Download - Microinmultire
-
8/10/2019 Microinmultire
1/135
- 1 -
Lector univ. dr. ADRIAN-GEORGE PETICIL
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
-
8/10/2019 Microinmultire
2/135
- 2 -
CUPRINS
INTRODUCERE 5
UNITATEA DE NVARENR. 1: ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE
I ESUTURI VEGETALE6
1.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 1 61.2 nceputurile culturilor de celule 7
1.3 Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro 13
1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitron ara noastr 16
1.5 Comentarii i rspunsuri la teste 18
1.6Lucrare de verificare nr.1 22
1.7 Bibliografie minimal 22
UNITATEA DE NVARE NR. 2: BAZELE TEORETICE ALE
MICROPROPAGRII I N VITRO23
2.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 2 23
2.2 Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro 24
2.3 Comentarii i rspunsuri la teste 33
2.4 Lucrare de verificare nr.2 36
2.5 Bibliografie minimal 36
UNITATEA DE NVARE NR. 3:LABORATORUL DE CULTURI IN VI TRO 37
3.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 3 37
3.2 Alctuirea laboratorului de micropropagare 38
3.3 Dotrile laboratorului 45
3.4 Comentarii i rspunsuri la teste 50
3.5 Lucrare de verificare nr.3 51
3.6 Bibliografie minimal 51
UNITATEA DE NVARE NR. 4:ASEPSIA N CULTURILE VEGETALE INVITRO
52
4.1 Obiectivele unitii denvare nr. 4 52
4.2 Msuri generale de igien i asepsie 53
4.3 Asepsizarea ncperilor, a instrumentarului i a celorlalte obiecte de laborator 54
4.4 Asepsizarea vaselor de cultur 55
4.5 Asepsizarea mediilor de cultur, apei i a altor substane 55
4.6 Asepsizarea materialului vegetal 56
-
8/10/2019 Microinmultire
3/135
- 3 -
4.7 Verificarea asepsizarii 57
4.8 Comentarii i rspunsuri la teste 59
4.9 Lucrare de verificare nr.4 61
4.10 Bibliografie minimal 61
UNITATEA DE NVARE NR. 5: MEDIILE DE CULTUR 625.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 5 62
5.2 Generaliti 63
5.3 Compoziia mediului de cultur 64
5.4 Compuii anorganici i organici 65
5.5 Compuii fenolici, compuii antivirali i extractele vegetale 74
5.6 Prepararea mediilor de cultur i pH-ul 75
5.7 Problemele i infeciile care apar n mediile de cultur 785.8 Comentarii i rspunsuri la teste 82
5.9 Lucrare de verificare nr. 5 84
5.10 Bibliografie minimal 84
UNITATEA DE NVARE NR. 6: FAZELE PROPAGRII IN VI TRO 85
6.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 6 85
6.2 Etapa 0 / Pregtirea materialului vegetal n vederea prelevrii explantului 86
6.3Etapa 1/ Iniierea i stabilizarea culturii
90
6.4 Etapa 2/ Multiplicarea 92
6.5 Etapa 3/ nrdcinarea 93
6.6 Etapa 4/ Aclimatizarea 94
6.7 Comentarii i rspunsuri la teste 96
6.8 Lucrare de verificare nr. 6 98
6.9 Bibliografie minimal 98
UNITATEA DE NVARE NR. 7: METODE DE PROPAGARE I N VITROA
CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI VEGETALE 99
7.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 7 99
7.2 Organogeneza 100
7.3 Culturile de apexuri 101
7.4 Cultura de minibutai 102
7.5 Culturile de meristeme 103
7.6 Culturile de calus 105
7.7 Microaltoirea 106
-
8/10/2019 Microinmultire
4/135
- 4 -
7.8 Cultura de embrioni i endosperm 108
7.9 Cultura de embrioni zigotici 110
7.10 Smna sintetic 111
7.11 Cultura de antere, polen, ovare, ovule i esut nucelar 113
7.12 Cultura de protoplati 1137.13 Comentarii i rspunsuri la teste 116
7.14 Lucrare de verificare nr. 7 118
7.15 Bibliografie minimal 118
UNITATEA DE NVARE NR. 8: MICROPROPAGAREA IN VITRO A
SPECIILOR HORTICOLE119
8.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 8 119
8.2 Micropropagarea in vitrola via-de-vie 1208.3 Micropropagarea in vitroa speciilor pomicole 121
8.4 Micropropagarea in vitroa speciilor floricole 124
8.5 Micropropagarea in vitroa cartofului 127
8.6 Micoriza i culturile in vitro 128
8.7 Comentarii i rspunsuri la teste 131
8.8 Lucrare de verificare nr. 8 132
8.9 Bibliografie minimal 132
9 GLOSAR DE TERMENI 133
10 BIBLIOGRAFIE 135
-
8/10/2019 Microinmultire
5/135
- 5 -
INTRODUCERE
Romnia are un mare potenial n ceea ce privete domeniile horticole, de la viticultur la
pomicultur, legumicultur sau floricultur, i n special, n ceea ce privete producerea dematerial sditor. Cum cerinele pieei moderne sunt pentru material sditor de calitate, liber de
virusuri i boli i certificat, micronmulirea - ca disciplin i afacere - este mai mult dect
necesar pentru evoluia pieei de profil.
Ne-am propus n acest manual dedicat studenilor de la Horticultur ID s trecem n revist
principalele instrumente cu care opereaz aceast disciplin, n sperana c, n viitor, una din
direciile de dezvoltare a pieei agricole va cuprindei domeniul micronmulirii, stabilind n acest
fel primele noiuni necesare pentru a opera n domeniul biotehnologiilor. Pe parcursul capitolelor
am trecut n revistdiverse aspecte legate de structura laboratoarelor, de necesarul tehnic aferent
pentru ca mai apoi s listam principalele tehnologii de producie n domeniul micronmulirii,
categoriile de culturi care se pot opera.
La fiecare capitol am ncercat s semnalm problemele deosebite care pot aprea sau
caracterul de importani inedit, micromulirea fiind un bra al biotehnologiei, o tiin aplicat
deosebit de valoroas, care necesit ns cunotine din varii domenii adiacente, de la biochimie,
agrochime, genetic sau biologie, la fiziologie i ameliorare.Pentru a ne ncadra ca ar membr cu drepturi depline n Comunitatea european, nu
avem doar drepturi, avem i obligaii, i una dindre acestea este aceea de a racorda serviciile
oferite la nivelul performanelor europene. Dezvoltarea segmentului de biotehnologii vegetale cu
aplicabilitate n horticultursau agricultur, prin deschiderea de laboratoare de micronmulire,
care s ofere spre comercializare att pe piaa interna ct i pe piaa european produse de
valoare, certificate i care s corespund exigenelor crescnde ale acestui domeniu - de la
productor la consumator, susine importana acestei materii de studiu n cadrul programeitiinifice a Facultii de Horticultur.
Autorul
-
8/10/2019 Microinmultire
6/135
- 6 -
UNITATEA DE NVARENR. 1:
ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI VEGETALE
CUPRINS
1.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 1. 61.2 nceputurile culturilor de celule. 7
1.3 Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro. 13
1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitron ara noastr. 16
1.5 Comentarii i rspunsuri la teste 18
1.6 Lucrare de verificare nr.1 22
1.7 Bibliografie minimal 22
1.1 Obiectivele Unitii de nvare nr. 1
Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:
Defineti locul disciplinei n arealul de specialitate.
Identifici principalele etape n dezvoltarea acestei tiine.
Listezi avantajele pe care le prezint aceast tiin i tehnic.
Plasezi cercetarea romneasc n contextul mondial al
dezvoltrii acestei tehnologii, ramur a biotehnologiilor.
-
8/10/2019 Microinmultire
7/135
- 7 -
1.2. nceputurile culturilor de celule.
Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez realizeaz cel mai spectaculos
proces din lumea vie, acela de transformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol
hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia de nenlocuit a Terrei, fiind
surs de hran i energie pentru om i animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator alatmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea oxigenului i rolul de materii prime
pentru unele industrii (alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omului pentru
perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i cultivare a plantelor.
Secolul XX, este considerat pe bun dreptate secolul marilor progrese care au condus la
mbogirea i acumularea informaiilor legate de natur, de descifrare a mecanismelor ereditii, de
descifrare a legitilor din domeniul fenomenelor biologice i a factorilor mutageni, a modului cum
acetia pot fi manipulai pentru inducerea variabilitii pentru crarea de noi forme vegetale,procedee de cultivare i nmulire a plantelor.
S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su totalitatea informaiei
genetice necesar dezvoltrii unui organism complet. Ea se supune principiului clasic al
totipoteneicelulare. Regenerarea de plante pornind de la o singur celul haploid sau diploid a
stat i st la bazatehnicii nmulirii plantelor in vitro.
Cultura de esuturi vegetale s-a dezvoltat ca urmare a cercetrilor lui Gottlieb Haberlandt
care, intuind capacitatea regenerativ a celulelor plantelor superioare, a ncercat s cultive esuturi
vegetale. El public n anul 1902 lucrarea Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzelle n care este
fundamentat teoretic ideea c orice celul diploid sau haploid conine informaia genetic
ereditar imprimat n genom. La acea vreme, experienele sale nu au fost ncununate de succes
deoarece a folosit explante din celule cu un grad nalt de difereniere morfofuncional (esut
palisadic, stomate etc.) dar i a limitelor la acea dat a cunotinelor de fiziologie vegetal, a
cunotinelor n stabilirea compoziiei substratului de cultur n ce privete natura i concentraia
substanelor macro i microelemente, a proporiei n care trebuie acestea folosite, a
indispensabilitii prezenei n mediu a unor surse de C organic, vitamine i stimulatori de cretere.
Ideea lui Haberlandt a fost respin de botanitii contemporani (E. Kster, 1926), care
susineau c obinerea de plante ntregi prin multiplicare de celule somatice nu este realizabil.
Haberlandt lanseaz totui ipoteza totipotenialitii celulare, concept pe care l gsim
formulat de Schleiden i Schwann (1939) la care i aduseser o contribuie n perioada 19201939
White, 1939 (care a reuit s obin calus din vrfurile rdcinilor de tomate) i R. J. Cautheret,
1934 (care a obinut calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun i morcov pe care le-a
-
8/10/2019 Microinmultire
8/135
- 8 -
stimulat cu auxine i le-a repicat n medii sterile), Wirchow n 1858, Bernard, 1878 i anatomistul
vegetal Goebel, citai de White n 1963.
Capacitatea unor celule eucariote de a funciona ca organisme primitive n condiiile
separrii de planta mam susinut de Haberlandt a fost exploatat prin diferite practici de nmulire
vegetativ (butire, marcotaj, altoire).Vchting i Rechinger (1893), citai de White (1963), au iniiat experimente pentru
determinarea limitelor de divizibilitate ale materialului vegetal, fr pierderea capacitii
regenerative.
n 1957, W. D. Stewart elaboreaz prima metodologie de cultivare in vitroa esuturilor
vegetale pe medii nutritive coninnd hormoni de cretere.
Progresele din domeniul biologiei au permis abia n zilele noastre - prin tehnicile
perfecionate i cunotinele despre structura i funcionalitatea celulelor i organitelor celulare generarea de plantule dintr-o singur celul.
Se cunosc citate n literatur (1904) experienele efectuate de Hanning care a obinut
plantule la crucifere pornind de la embrioni extrai din semine imature la Raphanus sativus,
R.landra, R.candatus i Cochlearia danica, experienele dovedind posibilitatea creterii pe medii
artificiale cu adaos de zaharoz a unor fragmente de plante.
Laibach (1925, 1929) demonstreaz utilitatea practic a tehnicii de nmulire in vitropentru
ameliorarea plantelor. El a izolat embrionii din semine neviabile din ncruciarea luiLinum perene
cu Linum austriacum, i-a adus la maturitate i i-a cultivat pe medii nutritive. Aceast metod a
servit mai trziu la realizarea de hibrizi ce ddeau natere la semine sterile, respectiv la embrioni
avortai.
ntre 1904 i 1932 au fost efectuate numeroase ncercri de cultivare pe medii artificiale a
unor explante, dar rezultatele au dovedit c cercetrile n domeniu se aflau n impas (White, 1963).
Muli cercettori s-au aliat n aceast perioad ideii susinut de Kster (1926) potrivit creia
cultivarea esuturilor vegetale este nerezolvabil (Morel, 1948).
Totui, experienele botanitilor au continuat, n jurul anilor 1930, savanii Gautheret n
Frana i concomitent White n Statele Unite efectueaz cercetri n direcia cultivrii in vitro a
explantelor provenite din esut cambial prelevat de la arar, salcie, ulm, plop, (Gautheret, 1931) i
rdcini excizate de la plantele de tomate (White, 1934).
Odat cu descoperirea n 1934 a primului fitohormon (acidul indolil acetic) de ctre
Kgl, Haagen Smit i Erxleben a fost deschis o nouetap n succesul cultivrii in vitro a
explantelor vegetale (Moore, 1979).
-
8/10/2019 Microinmultire
9/135
- 9 -
n Frana, Gautheret i Nobecourt (1939), lucrnd independent, obin calus din fragmente
prelevate din rdcinile metamorfozate (tuberizate) de morcov. White (1938), Gautheret i
Nobecourt (1939) realizeaz aproape simultan cultivarea in vitroa calusului, reuind s menin n
via esuturile inoculate i proliferarea acestora, dovedind posibilitatea transferrii i nmulirii
acestor esuturi prin subcultur.Putem considera c prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret i Nobecourt au pus bazele
cultivrii in vitro a explantelor vegetale: organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus
contribuia i n domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia, concentraia n macro i
microelemente eseniale pentru nutriia explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor
vitamine i auxine.
Culturile de calus i subcultivarea acestora au reuit i datorit descoperirii n 1934 a rolului
fiziologic al auxinei acidul 3 indolilacetic (AIA), care introdus n mediu de cultur favorizeazdeclanarea i susinerea proceselor regenerative.
n 1941, Van Querbeek i colab. demonstreaz efectul stimulator al laptelui de cocos
asupra dezvoltrii embrionilor i a formrii de calus din explante deDatura.
White i Braun, n 1942, apoi Braun singur, n 1945- reuesc cultivarea unor esuturi
tumorale caulinare pe medii aseptice. Meritele n multiplicarea i propagarea in vitroa unor plante
horticole revin lui Morel i Martin (1952, 1955). Ei au obinut material sditor devirozat pornind de
la plante infectate cultivate pe medii aseptice. Astfel, la nivelul materialului sditor au fost eradicate
virozele la cartof, orhidee, garoafe, dalii etc. (Margara, 1982).
Morel i Martin au demonstrat la dalii (1952) i la cartof (1955) c din meristemele
prelevate de la plante mame infectate sepot regenera clone sntoase. Morel (1960) la Cymbidium
stabilete tehnica de micropropagare in vitro care reprezint un prim pas n micropropagarea
industrial. El apreciaz c dintr-un singur explant ntr-un singur an se pot obine 4 milioane de
plante identice din punct de vedere genetic, libere de viroze. Cu aceast metod s-a revoluionat
tehnica nmulirii orhideelor, extins mai trziu la garoafe, crizanteme i alte specii ornamentale, la
pomii fructiferi, n viticultur i silvicultur.
O serie de ali cercettori (Gregory, 1940; Taylor, 1950; Nitsh, 1951; Sparrow i colab.,
1955; Maheshwari i Lal, 1958; Vasil, 1957, 1959 i alii) adopt o direcie deosebit de interesant,
aceea a regenerrii i diferenierii de plantule in vitro folosind componente florale, antere sau
grunciori depolen, fructe ori semine imature (Maroti, 1976).
Tehnica multiplicrii in vitro a explantelor s-a perfecionat n paralel cu rezultatele
cercetrilor din domeniul studiilor compoziiei i consistenei mediilor de cultur. Heller (1951)
experimenteaz creterea esuturilor pe mediu gelificat cu agar sau cu silicagel iar n 1955, Miller
-
8/10/2019 Microinmultire
10/135
- 10 -
i colab., izoleaz din sperma de heringi, chinetina. n 1957, Skoog i Miller avanseaz ipoteza
balanei hormonale, a raportului dintre auxin i citochinin, care favorizeaz iniierea de
rdcini i mugurai dintr-o cultur de calus.
Skoog (1956) i Miller (1957) descoper importana chinetinei i aduc elemente noi privind
efectul acestui hormon, precum i aciunea raportului ntre chinetin i auxin asupra proceselor deorganogenez la explantele cultivate in vitro, deoarece manipularea acestei balane influeneaz
reuita direcionrii proceselor de difereniere morfologic la esuturile cultivate prin aceast
metod.
Astfel, sporirea cantitii de auxin determin orientarea proceselor de morfogenez spre
rizogenez n timp ce creterea proporiei de chinetin induce formarea de mugurai i lstrai, iar
la concentraii ridicate fiecare hormon administrat separat determin generare de calus i inhibarea
proceselor de organogenez.Experienele lui Muir (1953) reprezint o premier n sensul c obine suspensii subcelulare
cu celule de Tagetes erectai Nicotiana tabacum iar Nickell cu celule de Phaseolus vulgaris. n
1954Muir i colab.izoleaz ca explant o celul care apoi a fost crescut pe punte de hrtie de filtru.
n 1954, Muir i colab.reuesc izolarea unei unice celule dintr-o suspensie de celule sau din
calus i obin prin diviziuni repetate un conglomerat de celule de tip calus. Doi ani mai trziu,
Nicckel (1956) descrie modul de cretere n cultur continu a unor suspensii celulare de fasole.
n deceniile cinci i ase ale secolului XX nregistrm rezultatele unor cercettori n
domeniu printre care amintim:
n 1944, Skoog iniiaz experimente pentru studierea proceselor de organogenez pe calus
de tutun, studiu care reprezint un progres n domeniul controluluievoluiei inoculilor vegetali in
vitro i un salt calitativ pentru dezvoltarea culturilor de esuturi i celule de plante. Studiile de
organogenez efectuate de Skoog n1944 pe calus de tutun reprezint un progres important n
domeniul controlriievoluiei inoculilor vegetali in vitro.
Caplin i Steward, 1948 i Steward i Caplin, 1951, 1952, realizeaz un pas n dezvoltarea
culturii in vitrola cormofite prin adugarea n mediile de cultur a laptelui din nuc de cocos i a
auxinei de sintez 2,4 diclorfenoxiacetic cu rol stimulator asupra creterii esuturilor de morcov i
de cartof. Aceste experiene relev faptul c unii fitohormoni sau substane fitoefectoare pot aciona
sinergic.
Torrey (1957) realizeaz o cultur de celule vegetale n pictur suspendat, Jones i colab.
(1960) obin o microcultur pe o lam de microscopie. Steward i Shantz (1956) i Reinert (1956)
studiaz creterea unei suspensii celulare dePicea glauca.
-
8/10/2019 Microinmultire
11/135
- 11 -
Reinert (1958) i Steward mpreun cu colaboratorii (1958) studiaz problema
embriogenezei ntr-o suspensie provenit din rdcini de morcov. Experiena inoculrii unei celule
i formarea unei suspensii celulare se datoreaz lui Jones i colab. (1960), iar obinerea de clone
dintr-o celul unic revine lui Hildebrandt (1958).
Skoog (1944) i Skoog i Tsui (citai de Gautheret, 1959) demonstreaz pe explantetisulare constnd din mduv de tutun o sporire a creterii masei de calus i formarea de mugurai
n condiiile aplicrii de adenin i ridicrii coninutului de fosfat n mediile de cultur.
n anul 1959 se realizeaz dintr-o singur celul o plantul (Braun). Aceast performan
repetat i prin experienele lui Vasil i Hildebrandt (1965), Chandra i Hildebrandt (1967),
confirm valabilitatea ipotezei emis la nceputul secolului de Hildebrandt, aceea a totipotenialitii
celulei vegetale i anume c dintr-o celul somatic, diploid poate fi regenerat o plantul ce i
poate continua i ncheia ciclul biologic complet la trecerea ei n cadrul natural de via.Progresele cele mai importante n domeniul cultivrii explantelor vegetale pe medii aseptice
s-au nregistrat dup anul 1960,astfel:
Bergman, 1960, relizeaz experimentul de obinere a unei culturi de celule cu circa 90%
celule libere individualizate prin metoda de filtrare a populaiei de celule. ncorporarea celulelor
ntr-o plac de mediu de cultur agarizat a condus la fenomenul c fiecare celul izolat a generat
cte o colonie de celule vizibil cu ochiul liber iar dup separare s-au realizat clone pornind de la o
celul unic.
n anul 1960, Cocking izoleaz pe cale enzimatic protoplati din rdcini, vrful acestora
sub influena unei enzime de origine fungic celulazaduc la formarea dup un timp a unei noi
membrane celulare.
Kohlenbach (1966) izoleaz mecanic celule din mezofil foliar separate din frunzele de
Macleaya cordatape care reuete s le cultive in vitro.
Nagata i Takebe n anul 1970 demonstreaz c proptoplatii izolai din mezofil de frunze
de tutun formeaz n timp mici colonii celulare.Ulterior, Takebe i colab.cultiv protoplati de
tutun dup metoda descris de Bergman (1960) reuind obinerea de calus din culturi de celule
generate din protoplati, prin care se regenereaz plantulele. Randamentul acestor metode la diferite
specii continu s creasc.
S-a nscut astfel ideea realizrii tehnicilor de fuziune a protoplatilor pentru obinerea de
hibrizi somatici ntre speciile la care hibridarea sexuat nu este posibil.
n 1972, Carlson i colab. obin primul hibrid somatic produs prin fuziune de protoplati de
laNicotiana glaucaxNicotiana langsdorffii.
-
8/10/2019 Microinmultire
12/135
- 12 -
Paralel cu descoperirile teoretice n domeniul cercetrilor genetice, care fundamenteaz i
pun bazele multiplicrii in vitro se nregistreaz progrese importante n domeniul cercetrilor
aplicative, acela de cultivare a explantelor pe medii aseptice.
Printre cei care au contribuit la dezvoltarea sistemului special de cultivare in vitro a
celulelor amintim pe Steward, Mages i Smith (1958),Tulecke i Nickell (1959, 1960). Ulterior,Byrne i Koch (1962) construiesc instalaii de mare capacitate pentru culturile de celule.
O realizare deosebitconst n punerea la punct a multiplicrii exemplarelor vegetale n ritm
accelerat , lucru greu de imaginat ca fiind realizabil cu trei decenii n urm.
Multiplicarea prin subculturi succesive in vitrorealizat de Murashige, 1977 i 1978 dintr-
un singur meristem de orhidee, care a fcut posibil obinerea a 4 milioane de exemplare, copii
fidele ale plantei donatoare, a demonstrat i eficiena economic a metodei prin care se face
economie de material biologic. Acest fapt a determinat pe practicieni s asimileze procedeeleelaborate n laboratoarele de cercetare i s standardizeze metodele pe profil industrial, crend
adevrate industrii horticole i silvice pentru obinerea prin aceast metod a materialului vegetal
pentru plantat. Clonarea in vitro n ritm intensiv a exemplarelor valoroase a uurat munca
amelioratorilor.
Test de autoevaluare1. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Ce rol joac plantele n existena uman?
b) Ce proces st la baza tehnicii nmulirii in vitro?
c) Cine a pus bazele cultivrii culturilor in vitroa explantelor vegetale,
celule, esuturi i organe i n ce an?d) n ce an i de ctre cine a fost confirmat teoria totipotenei celulare?
e) Comentai confirmarea importanei economice a micropropagrii.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.
-
8/10/2019 Microinmultire
13/135
- 13 -
1.3. Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro.
Avantajele multiplicrii in vitro, superioar metodelor de nmulire vegetativ clasic,
constau n rapiditatea (scurtarea timpului), obinereade plante juvenilizate, lipsa bolilor i vigoare
mai mare.
Metoda evit variabilitatea genetic i permite obinerea de material nevirozat n finalconducnd la creterea calitii materialului vegetal.
Este permis prin aceast metod i multiplicarea speciilor care nu au semine viabile sau
care nu se pot nmuli natural pe cale vegetativ.
Culturile de explante vegetale in vitro reprezint modele, instrumente valoroase n
cercetarea modern n domeniul biologiei vegetale. Ele prezint urmtoarele avantaje:
Permit studierea aciunii fitohormonilor, a implicrii permeabilitii, absorbiei,
fotosintezei, respiraiei, metabolismului, n morfogenez, genetic i biochimie.
Sunt domenii de abordare multidisciplinar.
Pun la dispoziie mijloacele stpnirii i dirijrii creterii.
Permit ntr-o perioad scurt de timp crearea de plante adaptate la condiii vitrege de
via (rezistente la aciunea duntoare a unor ageni stresani), plante create n decurs de
cteva luni prin comprimarea evoluiei filogenetice (Gill, 1980).
Din punct de vedere istoric dezvoltarea i evoluia cunotinelor n domeniul tehnicilor de cultivare
in vitroa celulelor i esuturilor vegetale cunoate 5 etape distincte:
Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:
Plantele sunt organismele care transform energia solar n
energie chimic i constituie aurul verdeai Terrei.
Principiul de baz al tehnicii nmulirii plantelor in vitroeste
acela al totipotenei celulare, elaborat de Haberland n 1902.
Descoperirea primului fitohormon (IBA) a deschis o nou
etap n succesul culturilor in vitro.
ncepnd cu 1960, a fost demonstrat eficiena economic a
multiplicrii in vitro, uurnd procesele de nmulire i
ameliorare a plantelor.
-
8/10/2019 Microinmultire
14/135
- 14 -
1. ntre anii 19391902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii structurale fundamentale a
lumii vii (Schleiden i Schwann, 1939) celula a fost acceptat ca unitate structural de
baz a organismelor vii, fiind apoi emis postulatul conceptului de totipotenialitate
(omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt, 1902.
2.
n perioada 1902 1920, o perioad de stagnare a cercetrilor n domeniu, deoareceprimele experimente cu culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile.
3. Etapa anilor 1920 1939 nregistreaz primelesuccese n domeniul creterii in vitroa
embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus, esuturi care cultivate apoi pe medii
aseptice i subcultivate periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal
(White, Gautheret i Nobecourt ).
4. A patra etap ntre 1939 1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi
cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate pe diferite medii decultur, pentru cunoaterea factorilor implicai n procesele de nmulire i difereniere a
celulelor, gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur, proveniena
i natura explantului.
n aceast direcie, n 1953 s-a reuit cultivarea meristemelor caulinare, aplicale (Morel
i Martin) i obinerea deplante libere de viroze folosind ca plant donatoare o plant
polivirusat, ocazie cu care s-a emis teoria (Skoog i Miller-1957), referitoare la
controlul hormonal al organogenezei (rolul balanei auxin/citochinin), obinerea de
embrioni somatici, (Steward i Reinert, 1958, 1959), primele culturi de celule (Muir,
Torrey i Jones i colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960) i
obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972).
5. Perioada ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa modern a
culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat prin extinderea larg a utilizrii
explantelor pentru multiplicare. n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie
cunosc o acumulare de cunotine n domeniile citologiei, citofiziologiei, biologiei
moleculare, geneticii i ameliorrii la nivel ultrastructural i molecular precum i n
biochimie, fiziologie etc.
Paralel cu cercetrile biologice fundamentale apar o serie de subramuri de biotehnologii
vegetale cum ar fi citofitotehnologiile:
nmulirea i clonarea cultivarilor valoroi;
micropropagarea i generarea de material vegetal sntos;
-
8/10/2019 Microinmultire
15/135
- 15 -
elaborarea de tehnologii de modificare a genomului unor specii cormofite;
exploatarea capacitii de biosintez a celulelor izolate n condiii de cultur
intensiv;
obinerea de embrioni somatici, producerea de semine artificiale;
clonarea rapid a unor soiuri rezultate din lucrrile de ameliorare.
Test de autoevaluare
2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:a) Comentai avantajele multiplicrii in vitro.
b) Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.
Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:
Avantajele multiplicrii in vitro constau n scurtarea timpuluipentru obinerea unor plante sntoase, viguroase, lipsite de
virusuri i a unor specii fr semine viabile care nu se pot nmuli
natural pe care vegetativ.
Din 1966 i pn n prezent este delimitat etapa modern a culturii
de celule i esuturi in vitro, cu implicaii economice majore.
-
8/10/2019 Microinmultire
16/135
- 16 -
1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitron ara noastr.
n ara noastr, din anul 1975 au fost abordate cercetri sistematice privind p roblemele
nmulirii plantelor in vitro fiind amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul deCercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice din Bucureti, n unitile de
cercetare agricol i horticol de la Fundulea, Vidra, Mrcineni, tefneti, n unitile de
nvmnt superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureti, Iai, Facultatea de Biologie din Bucureti,
Facultatea de Farmacie din Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere
Codlea (1988).
Ulterior au luat fiin numeroase nuclee de cercetare n domeniul culturilor de explante in
vitro, colective care s-au dezvoltat i laboratoare care s-au dotat pentru a contribui la lrgireacercetrilor i cunotinelor n acest domeniu.
n anul 1984 menionm apariia primei monografii cu acest profil intitulat Culturi de
celule i esuturi vegetale aplicaii n agricultur Ed.Ceres, autori Cachi C.D., Raicu P.Badea
M.E.
n anul 1999 la Iai, la Institutul Agronomic Ion Ionescu de la Brad apare tot n acest
domeniu lucrarea Biotehnologiile viitorului autor Constantin Milic.
n anul 2000 apare la Sibiu lucrarea Biotehnologie vegetal vol.I Bazele teoretice i
practiceautori Dorina Cachi-Cosma i Camelia Sand.
n nvmntul superior agricol, primele cursuri n domeniul culturilor de celule i esuturi
vegetale au luat fiin la Institutul Agronomic N.Blcescu din Bucureti sub form de cursuri
postuniversitare, ntre anii 19851988, fiind editat i un volum intitulat Curs practic de culturi de
esuturi in vitro, cu aplicaii n legumicultur i floricultur autori Cachi C.D. i Petrescu
C.(1985). Din anul 1987 acest curs s-a introdus sub form opional la seciile de biologie i la
facultile de horticultur din ar.
Tehnicile culturilor cu explante in vitro au cptat n ultimile decenii ca urmare a
progreselor teoretice i practice din domeniu, o ampl dezvoltare i extindere n ara noastr
aprnd o serie de bioindustrii profilate pe creterea in vitroa diferitelor explante, care impunea
pregtirea n acest domeniu a unor specialiti biotehnologi. Ca urmare este nfiinat n anul 1995
la Bucureti n cadrul Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar, Facultatea de
Biotehnologie cu ramuri ale biotehnologiei vegetale ce se constitue n discipline fundamentale
independente.
Micarea mondial din domeniul culturilor de explante este foarte activ.
-
8/10/2019 Microinmultire
17/135
- 17 -
n anul 1972 a luat fiin International Association for Plant Tissue Culture la care
Romnia a aderat n anul 1975. Din patru n patru ani au loc Congrese Mondiale organizate de
aceast asociaie.
La noi n ar se nfiineaz Asociaia Romn de Culturi de esuturi i Celule Vegetale.
Prima manifestare tiinific din ara noastr cu tematica culturilor de celule i esuturivegetale a fost oraganizat la Cluj Napoca n anul 1981 de Institutul de Cercetri de Biologie.
n 1989 tot la Institutul de Cercetri Biologice din Cluj Napoca s -a organizat al IV-lea
Simpozion Naional de Culturi de Explante.
n noiembrie 2000 se organizeaz la Universitatea Babe Bolyai Facultatea de Biologie
din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de esuturi i Celule Vegetale care marcheaz 25 de
ani de la iniierea primelor cercetri n domeniul culturilor de celule i esuturi n Romnia.
Test de autoevaluare
3. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Comentai istoricul culturilor in vitron ara noastr.
b) Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio industriilor
profilate pe nmulirea in vitro.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.
Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:
C n Romnia, dup anul 1975, a nceput amenajarea laboratoarelor de
culturi de esuturi precum i cercetarea sistematic n domeniu.
n domeniul nvmntului superior agricol, primele cursuri de culturi
in vitroau fost inute la Institutul Agronomic Nicoale Blcescu dinBucureti, ncepnd cu anul 1985.
-
8/10/2019 Microinmultire
18/135
- 18 -
1.5 Comentarii i rspunsuri la teste
ntrebarea 1
a) Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez
realizeaz cel mai spectaculos proces din lumea vie, acela detransformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol
hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia
de nenlocuit a Terrei, fiind surs de hran i energie pentru om i
animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator al
atmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea
oxigenului i rolul de materii prime pentru unele industrii
(alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omuluipentru perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i
cultivare a plantelor.
b) S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su
totalitatea informaiei genetice necesar dezvoltrii unui organism
complet. Ea se supune principiului clasic al totipotenei celulare.
Regenerarea de plante pornind de la o singur celul haploid sau
diploid a stat i st la baza tehnicii nmulirii plantelor in vitro.
c) Putem considera c,prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret
i Nobecourt au pus bazele cultivrii in vitroa explantelor vegetale:
organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus contribuia i n
domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia,
concentraia n macro i microelemente eseniale pentru nutriia
explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor vitamine
i auxine.
d) n anul 1959 se realizeaz dintr-o singur celul o plantul
(Braun). Aceast performan repetat i prin experienele lui Vasil
i Hildebrandt (1965), Chandra i Hildebrandt (1967), confirm
valabilitatea ipotezei emis la nceputul secolului de Hildebrandt,
aceea a totipotenialitii celulei vegetale i anume, cdintr-o celul
somatic, diploid poate fi regenerat o plantulce i poate
-
8/10/2019 Microinmultire
19/135
- 19 -
continua i ncheia ciclul biologic complet la trecerea ei n cadrul
natural de via.
e) Multiplicarea prin subculturi succesive in vitro realizat de
Murashige, 1977 i 1978 dintr-un singur meristem de orhidee, care
a fcut posibil obinerea a 4 milioane de exemplare, copii fidele
ale plantei donatoare, a demonstrat i eficiena economic a
metodei prin care se face economie de material biologic. Acest fapt
a determinat pe practicieni s asimileze procedeele elaborate n
laboratoarele de cercetare i s standardizeze metodele pe profil
industrial, crend adevrate industrii horticole i silvice pentru
obinerea prin aceast metod a materialului vegetal pentru plantat.
Clonarea in vitron ritm intensiv a exemplarelor valoroase a uurat
munca amelioratorilor.
ntrebarea 2
a. Avantajele multiplicrii in vitroconstau n rapiditatea (scurtarea
timpului) obinerii de plante juvenilizate, lipsa bolilor i vigoare
mai mare. Metoda evit variabilitatea genetic i permite obinerea
de material nevirozat n final conducnd la creterea calitii
materialului vegetal. Ea permite i multiplicarea speciilor care nu
au semine viabile sau care nu se pot nmuli natural pe cale
vegetativ. Dintre avantaje: permite studierea aciunii
fitohormonilor, a implicrii permeabilitii, absorbiei,
fotosintezei, respiraiei, metabolismului, n morfogenez, genetic
i biochimie; pune la dispoziie mijloacele stpnirii i dirijrii
creterii; permite ntr-o perioad scurt de timp crearea de plante
adaptate la condiii vitrege de via (rezistente la aciuneaduntoare a unor ageni stresani), plante create n decurs de
cteva luni prin comprimarea evoluiei filogenetice (Gill, 1980).
ntre anii 1939 1902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii
structurale fundamentale a lumii vii (Schleiden i Schwann,
1939) celula a fost acceptat ca unitate structural de baz a
organismelor vii, fiind apoi emis postulatul conceptului de
totipotenialitate (omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt,1902. n perioada 19021920, o perioad de stagnare
-
8/10/2019 Microinmultire
20/135
- 20 -
a cercetrilor n domeniu, deoarece primele experimente cu
culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile. Etapa
anilor 1920 1939 nregistreaz primele succese n domeniul
creterii in vitroa embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus,esuturi care cultivate apoi pe medii aseptice i subcultivate
periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal
(White, Gautheret i Nobecourt). A patra etap ntre 1939
1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi
cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate
pe diferite medii de cultur, pentru cunoaterea i a factorilor
implicai n procesele de nmulire i difereniere a celulelor,gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur,
proveniena i natura explantului. n aceast direcie, n 1953 s-a
reuit cultivarea meristemelor caulinare, apicale (Morel i
Martin), obinerea de embrioni somatici, Steward i Reinert,
1958, 1959), primele culturi de celule (Muir, Torrey i Jones
colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960)
i obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972). Perioada
ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa
modern a culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat
prin extinderea larg a utilizrii explantelor pentru multiplicare.
n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie cunosc
o acumulare de cunotine n domeniile citologiei,
citofiziologiei, biologiei moleculare, geneticii i ameliorrii la
nivel ultrastructural i molecular precum i n biochimie,
fiziologie etc.
ntrebarea 3
a. n ara noastr, din anul 1975 au fost abordate cercetri
sistematice privind problemele nmulirii plantelor in vitrofiind
amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul de
Cercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice
din Bucureti, n unitile de cercetare agricol i horticol de la
Fundulea, Vidra, Mrcineni, tefneti, n unitile de
-
8/10/2019 Microinmultire
21/135
- 21 -
nvmnt superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureti, Iai,
Facultatea de Biologie din Bucureti, Facultatea de Farmacie din
Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere
Codlea (1988).b. Tehnicile culturilor cu explante in vitro au cptat n ultimile
decenii o ampl dezvoltare i extindere n ara noastr, ca urmare a
progreselor teoretice i practice din domeniu, aprnd o serie de
bioindustrii profilate pe creterea in vitro a diferitelor explante, care
impunea i pregtirea n acest domeniu a unor specialiti biotehnologi.
-
8/10/2019 Microinmultire
22/135
- 22 -
1.6 Lucrare de verificare nr. 1
1.7 Bibliografie minimal
1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;
INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitatimplic activiti care necesit cunoaterea
Unitii de nvare nr. 1.
Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise tutorelui pentru comentarii,
corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:
Titulatura acestui curs (MICRONMULIREA PLANTELOR
HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele
studentei (studentului). Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s
nu depeasc o jumtate de pagin. Punctajul aferent este menionat
pentru fiecare ntrebare.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1. Ce rol joac plantele n existena uman? 1 p
2. Ceproces st la baza tehnicii nmulirii in vitro?1 p
3. Cine a pus bazele cultivrii culturilor in vitro a explantelor vegetale,
celule, esuturi i organe i n ce an?1p
4. n ce an i de ctre cine a fost confirmat teoria totipotenei celulare?1
p
5. Comentai confirmarea importanei economice a micropropagrii.-1p
6.Comentai avantajele multiplicrii in vitro. - 1p
7. Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.- 1p
8. Comentai istoricul culturilor in vitron ara noastr.- 1p
9. Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio
industriilor profilate pe nmulirea in vitro.-1p
*Un punct se acorda din oficiu.
-
8/10/2019 Microinmultire
23/135
- 23 -
UNITATEA DE NVARENR. 2:
BAZELE TEORETICE ALE MICROPROPAGRII I N VITRO
CUPRINS
2.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 2 232.2 Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro 24
2.3 Comentarii i rspunsuri la teste 33
2.4 Lucrare de verificare nr. 2 36
2.5 Bibliografie minimal 36
2.1 Obiectivele Unitii de nvare nr. 2
Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:
Cunoti particularitile i specificul biologic al celulelor din
perspectiva micropropagrii.
Defineti categoriile de celule implicate n micropropagare,
meristemele.
nelegi diferenierea celular. Principalele procese care au labaz diferenierea celular.
-
8/10/2019 Microinmultire
24/135
- 24 -
2.2. Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in
vitro
Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic, fiziologic i biochimic prin
care are loc sporirea numrului de celule prin acumularea de mas vegetativ, cnd au loc
modificri cantitative ireversibile iar n final plantele ating dimensiunile caracteristice fiecreispecii.
Paralel cu procesul de cretere cantitativ, are loc i procesul de dezvoltare, de evoluie
individual a plantelor care parcurg o serie de etape calitative ce ncep cu germinarea i se ncheie
cu nflorirea i fructificarea. Dezvoltarea parcurs conduce la realizarea ciclului ontogenetic care
cuprinde modificri morfologice, anatomice i fiziologice ce se produc ntr-o succesiune riguroas
determinat de factorii ereditari care la rndul lor sunt influenai de factorii de mediu.
Cunoaterea aspectelor legate de biologia dezvoltrii plantelor superioare este deosebit deimportant pentru nelegerea proceselor ce au loc n tehnica multiplicrii in vitro.
Procesele biologice ce au loc n timpul nmulirii, creterii i dezvoltrii plantelor parcurg
etape de acumulri prin sintez a unor compui endocelulari, compui care joac dou roluri i
anume: rol plastic(de constituie n cazul proteinelor i celulozelor) dar i rol de material genetic
(cazul ADN i ARN).
Meristemele sunt esuturi care ndeplinesc funcia de multiplicare celular, ele se divid
continuu pe tot parcursul vieii. Ele sunt celule tinere pe tot parcursul procesului de multiplicare.
La plantele adulte construirea arhitecturii corpului lor se realizeaz prin cteva tipuri de
meristeme categorisite dup criterii ca: localizare, caracteristici i origine, fiecare cu anumite
semnificaii din punct de vedere ontogenetic i anume:
meristeme histogenecare genereaz esuturi;
meristeme organogene care genereaz organe i anume:
radiculare apicale; caulinare apicale; foliare
meristeme embriogenecare dau natere la embrioni
La plantele superioare, organogeneza este indefinit, dar att timp ct planta sau pri din
aceasta sunt vii, procesul de multiplicare celular i formarea de masive histogene din meristeme
este continuu. ( meritos = divizibil n l. grec).
La cormofite, dup formarea oului sau zigotului, prima diviziune nseamn o polarizare care
va da natere la embrionul bipolar, una din celulele meristematice genereaz polul caulinar iar cea
de a doua polul radicular. Acest fenomen este valabil i n cazul formrii embrionilor somatici care
au origine n cte o celul somatic.
-
8/10/2019 Microinmultire
25/135
- 25 -
Dup germinaie din embrioni (zigotici sau somatici) se formeaz plantule la care n zona
hipocotil i n cotiledoane activitatea meristematic intr ndeclin i n continuare pe msur ce
plantula crete se transform n plantela care esuturile meristematice (embrionare sau formatoare)
se gsesc n vrfurile extreme ale rdcinilor i tulpinilor principale (care constituie axa plantei) sau
secundare.Dup localizarea meristemelorele pot fi:
meristeme embrionare(localizate n embrion);
meristeme apicale(localizate n vrfurile de cretere tulpini sau rdcini);
meristeme intercalarece pot fi:
discontinui(deasupra nodurilor unor tulpini);
continui laterale: cambiu (strat libero-lemnos) i felogen (strat
generator subero-felodermic).Dup caracterulcelulelor meristematice:
meristeme primordiale(promeristeme) din care fac parte celulele embrionilor i
cele mai tinere masive meristematice care formeaz vrfurile vegetative sau
domurile meristematice.
meristeme primare (semimeristeme) derivate din meristemele primordiale.
Dup originea celulelor meristematice clasificare funcie de evoluia teoriilor emise de unii
cercettori:
- dup Hanstein (18681870) meristemul radicular ar fi:
dermatogen(genereaz rizoderm);
periblem(genereaz scoar);
plerom(formeaz cilindrul central.
- dup Haberland (1900) meristemele sunt:
protoderm (din care apar esuturile protectoare rizoderma i epiderma);
procambiu(din care se formeaz esuturile conductoare i cele mecanice);
meristem fundamental(din care apar parenchimurile corticale i medulare.
- dup Schmidt (1924) meristemul apical al tulpinilor este format din:
tunica (ptura extern de celule care formeaz esutul protector i o parte din
scoar);
corpusul (ptura care genereaz celule ce dau natere la o parte din scoar,
cilindrul central i mduv).
-
8/10/2019 Microinmultire
26/135
- 26 -
- dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul
apical al tulpinii este constituit din:
meristem de ateptare care corespunde zonei apicale axiale i joac rol n
formarea primordiilor florale i a inflorescenelor;
inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel central nconjurat de
celule care periodic vor genera frunzele i scoara tulpinii;
meristemul medularce ocup poziia central i este aezat sub meristemul de
ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere parenchimului
medular.
n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o sintez a clasificrii acestor categorii de
meristeme pe care o prezentm mai jos.
-
esuturi meristematice primordialepromeristeme care pot fi: fr celule, cu
o celul iniial, cu mai multe celule iniiale
- esuturi meristematice primare semimeristeme care pot fi: apicale,
intercalare, laterale
- esuturi meristematice secundarecare pot fi: cambiul , felogenul
- esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la
nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate meristematic
numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.
La nivelul explantelor cultivate in vitro, grupuri cu celule cu caracter meristematic pot
proveni din celule cu caracter embrionar, preexistente n explante ce pot deveni primordii
radiculare, caulinare sau foliare. Aceste centre meristematice pot evolua anormal n meristeme
radiculare sau caulinare sau prin regresie n calus. Aceti meristemoizi prezeni la nivelul
explantelor, n cazul tehnicii in vitro pot avea efect benefic n procesele regenerative i demorfogenez.
n cazul multiplicrii in vitroare loc neogeneza de zone sau centre meristematice din celule
dedifereniate care sunt considerate meristeme speciale ntruct acestea nu exist n structurile
organelor ci generarea lor este determinat de excizare, de condiiile speciale de cultur, i de
prezena regulatorilor de cretere n substratul de cultur.
Autonomia explantelor sau celulelor meristematice n condiiile cultivrii in vitro,
imposibilitatea dirijrii proceselor de morfogenez ntr-o anumit direcie dorit sunt dificile
ntruct natura esuturilor i celulelor din structura explantelor poate exercita influene de durat pe
-
8/10/2019 Microinmultire
27/135
- 27 -
parcursul mai multor subculturi, explantul fiind independent de planta mam, dar are totui
informaia genetic motenit de la aceasta.
Diferenierea celular
Celulele tinere difereniate dup divizarea continu sufer transformri structurale i ospecializare morfologic i fiziologic cptnd caracteristici noi, proprii celulelor adulte mari.
Progresiv, modificrile secundare ce survin ngreuneaz schimburile dintre aceste celule cu cele
nvecinate cu toate c majoritatea celulelor difereniate din corpul plantelor rmn vii, cu o intens
activitate metabolic dar i pierd capacitatea de a se divide.
Integritatea sistemului, continuitatea celulelor unui esut, comunicarea dintre celulele i
esuturile unor organe din organismul viu se menin datorit unor substane elaborate de ctre
celule, substane care pot migra la distane mari i pot asigura relaia organismului unitar cuperceperea factorilor de mediu.
Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup de celule poart
denumirea de proces de inducie.Celulele asemntoare ca structur i funciune care determin n
esutul respectiv specificitatea fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna
funcionare aorganelor i activitatea ntregii plante.
Procesul de dedifereniere este invers procesului de difereniere celular. El rar se petrece
natural, spontan. Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra celulelor
difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea traumatic exogen.
n cazul multiplicrii in vitron condiiile detarii explantelor dediferenierea se produce n
sens regenerativ datorit aciunii fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule
meristematice apte a se divide.
Capacitatea celulelor de a se dediferenia este inegal rspndit n corpul plantei i depinde
de ct de avansat este procesul de difereniere n morfostructura celular.
n condiiile cultivrii explantelor in vitrocapacitatea regenerativ a celulelor este exploatat
la maximum. Sigur c aptitudinile regenerative ale inoculilor depind de proveniena explantului,
condiiile de cultur i de manifestarea integral a ntregii informaii genetice existent n genomul
inoculului. Succesul operaiei de regenerare de plante din diferite tipuri de explante depinde de
reuita metodelor de transformare a celulelor nemeristematice n celule meristematice obinute prin
dedifereniere.
n condiiile de cultur in vitro dediferenierea i revenirea celulelor la starea de celul
meristematic este condiie pentru instalarea i progresarea proceselor regenerative i realizarea
neoformrii unui nou organism vegetal.
-
8/10/2019 Microinmultire
28/135
- 28 -
Fazele dediferenierii sunt pe scurt urmtoarele:
1. Prima faz caracterizat prin:
amorsarea proceselor de dedifereniere
producerea dediferenierii celulelor, dobndirea caracteristicilor citologice ale
unui esut meristematic secundar cu celule aplatizate ce seamn ca aspect istructur cu cambiul
2. A doua faz a dediferenierii const n:
dediferenierea celulelor pn la stadiu de meristem primar
generarea de promeristeme sau meristemoizi din care pot aprea centre
organogene sau embriogene
3. A treia faz de dedifereniere se caracterizeaz prin:
formarea din celulele dedifereniate a calusului neorganizat, omogen structural lanivelul cruia se pot forma meristemoizi sau centri embriogeni
Putem considera c dediferenierea celulelor detaate de planta mam sau de unele organe,
anuleaz interdependena explantelor de organismul donor, celulele eliberate de aceast stare pot
s-i exprime n aceste condiii totipotena deinut n genom.
Deci, in vitro celulele se pot dediferenia mai rapid i mai uor ele fiind scoase de sub
interrelaiile i incidena factorilor endogeni care asigur echilibrul fiziologic al unui organism viu.
Morfogeneza: organogeneza i embriogeneza
Morfogeneza este diferenierea histologic complex a celulelor care n final duce la
formarea de organe proces numit organogenez, sau generare de embrioni proces numit
embriogenez.
Organogeneza este procesul de refacere a organelor prin activitatea meristemelor dup tipul
fitohormonilor folosii, genernd organe sau calus.
Embriogeneza este procesul n care, pornind de la zigot, celul somatic sau gamei (andro
i ginogenez) se genereaz un embrion.
Morfogeneza are la baz citodiferenierea ca exprimare a competenei celulare indus de
determinismul genetic.
n condiiile explantrii i inoculrii in vitro, capacitatea de citodifereniere a celulelor
depinde de capacitatea celulelor de a-i modifica starea lor de competen sub influena unor factori
interni i externi.
-
8/10/2019 Microinmultire
29/135
- 29 -
Dintre factorii interni amintim fitohormonii i natura esuturilor explantelor n ceea ce
privete susinerea i viteza de avansare a proceselor de morfogenez (organogenez sau
embriogenez)
Rolul mediului de cultur ce se ncadreaz n grupa factorilor externin care amintim sursa
de energie, temperatura, lumina i regimul fotoperiodic pot exercita o influen decisiv asupraproceselor regenerative i de morfogenez.
Organogeneza
Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i difereniere celular i tisular
a organelor.
n tehnica de multiplicare in vitro este vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a
mugurailor i tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza).n rizogenezsau formarea rdcinilor, pe lng factorii endogenin principal cel genetic-
un rol important l au fitohormonii, mai exact auxinele (endogene sau exogene) sau unele substane
cu aciune benefic asupra rizogenezei, substane formate n tinerele frunzulie ca rezultat al
activitii fotosintetice.
Aerarea (oxigenarea) zonei n care se produce rizogeneza, temperatura, pH-ul, rezervele
energetice endogene stimuleaz dar chiar condiioneaz rizogeneza alturi de factorul genetic (gen,
specie, soi) care au rol determinant n capacitatea rizogen a unor explante.
Caulogeneza, procesul de formare a tulpinilor, se afl deasemeni sub controlul genetic i
fitohormonal i evolueaz n funcie de condiiile de mediu i unii factori endogeni n mai mic
msur dect n cazul rizogenezei.
Caulogeneza este stimulat de un anumit raport ntre auxine i citochinine, raport care este
n favoarea citochininelor.
n cazul culturilor in vitro apariia centrilor meristematici, a mugurailor i apoi a
tulpinielor, este favorizat de prezena n mediul de cultur achinetinei, a benziladeninei.
Polaritatea fragmentelor: este proprietatea de care trebue s se in seama atunci cnd
fragmentele vegetative se introduc n substratul rizogen sau mediul de cultur i anume apexurile
sau meristemele apicale sau axilare utilizate pentru nmulire.
Embriogeneza
Procesul de formare a embrionului sau embriogeneza a cptat o nou dimensiune dup
descoperirea embriogenezei somatice n suspensia de celule, n anul 1958 de ctre Steward i
Reinert. Embrionul ca entitate morfoanatomic distinct este un stadiu intermediar de trecere de la
-
8/10/2019 Microinmultire
30/135
- 30 -
gametofit la sporofit n ciclul biologic al unui organism, la spermatofite, n cazul embriogenezei in
vitro, neogeneza unui embrion din celule somatice poart denumirea de embriogenez
nonzigotic sau embriogeneza somatic, diferit ca origine de embriogeneza zigotic.
Zigotul, (embrion derivat din ou sau zigot) este rezultatul fecundrii gametului femel
(oosfera) de ctre gametul mascul (spermatia).Cnd formarea embrionului se produce n lipsa fecundrii, fenomenul se numete apomixie.
n acest caz embrionul ia natere din elemente ale nuceleisau sacului embrionarsau chiar celule
ale integumentelor ovulului.
n cazul apomixiei, producerea embrionului se poate face prin:
partogenez cnd are loc la nivelul oosferei nefecundate i este: haploid
(generativ) sau diploid (somatic);
apogamie cnd geneza embrionului are loc dintr-o celul a sacului embrionar; aposporiecnd formarea embrionului are loc dint-o celul vegetativ a nucelei
sau a integumentului;
poliembrionie formarea mai multor embrioni din acelaovul prin apogamie
ct i prin aposporie. Acest tip de embrioni se numesc embrioni adventivi iar
embriogeneza se mai numete embriogenez asexuat.
n cazul multiplicrii in vitrola nivelul explantelor, calusul celulelor n cultur n suspensii,
fenomenul de embriogenez se declaneaz printr-o serie de multiplicri celulare dintr-o celul
unic prin diviziuni succesive, se formez un embrion nezigotic asemntor cu embrionul zigotic
din punct de vedere al mrimii, structurii i comportamentului specific fiecrei specii, embrion
denumit embrion somaticfenomenul cptnd denumirea de embriogenez somatic.
Manifestarea totipotenialitii celulei vegetale n acest caz, al embriogenezei somatice, are
loc prin:
androgenez (neoformarea unui embrion, apoi a unei plante haploide dintr-un
microspor sau gruncior de polen); i
ginogenez (neoformarea unui embrion din oosfera nefecundat, embrion care
este haploid i va da natere unei plante haploide).
n inducerea genezei de embrioni din celule somatice n tehnica de multiplicare in vitro
laptele din nuc de cocos introdus n mediul de cultur, care este bogat n citochinine joac un rol
pozitiv hotrtor.
Ca i n cazul organogenezei, i n embriogeneza somatic exist embriogenez somatic
direct cnd embrionii somatici iau natere din celulele explantelor care s-au folosit la iniierea
-
8/10/2019 Microinmultire
31/135
- 31 -
culturii i embriogenez somatic indirectcnd embrionii se formeaz din celule de calus ori din
suspensii celulare care provin din calus sau protoplati.
Embriogeneza somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid
deine ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia, tulpinia ct i muguraul care
asigur viitoarei plante un excelent debut n via, odat cu germinaia.Prin embriogenez somatic, ntr-un timp scurt i cu mare vitez, se pot obine un numr
mare de copii ale unui organism vegetal elit.
Plantele rezultate din embrioni somatici, identice din punct de vedere genetic cu donatorul
de explante, sunt libere de ageni patogeni, au cretere uniform, sunt robuste, au o mare
productivitate iar produsele lor sunt superioare din punct de vedere calitativ.
Embrionii somatici pot fi stocai pe o perioad lung de timp ca material biologic n bnci
de gene. Din embrionii somatici, prin multiplicarea in vitro, se pot obine produi secundari demetabolism ce pot constitui surs de extracte cu efecte fitofarmaceutice.
Pe calea embriogenezei somatice, studiile de mutagenez pot permite selecia rapid de noi
mutani de la care se pot obine noi soiuri valoroase ce pot fi multiplicate uor i introduse n
cultur.
Embriogeneza in vitropermite producerea unui numr mare de haploizi i triploizi ntr-un
interval scurt de timp i cu randament economic ridicat.
-
8/10/2019 Microinmultire
32/135
- 32 -
Test de autoevaluare
2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de
cretere i dezvoltare a plantelor.
b) Definii i clasificai meristemele.
c) Definii procesele de difereniere i de dedifereniere celular.
d) Care sunt fazele dediferenierii?
e) Definii organogeneza i embriogeneza i menionai de cte feluri
sunt acestea.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.
Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei: Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic,
fiziologic i biochimic prin care are loc sporirea numrului de
celule prin acumularea de mas vegetativ, cnd au loc modificri
cantitative ireversibile iar n final plantele ating dimensiunile
caracteristice fiecrei specii.
Meristemele sunt esuturi care ndeplinesc funcia de multiplicare
celular, se divid tot timpul, constituind celule tinere n procesul de
multiplicare.
Clasificarea meristemelor se face dup localizare, caracteristici,
origine i funcie. Celulele tinere diferentiate, dup faza de divizare continu, sufer
transformri structurale i o specializare morfologic i fiziologic,
cu caracteristici noi, proprii celulelor adulte, mari.
Morfogeneza este diferenierea histologic complex a celulelor
care, n final, duce la formare de organe, proces denumit
organogenez sau generare de embrioni, proces numit
embriogenez.
-
8/10/2019 Microinmultire
33/135
-
8/10/2019 Microinmultire
34/135
- 34 -
Dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul
apical al tulpinii este constituit din: meristem de ateptare care corespunde
zonei apicale axiale i joac rol n formarea primordiilor florale i a
inflorescenelor; inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel
central nconjurat de celule care periodic vor genera frunzele i scoaratulpinii; meristemul medular ce ocup poziia central i este aezat sub
meristemul de ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere
parenchimului medular. n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o
sintez a clasificrii acestor categorii de meristeme: esuturi meristematice
primordiale fr celule, cu o celul iniial, cu mai multe celule iniiale.
esuturi meristematice primare semimeristeme: apicale, intercalare,
laterale. esuturi meristematice secundare pot fi: cambiul, felogenul.esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la
nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate
meristematic numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.
c) Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup
de celule poart denumirea de proces de inducie. Celulele asemntoare ca
structur i funciune care determin n esutul respectiv specificitatea
fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna funcionare aorganelor i activitatea intregii plante. Procesul de dedifereniere este invers
procesului de difereniere celular. El rar se petrece natural, spontan.
Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra
celulelor difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea
traumatic exogen. n cazul multiplicrii in vitro n condiiile detarii
explantelor dediferenierea se produce n sens regenerativ datorit aciunii
fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule
meristematice apte a se divide. Capacitatea celulelor de a se dediferenia este
inegal rspndit n corpul plantei i depindede ct de avansat este procesul
de difereniere n morfostructura celular.
-
8/10/2019 Microinmultire
35/135
- 35 -
d) Fazele dediferenierii sunt urmtoarele: prima faz caracterizat prin:
amorsarea proceselor de dedifereniere; producerea dediferenierii
celulelor, dobndirea caracteristicilor citologice ale unui esut
meristematic secundar cu celule aplatizate ce seamn ca aspect i
structur cu cambiul. A doua faz a dediferenierii const n:
dediferenierea celulelor pn la stadiu de meristem primar; generarea de
promeristeme sau meristemoizi din care pot aprea centre organogene
sau embriogene. A treia faz de dedifereniere se caracterizeaz prin:
formarea din celulele dedifereniate a calusului neorganizat, omogen
structural la nivelul cruia se pot forma meristemoizi sau centri
embriogeni.e) Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i
difereniere celular i tisular a organelor. n tehnica de multiplicare in
vitroeste vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a mugurailori
tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza). Embriogeneza
somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid
dein ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia,
tulpinia ct i muguraul care asigur viitoarei plante un excelent debutn via, odat cu germinaia.
-
8/10/2019 Microinmultire
36/135
- 36 -
2.4 Lucrare de verificare nr. 2
2.5 Bibliografie minimal
1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;
INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 2.
Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise tutorelui pentru comentarii,
corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie
urmtoarele:
Titulatura acestui curs (MICRONMULIREA PLANTELOR
HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele
studentei (studentului).
Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s nu depeasc o
jumtate de pagin. Punctajul aferent este menionat pentru fiecare
ntrebare.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de
cretere i dezvoltare a plantelor.-1p
2) Definii i clasificai meristemele.-3p
3) Definii procesele de difereniere i de dedifereniere celular.-2p4) Care sunt fazele dediferenierii?-2p
5) Definii organogeneza i embriogeneza i menionai de cte feluri
sunt acestea1p
* Un punct se acord din oficiu.
-
8/10/2019 Microinmultire
37/135
- 37 -
UNITATEA DE NVARE NR. 3:
LABORATORUL DE CULTURI IN VI TRO
CUPRINS
3.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 3 373.2 Alctuirea laboratorului 38
3.3 Dotrile laboratorului 45
3.4 Comentarii i rspunsuri la teste 50
3.5 Lucrare de verificare nr. 3 51
3.6 Bibliografie minimal 51
3.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 3
Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:
Cunoti alctuirea laboratorului de micronmulire.
Cunoti principalele dotri tehnice necesare procesuluitehnologic care se desfoar n cadrul micronmulirii.
Deprinzi primele noiuni despre procedurile de lucru.
Ai o viziune de ansamblu a ce presupune dezvoltarea unui
laborator de micronmulire, didactic/cercetare sau industrial.
-
8/10/2019 Microinmultire
38/135
- 38 -
3.2 Alctuirea laboratorului.
Laboratoul de culturi in vitroeste mprit n dou spaii strict delimitate care asigurfiecare
n parte fluxul tehnologic continuu dac este nevoie. Spaiile laboratoului de micronmulire sunt
ncperi amenajate facil pentru ntreinere i evacuare, cu pardoseal din gresie sau mozaic, cu
pereii acoperii cu faian sau vopsea de ulei pentru a seputea ntreine uor i a fi facil pentruprocesele de asepsie. Orice defeciune care s-ar produce n cadrul laboratorului, de mai lung
durat, poate provoca perturbaii grave n desfurarea lucrrilor, stagnnd fluxul operaiunilor i
ducnd la pierderi majore de material vegetal.
Un aspect important care trebuie subliniat este acela al asigurrii unei curenii perfecte n
toate compartimentele laboratorului, praful i murdria constituind surse constante de germeni,
respectiv de infecii.
Respectnd condiiile de asepsie, evitm infectarea mediului de cultur cu microorganisme,n caz contrar, acestea se vor nmuli (mediile fiind deosebit de bogate n nutrieni i vitamine), flora
dezvoltat n recipientul de cultur devenind concurent pentru esuturile i celulele inoculate.
Infeciile microbiene i fungice avanseaz n scurt timp (2-5 zile de la inoculare) iar mediul de
cultur i modific proprietile, se altereaz, n el fiind eliminate toxine, pH-ul se modific i,
treptat, dezvoltarea explantelor este ncetinit i ulterior stopat definitiv.
n consecin, unul din aspectele majore pe care trebuie s le avem n vedere atunci cnd
dorim s iniiem culturi in vitro l constituie asigurarea unei asepsii perfecte, att a materialului
biologic ct i a recipientelor i a mediilor de cultur.
Laboratoarele de micronmulire pot fi laboratoare pentru cercetri cu profil biologic,
fiziologic, ameliorare, laboratoare de micronmulire care deservescinterese didactice, laboratoare
de micronmulire pentru afaceri la scar redus i ultima categorie, laboratoare de micronmulire
pentru afaceri la scar industrial.
Cerinele pentru realizarea acestor spaii sunt multiple i in att de sigurana procesului de
produciei ct i de securizarea operaiunilor. Deobicei, laboratoarele sunt mprite n dou zone:
zona steril i zona nesteril.
Zona nesteril este spaiul destinat activitilor care se desfoar n condiii
nesterile i este reprezentat de spltor, laboratorul de preparare a mediilor de
cultur, spaiile de incubare, camera frigorific, ncperea cu autoclave etc.
Zona steril, ncpere aseptic, steril, care conine mai multe hote de lucru cu flux
laminar orizontal de aer steril ce sunt folosite pentru urmtoarele procedee de lucru:
dezinfectarea materialului vegetal, prelevare i inoculare explante in vitroi repicare
sau subcultivare.
-
8/10/2019 Microinmultire
39/135
- 39 -
Dimensionarea zonelor i ncperilor se va face innd cont de volumul de activitate pe care
laboratorul urmeaz s l aib, de amploarea personalului care va deservi laboratorul, mobilierul i
aparatura folosit. n funcie de specificul activitii, inclusiv mobilierul sau aparatura vor fi
diferite, ca n cazul culturilor de meristeme versus obinerea de material pentru aclimatizat i
plantat.Cnd se urmrete obinerea de material de plantat devirozat, nu trebuie scpat din vedere
necesitatea amenajrii de ncperi pentru aplicarea termoterapiei, precum i a unui laborator
profilat pe testarea i certificarea calitii i a strii de sntate a plantelor generate in vitro.
Materialul de plantat rezultat, transferat din in vitro n mediul septic, dup aclimatizarea lui n
camera de cretere, urmeaz s fie plantat n ser (o construcie special n cazul n care se
urmrete pstrarea culturii n condiii de protejare fa de ageni fitopatogeni, sau o construcie
obinuit).Faptul ca unele din activitile din laboratorul de micronmulire sunt sezoniere,
desfurndu-se n funcie de fenofazele speciilor lucrate, va trebui ca planul de afaceri sgenereze
o diversificarea a activitilor, astfel nct investiia s se justifice i activitatea s fie n flux
continuu.
Ambele zone trebuie s rspund condiiilor standard de amenajare a laboratoarelor de lucru
tiinifice i s primeasc avizele de funcionare de la forurile specializate. Se vor asigura instalaii
de ap, lumin, canalizare, nclzire, gaze, toate n condiii perfecte de funcionare.
Alcatuirea zonei nesterile
Spltorul
Acesta poate fi amenajat ntr-o ncpere (de cca. 16 mp) cu canalizare n pardoseal, ciment
mozaicat sau gresie pe jos, cu panta uoar - n condiii de scurgere prinpardoseal.
Splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, funcie de volumul
inoculrilor zilnice. Dup evacuarea culturilor, mediile cu agar se colecteaz n glei i se arunc la
gunoi (agarul nfund instalaiile de canalizare); recipientele golite de mediu cu agar (precum i cele
etaneizate prin aplicare de folie de polietilen la cald), prealabil splrii, vor fi nmuiate n ap.
n consecin, n spltor- n funcie de volumul de sticlrie manipulat zilnic - trebuie s
avem n vedere amenajarea unor bazine pentru: nmuierea sticlriei, pentru splarea propriu -zis a
acesteia i, eventual, un al treilea bazin pentru limpezirea sticlriei splate.
Deasupra chiuvetei se va instala un distilator (de 510 litri) cu ap distilat (prezentnd
scurgere bazal, unde se va racorda un tub de cauciuc, cu clem) prin intermediul cruia vom avea,
-
8/10/2019 Microinmultire
40/135
- 40 -
n imediata apropiere a acesteia, o surs de ap distilat,
necesar pentru limpezirea final a sticlriei.
Chiuveta va fi prevzut cu robinete de ap cald
i rece i cu un sistem de iluminare care s asigure o
lumin corespunztoare ca intensitate, pentru creareacondiiilor optime de verificare a gradului de curire a
obiectelor splate. n ncpere se vor monta rastele pentru
uscarea sticlriei. Pe pereii rmai liberi se pot amplasa
dulapuri, n scopul depozitrii sticlriei, a unor materiale
i a reactivilor care nu necesit condiii speciale de
pstrare.
n spltor se va proceda i la curareamaterialelor vegetale, de tipul rdcinilor, rizomilor,
bulbilor, tuberculilor etc.
n cazul n care nu avem posibilitatea s asigurm
ap cald la robinet, n apropierea chiuvetei se va instala
un boiler. n vecintatea chiuvetei trebuie s existe cutii
pentru gunoi (preferabil cu capac) i un suport pentru
perii (periile vor fi de diferite forme i mrimi), necesare
Distilator pentru splarea sticlriei. Pentru scurgerea sticlriei, se va
avea n vedere i amenajarea unor suporturi avnd perforaiisau grtare.
Laboratorul pentru pregtirea mediilor de cultur
Este ncperea destinat preparrii mediilor de cultur, care trebuie sa fie spaioas (s
permit accesul concomitent a 3-4 persoane) i s fie corespunztor iluminat. Laboratorul va
deine instalaii de: canalizare, de ap curent (rece i cald), gaze, electricitate, pomp pentru vid.
Pardoseala va fi acoperit cu materiale uor lavabile. Dac spaiul o permite, vor fi aezate me se
att la perete ct i n centrul ncperii. Mesele de lucru vor fi faianate sau vor fi acoperite cu
material plastic ori cu folie melaminat, pentru a putea fi ntreinute uor i pentru a rezista la
reactivi.
Pe perei i sub mese se vor monta dulpioare, n scopul depozitrii n ele a sticlriei i a
substanelor. n laborator trebuie s fie instalate chiuvete cu ap rece i cald iar, n vecintatea lor,
se vor amplasa recipiente cu ap distilat i bidistilat.
-
8/10/2019 Microinmultire
41/135
- 41 -
n dreptul meselor se vor afla instalaii de gaz(aproximativ 3-4 guri de gaz repartizate pe
perei diferii), prize pentru curent de 220 V, precum i instalaie de vid (pentru operaiunile de
filtrare).
n laborator vor fi amplasate diferite aparate i anume: etuve, (din care, cel puin o etuv - decapacitate mare va funciona n regim de 160180C i o alta de tip bacteriologic, necesar pentru
Cntar electronic Plit cu agitator magnetic Cuptormicrounde
incubare, la ntuneric, a inoculilor i care
va funciona la 24-38 C) ; 1-3 agitatoare
magnetice (dac se poate cu plit
electric) care vor fi necesare pentru
operaiunile de dizolvare a substanelor,
pH metru portabil Autoclav
mai ales atunci cnd avem n vedere prepararea soluiilor stoc; n
laborator snt indispendabile i 1-2 bain marrie, de mare
capacitate, pentru prepararea mediilor cu agar (se pot face i
improvizaii, folosind, ca nlocuitori, vase de buctrie, n care se
introduce un material textil, pentru a proteja recipientele n timpul
fierberii apei), mai ales cnd nu dorim s folosim autoclavulpentrusolubilizarea agarului. De mare utilitate n laborator este un pH-
metru; n laborator este indispensabil i prezena unui frigider, de
mare capacitate, cu congelator, pentru pstrarea soluiilor stoc, a
unor substane i mediile de cultur pn la folosire, dup
sterilizare. Materialul vegetal, pn n momentul prelevrii
explantelor, poate fi pstratn camera frigorific.
-
8/10/2019 Microinmultire
42/135
- 42 -
ntr-o camer nvecinat laboratorului se vor instala balane electronice care s permit
cntrirea pn la subuniti de gram (100 10 mg), microscop optic i un stereomicroscop,
destinate examinrii materialului biologic, pre sau post inoculare.
n laborator trebuie s existe un sortiment variat i n cantiti ndestultoare de sticlrie.
Sterilizareancperea care se preconizeaz a fi utilizat n scopul sterilizrii, respectiv n care va
funciona autoclavul, poate avea dimensiune variabil, n funcie de numrul autoclavelor i de tipul
i mrimea acestora. Pentru a nu se produce o strangulare a fluxului operaiunilor de inoculareeste
de dorit s dispunem de dou autoclave funcionale, de mare capacitate, pentru a permite
sterilizarea concomitent a ct mai multe flacoane cu mediu.
Autoclavarea recipientelor cu medii de cultur se face la temperatura de 121C i 1,1
atmosfere, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur. Flacoanele cu medii sedepoziteaz n casolete metalice (de tip medical) sau n couri din srm, ori n tvi metalice apoi se
introduc n autoclav, cu perforaiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu flacoane vor fi
nvelite n hrtie de mpachetat, perforatdin loc n loc pentru a se permite accesul aburului din
autoclav, n interiorul ambalajelor. Dup autoclavare, la transportare, casoletele vor avea
perforaiile obturate. Etuv
ncperea n care se monteaz autoclaveletrebuie s
aib pardoseal din ciment, cu scurgere. Mediile, odat
sterilizate, pot fi pstrate o perioad de timp (preferabil la
ntuneric), n camer frigorific, pentru a evita degradarea
vitaminelor i a hormonilor i pentru a prentmpina
deshidratarea mediilor, prin evaporarea apei.
Apa distilat este indispensabil n laborator, att
pentru prepararea apei bidistilate ct i pentru splarea
materialului biologic sau la cltirea final a sticlriei. Bidistilatoarele, n general, sunt din sticl
special, lipsit de ioni de natriu. Bidistilatoarele de mare capacitate snt electrice.
Camera de cretere
Camera de cretere sau de incubare a culturilor este destinat pstrrii n condiii optime a
inoculilor, n vederea asigurrii bunei dezvoltri a acestora. Ea trebuie s ntruneasc condiii
maxime de septicizare, s nu fie igrasie, s nu fie demisol sau subsol, dei literatura veche
recomand, din contr, acest tip de amplasament pentru evitarea fluctuaiilor mari de temperatur.
Recent, nu se mai recomand amplasarea camerelor de cretere sub nivelul solului, deoarece
-
8/10/2019 Microinmultire
43/135
- 43 -
pot aparea probleme legate de umiditate,
microorganismele specifice zonelor calde i
umede, fraerisire.
Amenajarea etajelor n camerele de
cretere trebuie fcut de aa manier ncts se foloseasc la maximum spaiul
disponibil, permindu-se totodat accesul
cu uurin la recipientele cu inoculi. n
cazul n care ncperea nu poate fi
climatizat, se recomand ca distana dintre
polie s fie ceva mai mare, de cea 4050
cm. S-a constatat c rafturile de 1 m lime,cu nlimea de 2 m i de lungime variabil,
snt cele mai practice.
Flacoanele de cultur cu inoculi
trebuie expuse la lumin, pe etajere
metalice, iluminate n regim prestabilit,
Camera de cretere
reglabil, preferabil automatizat, folosindu-se tuburi fluorescente amplasate deasupra culturilor, la o
distan de 30-40 cm. n cazul utilizrii polielor din sticl la care dedesubt, n imediata
apropiere a recipientelor se gsesc instalate tuburile de iluminare (corespunztoare raftului de jos)
aezarea flacoanelor s fie fcut pe un strat izolator, de exemplu din polistiren expandat, pentru
a nu se suprancinge, situaie n care mediul de cultur gelificat cu agar se va deshidrata i va crpa.
Regimul de temperatur al camerelor de cretere se recomand a fi la 25-27C (2C fa de
temperatura dorit) iar umiditatea de 50%, dar nu sub 50%. Fluctuaiile de temperatur, chiar i
numai cele provocate ca urmare a stingerii tuburilor fluorescente n perioada de ntuneric, produc
modificri ale volumului aerului din recipientele de cultur (prin creterea sau scderea presiunii
interioare) cu formarea unor cureni care vehiculeaz n recipiente spori i germeni, provocnd
infectarea secundar a mediilor de cultur, chiar dup o lung perioad de timp de la inoculare.
Tuburile fluorescente vor fi montate astfel nct s se evite orice posibilitate de incendiu i
s se asigure o iluminare uniform a suprafeelor. Fotoperioada optim, adecvat unei creteri
corespunztoare a celor mai multor tipuri de explante, este aceea de 16 ore lumin/8 ore ntuneric.
Recomandrile privind intensitatea optim a luminii, la suprafaa mediilor cu inoculi, variaz de la
caz la caz; de regul, se indic ca iluminarea s corespund la cea 22,6 Kluci.
-
8/10/2019 Microinmultire
44/135
- 44 -
Transferarea din in vitro n mediul septic se face
trecnd plantele printr-o etap de ac1imatizare. O prim
acomodare a plantelor la viaa n mediul septic se face n
condiiile camerei de cretere. Plantulele eliberate de mediu
vor fi splate n ap (meninut la temperatura camerei),apoi vor fi introduse cu rdcinile ntr-un substrat inert
(perlit, nisip, vermiculit) simplu, sau n amestec cu turb,
argil, mrani etc. cu asigurarea umiditii ridicate.
Regimul de iluminare i cel termic vor rmne, la nceput, n
limitele obinuiten care au fost cultivate plantulele in vitro, pentru ca apoi treptat, timp de cca. 3-4
sptmni, s se aduc plantulele la regimul obinuit de cultur. Uneori, literatura recomand
trecerea plantulelor pentru o prim perioad de aclimatizare n incinte cu cea i abia dup cca.2-3 sptmni s intre n procesul standard de aclimatizare.
Alctuirea zonei sterile
Camera steril
Este ncperea n care se execut
sterilizarea, prelevarea i inocularea
explantelor. Pereii ncperii aseptice vor fi
vopsii n ulei sau vor fi placai cu faian,
pardoseala va fi din ciment pentru a fi uor
lavabil, dar nu va avea canalizare n
podea. Camera steril este bine s fie
amenajat n apropierea laboratorului de preparare a mediilor. Hot cu flux laminar de aer steril
n camera steril vor fi montate nie sau boxe (hote) cu flux laminar orizontal continuu, de aer
steril. Acestea au forme i dimensiuni variate iar asepsia aerului este asigurat prin filtre speciale
care reinparticulele mai mari de 0,2 mm. Hotele vor fi orientate pe peretele opus uii i ferestrelor,
pentru a evita formarea curenilor de aer.
Manevrele efectuate n condiiile hotei cu flux de aer steril cer deprinderea operatorului, cu
un mod special de executare a micrilor, nefiind permis s se interpun mna, penseta sau alte
obiecte (chiar dac snt sterile), ntre curentul de aer steril i recipientul deschis; n caz contrar,
-
8/10/2019 Microinmultire
45/135
- 45 -
adeseori, procentul de infecii poate
fi mai ridicat dect n condiiile
executrii acelorai operaiuni, n
niele aseptice, improvizate.
De regul, nia sau hota trebuiencrcat naintea nceperii
lucrului numai cu obiecte
sterilizate, iar operatorul se va spla
cu alcool pe mini, de fiecare dat
cnd prsete i revine n
perimetrul baleiat, scldat" de
fluxul laminar, orizontal, de aer steril. n condiiile efecturii unor inoculri obinuite, hota va fipus n funciune cu cca. 20 de minute nainte de nceperea operaiunilor. Hota steril va fi
prevzut cu instalaie de gaze (ori cu lmpi de spirt) i, dac este posibil, i cu instalaie de
vacuum; n spaiul propriu-zis de lucru vor fi aezate i suporturi pentru instrumente sterile i,
firete, att n ni ct i n camer, vor fi montate instalaii obinuite de iluminat i tuburi pentru
emanaie de raze ultraviolete necesare sterilizrii.
3.3. Dotrile laboratorului
Sticlria
n general, ntr-un laborator de culturi de esuturi se utilizeaz toate tipurile de recipiente
din sticl, de uz comunn laboratoarele de chimie-biologie. n laboratoare sunt necesare i pipete,
cilindrii gradai, plnii, baloane cotate (de diferite capaciti), sticle i borcane pentru reactivi (de
variate tipuri i mrimi) precum i vasele Erlenmeyer i Berzelius, dedimensiuni diverse, capsule
Petri, casolete, baghete, tuburi din sticl, sticlele de ceas, nuci filtrante, filtre Millipor, seringi,
exicatoare etc.
Ca recipiente de cultur pot fi folosite i baloanele cu fund plat ori variate vase din sticl
incolor, de forme i mrimi diferite.Pe lng recipiente din sticl, se folosesc frecventi flacoane
sau capsule Petri, din material plastic, livrate sterilizate, ambalate fiind n pungi din polietilen.
Acest tip de recipiente nu se sterilizeaz, mediul sterilizat i cald, se toarn n recipientele sterile, n
condiii de perfect asepsie (n hota steril). n condiii de producie se folosesc dispozitive
automate de injectare (la cald) a unor cantiti fixe de mediu comparabil cu procedeele similare din
fabricile de medicamente.
-
8/10/2019 Microinmultire
46/135
- 46 -
Flacoanele cu medii de cultur, n vederea
sterilizrii, vor fi obturate cu dopuri de vat hidrofil,
nfurate cu tifon; periodic dup utilizri repetate
dopurile de vat vor fi autoclavate i apoi uscate n etuv.
Dup folosire ndelungat, dopurile de vat trebuie nlocuite,cu al