Download - FDI2
PROTEINE
Definiţie
• Biomacromolecule formate din una sau mai multe catene, rezultate prin policon-densarea aminoacizilor.
Funcţionalitate extrem de diversă
• Biocataliza enzimatică• Hormoni• Transport, stocare• Formaţiuni motile• Suport structural• Anticorpi• Transmitere de impulsuri nervoase• Reglarea unor procese metabolice
Determinarea compoziţiei și purificarea proteinelor
1. Evaluarea conţinutului de proteină brută
• 1. Metoda KjeldahlSe bazează pe corelaţia conţinutului de
azot cu cel de proteină. Se consideră că proteinele contin 16 %
azot
Norg (NH4)2SO4
H2SO4
(NH4)2SO4 NH4OHNaOH
NH4OH NH3
NH3 NH4Cl
HCl
– Mineralizarea probei– Antrenarea amoniacului şi
dozarea acestuia
1. Evaluarea conţinutului de proteină brută
• 2. Metoda LowrySe bazează pe absorbanţala 660 nm a complexuluireacţiei de tip Biuret (proteină
+ Cu+2) şi formei reduse a reactivului Folin de catre Cu+
rezultat la oxidarea Tyr, Cysşi Trp
• Reactivi:– Soluţie alcalinocuprică– Reactiv Folin Ciocâlteu
(soluţie fosfomolibdo-wolframică NaWO4 2H2O NaMoO4 2H2O)
NO
N
H
R
H
N O
N
HR
H
Cu+2
Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
1. Evaluarea conţinutului de proteină brută
N
N
CO2H
CO2H
N
N
HO2C
HO2C
Cu+
• 3. Varianta reactivbicinconinic
Acid 2,2’ bichinolin 4,4’ dicar-boxilic
Proteina interacţionează cu ionul Cu2+ într+o reacţie similară cu reacţia Biuret. În urma acestei reacţii, în mediu alcalin are loc reducerea Cu2+ la Cu+ care dezvoltă o coloraţie purpurie prin complexare cu reactivul
562 nmAnal Biochem. 1985 Oct;150(1):76-85
• 4. Metoda Bradford• Deplasarea maximului de
absorbţie al colorantului în urma ataşării acestuia de proteină (465 595 nm)
CH3H3C
N
N
NH
O SO3-
SO3-
Coomassie Blue G-250
Bradford, M. M. (1976), Anal. Biochem. 72:248-254
2.Separarea și purificarea proteinelor
• 2.1. Distrugerea membranelor şi pereţilor celulari– Mijloace nechimice
• Utilizarea de abrazivi• Forfecarea prin de destindere• Ultrasonare
– Mijloace chimice• Solvenţi organici• Detergenţi• Agenţi chaotropici• Tratament alcalin• Enzime (lizozim)
DezintegratoareUltrasonic Forfecare la destindere
Dezintegratoare (continuare)
Centrifugarea2.2. Îndepărtarea resturilor de la omogenare
2.3. Purificarea grosieră a proteinelor
• Precipitare lapunctul izoelectric
• Precipitarea prin efect salin
Solubilitatea carboxihemoglobinei funcţie de tăria ionică și natura ionilor
Dializa
Purificarea fină a proteinelor
• Metode cromatografice• Metode electroforetice
Cromatografia de excluziune sterică
Electroforeza (principiu)
Relaţia mobilitate masa la separările electroforetice Gel electroforetic după migrare
Determinării structurii primare a proteinelor
1. Separarea catenelor (desfacere de legături slabe)– Utilizare de valori extreme ale pH-ului– Agenţi chaotropici (distrugători de structură)
• Uree 8M• Clorohidrat de guanidiună 6M
– Concentraţii ridicate de săruri (sulfat de amoniu)
2. Desfacerea puntilor disulfurice– metode reductive– metode oxidative
3. Stabilirea compoziţiei în aminoacizi– Hidroliza, separare
Secvenţa determinării structurii primare a proteinelor (continuare)
• 4. Stabilirea aminoacizilor de capăt– N, C.
• 5. Fragmentarea catenelor lungi– Chimic, enzimatic
• 6. Secvenţarea propriuzisă Edman• 7. Reconstituirea secvenţei prin alinierea
fragmentelor– Evaluarea secvenţelor pe tip de fragment
• 8. Relocarea punţilor disulfurice– Electroforeza fragmentelor înainte şi după desfacerea punţilor disulfurice
2.Desfacerea punţilor disulfurice
1. Căi reductiveMercaptoetanol
Ditiotreitol
2. Căi oxidativeAcid performic
3.Determinarea compoziţiei in aminoacizi
• Hidroliza acidă (HCl 6N la reflux 72-96h)
1. Separare cromatografica2. Identificare, cuantificare
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
NCH
R
O
O-H3N
R
CO2-
O
O-
NCH
R
CO2O
O-
NH2
R CHO
HOH
O
O-
N
O
O
OH
H
O
O-
N
O
OPurpura lui RUHEMANN
Ninhidrinã(tricetohidrindenhidrat)
dsdf
Rf=100 x ds/df
Reactia ninhidrinei şi determinarea calitativă prin cromatografie pe strat subţire a aminoacizilor
4. Determinarea aminoacizilor de capăt
• Aminoacizii N-teminali– a) dansilarea
• Aminoacizii C-teminali• a) Metoda Akabori
+ aa1 +...
hidrolizãacidã
-CH(R)-CO2H
NH3C CH3
SO2NH
Clorurã de dansil
-CH(R)-CO-NH-CH...
NH3C CH3
SO2NH
H2N-CH(R)-CO-NH-CH-....
NH3C CH3
SO2Cl
2,4 dinitrofluorobenzen
NO2
NO2
NH
NO2
NO2
NHNO2
NO2
F
+ aa1 +...
hidrolizãacidã
-CH(R)-CO2H-CH(R)-CO-NH-CH...
H2N-CH(R)-CO-NH-CH-....
a) Metoda Sanger
NH CH CO NH CH CO NH CH CO2-
R1R2R3
H2N NH2H2N NH2
H3N+ CH CO
Ri
NH NH2
H3N+ CH CO2
-
R1
i=2,...
Enzima Situs preferatTripsina R1: Lys, ArgClostripaina R1: ArgChimotripsina R1: Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, TrpTermolisina R2: Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, TrpPepsina R1: Phe, Leu, mulţi alţi aminoaciziProtează stafilococică (tampon fosfat) R1: Asp, GluProtează stafilococică (tampon HCO3- ) R1: GluSubtilizina R1: MulţiCarboxipetidaza A R2: Aminoacid C- terminal (exceptie, Arg,
Tyr, Trp)
H3N CH C
R1 O
O COOH3N CH
R2
H3N CH C NH
R1 O
COOCH
R2
5. Fragmentarea catenei polipeptidice
a. Fragmentare enzimatică
+
bromocian
homoserinolactona
H3NC NH CH C O
O
CH2
CH2
O
HO
H
SCNH3C
C NH CH C N
O
CH2
CH2
O
H
C NH CH C N
O
CH2
CH2
SH3C CN
O
H
C
N
Br
C NH CH C NH
O
CH2
CH2
SH3C
O
b. Fragmentare chimică cu bromocian
6. Secvenţarea Edman
N
NH
O
R1
S
NC
S
R1
NH
H2N
O
R2O
(H*)
R1
NH
N
O
R2O
S
CNH
H
(H*)
NH2
R2O
R1N
OS
CN
H(H*)
CF3CO2H
pH = 9
mediu apos
feniltiocarbamoil peptidă
peptida fărăaminoacidul N-termina
AnilinotiazolinonăFeniltiohidantoină (PTH)
7. Reconstitu-irea secvenţei totale
8. Relocarea puntilor disulfurice
Alanina A alaArginina R argAsparagina N asnAcidul Aspartic D aspCisteina C cysGlutamina Q glnAcidul Glutamic E gluGlicina G glyHistidina H hisIzoleucina I ileLeucina L leuLizina K lysMetionina M metFenilalanina F pheProlina P proSerina S serTreonina T thrTriptofan W trpTirozina Y tyrValina V val
Aminoacizii naturali, sistematizaţi pe diferite criterii
L-prolinaL-aminoacid
Structura primară şi secundară a unei proteine
Diagrama Ramachandran
Unghiurile de torsiune şi
Conformatiedefavorizata
Structuri helix
Principalele tipuri de structuri secundare dispuse pe diagrama Ramachandran
Modelulalfa helix în diferitereprezentări
Modele foi plisate (modele beta) paralel si antiparalel
Modelul paralel
Modelul antiparalel
Foi beta : model antiparalel
Foi beta : model paralel
Model paralel
Model antiparalel
FOI BETA
Model foaie beta antiparalel extins
Modalităţi de conectare ale structurilor beta:a) Antiparalel, prin buclăb) Paralel, prin buclă de dreapta, cazul comunc) Paralel, prin buclă de stânga, caz extrem de rar
Modalităţi de formare a structurilor helicoidale din proteine
Bucle• Buclele se plasează
între helixuri sau foi plisate. Ele nu sunt atât de rigide. De regulă aceste regiuni sunt zone de recunoaştere
Structuri suprasecundare
Interacţiuni care stabilizează structurile terţiare proteice