lactoz-negative, produc H2S, sunt ureaz-pozitive, indol-pozitive (exceptnd P. mirabilis i P. myxofaciens) iar pe mediul MIU se poate constata mobilitatea.36. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimiciAre o rezisten relativ crescut n mediu, n alimente etc i poate rezista n soluii antiseptice sau n detergeni, ceea ce poate crea probleme deosebite n mediul de spital. Rezist mai multe luni la temperaturi joase, inclusiv n alimentele congelate. Rezistena la antibiotice i chimioterapice este considerabil.36. 2. 6. Structur antigenicPrezint antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. Dup constatarea c serul bolnavilor de tifos exantematic aglutineaz cu o tulpin de proteus s-a demonstrat c genul include o serie de tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au nrudiri antigenice cu microorganisme aparinnd genului Rickettsia.Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri.

36. 2. 7. Rspuns imunPostinfecios apare un rspuns imun umoral care ns nu are utilitate practic.

36. 2. 8. Caractere de patogenitateProteus poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate, n condiii speciale (prsirea habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficiene ale sistemului imunitar).La fel ca i ceilali germeni Gram-negativi, elibereaz de la nivel parietal, dup distrugere, endotoxina (antigenul O, LPZ).Mobilitatea deosebit i permite invadarea tractului urinar.Producerea de ureaz alcalinizeaz urina i favorizeaz formarea de calculi (de ex. de struvit). Existena calculilor favorizeaz apariia altor infecii urinare sau cronicizarea acestora.Rezistena la antibiotice i chimioterapice este remarcabil.36. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produseDe regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului digestiv. Exist totui i toxiinfecii alimentare de tip infecios n care aceti germeni au reprezentat agenii cauzali.n mod frecvent se discut despre infeciile cu proteus la nivelul tractului urinar, dar sunt posibile mai rar i alte infecii (genitale, pleurezii, alte localizri n cursul unei bacteriemii) de regul la pacieni cu status imun deficitar sau n spital (infecii nosocomiale).

33. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul ProteusGenul Proteus este format din germeni pleomorfi (de unde i numele genului), foarte mobili, gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, care nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, produc fenil-alanin-dezaminaz, sunt nesporulai, necapsulai. Exist 2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris.De regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului digestiv (fac parte din flora microbian intestinal). Exist totui i toxiinfecii alimentare de tip infecios cu Proteus spp. n mod frecvent se discut despre infeciile tractului urinar (ITU), dar sunt posibile i alte infecii (tegumentare, genitale, cu alte localizri n cursul unei bacteriemii la pacieni cu status imun deficitar sau n spital / infecii nosocomiale). Vom discuta n continuare diagnosticul de laborator al ITU.Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluznd urmtoarele etape.1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Proteus spp. se pot recolta urin, puroi, diferite exsudate purulente, materii fecale, lichid de vrstur, alimente, snge etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de urin (vezi i capitolul 29). Din punct de vedere macroscopic, urina ar putea fi tulbure, purulent. Transportul urinei trebuie realizat rapid, n maxim 30 minute, iar dac aceast recomandare nu poate fi ndeplinit, p.p. trebuie transportat la rece (+ 4C).2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel, din sedimentul rezultat dup centrifugarea urinei. Examenul microscopic al urinei este foarte important pentru c este uor de realizat, este ieftin i permite observarea unor elemente care orienteaz diagnosticul. Examinarea microscopic a urinei ar putea conduce la economii importante (de timp, reactivi i materiale, medii de cultur); vezi i capitolul 29. Proteus spp. prezint un mare numr de cili peritrichi care confer mobilitatea caracteristic (exist i tulpini aciliate). Se poate realiza i un frotiu colorat Gram din urina omogenizat. Germenii au un accentuat polimorfism pe frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 30 m. Sunt necapsulai i nesporulai. Prezena a cel puin 1 leucocit / cmp microscopic la examinarea cu obiectivul de imersie sugereaz piuria, care ntr-un context clinic sugestiv ajut la definirea ITU. n cazul n care din urina omogenizat prelevm cu ansa calibrat de 0,01 ml urin iar n frotiul rezultat identificm cel puin 1-2 bacterii / cmp (n microscopia optic cu imersie) acest rezultat sugereaz prezena a 105 bacterii (uniti formatoare de colonii) / ml i respectiv infecia tractului urinar.3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic trebuie realizat n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Cresc pe medii simple inclusiv pe medii peptonate lichide cu degajarea unui miros caracteristic de putrefacie. Suport mari variaii de temperatur i de pH. Este necesar realizarea uroculturii cantitative i demonstrarea prezenei a peste 105 bacterii / ml de urin. Pe mediile simple uzuale, pe agar-snge, pe AABTL etc, nu se pot obine colonii izolate, fiind cunoscut fenomenul de invazie (vezi i capitolul 11). Acest aspect sugereaz prezena Proteus spp. n produsul patologic. Fenomenul poate fi inhibat dac se realizeaz nsmnarea p.p. pe medii selectivo-difereniale (ex. Mac Conkey sau ADCL). Pe aceste medii Proteus spp. produce colonii lactozo negative, de tip S.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi, cu un accentuat polimorfism (bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 30 m), necapsulai i nesporulai. Caractere de cultur: Fenomenul de invazie: reprezint un caracter de identificare preliminar pentru Proteus spp., o bacterie foarte mobil; dac nsmnm o tulpin care aparine acestui gen la periferia unei plci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%), de la locul nsmnrii cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde in aproape n aproape) pe toat suprafaa mediului Pe anumite medii selective, invazia este inhibat i se pot obine colonii izolate (adugm la mediul de cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc); aceste colonii sunt lactozo negative i de tip S Fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util n studii epidemiologice, n cazul n care tulpinile implicate aparin genului Proteus;dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri); dac tulpinile nu sunt diferite va avea loc creterea n valuri fr demarcaie cu dezvoltarea unei pnze de cultur continue Fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n cultur pur a unei tulpini de Proteus; cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie vertical va conduce (n cazul n care n p. p. exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi pure de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea superioar a mediului de cultur. Caractere biochimice: Proteus spp. include microorganisme lactozo negative. Alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi test comerciale; Proteus spp. este glucozo pozitiv (uneori cu producere de gaz), lactozo negativ, produce H2S, mobil, ureaz pozitiv, se poate dezvolta folosind citratul ca unic surs de carbon. Proteus spp. produce fenil-alanin-dezaminaz. Proteus mirabilis este indol negativ i ornitin decarboxilaz pozitiv n timp ce Proteus vulgaris este indol pozitiv i ornitin decarboxilaz negativ. Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui (anti-O i anti-H) pentru identificarea tulpinilor de Proteus, prin tehnici de aglutinare (la nivelul laboratoarelor de referin). Alte caractere / teste utilizate n identificare (n centre de referin): Testarea sensibilitii la bacteriofagi Gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice.5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul 14).