Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Studiu de caz privind acidul folic si derivatii sai
INTRODUCERE
Acidul folic şi derivaţii săi prezintă un larg interes în biologie şi medicină datorită
funcţiilor coenzimatice îndeplinite în organism într-o serie de reacţii de importanţă vitală.
Acidul folic participă la formarea timinei şi a bazelor purinice din ADN, deci deţine
un rol fundamental în creşterea şi reproducerea celulară.
Folat-coenzimele sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentând forme
biologic active ale acidului folic. De aici derivă importanţa specială a reducerii acidului folic
şi mai ales aceea a transformării acidului dihidrofolic în acid tetrahidrofolic, proces ce se
desfăşoară în organism sub acţiunea enzimei dihidrofolatreductază.
Această enzimă “cheie” a metabolismului folaţilor a constituit obiectul unor
numeroase studii biochimice şi histoenzimologice.
Ea reprezintă cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor
acidului folic, explicând marea eficacitate a unora dintre aceste substanţe ca agenţi citotoxici
şi în consecinţă, aplicabilitatea lor în terapia cancerului.
Dat fiind rolul derivaţilor acidului folic în biosinteza acizilor nucleici şi a proteinelor,
de un interes deosebit a beneficiat în această lucrare studiul implicaţiior acidului folic în
diferite situaţii fiziologice (sarcină, copil în creştere) sau patologice (neoplasme, în particular
leucemii, anemie megaloblastică, boli cronice exfoliative ale pielii). De asemenea, în lucrarea
de faţă s-a urmărit o reactualizare privind noile date apărute în literatura de specialitate în
legătură cu această temă: noutăţi referitoare la mecanismul absorbţiei, transportului şi
utilizării folaţilor, la carenţa de folaţi şi malformaţiile congenitale, la mecanismul de acţiune
al medicamentelor antiinflamatoare nesteroidiene (AINS).
De-a lungul ultimilor ani s-au făcut multe studii în ceea ce priveşte incidenţa
malnutriţiei la bătrâni (în special la pacienţii vârstnici spitalizaţi pe perioade mai mari, cât şi
la persoane care se hrănesc cu conserve).
Câteva studii au indicat o incidenţă crescută a malnutriţiei la persoanele trecute de 65
de ani. Malnutriţia a fost evaluată atât prin parametrii antropometrici cât şi biochimici
Pagina 2 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
(incluzând nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observată o incidenţă crescută a
anemiei la aceşti pacienţi, anemie datorată unui deficit de folaţi.
Mai mult, în ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propusă ca factor independent de
risc pentru boala arterială coronariană. De vreme ce deficitul de acid folic este o cauză
importantă de hiperhomocisteinemie în populaţia generală, scăderea hiperhomocisteinemiei
printr-un tratament simplu şi eficace cu acid folic poate scădea incidenţa bolii arteriale
coronariene.
Ţinând cont de informaţiile menţionate anterior am ales să studiez în partea
experimentală variaţia concentraţiei de acid folic din omogenate tisulare, în funcţie de vârstă
şi organ (ca factori independenţi).
Determinările le-am făcut pe şobolani împărţiţi în trei grupe de vârstă: tineri, adulţi şi
vârstnici şi concentraţiile de acid folic au fost măsurate din omogenatele tisulare din ficat,
creier, rinichi, splină.
Problema variaţiei acidului folic cu vârsta este de importanţă nu atât individuală, cât
socială, indicând oportunitatea unei suplimentări sistematice puţin costisitoare şi lipsită de
riscuri (cel puţin la cei ce prezintă manifestări clinice).
Abordarea acestei teme se impunea cu atât mai mult cu cât la noi în ţară există puţine
studii referitoare la acest subiect, iar în articolele de specialitate din întreaga lume este
menţionată tot mai frecvent.
ACIDUL FOLIC ŞI DERIVAŢII SĂI
1.1. Scurt istoric
Primele observaţii cu privire la existenţa unui nou factor alimentar, cu acţiune
vitaminică, s-au semnalat în perioada anilor 1931-1932, când s-a constatat că leucopenia şi
granulocitopenia maimuţelor poate fi vindecată cu ajutorul unui extract obţinut din drojdia de
bere.
În 1931, L.Wills şi B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ pe
maimuţă, numit vitamina M (M=monky). Tot în 1931, L.Wills, aflat în India, remarcă efectul
favorabil al unui extract din ficat şi drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale,
concluzionând că această afecţiune trebuie să fie cauzată de lipsa unui factor nutritiv, a unei
deficienţe alimentare.
Pagina 3 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
În 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constată că extractul din drojdia de bere
este activ şi asupra puilor de găină, stimulând creşterea acestora. A fost numit factor de
creştere pentru pui sau “Factor U”. A.G.Hogan şi E.M.Parrott reuşesc să descopere în
extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de găină, căruia îi dau numele de
“Vitamina Bc”(c=chick, pui de găină).
În perioada 1939-1940, E.E.Snell şi W.H.Peterson obţin din ficat un factor de creştere
pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi eluare cu alcool
amoniacal şi îl denumesc “factor L.Casei”sau “norit-eluat-factor”.
În 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reuşesc să izoleze din frunzele de
spanac acidul folic (folium=frunză), care stimulează creşterea la Streptococcus lactis şi
manifestă proprietăţi vitaminice la animale.
Ulterior s-a constatat că factorii nutritivi obtinuţi de diferiţi cercetători din drojdie,
ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeaşi grupă şi s-a propus denumirea lor
generică de acizi folici.
Termenul de folaţi este utilizat să desemneze toţi membrii familiei acizilor folici şi a
derivaţilor acestora, inclusiv compuşii în care acidul folic este legat de unul sau mai multe
resturi de molecule de acid L-glutamic.
Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuată de E.L.Wittle,
B.L.O’Dell, J.E.Vandenbelt, J.J.Pfiffner, în 1945, confirmată în acelaşi an prin sinteza de
R.B.Angir şi colab., care menţionează că în componenţa acidului folic intră şi unii pigmenţi
pteridinici izolaţi anterior din aripile fluturilor precum şi acidul p-amino-benzoic.
În 1962, C.Herbert consumă mai multe luni o dietă deficitară în folaţi şi stabileşte
simptomele care apar în starea carenţială. Totodată stabileşte necesităţile de folaţi pentru
oamenii adulţi.
Ulterior au fost identificaţi, în 1973, de către W.S.Osborne-White şi R.M.Smith
numeroşi factori nutritivi înrudiţi (aproximativ 28) din ficatul de oaie şi şobolan, dintre care o
importanţă deosebită o prezintă acizii folinici în reacţiile de transformilare.
În 1991, G.Wald stabileşte efectul favorabil al acidului folic în tratarea unor afecţiuni
neuropsihice. În 1992, Butterworth raportează că dozele mari de acid folic ajunse în sânge
reduc riscul apariţiei cancerului cervical la femeile infectate cu “papilloma virusul” uman.
În 1993 Serviciul de Sănătate Publică din S.U.A. hotărăşte ca toate femeile să
consume zilnic 0,4 miligrame de folaţi pentru a reduce riscul apariţiei unor malformaţii şi
afecţiuni cancerigene.
Pagina 4 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
1.2. Grupul acizilor folici
Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B, care
din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au acţiune hematopoetică
şi leucopoetică, dar se deosebesc între ele prin acţiunea specifică pe care o au asupra
diferitelor microorganisme şi specii de animale.
Aparţin acestui grup: acidul folic, acidul folinic, acidul tetrahidrofolic, acidul
dihidrofolic, vitamina Bc-conjugată, vitaminele M, U, R etc.
Acidul folinic se mai numeşte şi “citrovorum factor” deoarece este indispensabil
culturilor de Leuconostoc citrovorum. Vitamina M este un factor nutritiv care vindecă anemia
nutriţională la maimuţă, de unde îi derivă şi numele. Vitamina Bc-conjugată vindecă anemia
macrocitară a puilor de găină şi este esenţială pentru creşterea microorganismelor
Lactobacillus casei L. şi Streptococcus faecalis R.
Dintre alţi factori nutriţionali corelaţi cu grupa acidului folic menţionaţi de diferiţi
cercetători fac parte factorul U, factorul R, factorul S, vitaminele B10 si B11 etc., factori
necesari creşterii unor microorganisme sau vindecării unor forme diferite de anemie la
animale. Toţi aceşti factori se pot obţine prin extracte apoase din drojdii, frunze de spanac,
ficat etc., prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi apoi eluate de pe adsorbant cu diferiţi
compuşi. Prin metode fizice şi chimice compuşii din complex pot fi separaţi, identificaţi şi
dozaţi. Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roşii şi albe din sânge, în
prevenirea şi tratarea anemiilor, sunt factori de creştere pentru numeroase organisme;
deasemenea au un rol fundamental şi în activarea şi transportul unităţilor C1 active (-CH3, -
CH2OH, -C=O, HCOO-, -CH=NH etc.), în biosinteza bazelor azotate, a acizilor nucleici şi a
proteinelor, în metabolismul unor aminoacizi etc.
1.3. Structura acidului folic
Acidul folic se numeşte astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele plantelor
(folium-frunza). Se mai numeşte şi acid pteroilglutamic, denumire ce provine din structura sa
chimică. Este identic cu vitaminele Bc, B4, M, U, R, Lactobacillus factor, precum şi cu cea de
Norit eluat factor, pentru că la izolarea sa din produsele naturale se foloseşte adsorbţia pe
cărbune Norit (cărbune activ) şi eluare cu soluţii amoniacale.
Acidul folic are o structură complexă, având molecula compusă din trei fragmente:
Pagina 5 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
-un inel pteridinic pe care se găseşte grefată o grupare amino în pozitia 2 şi o grupare
hidroxil în pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina);
-un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA);
-un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid glutamic.
Primele două componente constituie acidul pteroic. Prin adăugarea la acesta a celui
de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obţine acidul pteroil-mono-glutamic
(Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid folic.
Structura moleculara a acidului folic
Structura chimică a acidului folic s-a stabilit iniţial prin identificarea compuşilor ce
rezultă din degradarea sa hidrolitică, în mediul alcalin aerob. În aceste condiţii din acidul
folic s-a obţinut o fracţiune cu funcţie aminică aromatică primară, din care prin hidroliza
ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic şi acidul glutamic.
A doua fracţiune avea structură pteridinică, era fluorescentă şi prezenta caracter acid.
Utilizarea difracţiei cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei de
acid folic dihidratat; acesta are o conformaţie extinsă cu nucleu pteridinic în poziţia ceto.
Oxigenul de la carbonul 4 şi atomul de azot 10 sunt de aceeaşi parte a moleculei, legându-se
de restul moleculei prin legături de hidrogen.
Pagina 6 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic
1.4. Caracterizarea compuşilor din categoria folaţilor
Folaţii reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a
moleculei de acid folic, structura de bază a grupului.
Derivaţii naturali ai acidului folic diferă între ei prin:
-starea de oxidare a ciclului pteridinic;
-natura substituienţilor de la carbonul din pozitiile N5 si N10;
-numărul resturilor de acid glutamic din moleculă.
Pteridinele au fost identificate în pigmenţii aripilor fluturilor, pe baza fluorescenţei
intense în U.V. (Hopkins, 1889-1893) şi ulterior au fost izolate o serie de pteridine
(xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente şi la microorganisme şi la
animale şi au fost supuse unor ample cercetări care au dus la stabilirea structurii (H.Wieland,
1925), la sinteza şi la elucidarea rolului lor biologic, de exemplu: cofactori şi hidrolaze ca
precursori ai vitaminei B12; în biosinteza şi/sau ca elemente structurale a acizilor folici şi
folinici.
Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) şi unul
piramizinic (B).
Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina).
Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte).
Prin ataşarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obţine acidul
pteroilmonoglutamic (Pte-Glu), respectiv acidul folic.
Prin adăugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legături γ, se pot
obţine diopterina (Pte-Glu2), teropterina (Pte-Glu3), vitamina Bc conjugată (Pte-Glu7).
Pagina 7 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Structura pteridinei si a pterinei
Pagina 8 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Structura unor compusi pteroidici si folici
Pagina 9 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Structura unor compusi pteroidici si folici
Pagina 10 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Structura xantopterinei si a biopterinei
Acidul pteroic nu prezintă activitate de creştere asupra L.casei şi nici antianemică.
Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are activitate
limitată de creştere asupra microorganismelor, dar, prezintă proprietăţi antianemice. A fost
obţinut din diferite produse biologice. Are substituit un radical formil la N10 al acidului folic.
Este de zece ori mai activ decât acidul folic asupra creşterii microorganismelor L.casei şi
Str.faecalis R.
Diopterina se găseşte sub formă de acid pteroil-L-glutamil-α-glutamic şi sub formă de
acid pteroil-γ-glutamil-glutamic. Primul acid este eficace în tratarea anemiei macrocitare la
om şi atenuează la canceroşi simptomele dureroase.
Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numeşte şi factor de creştere. Este
utilizat în tratamentul tumorilor maligne.
Rizopterina este un factor de creştere pentru Streptococcus faecalis R (SLR), dar nu
are acţiune asupra Lactobacillus casei şi nici asupra anemiei puilor de găină. Este un derivat
al acidului pteroic. S-a obţinut prin sinteză din acid pteroic şi acid folic. S-a izolat din lichidul
de fermentare de la Rhizopus nigricans.
Vitamina Bc conjugată sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid glutamic
substituite la acidul pteroic. Reprezintă forma predominantă sub care se găseşte acidul folic în
ţesuturi. Vitamina Bc conjugată nu are o acţiune directă asupra anemiei macrocitare la om şi
nici nu stimulează creşterea la L.casei şi Streptococcus lactis R. Prezintă acţiune curativă în
anemia puilor de găină. Sub acţiunea unei enzime hepatice numită vitamina-Bc – conjugaza,
vitamina Bc conjugată eliberează acidul pteroil glutamic activ.
Vitamina Bc conjugată este forma cea mai răspândită sub care se găseşte acidul folic
în alimentele naturale. Ea este eficientă în tratarea anemiei macrocitare şi la maimuţă. Enzima
vitamin – Bc conjugaza are acţiune carboxipeptidazică a fost iniţial izolată din ficat, iar
ulterior şi din rinichi de porc, pancreas (pui de găină), de la gâşte şi din materiale vegetale
Pagina 11 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
(cartofi, migdale). Microorganismele nu conţin această enzimă şi de aceea nu pot utiliza
vitamina Bc conjugată.
1.5. Derivaţii metabolic activi
Acidul folic este inactiv ca atare în cadrul metabolismului celular, formele metabolic
active fiind constituite din compuşii rezultaţi din:
Reducerea acidului folic în poziţiile 5, 6, 7, 8 rezultând acid dihidrofolic şi acid
tetrahidrofolic.
Carbonul asimetric din poziţia 6 conferă moleculei FH4 stereospecificitate pentru
diferite funcţii metabolice şi mai ales permite trecerea în formele dihidro, în schimb, se pare
că gruparea NH2 din poziţia 2 a nucleului pteridinic deţine rolul fundamental în coordonarea
moleculei de folat cu funcţie de coenzimă.
Reducerea acidului folic în acid tetrahidrofolic se realizează în două etape succesive;
întâi se obţine acidul dihidrofolic (FH2) şi apoi acidul tetrahidrofolic (FH4), sub acţiunea
enzimei dihidrofolatreductaza.
Pagina 12 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei
Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitică cu oxid de platină sau
paladiu în mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6, în prezenţa
acidului ascorbic. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic:
5, 6 H2 Pt. Glu. ;
7, 8 H2 Pt. Glu. ;
5, 8 H2 Pt. Glu. ;
dintre care numai acidul 7, 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic “standard”) s-a izolat şi
este stabil.
Acidul dihidrofolic este uşor degradat prin expunerea la aer sau sub acţiunea bazelor.
Degradarea sa este favorizată de EDTA în timp ce acidul ascorbic şi tiolic îl protejează.
Pagina 13 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Spectrul de absorbţie al acidului dihidrofolic la pH neutru prezintă două maxime la
lungimea de undă de 282 nm, precum şi la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care nu este
fluorescent, derivaţii săi în forma redusă posedă spectre de absorbţie carecteristice în UV.
Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus în poziţiile 5, 6, 7, 8. Poate fi
stabilizat în mediul acid (de exemplu în acid ascorbic 0,2-0,5% sau cu compuşi ce conţin
grupări tiolice cum ar fi mercaptoetanolul în soluţie 0,2-1 M).
Oxidarea cu aer produce o amină diazotabilă (acid para aminobenzoilglutamic).
Spectrul de absorbţie al acidului tetrahidrofolic prezintă două maxime, la lungimea de undă
de 298 nm, iar în absenţa agenţilor reducători maximul de absorbţie variază între limitele
270-298 nm.
Spectrul de absorbţie al derivaţilor acidului folic la diferite pH-uri
Compusul Maximul de absorbţie la diferite pH-uri (în nm)
Acid Neutru Bazic
Folat 292 280 257
Dihidrofolat 282 282, 310 283
Tetrahidrofolat 272 270, 298 -
N5 – formil FH4 - - 282
N5, N10 – metenil FH4 348 x x
N10 – formimino FH4 xx 258 255
N5, N10 – metilen FH4 292 293 297
N5 – metil FH4 - 290 -
Valoarea nu este cunoscută;
x compusul se transformă în N10 – formil FH4 în soluţie neutră sau bazică;
xx compusul se transformă în N5, N10 – metenil FH4 în soluţie acidă.
B. Substituirea de grupări monocarbonate în poziţiile N5 sau N5, N10 sau N10. Mai
jos sunt reprezentate structurile celor mai importanţi derivaţi ai acidului folic, metabolic
activi: N5 – metil FH4: N5 formil – FH4; N5, N10 – metilen – FH4; N5, N10 – metilenil –
FH4.
Pagina 14 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Structura generală a derivaţilor N5–substituiţi în care R poate fi:
-CH3 în N5 – metil – FH4;
-CHO în N5 – formil – FH4;
-CH = NH în N5 formimino – FH4 este prezentată mai jos
Structura generala a derivatilor acidului folic N5 - substituiti
Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic
Modificarea numărului reziduurilor de acid glutamic din moleculă.
Resturile de acid glutamic sunt condensate între ele într–un mod special (gruparea –
COOH din poziţia γ a unui rest se leagă de gruparea – NH2 a altui rest de acid glutamic. Mai
des întâlnite sunt formele în care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) şi n = 5 (acid
pteroilpentaglutamic) în celule animale şi
n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante.
Structura pteroilpoliglutamatilor
1. 6. Proprietăţi fizice şi chimice ale acidului folic
1. 6. 1. Proprietăţi fizice
Pagina 15 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Acidul folic este o substanţă solidă, cristalină de culoare galbenă, greu solubil în apă
(0.16mg/100ml), piridină, în fenol, în metanol, în acid acetic glacial şi insolubil în cloroform,
benzen, eter şi acetonă. Ca sare de sodiu este solubil în apă. Este optic activ dextrogir (+) 16˚,
iar în mediul acid la pH 4 – 12 este stabil, cu ionii metalelor grele formează compuşi
complecşi (cu Fe 3+ roşu, Cu2+ verde, Co2+ galben), iar în mediul bazic formează săruri cu
metalele alcalinopământoase. Acidul folic se descompune sub influenţa luminii şi a razelor
UV, rezultând acid pteridoxamin – 6 – carboxilic şi alţi compuşi proveniţi din catena laterală.
Spectrul său de absorbţie în ultraviolet este asemănător cu cel al xantopterinei. Acidul folic se
prezintă sub formă de plăcuţe galbene, lenticulare, subţiri, birefringente, cu punct de topire la
250˚C. Prin autoclavare 30min, pierde 70% din activitate la pH = 1. La 100˚C, sub acţiunea
acizilor se descompune în acid p – aminobenzoil – glutamic şi partea pteridinică modificată.
Solubilitatea acidului folic în apă poate fi măsurată prin încălzire la 75˚C sau prin adăugare
de glicocol. Soluţiile neutre sunt mai stabile, iar cele alcaline se oxidează cu uşurinţă. Este
incompatibil cu substanţe oxidante sau reducătoare deoarece se degradează. Cu Ca2+
formează o sare insolubilă, iar în soluţie alcoolică este incompatibilă cu clorhidraţi, FeSO4,
preparate acide, siropuri acide, gume şi mucilagii vegetale. Este inactivat de acidul ascorbic,
acidul nicotinic, vitaminele B1, B2, sulfamide, etc.
1. 6. 2. Proprietăţi chimice
Dintre proprietăţiile chimice ale acidului folic menţionăm posibilitatea reducerii
ciclului pteridinic în derivaţi di – şi tetrahidrofolici; ataşarea la o serie de enzime prin
intermediul grupării – NH2 din poziţia 2 (legături peptidice); transportul de unităţi
monocarbonate în poziţiile N5, N10; atomul de carbon din poziţia 6 conferă stereospecificitate
moleculei.
2.FOLAŢII ÎN NATURĂ ŞI ÎN ORGANISM
2.1. Răspândire în natură
Pagina 16 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Acidul folic şi derivaţii săi au o largă răspândire în alimente. Se găsesc în cantitate
mare în ficatul animalelor, în frunzele plantelor superioare, în special în spanac, în mazăre,
germeni de grâu, drojdii, sfeclă, lămâi şi în unele microorganisme.
Conţinutul substanţelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11,5μg/g, iar
în frunzele mature de 6-7 μg/g. În ierburi, conţinutul acidului folic variază între 3-7,5 μg/g.
Cele mai mari cantităţi de acid folic şi de folaţi se găsesc în regnul animal. În ficatul de bou
se găsesc 290 μg%, în ficatul de pui se găsesc 370 μg%, iar în cel de porc 220 μg%. Cerealele
conţin în medie 35 μg%, iar dintre fructe lămâile 80 μg%, bananele 30 μg%, portocalele 33
μg%. Legumele au un conţinut mai redus, fiind cuprins între 8 şi 25 μg%.
O bună parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinală fapt ce îngreunează
stabilirea necesităţilor pentru om şi animale.
Acidul folic se găseşte în cantităţi variabile în toate alimentele uzuale. Ficatul şi
muşchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate, dar şi sursele vegetale constituie un aport
însemnat. Laptele de vacă conţine cantităţi mici de acid folic.
În timpul preparării alimentelor o parte din folaţi se distrug, dar în acelaşi timp se
eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Cele mai multe forme de
folaţi nu au stabilitate mare în alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin uscare la
temperatura camerii până la 70% din activitatea folaţilor în decurs de 3 zile. Cantităţi mari de
folaţi se pierd în timpul extragerii, la prepararea hranei în soluţii apoase şi prin fierbere.
Uneori pierderile totale se ridică până la 85 - 90%.
2. 2. Necesarul de folaţi al organismului uman
Cantitatea de acid folic total dintr-o dietă normală variază între 50 – 2000 mg zilnic.
Necesarul minim de acid folic este de 50 μg /zi, dar această valoare poate creşte în
anumite stări fiziologice (sarcină, pubertate) sau patologice (neoplazii, dermatoze cronice,
etc.)
Comisia F. A. O.- O. M. S. recomandă următoarele valori pentru aportul zilnic de acid
folic: 60 μg/zi pentru sugari, 100 μg/zi de la 1 –12 ani, 200 μg/zi între 13 – 19 ani şi peste
200 μg/zi pentru adult.
Folaţii existenţi în natură sunt conjugaţi cu mai multe molecule de acid glutamic,
acidul pteroilmonoglutamic negăsindu-se ca atare în vreo sursă naturală; lanţul acid
poliglutamic fiind încărcat cu o sarcină electrică negativă, împiedică absorbţia vitaminei ca
Pagina 17 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
atare. Pentru a fi absorbiţi, poliglutamaţii alimentari trebuie să fie hidrolizaţi la
monoglutamaţi. Această hidroliză are loc la nivelul jejunului proximal, sub acţiunea unei
conjugaze (cel mai probabil intraenterocitară) pH-dependentă şi zinc-dependentă. După aceea
monoglutamaţii rezultaţi vor fi absorbiţi printr-un mecanism activ facilitat de glucoză.
Această absorbţie poate fi însă pasivă pentru doze crescute de folaţi. În cursul
transportului lor intraenterocitar monoglutamaţii sunt metilaţi şi apoi reduşi la dihidro- şi
tetrahidrofolaţi sub acţiunea dihidrofolatreductazei.
La individul normal, aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este absorbit,
indiferent de doza administrată. La o doză mai mică de 200μg
/zi, excreţia urinară este minoră sau absentă. În schimb, la doze mai mari, aceasta
poate deveni considerabilă, şi anume: 6% pentru 1mg/zi; 10% pentru 2mg/zi; 50% pentru
50mg/zi, până la 80% pentru 15mg/zi.
Sângele conţine aproximativ 1mg% folaţi, cea mai mare parte (90%) aflându-se în
eritrocite, la nivelul cărora predomină pteroilglutamotetrahidrofolaţii.
Există proteine ce leagă folaţii în plasmă, dar rolul lor este încă neclar.
Folaţii plasmatici se află sub formă de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) şi
sunt transportaţi în celule printr-un “carrier” care este specific pentru formele reduse (FH4).
Odată ajuns în celulă, folatul trece în forma poliglutamată după pierderea grupării N5-CH3
într-o reacţie de transfer a grupării metil. Forma poliglutamată pare a fi forma în care celulele
reţin şi depozitează folaţii.
În organism folaţii sunt depozitaţi în toate ţesuturile, dar cu precădere la nivelul
rinichilor, pancreasului şi mai ales ficatului. Rezervele normale de folaţi sunt estimate între 5-
20mg, din care jumătate în ficat; ţinând seama de necesarul zilnic minim de folaţi (50μg),
reiese faptul că rezervele organismului permit menţinerea unei hematopoeze normale timp de
2-4 luni. Totuşi, în caz de creştere importantă a necesităţilor (stări septice, traumatisme
grave), timpul scurs până la apariţia manifestărilor hematologice şi mai ales a trombopeniei,
poate fi mai scurt (15 zile sau mai puţin).
Pierderea folaţilor se produce prin descuamarea zilnică a celulelor epiteliale din piele
şi tractul intestinal, ca şi prin bilă, urină, transpiraţie şi salivă. Rata pierderii este de doar 1-
2% din totalul rezervelor hepatice, dar valoarea ei este de 10 ori mai mare decât a vitaminei
B12 deoarece cantitatea minimă de folaţi necesară a fi absorbită zilnic este de 100 de ori mai
mare decât cea a vitaminei B12, iar turn-over-ul folaţilor este mult mai mare, simptomele
deficienţei de folaţi se dezvoltă mult mai rapid decât cele ale vitaminei B12. Deficitul va fi
Pagina 18 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
totuşi aparent doar după câteva luni de la apariţia tulburării primare de aport, absorbţie sau
utilizare.
2.3.Manifestările clinice ale deficitului de folaţi în organism
Manifestările clinice ale deficitului de folaţi implică celulele din ţesuturile cu rată de
multiplicare rapidă, şi mai ales sângele şi mucoasa intestinală. Manifestările neurologice ce
apar în cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin potenţialul lor de
ireversibilitate) sunt mai puţin frecvente.
Manifestările hematologice constau în primul rând în anemie megaloblastică, datorată
unei eritropoeze ineficiente.
Sinteza de ADN anormal (prin încorporarea de d-UTP în locul d-TTP) duce la
hematopoeză de tip megaloblastic, asincronism de maturaţie nucleo-citoplasmatic (nucleii
sunt mai puţin maturi decât era de aşteptat, cromatina nucleară este dispersată). În măduva
osoasă apar mitoze anormale, hipercelularitate, metamielocite gigante şi scăderea raportului
mieloido/eritrocitar. Precursorii anormali sunt distruşi prematur în măduva osoasă, rezultând
anemie prin eritropoeză ineficientă, bilirubină indirectă crescută şi hemosiderină normală sau
crescută.
În sângele periferic se identifică hematii macrocitare (VEM > de 100μ3),
hemoglobină scăzută sau chiar normală faţă de numărul de eritrocite scăzut (datorită VEM
crescut, acesta fiind şi motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine suportate
de către aceşti pacienţi); frotiul sanguin arată o marcată anizocitoză, poikilocitoză şi
macrocitoză.
În ceea ce priveşte celelalte serii celulare sanguine, modificările sunt mai rare, dar şi
mai precoce: numărul leucocitelor şi al plachetelor poate fi scăzut, iar apariţia PMN
hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) în periferie este cvasipatognomonică pentru anemie
megaloblastică.
Pe frotiul de măduvă osoasă se observă, deasemenea, precursori anormali ca mărime
şi morfologie şi pentru seria granulocitară, iar clinic se poate constata un sindrom
hemoragipar sau o scădere a imunităţii celulare.
Valorile plasmatice ale folaţilor sunt scăzute (normal 6-20ng/ml), dar aceste valori pot
reflecta variaţii recente în aportul dietetic. Măsurarea folaţilor eritrocitari este în acest sens o
măsurătoare cu grad crescut de precizie, nefiind supusă acestor fluctuaţii. Frecvent deficitul
de folaţi este asociat cu deficitul de B12 (evidenţiat prin testul Schilling).
Pagina 19 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Clinic, anemia se manifestă prin slăbiciune, ameţeli, palpitaţii, angor, insuficienţă
cardiacă, tahicardie. Culoarea tegumentelor este palidă, cu nuanţă subicterică, rareori apare
purpura (datorită trombocitopeniei), iar uneori splina şi ficatul pot fi uşor mărite.
A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive, reflectând afectarea
proliferării epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) în cadrul deficitului de folaţi.
Pacienţii prezintă o limbă zmeurie (roşie, lucioasă, depapilată, dureroasă), anorexie (cu
uşoară scădere în greutate), diaree, steatoree, etc.
Manifestările neurologice şi psihice includ cel mai frecvent un tablou de polinevrită
senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal), se mai poate observa un sindrom depresiv,
anxietate, demenţă sau psihoză.
Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate, anemie
macrocitară normocromă aregenerativă), a frotiului de măduvă osoasă (hematopoeză
megaloblastică), a nivelului de folaţi plasmatic (mai puţin concludent) sau eritrocitar (se mai
pot folosi testul de supresie prin deoxiuridină, excreţia urinară de formiminoglutamat în
exces) şi excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal).
Diagnosticul etiologic presupune o anamneză amănunţită cu privire la dietă şi
explorarea funcţiei intestinului subţire.
2.4. Tratamentul deficitului de folaţi
Tratamentul deficitului de folaţi este un tratament de substituţie, pe toată durata vieţii
(sau până la excluderea cauzei primare).
Folaţii sunt utilizaţi în scop terapeutic sub formă de:
acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg)
acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub formă de soluţie pentru injectare
parenterală, dar la fel de eficace şi pe cale orală.
O doză de 50-100μg/zi permite obţinerea unui răspuns hematologic, dar doze mai
importante, de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 săptămâni sunt necesare pentru a corecta
rezervele organismului. Această doză, administrată pe cale orală, este suficientă chiar şi în
caz de malabsorbţie.
3. METABOLISMUL FOLAŢILOR
Pagina 20 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
3.1. Extragere, sinteza şi biosinteza folaţilor
Acidul folic se poate obţine în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat, spanac,
drojdii, cojile cerealelor,etc) prin extracţie cu apă la pH 3, adsorbţie pe cărbune activ (norit),
eluţie cu soluţie amoniacală 2,8%, purificat prin readsorbţie pe cărbune, eluare cu anilină şi
precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritină, etc. În prezent se realizează
iniţial inactivarea enzimelor, care distrug cofactorii naturali prin încălzirea rapidă a
materialului la 95˚C, în prezenţă de tampon ascorbat sau amestec cu uree 6M si cloroform.
Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbători de ioni şi separare prin eluare
în gradient de concentraţie cu soluţii amoniacale sau de anilină.
Prin sinteză acidul folic se obţine prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)-
glutamic, cu aldehida 2,3-dibrompropionică şi cu compusul 2,4,5-triamino-6-
hidroxipiridinclorhidrat în prezenţă de NaOH, O2 şi acetal.
Schema sintezei acidului folic
În produsele naturale acidul folic se găseşte în stare liberă în cantitate relativ redusă,
deoarece se găseşte în cantitate mai mare sub formă de compuşi chimici diferiţi, unii cu mai
multe resturi de acid glutamic, care au însă aceeaşi importanţă nutritivă pentru organismele
vii.
Prin experienţe “in vitro” s-a observat că prin adăugarea de acid folic pe secţiunile
hepatice din mediul de reacţie, în prezenţa acidului ascorbic, se obţine acidul folinic, care este
un derivat formilat al acidului formic. Acidul folinic obţinut prin sinteză este de două ori mai
puţin activ decât cel natural, deoarece prin sinteză se obţin 2 stereoizomeri din care numai
unul este activ.
Pagina 21 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obţine “in vitro” prin formilarea şi hidrogenarea sa
la temperatură ridicată, în prezenţa acidului ascorbic, iar “in vivo” sub acţiunea
piridinnucleotidreductazei şi a vitaminei C, se formează iniţial acidul dihidrofolic (FH2), care
prin hidrogenare trece în acidul folinic.
Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. Până în
prezent s-au efectuat cercetări în acest domeniu pe microorganisme şi pe animale, cu ajutorul
unor inhibitori. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor intestinale. Biosinteza
acidului folic este stimulată de acidul ascorbic.
Experimental s-a dovedit că unele microorganisme sunt capabile să biosintetizeze
acidul folic din precursori mai simpli, prin reacţii de condensare, sub acţiunea unor enzime.
Astfel, extractele celulare de E. coli, realizează biosinteza acidului folic din acid glutamic,
acid p-aminobenzoic şi 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida, iar extractele de
Lactobacillus arabinosus sunt capabile să utilizeze ca şi compuşi pteridinici 2-amino-4-
hidroxi-6 hidroximetilpteridina şi 2-amino-4-hidroxi-6-carboxildehidropteridina în prezenţa
ATP şi a ionilor de Mg2+. Biosinteza acidului folic se realizează mai repede dacă compusii
pteridinici conţin acidul pirofosforic la C-9.
În experienţele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat că în prezenţa
ATP, HS-CoA şi acidului p-aminobenzoic se formează un derivat adenilic monofosforic al
acidului p-aminobenzoic, care reacţionează cu acidul glutamic şi formează compusul p-
aminobenzoilglutamic. Prin unirea acestui produs cu pterina se formează acidul folic.
Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium
Pagina 22 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic în acid dihidrofolic,
iar din ficatul puilor de găină s-a izolat un sistem enzimatic capabil să transforme acidul
dihidrofolic în acid tetrahidrofolic.
Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic
Transformarea acidului folic în acid folinic s-a pus in evidenţă atât la animale, cât şi la
microorganisme în prezenţa ATP, FAD, Mg2+, acid ascorbic şi a unor enzime specifice. În
ficatul puilor de găină s-a identificat o enzimă care în prezenţa ATP si Mg2+ realizează
transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic în acid N-10-tetrahidrofolic.
3.2. Absorbţie, excreţie şi necesităţi
Acidul folic în stare liberă, ca acid pteroilmonoglutamic este uşor şi rapid absorbit de
organism în cantităţi de până la 15-20mg/zi. Absorbţia are loc mai ales incepând din partea
proximală a intestinului subţire şi continuă, pe toată lungimea sa, cu un consum de energie,
cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantităţi fiziologice mici.
Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasivă. În multe produse alimentare acidul
folic se prezintă predominant sub forme poliglutamate. Din aceşti derivaţi acidul folic este
absorbit numai după o deconjugare prealabilă a acestor compuşi. În tubul digestiv şi în
rinichi, s-a pus în evidenţă existenţa unor sisteme enzimatice hidrolizante (conjugaze) care
scindează complexele acidului folic. Absorbţia acidului folic poate fi perturbată şi micşorată
Pagina 23 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
de diferiţi compuşi cum sunt: difenilhidrantoina, pirimidine, cicloserine, etanol, glicocol,
serina, homocisteina şi metionina.
Se consideră că acidul folic, precum şi derivaţii acestora, sunt convertiţi în mucoasa
intestinală sub acţiunea unor acidfolicreductaze în derivaţi metilici (CH3-FH4), forme sub
care trec în sângele venei porte şi apoi la ficat.
Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici şi folinici existenţi la oamenii adulţi,
aproximativ 30-40% se găsesc în ficat (5-15μg/g), de unde prin circulaţia sanguină se
aprovizionează toate organele şi ţesuturile. Imediat după absorbţie şi parţial chiar în timpul
absorbţiei, acidul folic este convertit în diferiţi compuşi metabolici activi cum sunt:
acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4);
acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4);
acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4);
acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4);
acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4).
În toţi aceşti derivaţi apare ca structură de bază acidul tetrahidrofolic (FH4), care joacă
rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei unităţi C1.
Acidul folic este transportat în organism sub formă de CH3-FH3 legat de proteine
transportoare, având în sânge o concentraţie de 300ng/ml. Folaţii se găsesc în cantitate mai
mare în eritrocite, cu variaţii normale între 160-640ng/ml de eritrocite. Conţinutul folaţilor
din eritrocite, se menţine relativ constant şi reflectă gradul de aprovizionare a întregului
organism cu aceşti compuşi. Cantitatea de folaţi din sânge scade în bolile de cancer
(leucemii), carenţa folinică şi anemie pernicioasă, în ciroza alcoolică, anemii gravidice, etc.
Plasma sanguină conţine 5-20ng/l, iar eritrocitele conţin cantităţi de 30 de ori mai mari de
folaţi.
În sânge şi ţesuturi, acizii folici suferă procese de interconversiune şi de catabolizare.
Acidul folic se transformă mai ales în derivaţi tetrahidrofolici. În eritrocite acidul folic prin
metabolizare dă naştere la acid p-aminobenzoilglutamic şi la un derivat aldehidic al pterinei.
În ficat, acidul folinic se degradează în compuşi similari, reacţia fiind activată de acidul
glutamic şi inhibată de acidul ascorbic. Tot la nivelul ficatului se transformă acidul folic în
acid N-10-formil-folinic.
Eliminarea folaţilor şi a metaboliţilor acestora se face în cantitate mai mare prin
fecale, aproximativ 200-500μg/zi la omul adult, cuprinzând aproximativ 20% din cantitatea
ingerată şi partea neabsorbită produsă de flora intestinală.
Pagina 24 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Excreţia prin urină este mică, aproximativ 2-5 μg/zi, dar creşte prin administrarea de
doze orale, după saturarea organismului cu folaţi. Eliminarea folaţilor prin urină reprezintă
sub 1% din cantitatea acestora în organism.
Dacă se administrează intravenos doze mici de acid folic (1μg/kg corp), aproximativ
90% din cantitatea administrată este distribuită din fluxul sanguin în tot corpul în decurs de 3
minute, iar aproximativ 2% se elimină prin urină. Dacă însă se măresc dozele până la
150μg/kg corp, până la 90% din cantitatea administrată se elimină prin urină, în decurs de 6-
12 ore, sub formă de acid folic sau derivaţi apropiaţi sub aspect structural.
La o dietă normală, corespunzătoare la o ingestie de 600 μg de acid folic pe zi,
cantitatea acestui acid din organism se apreciază a fi între 6-10mg, cantitate suficientă pentru
trei sau patru luni, dacă este blocată absorbţia. O altă cale de eliminare a acidului folic este
cea cutanată. Prin transpiraţie se elimină cantităţi destul de însemnate de folaţi, precum şi prin
bilă.
3.3. Rol şi activitate biochimică
Acizii folici, sub formă de acizi tetrahidrofolici, reprezintă coenzimele unor sisteme
enzimatice, implicate în activarea şi transportul unor fragmente monocarbonice (C1) sub
formă de hidroximetil (-CH2OH), formil (-COH), formiat (HOOC-), metil (-CH3),
formimino (CH=NH), care iau parte la reacţii deosebit de importante pentru organism.
Formele coenzimatice active, care poartă fragmente sau radicali cu un atom de
carbon, sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte:
acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4);
acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4);
acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4);
acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10-CH2-FH4);
acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4).
Pagina 25 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic
Derivaţii coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obţine pe două căi principale:
-tratarea directă a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic
(FH4);
-transferul direct al acestor unităţi pe FH4. Ca substanţe donatoare de unităţi C1, cele
mai active sunt serina, histidina, xantina, metionina, colina, betaine, nicotina, timina, acidul
glutamic etc. Ca acceptori de grupări C1 funcţionează glicocolul, colamina, nornicotina,
uracilul, homocisteina, gliconamidoribozida, acidul folic etc.
Pagina 26 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Existenţa acidului N-5-formil-tetrahidrofolic, care este inert, sub aspect
coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi uşor transformat pe
cale enzimatică în acid N-10-metenil-tetrahidrofolic, iar acesta cu apa dă acidul N-10-formil-
terahidrofolic care este cel mai activ metabolit.
Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma şi prin reacţia directă dintre
aldehida formică şi FH4:
Reacţia este catalizată de formiltetrafolatsintetaza, care a fost izolată din ficatul de
porumbel şi din diferite microorganisme. Fragmentele monocarbonice sunt, sub aspect
metabolic, interconvertibile, deoarece pot trece reciproc una în alta, sub acţiunea unor sisteme
enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei în prezenţă de NADP+şi NAD+.
Transportul fragmentelor C1 de la o substanţă la alta se realizează de acidul
tetrahidrofolic şi derivaţii săi menţionaţi anterior.
Dintre reacţiile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice, face
parte şi transformarea serinei în glicocol în prezenţa piridoxalfosfatului (PALP):
Din histidină, se obţine ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care
transferă radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic.
Pagina 27 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub acţiunea unei
ciclodezaminaze, formează acidul N-5,N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4).
Acelaşi mecanism de reacţie se produce şi la transformarea xantinei în formiminoglicocol.
Glicocolul, printr-o reacţie de transaminare, formează acid glicoxalic, care cedează
gruparea formil acidului glutamic, în prezenţă de NAD+ cu formare de acid N-formil-
glutamic.
Acidul formilglutamic cedează radicalul formil acidului FH4 şi se formează acidul
folinic, care este mai puţin activ. Acesta în prezenţa ATP se transformă în acidul N-10-
formil-tetrahidrofolic.
Pagina 28 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Coenzimele folinice, care au fixate unităţi C1, se comportă ca donori în reacţiile care
necesită acceptarea fragmentelor –CH2OH, -CHO, -CH=NH, HCOO-, -CH3. În funcţie de
felul compuşilor care se sintetizează în urma transferului de unităţi C1, participă la reacţie
una sau alta din formele active.
În reacţiile cu cedare de radicali formil vor funcţiona ca donori acizii N-10-formil-
FH4 şi N-5, N-10=CH-FH4. Ca donori de grupări –CH2-OH este mai activ acidul N-5, N-10-
CH2-FH4, iar ca donori de radicali CH3 funcţionează acidul N-5-CH2-FH4 şi uneori acidul
N-5,N-10-CH2-FH4.
Acceptorii de grupări C1 active sunt mai numeroşi în procesul de biosinteză a bazelor
şi a nucleotidelor purinice, în biosinteza colinei, betainei, nicotinei, etc. În procesul de
biosinteză a bazelor purinice sunt cedate două grupări formil, localizate la C-2 si C-8 al
nucleului purinic. Dintre compuşii intermediari care se formează în procesul de biosinteză a
bazelor purinice, în urma primirii unor unitaţi C1 active fac parte :
-formilglicinamidoribozida(FGAR)
-formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR)
Datorită participării coenzimelor folinice în biosinteza nucleotidelor purinice, ce iau
parte la formarea acizilor nucleici, rezultă rolul important pe care îl au acizii folici în
procesele de creştere şi reproducere celulară.
Acidul N-5,N-10-metilen-FH4 are un rol însemnat în biosinteza ADN, deoarece se
comportă ca o coenzimă în reacţia de transformare a uracilului în nucleozide şi nucleotide în
timină. Ea donează un radical metil la 2’-deoxiuridin-nucleotide (sau nucleozide) şi acestea
se transformă în 2’-deoxitimidin-nucleotide, respectiv nucleozide. Transformarea uracilului
în timină se face în molecula nucleotidelor (nucleozidelor), care reprezintă cărămizile de bază
în biosinteza acidului deoxiribonucleic.
În cazul biosintezei metioninei se realizează transferul grupării metil de la N-
5-CH3-FH4 la homocisteină.
Pagina 29 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
În procesul de biosinteză a metioninei se produce neogeneza grupei metil şi nu
transferul acesteia de la alţi donori. Metionina are rol însemnat în formarea
colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colină provin din metionina activată (S-
adenozilmetionina).
Dintre reacţiile la care participă N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4,e importantă
trasformarea betainei în serină.
Ultima reacţie este reversibilă fapt important deoarece serina se poate transforma în
glicocol, constituind o importantă sursă de fragmente –CH2OH.
Există date experimentale care dovedesc că timina poate substitui acidul folic în
stimularea creşterii unor microorganisme (Str. faecalis), iar efectul optim al acidului folic
asupra acestor microorganisme se obţine când se administrează împreună cu vitamina B12.
Datorită acestor corelaţii se consideră că acidul folic funcţionează direct sau indirect ca o
coenzimă în biosinteza timinei. Unele microorganisme transformă uşor uracilul în timină sau
citozină, dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. În prezenţa formiatului marcat
cu 14C, acesta se regăseşte în atomul de carbon al grupării metil din timină.
Pagina 30 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic, pe lângă transformarea glicocolului în serină, şi a
homocisteinei în timină, contribuie activ la transformarea uracilului în timină şi a metioninei
în creatină precum şi la biosinteza inelelor porfirinice. Prin administrarea de formiat marcat
cu 14C se regăseşte în hem, numai la animalele tratate cu acid folic, nu şi la cele aflate în
carenţă de folaţi.
Acidul folic stimulează activitatea colinesterazei, a cărei diminuare ar duce la o
creştere a acetilcolinei, cu influenţă negativă asupra hematopoezei, dar inhibă activitatea
tirozinazei şi a xantinoxidazei. Acidul tetrahidrofolic stimulează biosinteza nucleelor
porfirinice şi a nucleoproteidelor. La maimuţe cu deficienţe de acid folic, conţinutul
nucleoproteidelor scade în mod accentuat, iar situaţia se redresează prin administrare de acid
folic.
Acidul folic este un factor important pentru creşterea animalelor tinere şi pentru
microorganisme. Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului. Asigură
funcţionarea optimă a sistemului nervos. A manifestat efecte antiteratogene la animalele
tratate cu pirimetamină.
4. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAŢILOR LA OM
4.1. Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism
Cauzele ce duc la scăderea acidului folic în organism sunt multiple, implicând aportul
de acid folic, necesităţile metabolice crescute (sarcină, anemie cronică hemolitică, neoplasm),
malabsorbţia (sprue, medicamente-fenitoina, barbiturice, etanol) sau interferarea căilor
metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat, etanolul) şi altele.
Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent întâlnit decât deficitul de
vitamină B12. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte bătrânii cu aport alimentar
nediversificat (conserve, regimul “tea and toast”) şi ocazional adolescenţii- alcoolicii şi
toxicomanii. În cazul alcoolicilor sursa lor principală o constituie băuturile alcoolice, acestea
având conţinut de acid folic scăzut (berea, vinul) sau practic nul (băuturile distilate). În
alcoolismul cronic se cumulează aportul scăzut cu scăderea utilizării acidului folic.
Necesităţile metabolice crescute de folaţi apar atât în condiţii fiziologice (sarcină,
perioadele de creştere în copilărie şi adolescenţă) precum şi în condiţiile patologice de
Pagina 31 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
creştere a ratei de multiplicare a ţesuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinală, măduva
osoasă).
Astfel, în timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de câteva ori faţă
de normal, iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare faţă de primipare.
Pentru un organism sănătos şi o dietă raţională, echilibrată, necesităţile suplimentare nu
constituie un impediment. Anemia ce apare in timpul sarcinii este rezultatul unui consum
crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizanţi ca: alimentaţie deficitară, ignoranţa,
etc. Important de reţinut este că anemia poate fi anterioară sarcinii şi o agravează prin
necesităţile crescute; existând cazuri în care anemia din perioada iniţială a sarcinii se
datorează unor deficienţe alimentare sau menometroragiilor.
Cauza principală a deficienţei de folaţi în sarcină este reprezentată de creşterea
sintezei de ARN, ADN asociată cu dezvoltarea fătului, placentei şi uterului, precum şi cu
expansiunea masei eritrocitare a mamei. Pot interveni şi alţi factori precum: anorexia,
reducerea absorbţiei de folaţi şi creşterea necesarului favorizată de infecţiile urinare
frecvente. Gemelaritatea accentuează nevoile de acid folic, determinând creşterea de
aproximativ 5 ori a posibilităţii de apariţie a deficienţei de acid folic în ultimul trimestru al
sarcinii.
Lipsa acidului folic, necesar pentru sinteza ADN, determină tulburări de maturaţie şi
multiplicare celulară, cu repercursiuni asupra produsului de concepţie, mergând de la
malformaţii ale tubului neural, pâna la avort. Rolul acidului folic în etiologia defectului de
tub neural precum şi metodele de profilaxie ale acestor malformaţii prin suplimentarea dietei
femeii gravide sunt foarte importante.
În condiţii patologice, necesităţile de acid folic cresc cel mai frecvent datorită unei
eritropoeze foarte active (de ex. anemia hemolitică cronică). Malabsorbţia poate duce la un
deficit de acid folic în condiţiile unui aport de folaţi normal; ea are drept cauză afecţiuni ale
intestinului (sprue tropical, enteropatia glutenică etc.), alcoolismul cronic sau medicamente
ce acţionează probabil pe această cale (fenitoina, barbiturice).
Interferarea căilor metabolice ale acidului folic se datorează alcoolului, unor rare
deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). În
celulele în care aceşti inhibitori de DHFR se acumulează este împiedicată transformarea
deoxiuridinmonofosfat (dUMP) în deoxitimidinmonofosfat (dTMP) şi drept consecinţă are
loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat în lanţurile de ADN într-o proporţie ce va depăsi
cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc, excizează şi repară eroarea, rezultând astfel
false lanţuri de ADN ce explică eritropoeza megaloblastică.
Pagina 32 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
I aport inadecvat dieta neechilibrată(alcoolici, adolescenţi, copii în
creştere)
II necesităţi crescute 1.sarcina
2.copilărie
3.neoplasm
4.eritropoeză crescută(anemie hemolitică cronică)
5.boli cronice exfoliative ale pielii
6.hemodializă
III malabsorbtia 1.sprue tropical
2.enteropatie glutenică
3.medicamente:fenitoina, barbiturice
IV interferarea căilor
metabolice
1.inhibitori DHFR(Metotrexat)
2.etanol
3.rare deficite enzimatice (DHFR)
Cauzele deficitului de folati
4.2. Folaţii şi sarcina; profilaxia malformaţiilor fetale prin administrarea acidului folic
Datorită rolului fundamental al folaţilor în replicarea celulară, s-a stabilit pentru prima
oară în 1964, de către Hibbard că deficitul de folaţi, cunoscut deja ca fiind răspunzător de
hematopoeza anormală, ar putea induce modificări şi asupra produsului de concepţie şi a
placentei, putând (mai ales dacă apare la începutul gestaţiei) da avorturi spontane sau
malformaţii. În ultimul timp, interesul cercetătorilor a fost focalizat mai ales spre relaţia
deficit de acid folic –malformaţii ale tubului neural (prima asociere în acest sens a fost facută
de Hibbard, 1965, când 66% dintre mamele cu produs de concepţie afectat au avut
concentraţii crescute de acid forminoglutamic în urină). Un studiu prospectiv privind nivelul
folaţilor eritrocitari la gravide în primul trimestru de sarcină a arătat o incidenţă semnificativ
crescută a malformaţiilor la gravidele cu nivel al folaţilor eritrocitari redus (<130μg/ml).
Problema efectului protector al administrării preventive a acidului folic a fost obiectul
unui amplu program de cercetare administrat în Marea Britanie în 1983 şi finalizat în 1991
(MRC Vitamin Study Group 1991); astfel, una din patru femei având în antecedente o sarcină
Pagina 33 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
afectată din această cauză a primit 4 mg acid folic timp de minimum 12 săptămâni înaintea
concepţiei şi în timpul primelor 3 luni de sarcină. Riscul apariţiei malformaţiilor de tub neural
la produsul de concepţie a fost semnificativ mai mic la gravidele ce au primit acid folic faţă
de lotul martor.
Confirmarea efectului protector al suplimentării folaţilor în profilaxia recurenţei
malformaţiilor de tub neural susţine utilitatea administrării de folaţi la femeile ce aparţin unei
grupe de risc (din punct de vedere al apariţiei malformaţiilor neurale fetale) şi pune problema
extinderii administării profilactice a folaţilor la toate femeile gravide.
Un mare număr de femei gravide au un aport dietetic de folaţi sub valorile
recomandate (300μg de folaţi/zi), dar numai o mică parte din acestea vor avea un produs de
concepţie normal; oricum până în prezent este imposibilă determinarea certă a apartenenţei
gravidei la o grupă de risc crescut din acest punct de vedere, făcând foarte greu o profilaxie
ţintită.
Cele trei mari direcţii ale strategiei privind profilaxia deficitului de folaţi şi a
consecinţelor acestuia, sunt: educaţia generală privind dieta (cu o atenţie specială privind
grupurile cu cerinţe crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice, sindroame de
malabsorbţie, tulburări metabolice), suplimentare a alimentelor cu acid folic şi administrarea
suplimentară de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide în scurt timp.
Din punct de vedere al avizului privind dieta, se recomandă consumul crescut de
legume proaspete, spanac, fulgi de porumb, lapte (de exemplu o supă de spanac conţine
aproximativ 125 μg, o porţie de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 μg). Astfel, se
combate ipoteza că deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic
scăzut, accentul fiind pus pe alimentele populare şi nici foarte scumpe. Orientarea populaţiei
pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitară, atât în perioada
antenatală, cât şi în şcoli şi în rândurile adolescenţilor.
Suplimentarea artificială cu folaţi a alimentelor comerciale disponibile pune problema
libertăţii de opţiune şi a posibilelor reacţii adverse, precum neuropatia datorată unui exces de
acid folic la vârstnici. Alimentele alese trebuie să fie consumate cu precădere de către
populaţia ţintă, iar nivelul suplimentării trebuie să fie cel minim protector (pentru a evita
aportul excesiv de acid folic); cele mai frecvente alimente îmbogăţite în folaţi sunt pâinea
(există deja pâine suplimentată cu conţinut în folaţi 120μg/100 grame), iar fulgii de porumb
sunt fortificaţi la 250 μg/100g (75μg/porţie medie); aceste evaluări aparţin Expert Advisory
Group şi sunt valabile pentru produse alimentare in Marea Britanie.
Pagina 34 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Problema suplimentării acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru
marea masă a populaţiei, întrucât numărul restrâns al celor cu risc crescut va beneficia
probabil de consult şi tratament adecvat. Din nefericire, în general concepţia nu este
planificată şi numai un număr restrâns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal.
Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi) în
scop profilactic, dar grija unei supradozări a ridicat problema folosirii unor doze “fiziologice”
(0,5mg/zi) pentru profilaxia generală antenatală. Astfel, deşi nu se cunosc posibilele reacţii
adverse ale acidului folic asupra femeilor în perioada de fertilitate, se recomandă doze mici
pentru mamele cu risc mic şi doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu risc crescut. În orice caz,
suplimentarea trebuie începută cu trei luni înaintea concepţiei şi continuată primele 8-12
săptămâni de sarcină. Un efect protector, dar de intensitate mai mică, poate fi obţinut şi dacă
suplimentarea este începută mai tarziu, chiar la începutul gestaţiei.
În concluzie, dozele sugerate au fost stabilite empiric şi nu se ştie dacă efectul
protector al folaţilor împotriva apariţiei malformaţiilor este la fel de cert ca şi cel împotriva
recurenţei lor. Deşi nu s-au evidenţiat încă reacţiile adverse pentru doze mari, ele pot apărea
abia după mulţi ani, aşa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene ale vitaminei A
(1990). Strategia cea mai corectă ar consta în evitarea administrării dozelor farmacologice
dacă nu există o justificare clară.
Punerea la punct a unui protocol de “screening” prenatal privind femeile cu risc
crescut ar putea reorienta întreaga strategie profilactică şi poate fi obiectul unor cercetări
ulterioare la noi în ţară.
4.3. Acidul folic, ţinta terapiei anticanceroase
Terapia antineoplazică depăşeşte în vechime vârsta de 50 de ani. Dacă înainte de 1940
cuvântul cancer apărea în indexul tratatelor de farmacologie doar accidental, astăzi
chimioterapia reprezintă o piatră de temelie în terapia cancerului. Principalul progres al
ultimilor ani nu constă în lărgirea numărului de agenţi antineoplazici descoperiţi, ci în
dezvoltarea conceptuală a terapeuticii. Aceasta constă în: stabilirea unor regimuri terapeutice
mai eficace prin administrarea simultană a diverse medicamente, incluzând agenţi
antineoplazici şi stimulatori ai răspunsului biologic; înţelegerea mecanismelor de acţiune ale
medicamentelor, lucru care duce la prevenirea sau micşorarea efectelor toxice; aprofundarea
mecanismelor de rezistenţă la terapie; creşterea întrebuinţării terapiei adjuvante (prevenirea
recidivelor şi distrugerea micrometastazelor, după radioterapie şi/sau chirurgie) şi
Pagina 35 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
neoadjuvante (administrarea înainte de radioterapie sau chimioterapie sau chirurgie pentru
scăderea masei tumorale); lărgirea cunoştinţelor despre iniţierea tumorală, diseminarea,
implantarea şi creşterea metastazelor.
Antimetaboliţii sunt substanţe proiectate ca inhibitori competitivi ai reacţiilor
enzimatice ale metabolismului intermediar, sau cu analogi inactivi ai substraturilor reacţiilor
specifice. Majoritatea sunt specifici doar în timpul anumitor faze ale ciclului celular.
Antimetaboliţii nu sunt administraţi obişnuit ca medicatie unică, datorită specificităţii de fază
şi a faptului că afectează sinteza macromoleculară în puncte multiple.
Acidul folic reprezintă o ţintă atractivă pentru chimioterapia antitumorală, datorită
rolului său esenţial în sinteza precursorilor ADN. Formele reduse de acid folic
(tetrahidrofolaţi) sunt necesare pentru sinteza purinelor şi a timidilatului. N10-formil-FH4 şi
N5, N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonată la sinteza acidului inozinic,
precursorul adenilatului (AMP) şi guanilatului (GMP). Într-o altă cale metabolică importantă,
N5, N10-metilen-FH4 asigură o grupare metil şi doi atomi de hidrogen pentru sinteza
timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. Farber şi colab. au propus că analogii acidului folic
pot inhiba proliferarea celulelor maligne, o ipoteză care a fost confirmată de testele iniţiale,
cu aminopterină (acid 2,4 diamino 4 dezoxifolic), în 1948. Acest compus a fost înlocuit mai
târziu cu derivatul său N10 metilat, metotrexatul (MTX).
Antifolaţii ocupă un loc important în terapia antineoplazică; aceştia au produs prima
remisie temporară a leucemiei (Farber et al. 1948) şi prima vindecare a unei tumori solide,
coriocarcinomul (Hertz, 1963). Procentajul crescut de remisiuni complete ale
coriocarcinomului a impulsionat cercetarea în domeniul chimioterapiei. Interesul pentru
antifolaţi a crescut semnificativ după introducerea terapiei cu doze mari combinate cu
leucovorină (acid folinic, factor C), care scade efectul toxic al metotrexatului. Folosirea
dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori ca sarcomul osteogenic, tumori
ce nu răspund la doze mici. MTX este folosit şi în terapia psoriazisului, o boală non-
neoplazică caracterizată prin proliferare rapidă, anormală a celulelor epidermoide (McDonald
1981). În plus, antifolaţii sunt inhibitori puternici ai reactivităţii imune mediate celular, având
şi rol de agenţi imunosupresori ce se folosesc în transplantele de organe, în tratamentul
artritei reumatoide şi în granulomatoza Wegener (Jackson 1984, Chabner et al. 1985).
Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoaştere
clinică, ca medicament eficace, cu toxicitate acceptabilă. În ultimii 20 de ani au fost testaţi
clinic noi compuşi antifolaţi, cum ar fi diaminopirimidinele şi chinazolinele. Cel mai recent
dintre acestea este trimetrexatul, un antifolat chinazolinic lipofil, care ocoleşte obligativitatea
Pagina 36 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
din cazul folaţilor şi a metotrexatului de a folosi transportul activ. Trimetrexatul are activitate
puternic antiparazitară şi efecte antineoplazice, testate încă în ambele specialităţi. Un alt folat
din ce în ce mai interesant este 10-EDAM (10-etil-5-diazo-aminopterina), un inhibitor potent
al dihidrofolat reductazei, care posedă transport şi poliglutamare îmbunătăţite faţă de
metotrexat. Trimetrexatul şi 10-EDAM au demonstrat o activitate antitumorală în tratamentul
carcinoamelor de intestin, plămân.
MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS),
alături de toţi ceilalţi antimetaboliţi. În general, drogurile CCS s-au dovedit eficace împotriva
malignităţilor hematologice şi a altor tumori în care proliferează o proporţie relativ crescută
de celule.
O problemă majoră a chimioterapiei anticanceroase este rezistenţa la drog. Unele
tipuri tumorale, cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezintă o rezistenţă
primară, adica o lipsă de răspuns la prima expunere la drog. Rezistenţa dobândită se dezvoltă
în diferite tipuri de tumori iniţial sensibile la tratament. Experimental, se poate observa
apariţia unei rezistenţe specifice pentru un anumit drog, care apare datorită fenomenului de
amplificare genică. Alteori se observă un fenotip cu rezistenţă multiplă, după expunerea la un
singur agent. Acesta este frecvent asociat cu creşterea expresiei genei MDR 1 pentru o
glicoproteină membranară (glicoproteina-P), implicând efluxul medicamentului. Această
proteină transportoare, care apare atât în celule normale cât şi în celule tumorale, foloseşte
energia ATP pentru evacuarea multor molecule străine, nefiind limitată doar la agenţii
antineoplazici. Un alt mecanism de rezistenţă multiplă implică modificări calitative şi
cantitative în topoizomeraza II, enzima care repară leziunile produse în ADN de
medicamentele antineoplazice.
Principalele mecanisme de rezistenţă cunoscute sunt:
transportul deficitar al MTX în celule (Assaraf & Shimke 1987);
producţia de forme de DHFR alterată, care are afinitate scăzută pentru inhibitor (Thill
et colab. 1988);
creşterea concentraţiei intracelulare a DHFR;
scăderea abilităţii de a sintetiza poliglutamaţi de MTX;
scăderea activităţii timidilat-sintetazei (Curt 1985).
Pagina 37 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Pagina 38 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor
4.4. Mecanisme de acţiune şi rezistenţă
Activitatea antitumorală a analogilor de folaţi este rezultatul substituţiei unei grupări
amino cu una hidroxil în poziţia 4 a inelului pteridinic, schimbare care transformă molecula
de folat din substrat, într-un inhibitor ce se leagă strâns de enzima cheie a metabolismului
folic intracelular, dihidrofolatreductaza (DHFR).
Pentru a întelege acţiunea metotrexatului şi a altor antifolaţi, este necesar să se
determine rolul determinant al DHFR în metabolismul folaţilor. Derivaţii acidului folic sunt
coenzime active doar în forma complet redusă de tetrahidrofolaţi. În reacţia timidilat
sintetazei (TS), acidul N5, N10 metilen FH4 este convertit la DHF. Acest cofactor inactiv
devine apoi substrat pentru DHFR, care transferă doi atomi de hidrogen de la cofactorul
NADPH la DHF pentru a forma FH4. În celulele cu ritm crescut a sintezei de timidilat,
inhibiţia DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de cofactori folat în formă
inactivă, de DHF, ceea ce are ca rezultat inhibiţia sintezei purinelor şi timidilatului.
Astfel, citotoxicitatea MTX-ului este determinată de perturbarea sintezei de novo a
purinelor şi a sintezei timidilatului, iar importanţa relativă a fiecărui efect variază la diferitele
tipuri de celule cultivate in vitro şi, probabil, la celulele normale şi maligne in vivo.
Borsa şi Whitmore au demonstrat că citotoxicitatea MTX-ului faţă de limfocite de
şoarece poate fi crescută prin administrarea de purine, probabil datorită creşterii efectului
antitimidilat al MTX. Totuşi, în modelele de limfom L5178, MTX a avut un efect antipurinic
letal. În general, întreruperea sintezei de novo a purinelor apare în prezenţa unor nivele
crescute de timidilat sintază şi se produce prin consumarea rezervelor de folaţi reduşi
necesare sintezei acestora. Deoarece legarea strânsă de DHFR şi depleţia consecutivă a
folaţilor reduşi sunt esenţiale pentru mecanismul de acţiune a MTX, activitatea timidilat
sintazei modulează citotoxicitatea MTX. Inhibiţia timidilat sintazei (prin administrarea F-
pirimidinelor şi reducerea rezervelor de dUMP) scade turnover-ul folaţilor reduşi şi reduce
citotoxicitatea MTX. Importanţa activităţii timidilat sintazei în determinarea citotoxicităţii
MTX a fost confirmată recent de Tattetersall şi colaboratorii, care au investigat capacitatea
timidinei de a proteja culturi de celule mamare împotriva unei doze letale de MTX. Când a
fost administrată cu două ore înaintea MTX, timidina a protejat ambele linii celulare, normale
şi maligne. Măsurarea rezervelor intracelulare de nucleotide a demonstrat că timidina
realizează o depleţie a rezervei de dUMP (prin inhibiţia cu TTP a dCMP deaminazei) şi
Pagina 39 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
încetineşte reacţia timidilat sintazei, conservând astfel folaţii reduşi şi păstrând sinteza de
novo a purinelor. MTX-ul poliglutamat are un efect inhibitor puternic şi direct asupra
timidilat sintazei şi a enzimelor sintezei purinelor; prin aceste efecte inhibitorii pot contribui
direct la citotoxicitatea drogului.
Evenimentele care conduc la acţiunea citotoxică a MTX, începând cu transformarea
membranelor celulare, transformarea în derivaţi poliglutamaţi, legarea de DHFR, deleţia
folaţilor reduşi intracelulari şi inhibiţia sintezei ADN constituie paşi importanţi în
determinarea răspunsului la tratament şi a toxicităţii acestui medicament.
4.5.Transportul transmembranar
Traversarea de către antifolaţi a membranelor celulare a fost studiată cu multă atenţie
datorită legăturii dintre anomaliile de transport şi rezistenţă. Studiile clasice ale lui Goldman
şi colab. au stabilit că MTX intră în celule pe baza unui proces activ sensibil la temperatură,
dependent probabil de o proteină transmembranară. Influxul poate fi observat şi în vezicule
membranare izolate.
Aportul celular de folaţi se produce prin cel puţin două mecanisme independente:
folaţii reduşi sunt internalizaţi printr-un sistem “carrier” (RFC-reduced folate carrier) cu
afinitate redusă (Km=1-5μM) prin transport anionic, întâlnit în majoritatea celulelor, iar
acidul folic şi 5-metil-FH4 intră în celulă în complex cu o proteină membranară care leagă
folatul (FBP folate binding protein). FBP leagă folaţii cu afinitate crescută (Kd de ordinul
nM) şi apoi îi eliberează în citoplasmă printr-un proces de endocitoză mediată de receptori.
Se pare că FBP acţionează la concentraţii scăzute de folaţi (<50 nM) iar carrierul la
concentraţii normale sau crescute.
Macromoleculele care leagă folaţii au fost izolate din membranele unor celule de
mamifere, dar nu li s-a dovedit vreun rol în transport. Mecanismul transportor al MTX în
celulele leucemice murinice şi umane este deasemenea utilizat de folaţii reduşi naturali,
incluzând agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). MTX şi folaţii reduşi concurează,
deci, pentru a intra în celulă. În plus, printr-un proces cunoscut sub numele de heteroschimb,
MTX intracelular liber este forţat să iasă din celule atunci când intră în celule cantităţi
crescute FH4 extracelular.
Gena RFC e localizată distal, pe braţul lung al cromozomului 21. Afinitatea “carrier”-
ului pentru MTX se situează între 1μM-6μM pentru diverse linii de celule tumorale (murine
Pagina 40 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
şi umane), în timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este oarecum mai scăzută
Km=87 μM. Acestă afinitate mai mare a carrier-ului celulelor tumorale este considerată ca
fiind explicaţia persistenţei mai îndelungate a MTX liber intracelular şi poate contribui la
selectivitatea acţiunii antifolaţilor împotriva tumorilor, faţă de celulele normale. Acumularea
MTX în celulele tumorale poate fi influenţată de alţi agenţi antitumorali, incluzând
medicamente frecvent utilizate ca antifolaţi în terapiile combinate. Vincristina creşte MTX
intracelular, inhibând efectul medicamentului. Concentraţia vincristinei necesară pentru a
produce acest efect (10μM) nu este uşor obţinută în timpul chimioterapiei clinice, care
produce frecvent niveluri sanguine maxime ale vincristinei mai mici de 0,1μM. Influxul
MTX este inhibat de ouabaină, glucocorticoizi şi cefalotin, în timp ce acumularea este
crescută de probenecid, prin inhibarea efluxului. Nici una dintre aceste interacţii nu a dovedit
că afectează chimio terapia clinică.
Faza proliferativă sau cinetică a celulelor influenţează puternic procesul de transport.
Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o viteză de preluare a MTX de 3 ori mai
mare şi o viteză de eflux a drogului cu 50% mai mică decât o au celulele în faza staţionară de
creştere. Aceste modificări cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori. Dependenţa
transportului de ritmul de creştere poate contribui la creşterea citotoxicităţii MTX pentru
celulele care se divid rapid, dar şi mărirea necesarului de folaţi reduşi în fazele de creştere
rapidă pentru a contribui la aceasta. În continuare la procesul de transport activ cu afinitate
crescută, descris mai sus, un al doilea mecanism de intrare apare la concentraţii crescute ale
drogului (peste 20μM). Acest al doilea proces poate fi difuzie pasivă, sau un proces realizat
pentru un “carrier” specific. Alte aspecte ale acestui proces de transport sunt lipsa competiţiei
dintre MTX şi FH4 pentru intrare, precum şi absenţa heteroschimbului dintre MTX si FH4.
Mecanismul de intrare explică abilitatea celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la
concentraţii extracelulare crescute şi reprezintă o motivaţie raţională a utilizării dozelor
crescute de MTX în chimioterapie. Un studiu recent a lui Henderson şi Zeveny a evidenţiat
doar o singură cale de influx cu afinitate crescută pentru concentraţii de până la 50μM, dar
trei sisteme de eflux pentru MTX. Cel mai important dintre acestea pare să fie acelaşi care
mediază şi influxul de MTX. A doua cale a fost caracterizată prin sensibilitatea la
bromosulfonftaleină, în timp ce a treia a fost insensibilă la această substanţă şi la inhibitori
competitivi ai MTX. Contribuţia acestor componente la eflux poate fi modificată în funcţie de
prezenţa extracelulară a anionilor glucozei, sau a inhibitorilor metabolici. Acumularea şi
persistenţa drogului în tumori faţă de ţesutul normal determină în mod clar durata sa de
acţiune în teritorii specifice. Au fost observate nivele maxime intracelulare mai mari şi o
Pagina 41 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
persistenţă mai îndelungată a drogului în celulele leucemice ale murinelor, sensibile la MTX,
faţă de epiteliul intestinal, în timp ce linia celulară sarcomatoasă 180 rezistentă, a acumulat
concentraţii mai scăzute de drog, a avut perioade mai scurte ale inhibiţiei sintezei ADN şi a
fost neafectată în experimentele chimioterapice. Analiza specifică in vitro a ratelor de
preluare a medicamentului de către celulele leucemice a evidenţiat o relaţie pozitivă similară
între răspunsul la medicament şi transport.
Există diferenţe semnificative ale caracteristicelor de transport între diverşi antifolaţi.
Antifolaţii chinazolinici au o rată de eflux mai crescută. Aceste diferenţe se corelează cu
acumularea intracelulară mai mare a chinazolinelor şi aminopterinei faţă de MTX, după doze
echimolare în vivo. Importanţa transportului MTX în determinarea răspunsului clinic este
nesigură. Alte mecanisme de rezistenţă, în special creşterea concentraţiei de DHFR ca urmare
a amplificaţiei genice, au fost observate în tumori umane şi murinice expuse la creşteri
treptate ale concentraţiei drogului in vitro care poate fi un mecanism la fel de important şi în
practica clinică. Înţelegerea rezistenţei la antifolaţi la nivel clinic rămâne incompletă. Au fost
propuse noi investigaţii, cu scopul de a ocoli rezistenţa cauzată de deficienţa de transport.
Antifolaţii liposolubili, cum sunt esterii de MTX, diaminopirimidinele, triazinaţii şi
trimetrexatul au o excelentă activitate antitumorală în culturile de celule în tratamentul
experimental al tumorilor la rozătoare şi ar trebui să penetreze celulele deficiente în transport.
Dibutilester-MTX are deasemenea proprietatea neobişnuită de a inhiba încorporarea timidinei
în ADN, aparent datorită inhibiţiei transportului nucleozidelor. Diesterii MTX sunt rapid
hidrolizaţi la compusul de bază în plasma de şoarece, dar sunt mai stabili în plasma maimuţei,
câinelui şi omului; când sunt inhibate în aceste plasme dibutilesterii sunt convertiţi la derivaţi
α şi γ monobutilici, fiind inhibitori stabili şi eficace ai DHFR. Proprietăţile de transport ale
monobutilesterilor nu au fost încă definite. Conjugaţii de MTX şi polilizină, care sunt toxici
pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient, oferă şi posibilitatea de a
ocoli rezistenţa la transport. Deoarece conjugatul polilizin-MTX nu inhibă direct DHFR şi
toxicitatea sa poate fi anulată prin administrarea simultană de leucovorină, este probabil că şi
compusul suportă liza intracelulară, cu eliberarea antifolatului.
Shen şi colab. au postulat că conjugatul intră în celulă prin pinocitoză şi prin liza
enzimatică ce apare în lizozomi. Astfel, conjugatul polilizină-MTX este transportat printr-un
sistem “carrier” independent. Tiamin pirofosfatul, care inhibă transportul MTX, protejează
fibroblaştii de şoarece de toxicitatea MTX, dar nu de aceea a polilizin-MTX. Deşi acidul folic
este capabil să salveze celulele hepatom Reuber H35 de citotoxicitatea MTX, este incapabil
Pagina 42 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
să salveze o murină rezistentă la transport de efectele polilizin-MTX, probabil deoarece, ca şi
MTX, acidul folic este incapabil să intre în celulele rezistente la transport.
O altă încercare de a depăşi rezistenţa la transport este încapsularea MTX în vezicule
fosfolipidice bistrat, numite lizozomi. Aceste plachete microscopice ce conţin medicament
pot, teoretic, transporta MTX la suprafaţa celulară, unde intrarea poate fi făcută prin
pinocitoză, sau prin contopirea membranelor celulare şi lipozomice. Lasserman şi colab. au
reuşit să îndrepte lipozomi cu purtători de haptene, conţinând MTX, spre celulele
mielomatoase murinice care exprimau pe suprafaţa lor imunoglobuline cu afinitate pentru
haptene. Deşi lipozomii localizau celule ţintă mielomatoase cu acurateţe nu a fost observată
nici o inhibiţie a încorporării deoxiuridinei, deoarece conţinutul veziculelor nu a putut intra în
celulă. Deşi rezultate încurajatoare cu lipozomi încărcaţi cu MTX au fost raportate pe modele
animale, majoritatea dovezilor sugerează că îmbunătăţirea supravieţuirii provine de la
întârzierea nespecifică a clearence- lui plasmatic şi nu din transportul selectiv al
medicamentului la tumora. O excepţie posibilă a acestei concluzii este tehnica de încapsulare
a MTX in lipozomi termolabili. Dacă tumora este apoi incălzită, eliberarea preferenţială a
MTX apare la sediul tumorii, ducând la o activitate terapeutică îmbunătăţită.
MTX – γ - aspartat
Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legături γ - peptidice
Un alt experiment a fost folosit de Heath şi colab., folosind MTX-γ aspartat, conţinut
în lipozomi înveliţi în anticorpii specifici antitumorali. Acest analog de MTX are capacitate
limitată de a traversa membrana celulară şi este de 200 de ori mai puţin toxic decât MTX,
datorită transportului deficitar. Citotoxicitatea a apărut doar prrin eliberarea intracelulară a
Pagina 43 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
drogului via lipozomi îmbrăcaţi cu anticorpi specifici pentru fibroblaşti murinici L 929. În
mod ideal, va fi nevoie de identificarea unor antigene tumorale umane comune în scopul de a
face acest experiment util din punct de vedere clinic.
4.6. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază
Caracteristicile fizice ale legării NADPH şi a MTX de DHFR au fost stabilite prin
studii cristalografice cu raze X şi prin determinarea secvenţelor de aminoacizi ale enzimelor
naturale şi ale celor modificate chimic. Au fost studiate enzime bacteriene şi de la mamifere;
secvenţele de aminoacizi posedând similitudini puternice în poziţiile implicate în legarea
cofactorilor sau a inhibitorilor. În general, MTX este legat printr-o porţiune lungă, hidrofobă,
formată din izoleucina-7 (sau leucina-7), alanina-9, leucina-31, fenilalanina-34 şi alte
reziduuri. Două interacţii mai importante participă la potenţarea legării 4-amino-antifolaţilor:
oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizează o legătură de hidrogen cu gruparea 4-
aminei ;
gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30) protonează atomul N al
MTX, dar nu şi pe cel al substratului fiziologic (FH4). În plus, substratul fiziologic pare să se
lege de enzimă într-o configuraţie răsturnată, în comparaţie cu inhibitorul.
În prezenţa NADPH-ului în exces, afinitatea de legare a MTX de reductază a fost
estimată între 1nM şi 1pM. Această afinitate este crescută de pH-ul acid, potenţată de ionii de
K+ şi oxidarea grupărilor sulfhidril ale enzimei. În condiţiile unui pH scăzut, a excesului de
NADPH şi a unei afinităţi scăzute a inhibitorului faţă de enzimă, legarea este
stoechiometrică, ceea ce inseamnă că fiecare moleculă de MTX va lega o moleculă de
enzimă. Complexul enzimă-NADPH-inhibitor este extrem de stabil, supravieţuind
electroforezei în gel şi filtrării în gel.
NADH are deasemenea capacitatea de a acţiona ca şi cosubstrat pentru DHFR în locul
NADPH, pentru reducerea folatului şi a dihidrofolatului. Spre deosebire de NADPH, NADH
nu asigură legarea MTX de DHFR. Importanţa raportului dintre NADH şi NADPH în
determinarea răspunsului la MTX rămâne să fie stabilită.
Legarea MTX la reductaza izolată de la Streptococcus faecium generează lent un
complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. Procesul a fost denumit inhibiţie strâns legată şi
lentă. Alţi analogi de folaţi, incluzând diaminopirimidinele, trimetroprimul şi aminopterina
urmează acelaşi proces cinetic, de “legare strânsă şi lentă”, în timp ce pteridinele ce nu au
Pagina 44 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
gruparea acid amino benzoic se comportă ca inhibitorii competitivi clasici ai enzimei.
Cinetica a fost evaluată folosind şi modele de simulare .
În terapeutică, MTX acţionează ca un inhibitor cu legare strânsă, dar reversibil. În
condiţiile unor concentraţii crescute de substrat competitiv şi la un pH normal, este necesar
un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiţii complete a enzimei. În
culturile de celule şi în sisteme acelulare, 3H-MTX (MTX marcat cu 3H) legat de enzimă
poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog, fenomen ce indică o
disociere lentă, dar stabilă a MTX de pe enzimă. Acestă disociere lentă este considerabil mai
rapidă decât cea calculată în experimente cu enzimă pură în prezenţa unui exces de NADPH.
Motivul acestei diferenţe este încă neclar, dar poate fi rezultatul diferenţelor din mediul ionic,
de legare prin complexe cu afinitate scăzută a drogului cu DHFR şi NADP+, sau doar cu
enzima. Deci este necesar un exces de drog liber, nelegat, pentru a menţine inhibiţia totală a
DHFR şi a sista sinteza timidilatului. De exemplu, dacă se incubează celule tumorale cu
cantităţi crescute de MTX pentru a permite titrarea totală a enzimei şi apoi se scoate drogul
nelegat din soluţie, sinteza timidilatului va reîncepe imediat în ciuda persistenţei MTX
intracelular legat de enzimă.
5. REZULTATE EXPERIMENTALE
În studiul prezent am folosit o metodă spectrofotometrică pentru a determina
concentraţia de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat, rinichi, creier,
splină) la şobolanii albi; acest studiu a fost
realizat în scopul aflării variaţiei concentraţiei de acid folic în funcţie de:
vârstă;
organ.
Pentru curba de etalonare am folosit:
metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare;
reactivul naftiletilendiamină pentru determinarea acidului folic.
Concentraţiile acidului folic în funcţie de vârstă şi de organ le-am estimat prin metoda
descrisă de Lowry (Lowry, 1951), cu ajutorul acidului fosfomolibdenowolframic.
Determinarea concentraţiei de acid folic la şobolani
Pagina 45 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
5.1. Material şi metodă
Animale şi dietă
Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de şobolani albi, de sex masculin, fiecare grup
constând în cinci şobolani de vârstă şi greutăţi apropiate, astfel:
1)-primul grup: şobolani tineri, cu vârsta mai mică de şase luni şi greutate mai mică
de 50 de grame;
2)-al doilea grup: şobolani adulţi, cu vârste cuprinse între şase luni şi un an şi greutate
cuprinsă între 100 grame şi 125 grame;
3)-al treilea grup: şobolani bătrâni, cu vârste în jur de un an sau chiar mai mult şi
greutate mai mare de 125 grame.
Toţi şobolanii au fost supuşi la aceeaşi dietă.
Prepararea omogenatelor tisulare
Toate operaţiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigaţii biochimice
se fac la 0-4˚ C. Sticlăria de lucru, eprubetele şi cupele de centrifugă, soluţiile de spălare şi
mediile de omogenizare au fost păstrate la gheaţă şi au fost reci în momentul întrebuinţării.
Animalele de laborator au fost decapitate şi apoi supuse exsanguinării.
S-au izolat organele necesare experimentului: ficat, rinichi, creier şi splină, iar apoi s-
au presat uşor pe hârtie de filtru, pentru a îndepărta sângele. S-au cântărit foarte repede.
Fiecare organ a fost spălat de câteva ori (într-un pahar Berzelius menţinut în gheaţă)
cu soluţie rece de NaCl 0,15M până ce lichidul de spălare a rămas limpede.
Apoi, cu o foarfecă s-a mărunţit bine organul şi s-a spălat cu NaCl 0,15M, pâna ce
soluţia de spălare a rămas limpede.
Pentru omogenizare 5 ml de soluţie de NaCl 0,15M au fost adăugaţi pe gramul de
ţesut (cu scopul de a obţine un omogenat de concentraţie 10%).
Ţesuturile uşor poterabile (ficat şi creier) au fost omogenizate la 1500rpm, timp de 2
minute, într-un omogenizator de sticlă tip Potter-Elvehjem. Ţesuturile mai dure (rinichi şi
splină) au necesitat o omogenizare cu o durată mai crescută.
Omogenatele obţinute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (după o prealabilă
echilibrare). Sunt sedimentaţi:
-nucleii;
-celulele întregi;
-debriurile celulare;
-hematiile.
Pagina 46 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Supernatantul se decantează şi se păstreaza în gheaţă pentru alte determinări
biochimice.
Pentru a putea compara şi interpreta rezultatele determinărilor biochimice pe
omogenate, materialul biologic s-a standardizat în două moduri:
-prin raportare la greutatea produsului la începutul determinării (standard de
preparare);
-prin raportare la conţinutul proteic al omogenatului.
Standard de preparare
Iniţial organul sau fragmentul de organ se cântăreşte. În funcţie de greutatea sa se
realizează omogenate de 10-20%, diverse soluţii de omogenizare.
Standardizarea se obţine preparând totdeauna omogenate de aceeaşi concentraţie.
Raportarea la conţinutul proteic
Este metoda de standardizare cea mai utilizată.
Metoda de determinare a proteinelor celulare folosită pentru standardizare
(metoda biuretului)
-sensibilitate de 0,25-10mg/ml omogenat
Principiu:
Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastră caracteristică,
a cărei intesitate este direct proportională cu concentraţia proteinelor din probă.
Reactivi:
1.reactivul biuret;
2.NaOH 10%.
Reactivul biuret se prepară astfel:
-tartrat de sodiu şi potasiu –9g;
-CuSO4·5H2O –3g;
-KI-5g;
Se dizolvă şi se aduce la 1000ml cu NaOH 0,2N.
Pagina 47 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Reactivul preparat corect este de culoare albastră. Se păstrează timp nelimitat. Dacă
reactivul este contaminat cu alte substanţe apare un precipitat roşcat şi nu se mai foloseşte.
Tehnica
Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluţii limpezi, ele prezintă o anumită
turbiditate, dând cu reactivul biuret un efect secundar ce interferă cu reacţia de culoare. Se
face pentru fiecare determinare şi un martor de turbiditate.
Martor de culoare Martor de turbiditate Proba
2 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată
0,2 ml omogenat 0,2 ml omogenat
1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10%
3 ml reactiv biuret 3 ml apa distilată 3 ml reactiv biuret
Se agită bine. Se lasă în repaus 30 de minute la temperatura camerei, după care se
citeşte extincţia la lungimea de undă de 540 nm, cu grosimea stratului de 10 nm.
Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare , iar extincţia martorului
de turbiditate faţă de cea a apei distilate.
Calculul cantităţii de proteine se face prin raportarea valorii corespunzătoare
diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.
Curba etalon
-se prepară o soluţie standard de albumină serică de bou;
-se pregăteşte o scară de diluţii de concentraţii cunoscute cuprinse între 0,25-60
mg/ml ;
-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior ;
-se reprezintă grafic modul de variaţie a extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei
de proteine
Pagina 48 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Concentraţie (mg/ml) Extincţie (p/c-t/H2O)*
60 0,617
30 0,320
15 0,166
7,5 0,090
3,75 0,042
1,875 0,024
0,9375 0,012
0,46875 0,006
0,234375 0,003
*)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de
turbiditate faţă de cea a apei distilate
5.2.Determinarea conţinutului în acid folic
Reactivi
-fosfat dibazic de potasiu soluţie 3%;
-permanganat de sodiu 0,4%;
-azotit de sodiu soluţie 2%;
-acid clorhidric soluţie 5N;
-acid sulfamic soluţie 5%;
-diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluţie 0,1%.
Tehnica
Proba Martor de turbiditate Martor de culoare
2,5 ml omogenat 2,5 ml omogenat 2,5 ml KmnO4
0,5 ml KMnO4 0,5 ml apă 0,5 ml KMnO4
Se lasă 2-3 minute
Pagina 49 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2
0,5 ml HCl 0,5 ml HCl 0,5 ml HCls
Se agită puternic şi se lasă 2 minute
O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic
Se agită puternic până la îndepărtarea NO2
0,5 ml NED 0,5 ml NED 0,5 ml NED
Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare şi a martorului de
turbiditate faţă de cea a apei distilate după 10 minute la lungimea de undă 530 nm în cuvă de
10 mm.
Calculul cantităţii de acid folic se face prin raportarea valorii corespunzătoare
diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.
Curba etalon:
-se prepară o soluţie standard de acid folic;
-se pregăteşte o scară de diluţii cu concentraţii cunoscute cuprinse între 1,2023-130
μg/ml;
-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior;
-se reprezintă grafic modul de variaţie al extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei
de acid folic.
Concentraţie
μg/ml
Extincţie
p/t*
Extincţie
p/c –t/H2O
130 1,226 1,2648
108,33 1,0508 1,0728
86,66 0,8756 0,8555
65 0,6198 0,565
43,33 0,3585 0,2905
21,66 0,2758 0,1766
10,83 0,1555 0,0718
7,22 0,1394 0,0431
3,61 0,1180 0,0303
Pagina 50 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
*)extincţia probei faţă de cea a martorului de turbiditate
**)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de
turbiditate faţă de a apei distilate.
Măsurarea cantităţilor de acid folic din omogenatele tisulare
Concentraţiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen
diamina), o metodă de bază, spectrofotometrică. Această metodă se foloseşte ca tehnică de
dozare în industria farmaceutică (Atanasiu şi colab., 1989)
Reactivi
-_monofosfat de potasiu –3%;
permanganat de potasiu –0,4% ;
NaNO2 -2%
acid hidrocloric – 5%;
acid sulfamic –5%
NED-0,1%
Tehnica
Proba Martor de culoare
2,5 ml omogenat 2,5 ml K2HPO4
0,5 ml KMnO4 0,5 ml KMnO4
Se lasă 2-3 minute
0±,5 ml HCl 0,5 ml HCl
0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2
Pagina 51 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Se agită şi se lasă 2 min
0,5 ml acid sulfamic 0,5 ml acid sulfamic
Se agită până când N2 este complet înlăturat
0,5 ml NED 0,5 ml NED
Se lasă 10 minute
Se citeşte extincţia faţă de martorul de culoare la lungimea de undă de 530 de nm;
concentraţia de acid folic corespunzătoare acestei extincţii s-a calculat prin raportarea la
curba standard (prin metoda expusă anterior).
Rezultatele obţinute s-au exprimat atât în funcţie de greutatea iniţială a organului (μg
de acid folic/g de ţesut), cât şi în funcţie de concentraţia de proteine din omogenat (μg de acid
folic/mg de proteine).
Măsurarea concentraţiei de proteine din omogenat
Concentraţia de proteine a fost calculată prin metoda descrisă de Lowry (Lowry,
1951), metodă bazată pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul “Folin-Ciocalteu”).
Reactivi
Reactivul A: - 4g NaOH;
-10g sare Seignette;
-apă distilată până la 1000ml;
Reactivul B: -5g CuSO4·5 H2O;
-apă distilată până la 1000 ml;
Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0,5 ml reactiv B;
Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic.
Pagina 52 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Tehnica
Peste 20 μl de omogenat se adaugă 180 μl de apă distilată, iar apoi se adaugă 5ml
reactiv C şi 0,5ml reactiv Folin-Ciocâlteu; întregul amestec a fost agitat şi după aceea lăsat
timp de 30 de minute. Extincţia s-a citit la o lungime de undă de 660 nm, faţă de un martor ce
conţinea 20μl de apă distilată în loc de 20μl de omogenat. Rezultatele au fost deasemenea
raportate la o curbă etalon, curbă construită pe baza unor concentraţii proteice cunoscute (prin
metoda descrisă anterior).
Pagina 53 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Pagina 54 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
5.3.Rezultate şi discuţii
Variaţia concentraţiei de acid folic: în funcţie de vârstă şi organ
Acid folic
Concentraţie
(valoare ±eroare)
Proteine
Concentraţie
(valoare±eroare)
Organ Grupa de
vârstă
μg de acid folic/g
de ţesut
μg de acid
folic/mg de
proteine
mg de proteină/ml
omogenat
Ficat
tânăr 431,48±4,76 25,74±1,76 2,80±0,99
adult 322,07±3,36 30,12±1,12 2,71±0,43
bătrân 195,52±2,83 18,54±2,55 2,11±0,33
Rinichi
tânăr 333,13±8,08 27,93±6,54 2,13±0,41
adult 208,57±4,54 20,37±3,88 1,25±0,13
bătrân 227,31±2,03 46,73±9,07 1,13±0,13
Pagina 55 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Creier
tânăr 336,36±9,23 29,04±1,43 2,06±0,72
adult 110,48±3,17 27,81±2,87 1,61±0,33
bătrân 27,08±2,31 7,44±2,77 1,23±0,27
Splină
tânăr 120,73±1,68 20,03±3,88 1,07±0,04
adult 109,03±9,74 17,08±2,53 1,13±0,17
bătrân 91,53±3,83 6,41±1,74 1,25±0,28
Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/g de ţesut
Pagina 56 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Variaţia
concentaţiei de acid folic pe
grupe de vârstă exprimată
în μgAF/mg prot.
Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in μg AF/g de tesut
Variaţia concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă
Din studiul grafic al variaţiei concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă (exprimată
în μg de AF/g de ţesut) s-a observat o scădere gradată de la tineri spre adulţi şi spre bătrâni,
cu excepţia concentraţiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. În acest caz particular
concentraţia de acid folic scade de la tineri la adulţi, ca apoi să crească paradoxal la şobolanii
bătrâni.
Sunt două posibile explicaţii prentru aceste variaţii neaşteptate.
prezenţa unei concentraţii crescute de folaţi în omogenatul de rinichi la tineri;
Pagina 57 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
prezenţa unei concentraţii scăzute de proteine în acest omogenat.
Dintre aceste două ipoteze ultima este mai plauzibila. Această ipoteză
s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentraţiilor proteinelor din
omogenatul de rinichi de la tineri şi de la adulţi.
În ceea ce priveşte concentraţiile de acid folic din creier nu are valoare faptul că s-a
obţinut o scădere a concentraţiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mărime) de la
tineri spre adulţi.
Variaţiile concentraţiilor de acid folic în funcţie de organ:
Din toate tipurile de reprezentări grafice, pe grupe de vârstă, rezultă faptul că
indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (μg acid folic/g de ţesut sau μg acid
folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folaţi s-a obţinut în omogenatul de ficat;
aceste rezultate sunt în concordanţă cu studiile histologice făcute anterior (Onicescu şi colab.,
1979) şi cu nivelul activităţii metabolice din ficat (implicând metabolismul hepatic a unei
singure unităţi carbonice).
S – au obţinut cantităţi mult mai mari de acid folic în ficat şi rinichi, faţă de valorile
corespunzătoare din splină şi creier.
Pagina 58 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Variaţiile concetraţiilor de acid folic în funcţie de organ (exprimate în μg AF/mg de
proteine)
Concluzii
În acest studiu s-a dovedit o incidenţă crescută a deficitului de acid folic la bătrâni,
deficit cauzat în principal de malnutriţie. Este necesară o evaluare ulterioară pentru a
demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic în diferite sindroame clinice la bătrâni
(ca de exemplu deficite imunologice şi neuropsihiatrice). Tabloul clinic nespecific al
malnutriţiei la bătrâni (care este adesea greşit diagnosticată) însoţit de deficienţă de folaţi
induc homocisteinemia şi se asociază cu un risc crescut cardiovascular. Aceste observaţii sunt
argumente în favoarea următoarelor concluzii:
stării nutriţionale a bătrânilor trebuie să i se acorde o mai mare importanţă decât unui
diagnostic de rutină
soluţia este suplimentarea de acid folic la bătrâni (măcar la pacienţii cu risc de a
dezvolta o deficienţă de acid folic, la pacienţi instituţionalizaţi la geriatrie, la pacienţii ce
consumă mâncare conservată etc.); această soluţie este atât sigură cât şi ieftină (singura
reacţie adversă a fost observată la epileptici).
Pagina 59 din 59
Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Pagina 60 din 59