Download - Medicina Celulara LP 05 Anticorpi
Procedee microscopice de
investigare celulară
prin folosirea
anticorpilor
Dr. Cătălin Gabriel MANOLE
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Definiţia noţiunii de anticorp
• ANTICÓRP s. m. proteină specifică elaborată de organism ca răspuns la pătrunderea unui antigen. (< fr. anticorps) (DEX)
N.B. Prin antigen înţelegem orice proteină străină de organismul care produce anticorpul.
O imunoglobulină, în forma literei “Y”, produsă de limfocitele B, folosită de sistemul imun pentru identificarea și neutralizarea particulelor străine.
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Epitop
Paratop
Definiţia noţiunii de anticorp
Interacționează specific cu o
secvență de aminoacizi
(EPITOP) din structura unei
proteine (ANTIGEN)
Fiecare braț al anticorpului
conține un paratop, care este
specific pentru un singur
epitop.
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Epitop
Paratop
1. Regiunea Fab
2. Regiunea Fc
3. Lanț greu
4. Lanțurile ușoare
5. Paratop
6. Regiune balama
Structura generală
a anticorpilor
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
• Imunomarcare pentru microscopia optică
– Imunohistochimia
– Imunofluorescența
• Imunomarcare pentru microscopia electronică
– Imuno-electrono-microscopia
Metode de utilizare a
anticorpilor în microscopie
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Metode de
imunomarcare pentru microscopie
• Metoda directă
• Metoda indirectă
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
• Reprezintă totalitatea tehnicilor care folosesc
anticorpi pentru localizarea antigenelor
corespunzătoare
– pe secțiuni tisulare
• Criosecțiuni
• Secțiuni la parafină
– pe celule în cultură
• Face posibilă vizualizarea distribuției și localizării
componentelor celulare în microscopie optică
Imunomarcarea
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Principiul metodei
• Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un
anticorp (Ac)
• Ac sunt purificați din serul animalelor de laborator
• Ac vor fi cuplați cu un sistem de detecție
– ENZIMĂ căreia i se furnizează un SUBSTRAT care va fi
transformat într-un compus colorat (IMUNOHISTOCHIMIE)
• Vizualizare în microscopie optică, cu lumină directă
– MOLECULE FLUORESCENTE (IMUNOFLUORESCENȚĂ)
• Vizualizare în microscopie de fluorescență
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Metoda directă
- anticorp primar marcat -
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Metoda indirectă
anticorp primar nativ și anticorp
secundar marcat
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
{ IMUNOHISTOCHIMIA
Imunohistochimia
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Enzimă Substrat Culoare
Proxidaza de hrean Horseradish peroxidase
(HRP)
3,3'-diaminobenzidină (DAB) Brun-negru
Forfataza alcalină Alkaline phosphatase (AP)
Combinație de clorură de
tetrazoliu (nitro blue tetrazolium
chloride NBT) și 5-bromo-4-cloro-
3-indolil-fosfat (BCIP)
Negru – violet
http://www.ihcworld.com/products/ihc-detection-system/Chromogen.htm
DAB+ kit
BCIP/NBT
• Structuri membranare
• Organite celulare
• Componente nucleare
Ce structuri celulare pot fi
marcate ?
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Ac pentru ribozomi
ovar
Ac pentru mitocondrii
colon
Ac pentru
componente ale membranei plasmatice
ficat ficat
Ac pentru
componente ale invelișului nuclear
Evaluarea proliferării celulare
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Evaluarea apoptozei
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
IMUNOFLUORESCENȚA
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
• O variantă de luminiscență
• O moleculă capabilă de fluorescenţă (fluorofor,
sau fluorocrom) excitată cu lumină de o anumită
lungime de undă, va emite o radiație
electomagne-tică cu o lungime de undă
superioară, în spectrul vizibil
• Parametrii:
– Spectru de absorbție/excitație
– Spectru de emisie
– Intensitate
– Durată
Fluorescența
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Spectrul
electromagnetic
Microtubuli
ADN
Ribozomi
Filamente de actină
ADN
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
ADN (cromozomi)
Microtubuli (fus de diviziune)
Imuno-electrono
microscopia
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
• Metoda a fost introdusă pentru prima oară în
1971 de către Faulk & Taylor
• Folosește anticorpi adsorbiţi pe particule de aur
(5-30 nm)
• După caracteristicile anticorpului primar şi
structura celulară căreia se adresează
marcarea se poate realiza:
– pre-includere
– post-includere
• Metoda mai scumpă și mai laborioasă
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Date generale
- Cea mai bună metodă pentru detectarea și
localizarea proteinelor în diferite
compartimente celulare datorită puterilor de
mărire și de rezoluție superioare
Scop
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” București
Prolactină în
granule de secreţie
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968432811001417
http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2800001_jkms-25-16-g005&req=4
http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/BerndCV/Lab/EpithelialInfoWe
b/Transcytosis.html
În celule endoteliale din ficat
În endoteliul
aortic
IMUNOHISTOCHIMIE
IMUNOELECTRONOMICROSCOPIE
Evidenţieri
pentru
caveolină 1