UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
CRAIOVA
FACULTATEA DE MEDICINĂ GENERALĂ
REZUMAT
TEZĂ DOCTORAT
Rolul celulelor stem progenitoare circulante
şi al receptorilor factorilor de creştere
în diagnosticul şi terapia tumorilor cerebrale
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof. Univ. Dr. Dricu Anica
DOCTORAND
Bănicioiu Mihai Daniel
Studiile au fost finanţate din proiectele:
FONDUL SOCIAL EUROPEAN, COD: POSDRU/6/1.5/S/8
PARTENERIATE IN DOMENII PRIORITARE, COD PROIECT: PNI/ 4.1/41-063/2007
CRAIOVA
2011
2
Investeşte în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Axa Prioritară: 1. Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii
economice şi dezvoltării societăţii
Domeniul Major de Intervenţie: 1.5. Programe doctorale şi postdoctorale în
sprijinul cercetării
Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecvenţă prin acordarea de
burse doctorale"
Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8
Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova
3
CUPRINS
PARTEA GENERALĂ (STADIUL CUNOAŞTERII)
1. TUMORILE CEREBRALE
1.1 Consideraţii generale..............................................................................................................................................................................................................................5
1.2 Clasificarea tumorilor cerebrale......................................................................................................................................................................................5
1.3 Epidemiologie........................................................................................................................................................................................................................................................6
1.4 Simptomatologie...............................................................................................................................................................................................................................................6
1.5 Diagnostic şi investigaţii..................................................................................................................................................................................................................6
1.6 Tratamente......................................................................................................................................................................................................................................................................6
1.7 Celulele stem canceroase cerebrale............................................................................................................................. ..............................................7
2. GLIOBLASTOMUL
2.1 Incidenţă............................................................................................................................. .................................................................................................................................................8
2.2 Etiologie şi factori predictivi....................................................................................................................................................................................................8
2.3 Tablou clinic................................................................................................................................................................................................................................................................8
2.4 Biologie moleculară.....................................................................................................................................................................................................................................9
2.5 Rolul celulelor stem progenitoare circulante în diagnosticul glioblastoamelor............10
3. TIPURI DE TRATAMENT ÎN GLIOBLASTOM
3.1 Terapia chirurgicală...................................................................................................................................................................................................................................10
3.2 Radioterapia................................................................................................................................................................................................................................................................10
3.3 Chimioterapia.....................................................................................................................................................................................................................................................11
4. RECEPTORII TIROZIN-KINAZICI ŞI LIGANZII LOR
4.1 Familia IGF ..............................................................................................................................................................................................................................................................11
4.2 Familia EGF..............................................................................................................................................................................................................................................................12
4.3 Familia PDGF........................................................................................................................................................................................................................................................12
4.4 Familia VEGF........................................................................................................................................................................................................................................................12
PARTEA SPECIALĂ (STUDIU EXPERIMENTAL)
5. OBIECTIVE......................................................................................................................................................................................................................................................13
6. MATERIAL ŞI METODĂ..............................................................................................................................................................................................14
6.1 Materiale...........................................................................................................................................................................................................................................................................14
6.2 Celule şi culturi celulare.................................................................................................................................................................................................................14
6.3 Tratarea celulelor...........................................................................................................................................................................................................................................14
6.4 Determinarea viabilităţii celulare............................................................................................................................. ...................................................15
6.5 Determinarea timpului de dublare a celulelor (T2) .............................................................................. ....................15
6.6 Western Blotting.............................................................................................................................................................................................................................................16
6.7 Citometrie de flux.........................................................................................................................................................................................................................................16
6.8 Analiza statistică.............................................................................................................................................................................................................................................17
7. REZULTATE.................................................................................................................................................................................................................................................17
8. DISCUŢII................................................................................................................................................................................................................................................................28
9. CONCLUZII.....................................................................................................................................................................................................................................................31
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ..................................................................................................................................................................................32
4
INTRODUCERE
În ciuda descoperirilor recente din lumea medicală, una dintre principalele cauze de
mortalitate şi morbiditate în intreaga lume o reprezintă cancerul. În ţara noastră, incidenţa
tumorilor cerebrale maligne este de 4,3/100000 locuitori, ele constituind 2% din totalitatea
neoplaziilor la adult, mortalitatea generală fiind de 4,65/100000 locuitori. (Iacob et al. 2004).
În această teză de doctorat, cercetarea a fost restrânsă la studierea unor aspecte
neelucidate încă, referitoare la clasa tumorilor cerebrale. Tumorile cerebrale prezintă o mare
varietate ca tip, localizare, rată de creştere şi sunt extrem de heterogene din punct de vedere
fenotipic şi genotipic. Cea mai frecventă şi cea mai agresivă tumoră cerebrală la adulţi este
reprezentată de glioblastomul multiform, caracterizat de o creştere rapidă şi de capacitatea de a
infiltra ţesuturile adiacente, având o rată medie de supravieţuire de aproximativ 14 luni.
Lucrarea de faţă este un răspuns la necesitatea observată şi prin studierea literaturii de
specialitate în ceea ce priveşte diagnosticul şi terapia tumorilor cerebrale. Acest domeniu este în
continuu cercetat şi are extraordinar de multe aspecte neexploatate încă. În aceste condiţii, am
considerat oportun sa elucidez, măcar în parte, următoarele probleme legate de
- corelaţia dintre gradul tumoral şi numărul de celule endoteliale progenitorii circulante,
- efectul produs de inhibitorul STI571 (Imatinib mesylate) asupra celulelelor de
glioblastom în vitro şi
- evaluarea efectului citotoxic al agentului de metilare S-adenozil-metionina (SAM)
asupra tumorilor cerebrale de grad înalt (high grade glioma, HGG) şi a interferenţei cu expresia
IGF-1R în vitro.
La finalizarea acestei teze, doresc sa menţionez că lucrarea de faţă nu ar fi putut fi dusă la
bun sfârşit fără îndrumarea competentă şi susţinută a doamnei Prof. Dr. Anica Dricu,
conducătorul meu de doctorat, căreia îi adresez sincere mulţumiri.
Cuvinte cheie:tumori cerebrale, celule stem progenitoare circulante, receptori ai
factorilor de creştere.
5
PARTEA GENERALĂ (STADIUL CUNOAŞTERII)
1. TUMORILE CEREBRALE
1.1 Consideraţii generale
Deşi cele mai recente tratamente împotriva cancerelor controlează creşterea şi
proliferarea celulelor tumorale, acestea nu sunt capabile de a eradica în totalitate masa de celule
tumorale (Schulenburg 2006). Metodele terapeutice folosite în tratamentul tumorilor cerebrale
sunt foarte variate şi alegerea lor este dictată de factori precum vârsta pacientului, dimensiunea şi
localizarea tumorii sau rata de creştere estimată postterapeutic. În prezent, biologia tumorilor
cerebrale este incomplet cunoscută, mai ales în ceea ce priveşte relaţia cu parenchimul adiacent
indemn.
1.2 Clasificarea tumorilor cerebrale
În conformitate cu clasificarea WHO, Organizaţia Mondială a Sănătaţii (WHO) a
clasificat tumorile cerebrale astfel:
1. Tumori neuroepiteliale: a) Tumori gliale; b) Tumori neuronale şi neuronal-gliale
mixte; c) Tumori nongliale
2. Tumori meningeale: a) Meningioame; b) Hemangiopericitoame; c) Leziuni
melanocitice
3. Tumori ale celulelor germinale:a) Germinoame; b) Carcinoame embrionare;
c)Tumori ale sinusului endodermal; d) Coriocarcinoame; e) Teratoame; f) Tumori mixte ale
celulelor germinale
4. Tumori ale regiunii selare: a) Adenoame pituitare; b) Carcinoame pituitare;
c)Craniofaringioame
5. Tumori cu histogeneză nesigură:
6. Limfomul primar al SNC
7. Tumori ale nervilor periferici ce afectează SNC:
8. Tumorile metastatice
6
Glioamele maligne reprezintă o clasă de tumori cerebrale care include mai multe entităţi
heterogene cu origine comună, derivând din celulele gliale. Din punct de vedere histopatologic,
glioamele sunt clasificate în astrocitoame, oligodendroglioame, oligoastrocitoame şi tumori
ependimale.
Glioblastoamele sunt stadializate în 4 grade, gradul IV fiind reprezentat de glioblastomul
multiform cu gradul cel mai înalt de malignitate, acesta fiind cea mai agresivă şi cea mai
frecventă formă, fiind caracterizat prin celularitate intensă, activitate mitotică, proliferări
microvasculare şi necroză (Louis et al. 2007).
1.3 Epidemiologie
Etiologia tumorilor cerebrale este necunoscută până în prezent. Totuşi sunt câteva
sindroame ereditare familiale care au fost asociate cu apariţia tumorilor cerebrale primare:
neurofibromatoza 1 şi 2, sindromul Li-Fraumeni şi sindromul Turcot (Louis and von Deimling
1995).
1.4 Simptomatologie
Creşterea masei tumorale determină semnele specifice hipertensiunii intracraniene şi
simptome nespecifice ale tumorilor cerebrale precum: convulsii, hemipareze, dificultăţi de
vorbire, tulburări de personalitate, crize convulsive această simptomatologie depinzând de
localizarea tumorii.
1.5 Diagnostic şi investigaţii
Diagnosticul de certitudine al tumorilor cerebrale este histopatologic şi se pune după
analiza unui fragment de ţesut tumoral în urma unei biopsii. De asemeni, investigaţiile imagistice
au o importanţa deosebită în stabilirea diagnosticului, examinarea tomografiei computerizate
(CT) furnizând date importante în legătură cu diametrele, localizarea şi caracteristicile tumorii,
iar rezonanţa magnetică nucleară (RMN) permite identificarea cu precizie a caracteristicilor
tumorale cât şi raporturile acesteia cu structurile anatomice învecinate. Spectroscopia prin
rezonanţă magnetică (RMS) este o metodă imagistica relativ nouă ce vizualizează distribuţia
regională a substanţelor chimice asociate cu metabolismul tumoral şi modificările biochimice.
1.6 Tratamentul tumorilor cerebrale
Terapia standard pentru patologia tumorală cerebrală este reprezentată de chirurgie,
radioterapie şi chemoterapie, aceste metode având însă o specificitate redusă pentru celulele
7
tumorale precum şi efecte adverse semnificative. În plus, ele pot determina apariţia de novo a
unei alte tumori.
Chirurgia reprezintă în prezent principala modalitate de tratament a tumorilor cerebrale.
Radioterapia s-a dovedit utilă în tratamentul majorităţii tumorilor cerebrale şi a
metastazelor. Radioterapia poate fi utilă ca şi monoterapie, pre- sau postoperator, sau în asociere
cu chimioterapia.
Dezavantajele chimioterapiei sunt reprezentate de rezistenţa intrinsecă la agenţii
chimioterapici şi de dezvoltarea chimiorezistenţei pe parcursul tratamentului. De aceea se
recurge adesea la tratamente care utilizează combinaţii dintre diferiţi agenţi chimioterapici.
1.7 Celulele stem canceroase cerebrale
Conform teoriei moderne, transformarea malignă a celulei normale în celula canceroasă
se petrece la nivelul celulelor stem existente în ţesutul adult. În pofida cercetărilor intense din
ultima perioadă, originea exactă a celulelor stem canceroase (CSC) rămâne necunoscută.
În tumorile cerebrale, celulele stem canceroase se găsesc în procent de 1% până la 30%
şi, conform datelor publicate în literatura de specialitate, prezintă proprietăţi similare celulelor
stem neurale (Beier et al. 2007) .În prezent, markerii de suprafaţă ai celulelor stem canceroase au
fost identificaţi în numeroase tipuri de cancere.
La nivel molecular, o etapă importantă în apariţia celulelor stem tumorale (CST) ar putea
fi reprezentată de alterarea căilor de autoregenerare a celulelor stem adulte existente în tesutul
cerebral. În tumorile cerebrale sunt afectate deopotrivă căile proliferării şi diferenţierii celulare,
cât şi mecanismele morţii celulare. Proto-oncogenele sunt convertite în oncogene şi devin
amplificate sau suferă mutaţii activatoare.
Conceptul ca dezvoltarea şi progresia tumorala să depindă de evoluţia CST schimbă
dramatic posibilităţile prin care boala canceroasă poate fi vindecată. Identificarea şi terapia ţintită
împotriva CST reprezintă o provocare majoră în terapia modernă anticanceroasă, cercetătorii
încercând să găsească noi terapii molecular ţintite împotriva acestor celule.
8
Figura 1. Terapia ţintită împotriva CST. Noul tip de terapie tumorală
2.GLIOBLASTOMUL
2.1.Incidenţa
Glioamele maligne sunt cele mai frecvente tipuri de tumori cerebrale primare la adulţi în
unele studii, fiind relatate ca reprezentând aproximativ 50% din tumorile cerebrale primare,
glioblastomul fiind cel mai întâlnit subtip histologic la adulţi (Lonn et al 2005).
2.2. Etiologie şi factori predictivi
Glioblastomul primar apare cu predilecţie la adulţi, cu vârsta între 40 şi 70 ani, bărbaţii
fiind mai frecvent afectaţi. Radiaţiile ionizante au fost de asemenea asociate cu o probabilitate
crescută de apariţie a acestuia (Ohgaki and Kleihues 2005).
2.3. Tablou clinic
Simptomatologia glioblastoamelor primare se instalează relativ rapid, în mai puţin de 3
luni, în cazul glioblastoamelor secundare istoricul clinic al bolii fiind mai lung - intre 1 şi 5 ani
(Ohgaki and Kleihues 2005). Cele mai frecvente localizări sunt: lobul frontal, lobul parietal,
lobul temporal şi lobul occipital.
Simptomatologia poate fi nespecifică, cuprinzând semnele presiunii crescute
intracraniene sau specifică localizării tumorii. Simptome generale cuprind: cefalee, vărsături,
tulburări vestibulare, crize comiţiale.
9
2.4. Biologie moleculară
Procesul de transformare neoplazică constă în modificări la nivelul oncogenele, genelor
supresoare tumorale, genelor ce sunt implicate în repararea AND-ului celular şi genelor ce
mediază ciclul celular şi apoptoza.
Glioblastoamele primare se caracterizează prin amplificarea sau supraexpresia EGFR
(receptorul factorului de creştere epidermal) şi supraexpresia MDM2, LOH 10q (mutaţii ale
genelor PTEN şi RB1), mutaţii ale genei TP53 fiind găsite mai rar în acest grup de tumori
(Ohgaki and Kleihues 2007). În cazul astrocitoamelor de grad inferior frecvent apar mutaţii ale
genei TP53, acestea fiind cele mai timpurii alterări genetice detectate. De asemenea,
supraexpresia factorului de creştere plachetar (PDGF) este un eveniment timpuriu în dezvoltarea
astrocitoamelor de grad inferior. În progresia către glioblastomul secundar grad IV, LOH 10q
intervine ca un eveniment tardiv.
Mutaţiile genetice pot apărea şi progresiv, de la tumorile de grad inferior, grad II către
cele de grad III şi apoi către glioblastomul secundar, grad IV. Durata până la progresia către
gradul IV poate varia între 1 şi 5 ani.
Figura 2. Progresia de la glioamele cu grad mic de malignitate la glioblastomul primar si
secundar.
10
2.5 Rolul celulelor stem progenitoare circulante în diagnosticul glioblastoamelor
Glioblastoamele sunt caracterizate de o neovascularizaţie bogată, ce joacă un rol deosebit
de important în dezvoltarea şi progresia tumorală. Celulele endoteliale progenitorii (CEP) sunt
celule derivate din măduva hamatogenă şi au proprietatea de a se diferenţia în celule endoteliale
mature. Fenotipul CEP este caracterizat de expresia markerului specific hematopoietic CD34,
markerul specific celulelor stem CD133 şi a markerului endotelial VEGFR2 (Peichev et al.
2000). Eliberarea şi mobilizarea CEP este influenţată de factorii de creştere pro-angiogenici
(Kalka et al. 2000).
Rafat et al. a desfăşurat un studiu în care a inclus pacienţi cu glioblastom (GBM) şi
pacienţi cu metastaze cerebrale, numărul de CEP circulante fiind semnificativ crescut la pacienţii
cu GBM faţă de cei cu metastaze şi faţă de grupul control.
Deşi mecanismele fiziopatologice prin care intervin şi influentează angiogeneza şi
progresia tumorală nu sunt pe deplin cunoscute, CEP s-au dovedit a fi un potenţial marker atât
pentru neoangiogeneza tumorală cât şi pentru răspunsul la terapia antiangiogenică.
3. TIPURI DE TRATAMENT ÎN GLIOBLASTOM
3.1 TERAPIA CHIRURGICALĂ
Intervenţia chirurgicală are un rol important în managementul terapiei glioblastomului.
Scopurile intervenţiei chirurgicale sunt obţinerea materialului bioptic necesar examenului
histopatologic şi extirparea tumorii în scop curativ. Glioblastomul cât şi astrocitomul de grad III
WHO sunt tumori cu caracter infiltrativ, marginile tumorii fiind neregulate şi insotite de edem
peritumoral, astfel o rezecţie totală fiind greu de realizat.
3.2 RADIOTERAPIA
3.2.1 Radioterapia convenţională
Tratamentul standard după rezecţia totală sau parţială a tumorilor de grad III sau IV este
radioterapia externă fracţionată. Recomandările actuale sunt administrarea unor doze totale de
50-60 Gy, în fracţiuni de 1.8-2.0 Gy pe zi, cinci zile pe săptămână, timp de 6 sau 7 săptămâni
(Laperriere et al. 2002).
11
3.2.2 Radioterapia streotactică
Avantajele radioterapiei stereotactice sunt reprezentate de faptul că dozele de radiaţii sunt
mai mici decat cele utilizate în radioterapia fracţionată, datorită direcţionării mai precise a
radiaţiilor pe direcţia masei tumorale. Metoda are eficacitate crescută, iar riscul lezării ţesutului
normal adiacent este mai scazut. Două din metodele de tratament ale radioterapiei stereotactice
sunt Gamma knife şi Cyberknife.
3.2.3 Alte modalităţi de radioterapie
BNCT (boron neutron capture therapy) este o metodă de tratament promiţătoare în terapia
glioblastomului, dar deocamdată este înca la nivel experimental (Joensuu et al 2003). BNCT se
bazează pe capacitatea particulelor de 10B de a capta neutroni termici şi de a determina
dezintegrarea acestora în particule α şi nuclei de litiu.
Radioterapia hiperfracţionată ce utilizează mai multe doze mici de radiaţie pe parcursul
unei zile şi creşterea dozei totale până la 70 Gy, nu a îmbunătăţit supravieţuirea pacienţilor cu
glioame maligne (Prados et al 2001).
3.3 CHIMIOTERAPIA
Trialurile clinice ce au comparat radioterapia versus radioterapie plus chimioterapie au
aratat o creştere a duratei medii de supravieţuire în cazul folosirii radioterapiei şi chimioterapiei
adjuvante (Stewart et al 2002). Cea mai utilizată combinaţie medicamentoasă este numită PCV şi
este formată din procarbazină, lomustină şi vincristină (Stupp et al 2005).
Inhibarea genei MGMT asociată cu rezistenţa la agenţi alchilanţi s-a dovedit a fi un factor
important în creştererea ratei de supravieţuire. (Heigi et al 2004).
4. RECEPTORII TIROZIN-KINAZICI ŞI LIGANZII LOR
4.1 Familia IGF. Liganzii şi receptorii IGF
Factorul de creştere insulinic de tip 1 (IGF-1) este o proteină codificată de gena IGF1
aflată pe cromozomul 12. IGF-1 este sintetizată în principal în ficat şi producerea sa este
stimulată de hormonul de creştere (GH). IGF-1 şi receptorul său specific IGF-1R sunt implicaţi
în stimularea creşterii celulare, proliferare şi inhibarea apoptozei. IGF-1R deţine un rol important
în menţinerea fenotipului malign, supraexpresia sa fiind exprimată în mai multe tipuri de
cancere.
12
4.2 FAMILIA EGF. Liganzii şi receptorii EGF
EGFR (receptorul factorului de creştere epidermal) este un receptor tirozinkinazic,
implicat în stimularea diviziunii celulare, proliferare şi invazie. Gena EGF prezintă amplificări şi
supraexpresie în aproximativ 40% din cazurile de glioblastom, majoritatea primar (Ekstrand
et.al. 1992).
Cea mai comună mutaţie a EGFR este EGFRvIII, mutaţie ce constă în deleţia exonilor 2
– 7, rezultând o variantă de receptor fără domeniul de legare ligand-specific funcţional.
4.3 FAMILIA PDGF. Liganzii şi receptorii PDGF
Liganzii factorului de creştere derivat din plachete: PDGF-A, -B, -C,-D, sunt recunoscuţi
de două tipuri de receptori PDGFR-α (specifici celulelor tumorale) şi PDGFR-β (specifici
vaselor tumorale) localizaţi pe membrana celulara. Supraexpresia PDGFR-α apare frecvent în
glioamele cu grad scăzut de malignitate şi este implicată în progresia acestora către
glioblastomul secundar. Supraexpresia PDGFR-α este frecvent însotită şi de LOH 17p şi deleţia
genei TP53.
4.4 FAMILIA VEGF. Liganzii si receptorii VEGF
Liganzii familiei VEGF (VEGF – A, VEGF – B, VEGF – C, VEGF – D) influentează
răspunsul celular prin legarea de receptorii specifici VEGFR – 1, VEGFR – 2, VEGFR – 3, sunt
activaţi prin transfosforilare. În procesul angiogenezei, cea mai importantă izoformă este VEGF
– A, ce are rol în stimularea migrării şi mitozei celulelor endoteliale, în formarea lumenului
vaselor de neoformaţie şi stimularea migrării monocitelor şi macrofagelor. VEGF – B are rol in
angiogeneza embrionară, iar VEGF – C SI VEGF – D au rol în angiogeneza vaselor limfatice.
Niveluri crescute de VEGF au fost detectate în zonele necrotice cu hipoxie accentuată la
pacienţii cu glioblastom. De asemeni, nivelurile crescute de VEGF au fost asociate cu o
progresie rapidă tumorală şi un prognostic rezervat.
13
PARTEA SPECIALĂ (STUDIUL EXPERIMENTAL)
5. OBIECTIVE
OBIECTIVUL NR. 1 - Evaluarea numărului de CEP circulante la pacienţii cu
glioblastom, comparativ cu pacienţii diagnosticaţi cu tumori cerebrale de grad mic;
Motivaţia studiului: În procesul de neoangiogeneză, proces important în creşterea şi
invazia glioblastomului, un rol important îl joacă eliberarea şi mobilizarea celulelor progenitorii
endoteliale (CEP) circulante derivate din maduva hematogenă. Un nou concept apărut recent ar fi
că celulele tumorale pot produce diverse semnale moleculare ce pot elibera şi mobiliza CEP
circulante la locul tumorii, unde au ca scop stimularea neoangiogenezei. În plus, markerii de
suprafaţa ai celulelor stem canceroase au fost identificaţi în numeroase tipuri de cancere,
evidenţiindu-se importanţa pe care o au în diagnosticarea cancerului
OBIECTIVUL NR. 2 - Determinarea efectului produs de tratamentul cu STI571
asupra celulelor de glioblastom in vitro;
Motivaţia studiului: Ţinte terapeutice specifice în ţesuturile maligne sunt reprezentate şi
de receptorii tirozinkinazici şi receptorii tirozinkinazici constitutiv activi, deoarece aceste
proteine au o expresie înaltă la nivelul ţesutului malign. Există la această oră diferite modalităţi
de inactivare a receptorilor tirozinkinazici cum ar fi: anticorpi monoclonali, inhibitori cu
moleculă mică, peptide sintetice, siRNA etc. Un inhibitor cu moleculă mică, utilizat la aceasta
oră ca tratament în diferite forme de cancer, este STI571 (Imatinib mesylate). STI571 se
foloseşte în tratamentul leucemiei limfoblastice acute, dar şi alte tipuri de cancere cum ar fi
tumorilor stromale gastrointestinale sau cancerul pancreatic. Nu este însă foarte bine elucidat
rolul său în tratamentul glioblastomului.
OBIECTIVUL NR. 3 - Evaluarea efectului citotoxic al agentului de metilare SAM
asupra tumorilor cerebrale de grad inalt (high grade glioma, HGG) şi a interferenţei cu
expresia IGF-1R in vitro.
Motivaţia studiului: Studii anterioare au arătat ca S-adenozil-metionina (SAM),
principalul donor de grupări metil în numeroase procese biologice, induce moartea celulelor
canceroase prin modificarea profilului de metilare ADN. Alte studii ştiintifice sugerează, că
SAM inhibă efectul mitogen al factorilor de creştere în celulele canceroase. De asemenea,
studiile anterioare demonstrează importanţa IGF-1R în supravieţuirea şi proliferarea celulelor de
glioblastom.
14
6. MATERIAL ŞI METODĂ
6.1 Materiale
Materialele utilizate în studiu au avut urmatoarele provenienţe: reactivii utilizaţi pentru
tratarea culturilor celulare -: Invitrogen/Life Technologies, Inc.(Rockville, MD, SUA), Bovine
serum albumin (BSA) - Sigma (St. Louis, MO, USA), STI571 - Novartis Pharmaceuticals Corp.
(Basel, Switzerland). IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF şi FGF-2 - R&D Systems
(Abington, UK). Kitul MTT - Roche Diagnostics Gmbh (Mannheim, Germany),
S’Adenosylmethyonina (SAM) - New England Bio-labs.
6.2 Celule şi culturi celulare
Linia celulară BT1GB a fost etablată din segment tumoral colectat de la pacient cu
glioblastom în concordanţă cu procedurile standard. Culturile celulare primare 18 şi 38 au fost
etablate din tumori cerebrale cu grad înalt de malignitate (HGG), la Spitalul Universităţii
Uppsala, în concordanţă cu procedurile standard.
Toate liniile celulare au fost cultivate în mediu Minimum Essential Modified (MEM) ce
conţine 10% ser fetal bovin (FBS), 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi
100UI/ml streptomicină). Celulele au fost cultivate în recipiente de culturi de celule de diferite
dimensiuni, în role Petri, având diametrul de 35mm, 60mm şi 150mm sau în plăcuţe cu 96 de
godeuri (în funcţie de tipul fiecărui experiment), şi au fost menţinute în incubator umidifiat la
37°C , 95%O2 şi 5%CO2.
6.3 Tratarea celulelor
Celulele de glioblastom BT1GB au fost cultivate în MEM ce conţine 10% ser fetal bovin
(FBS) suplimentat cu 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi 100UI/ml
streptomicină). Celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml. După atingerea
confluenţei, celulele au fost tripsinizate apoi au fost transferate în plăcuţe cu 96 de godeuri (în
funcţie de designul fiecărui experiment) şi menţinute în incubator umidifiat la 37°C, 95%O2 şi
5%CO2. Pentru determinarea dozei-răspuns, celulele au fost cultivate în condiţii standard de
cultură (mediu complet cu 10% FBS şi suplimente) şi tratate cu STI571 0.3125M, 0.625M,
1.25M, 2.5M, 5M, 10M, 20M, 40M, 60M sau 80M, la interval de 24 de ore, timp de
3 zile. STI571 a fost diluat în apă. S-a folosit o soluţie stoc de 100 mM care a fost păstrată la -
20°C. Controlul a constat din celule netratate, cultivate în condiţii standard de cultură.
Viabilitatea celulară a fost apoi analizată după 72h. Pentru determinarea rolul factorilor de
15
creştere asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571, celulele au fost spălate de două ori
cu fosfat cu soluţie tampon salină şi incubate cu mediu cu 1% ser cu sau fără adaos de 50ng/ml
IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF şi FGF-2 şi tratate cu 1.25M, 2.5M, 5M sau 10M
STI551 la interval de 24 de ore, timp de 3 zile. Factorii de creştere au fost diluaţi în apă. S-a
folosit o soluţie stoc de 1g/ml care a fost păstrată la 20°C. Controlul a constat din celule
netratate, cultivate în condiţii standard de cultură. După 72h a fost analizată viabilitatea celulară.
Un număr de 15x103celule/godeu/200μl mediu de cultură au fost cultivate pe plăcuţe cu 96 de
godeuri, incubate timp de 8h şi tratate cu diferite concentraţii de STI571 şi/sau factori de
creştere.
Liniile celulare de HGG, 18 şi 38, au fost cultivate în MEM ce conţine 10% ser fetal
bovin (FBS) suplimentat cu 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi 100UI/ml
streptomicină). Celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost
transferate în placuţe cu 96 de godeuri (4x103 celule/godeu) în 0.2 ml de mediu MEM standard
cu diferite concentraţii de SAM (0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM, 150
μM sau 200 μM) şi incubate pe un interval de 7 zile, dupa care a fost analizată viabilitatea
celulară. Viabilitatea celulara a fost determinată şi prin numararea zilnică a celulelor în arii
marcate în prealabil, timp de 7 zile de la tratarea celulelor.
În toate experimentele efectuate în studiu au fost introduse grupuri de control, în care
celulele au fost tratate numai cu substanţele folosite pentru diluţie.
6.4.Determinarea viabilitatii celulare
Viabilitatea celulară a fost determinată şi prin numararea zilnica a celulelor. În acest
scop, celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost transferate în
role Petri, având diametrul de 35mm. Pe partea exterioară a fundului rolelor Petri au fost în
prealabil marcate anumite zone, în care apoi au fost numărate celulele la intervale de timp
precizate anterior. Procentul de celule care au supravieţuit la intervalele de timp indicate în
experiment a fost apoi calculat prin raportare la numarul iniţial de celule.
6.5 Determinarea timpului de dublare a celulelor (T2)
Liniile celulare de HGG 18 şi 38, au fost cultivate în MEM ce conţine 10% ser fetal
bovin (FBS) suplimentat cu 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi 100UI/ml
streptomicină). Celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost
16
transferate transferate în role Petri, având diametrul de 35mm, la o densitate de 1000cel/ml.
Celulele au fost cultivate în condiții standard timp de 7 zile, apoi au fost numărate zilnic, iar T2
a fost calculat prin metoda regresiei liniare, utilizând mai multe puncte de timp. La sfârşitul
experimentului, T2 a fost calculate prin utilizarea a două puncte de timp, cu aplicarea formulei:
T2 = txln2/ln(N/N0 + 1) Unde: t = durata experimentului
N0 = numărul iniţial de celule
N = este creşterea numarului de celule pe durata experimentului
6.6. Western Blotting
Separarea şi detecţia proteinelor a fost determinată prin metoda Western Blot, desfăşurată
în trei etape distincte.
Prima etapă este reprezentată de separarea amestecului de proteine prin electroforeză pe
un gel poliacrilamidic (PAGE). Cu ajutorul unui câmp electric, proteinele sunt apoi transferate
pe o membrană de nitroceluloză.
În următoarea etapă are loc tratarea proteinelor din membrană cu o soluţie care conţine
anticorpii primari, specifici pentru proteinele studiate. Proteinele sunt apoi blocate cu anticorpul
secundar, care se leagă de anticorpul primar formând astfel un complex de molecule de anticorp.
Ultima etapă este reprezentată de detecţie, care consta în amplificarea semnalului prin
metoda chemiluminiscenţei.
În cazul experimentelor efectuate pentru actualul studiu, celulele au fost lizate în soluţia
de lizare. Lizatul a fost centrifugat pentru îndepărtarea componentelor insolubile. Proteinele au
fost cuantificate cu ajutorul kit-ului Bio-Rad Dc. Cantităţi egale de proteină au fost separate pe
geluri SDS-PAGE 10% şi ulterior transferate pe membrane Immobilion-P PVDF (Millipore).
Membranele au fost blocate cu lapte praf degresat 5% dizolvat în soluţie salină Tris ce conţine
0,1% Tween 20 (TBST), apoi au fost incubate cu anticorp primar diluat în lapte praf degresat 1%
diluat în TBST, incubate apoi cu anticorp secundar legat de peroxidază diluat la rândul său în
lapte praf degresat 1% diluat în TBST. Ulterior a fost folosit sistemul de detecţie ECL pentru
determinarea Western Blot a anticorpului în conformitate cu instrucţiunile producătorului.
6.7. Citometrie de flux
Pentru identificarea şi cuantificarea celule progenitorii endoteliale (CPE), celulele în
suspensie au fost marcate fluorescent şi apoi au fost analizate prin citometrie de flux. Pentru
17
cuantificarea CPE circulante prin FACS (sortare celulară activată fluorescent), sangele periferic
este incubat cu anticorpi conjugaţi fluorescent împotriva CD45, CD34, CD31, CD133 sau
VEGFR2. Pentru fiecare procedură de izolare vor fi folosiţi markeri de control corespunzători.
Dupa filtrare, numărul de celule CD45-/CD31+/ CD34+ şi CD45-/ CD31-/CD34-/
CD133+/VEGFR2+ au fost cuantificate şi exprimate ca celule/ml de sânge, folosind CyFlow SL
flow cytomoter şi sotware-ul FlowMax. Pentru fiecare măsurare au fost înregistrate 100.000
evenimente.
6.8.Analiza statistică
Toate datele reprezită media ± deviaţia standard. Datele au fost analizate folosind testul t
ANOVA . Valorile p< 0.05 au fost considerate semnificative statistic.
7.REZULTATE
7.1 Numarul de CEP circulante este semnificativ mai mare la pacientii cu
glioblastom comparativ cu pacientii diagnosticati cu tumori cerebrale de grad mic.
În studiu au fost evaluate valorile CEP în sângele periferic colectat de la 12 pacienţi: 4
pacienţi cu glioblastom (grad IV WHO) şi 8 pacienţi cu tumori cerebrale cu grad mic de
malignitate (grad I, II WHO).
Dintre aceştia, 1 pacient a fost diagnosticat cu meningiom meningotelial, 1 pacient cu
meningiom tranziţional, 2 pacienţi cu meningiom microchistic, 1 pacient cu meningiom cu celule
clare, 2 pacienţi cu meningiom şi 1 pacient cu meningiom psamomatos.
Pacienţii incluşi în studiu au fost operaţi la Clinica de Neurochirurgie a Spitalului
Bagdasar Arseni Bucuresti şi au avut confirmat diagnosticul histopatologic.
Determinarea valorilor celule endoteliale progenitorii (CEP) circulante din sângele
periferic, colectat de la pacienţi cu tumori cerebrale, a fost făcută folosind anticorpi monoclonali
împotriva CD45 (pentru excluderea celulelor hematopoietice) şi markeri endoteliali CD31,
CD34, CD133 şi VEGF R2, conjugaţi direct cu fluorocromii Pacific-Blue, FITC, PE, PercPsi
APC. CEP circulante (definite ca celule CD45-/CD31+/CD34+/CD133+/VEGF R2+ ) au fost
cuantificate şi exprimate ca număr de celule/mL de sânge, folosind “five-colour flow cytometry”.
Analizarea datelor a început după achiziţia a 100.000 de evenimente. Din totalul de celule
a fost izolată populaţia limfocitară (Fig.3.segmentul I), apoi populaţia CD45- (Fig.3 segm..II) a
fost selectată pentru marcarea cu CD31 şi CD34 (Fig.3. segm. III). În final, în Fig.3
18
segmentul.IV, a fost selectată populaţia celulară prezentând coexpresia CD133+ VEGFR2+.
Etapele parcurse au fost aceleaşi, indiferent de tipul de tumora cerebrala, iar pentru exemplificare
a fost selectat doar experimentul ce a folosit meningiomul meningotelial.
Figura 3. .Numarul de CEP circulante pentru pacientul cu meningiom meningotelial
Rezultatele noastre au arătat că nivelurile de CEP au fost semnificativ (p<0.05) mai mici
la toţi pacienţii diagnosticaţi cu tumori de grad mic, faţă de pacienţii cu glioblastom. La pacienţii
cu glioblastom am gasit în medie de 3 ori mai multe CEP decât la tumorile cu grad mic. Totuşi
nu au fost observate diferenţe semnificative între grupurile cu tumori de grad mic (Fig.4)
Figura 4. Comparaţie între numărul de CEP din sângele periferic al pacienţilor diagnosticaţi cu: meningiom
meningotelial, meningiom tranziţional, meningiom microchistic, meningiom cu celule clare, meningiom, meningiom
psamomatos şi glioblastom.
Rezultatele semnificative statistic comparative cu glioblastomul (p 0,005)
I II
III IV
19
7.2 Determinarea efectului produs de tratamentul cu STI571 asupra celulelelor de
glioblastom în vitro
În celulele aparţinând liniei BT1GB, citotoxicitatea produsă de tratamentul cu STI571 a
fost dependentă de doza utilizată. Supravieţuirea celulelor a fost determinată la 3 zile după
tratament.
În primul set de experimente, a fost evaluată doza raspuns după tratamentul cu STI571 (Figura
5). Celulele BT1GB au avut o rată de supravieţuire ce a scăzut constant de la 98% după
tratamentul cu 0.3125M, până la 8.8% după tratamentul cu 40M M STI571. Peste această
concentraţie, rata de supravieţuire a scăzut foarte puţin, până la 7% în cazul concentraţiei 80M
M STI571. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control.
0
20
40
60
80
100
120
0 mM
0.3125 m
M
0.625 m
M
1.25 m
M
2.5 m
M
5 mM
10 mM
20 mM
40 mM
60 mM
80 mM
Pro
cen
t d
in c
on
tro
l
STI571
Figura 5. Doza-răspuns după tratamentul cu STI571. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele
reprezintã medie +/- deviaþie standard a douã experimente independente.
Apoi, a fost determinat efectul tratamentului cu STI571 asupra celulelor de glioblastom
cultivate în condiţii standard sau fără nutrienţi (Figura 6). Din grafic, se observă că procentele de
supravieţuire ale celulelor menţinute în condiţii standard au scăzut constant odată cu creşterea
concentraţiei de STI571, dar valorile obţinute au fost mai mari decât cele obţinute în cazul
celulelor tratate cu STI571 si cultivate în mediu cu 1% FBS. Pentru exemplificare, după
tratamentul cu 10M STI571, celulele BT1GB cultivate în mediu cu 1% FBS au supravieţuit în
procent de 32,2%, iar cele cultivate în condiţii standard au supravieţuit în procent de 59,2%.
Datele reprezintă medie +/- deviaţie standard a două experimente independente. Toate rezultatele
obţinute au fost semnificative statistic (p 0,005).
20
Figura 6. Efectul tratamentului cu STI571 asupra celulelor de glioblastom cultivate în condiţii standard sau fără
nutrienţi. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele reprezintã medie +/- deviatie standard a douã
experimente independente.
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 in conditii standard (p 0,005
În următorul set de experimente, am observat efectul stimulativ al factorilor de creştere
IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 asupra celulelor de glioblastom (Figura 7).
Creşterea celulară a celulelor BT1GB cultivate în mediu cu 10% FBS a fost de 0,98 ori mai mare
decât a celulelor cultivate în mediu cu 1% FBS. Adăugarea factorilor de creştere a indus o
creştere a proliferării celulare, comparativ cu cea celulelor cultivate în mediu cu 1% FBS, dar
mult mai mică decât în cazul celulelor BT1GB cultivate în mediu cu 10% FBS.
Figura 7. Efectul stimulării cu IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 asupra creşterii celulelor
de glioblastom . Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele reprezintã medie +/- deviatie standard a
douã experimente independente.
Rezultatele semnificative statistic comparative cu controlul (p 0,005)
Este cunoscut faptul că activarea IGF-1R de către ligandul său, IGF-1, duce la activarea
receptorului, care la rândul său produce un efect anti-apoptotic în celulele maligne.
0
20
40
60
80
100
120
Control 2.5 uM 5 uM 10 uM
Pro
ce
nt
din
co
ntr
ol
1%S
10%S
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1%S
10%S
1%S+IF
G1
1%S+PD
GF-B
B
1%S+VEG
F-B
1%S+SC
F
1%S+EG
F
1%S+FG
F-2
Fo
ld
21
Supraexpresia sau creşterea activităţii IGF-1R a fost observată în multe tipuri de cancere,
incluzând: cancer de sân (Almeida et al, 1994; Dricu et al.1999), cancer pulmonar (Cosaceanu et
al. 2007; Kiaris et al. 1999), cancer de colon (Xiao et al. 2007), cancer de prostată (Figueroa et
al. 1995), melanom (Xie et al. 1999) şi tumori gliale (Chakravarti et al. 2002). În glioblastom,
IGF-1R a fost identificat ca potenţial marker genetic (Hui et al. 2001) şi de asemeni este implicat
în rezistenţa la radio şi chimioterapie (Chakravarti et al. 2002; Carapancea et al. 2009;
Carapancea et al. 2007).
Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea IGF-1R, am
studiat efectul stimulării cu IGF-1 asupra citotoxicitaţii induse de tratamentului cu STI571 în
liniile de glioblastom. Astfel, celulele au fost stimulate cu IGF-1 şi tratate cu diferite
concentraţii de STI51: 2.5 M STI571 (Figura 8a), 5 M STI571 (Figura 8b), şi 10 M STI571
(Figura 8c).
a b c
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
Pro
ce
nt
din
co
ntr
ol
Componente 1 2 3 4 5
10%S +
1%S + + + +
IGF-1 + +
STI571 + +
Figura 8. Rolul stimulării cu IGF-1 asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)
Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea PDGFR, am
studiat efectul stimulării cu PDGF-BB asupra citotoxicitaţii induse de tratamentului cu STI571 în
liniile de glioblastom. Astfel, celulele au fost stimulate cu PDGF-BB şi tratate cu diferite
concentraţii de STI51: 2.5 M (Figura 9a), 5 M (Figura 9b), şi 10 M (Figura 9c).
22
a b c
Componente 1 2 3 4 5
10%S +
1%S + + + +
PDGF-BB + +
STI571 + +
Figura 9. Rolul stimulării cu PDGF-BB asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)
Este, de asemenea, cunoscut faptul că activarea VEGFR de către liganzii VEGF,
activează receptorii, producând un efect mitogen. Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al
STI571 este mediat de inhibarea VEGFR, am studiat efectul stimulării cu VEGF-B asupra
citotoxicitaţii induse de STI571 în liniile de GB. Celulele au fost stimulate cu VEGF-B şi tratate
cu diferite concentraţii de STI51: 2.5M (Fig. 10a), 5M (Fig. 10b), şi 10M (Fig. 10c).
a b c
Componente 1 2 3 4 5
10%S +
1%S + + + +
VEGF + +
STI571 + +
Figura 10. Rolul stimulării cu VEGF-B asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)
23
Ligandul SCF se leagă de receptorul c-Kit şi are ca efect activarea proteinei. Pentru a
verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea c-Kit, am studiat efectul
stimulării cu SCF asupra citotoxicitaţii induse de tratamentul cu STI571 în liniile de glioblastom.
Astfel, celulele au fost stimulate cu SCF şi tratate cu diferite concentraţii de STI51: 2.5 M
(Figura 11a), 5 M (Figura 11b), şi 10 M (Figura 11c).
a b c
Componente 1 2 3 4 5
10%S +
1%S + + + +
SCF + +
STI571 + +
Figura 11. Rolul stimulării cu SCF asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)
Legarea ligandului EGF de l receptorul sau, EGFR, activează acestă proteină
membranară , producând un efect mitogen. Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este
mediat de inhibarea EGFR, am studiat efectul stimulării cu EGF asupra citotoxicitaţii induse de
STI571 în liniile de GB. Celulele au fost stimulate cu EGF şi tratate cu diferite concentraţii de
STI51: 2.5 M (Figura 12a), 5 M (Figura 12b), şi 10 M (Figura 12c).
a b c
24
Componente 1 2 3 4 5
10%S +
1%S + + + +
EGF + +
STI571 + +
Figura 12. Rolul stimulării cu EGF asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)
Efectul mitogen al factorului FGF este mediat de receptorul său FGFR. Pentru a verifica
dacă efectul citotoxic al STI571 produce inhibarea FGFR, am studiat efectul stimulării cu FGF
asupra citotoxicitaţii induse de tratamentul cu STI571 în liniile de glioblastom. Celulele au fost
stimulate cu FGF şi tratate cu diferite concentraţii de STI51: 2.5 M (Figura 13a), 5 M (Figura
13b), şi 10 M (Figura 13c).
a b c
Componente 1 2 3 4 5
10%S +
1%S + + + +
FGF + +
STI571 + +
Figura 13. Rolul stimulării cu FGF-2 asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571
Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)
Analizând rezultatele obţinute, s-a observat că adăugarea factorilor de creştere în mediu a
dus la o creştere semnificativă a proliferării celulare de la aprox. 50% în condiţii 1%S până la
aprox. 70% în condiţii 1%S+IGF-1, fiind uşor diminuată la adăugarea agentului inhibitor STI51
până la aprox. 60%. Comparativ cu o rată a proliferării de aprox. 50% în condiţii de 1%S,
adăugarea de STI51 a condus la o scădere a proliferării până la aprox. 25%.
25
7.3. SAM induce citotoxicitate în celulele de GB printr-un mecanism independent de
IGF-1R
Studii anterioare au arătat că S-adenozil-metionina (SAM), principalul donor de grupări
metil în numeroase procese biologice, ar induce moartea celulelor canceroase prin modificarea
profilului de metilare ADN. Alte studii ştiintifice sugerează că SAM inhibă efectul mitogen al
factorilor de creştere în celulele canceroase. De asemenea, studiile noastre anterioare
demonstrează importanţa IGF-1R în supravieţuirea şi proliferarea celulelor de GB.
În acest studiu, a fost investigat efectul citotoxic indus de SAM în doua linii celulare de
GB (18 şi 38). Celulele în cultură au fost expuse timp de 7 zile la diferite concentraţii de SAM,
iar viabilitatea celulară a fost analizată prin numărarea celulelor viabile în arii marcate.
Un parametru important în determinarea dinamicii creşterii celulare este parametrul
numit “Timpul de dublare celulară” (T2). T2 arată care este timpul necesar unei diviziuni
celulare complete.
În cazul bolilor maligne, valoarea T2 este o indicaţie importanţa în prognosticul bolii şi
permite să se evalueze eficienţei medicamentelor utilizate în radio şi / sau chimioterapie. De
aceea, am determinat T2 pentru cele două linii celulare HGG (18, 38) luate în studiu., T2 a fost
determinat prin metoda regresiei liniare, utilizând mai multe puncte de timp şi prin utilizarea a
două puncte de timp. Rezultatele obţinute prin metoda regresiei liniare, arată că T2 are valoarea
79,5±5,54 pentru linia celulară 18 şi 75,25±6,02 pentru linia 38. Valorile T2 obţinute prin
metoda care ia in calcul doua puncte de timp, nu difera semnificativ de cele obtinute prin metoda
regresiei liniare, astfel: valoarea T2 pentru linia celulară 18 este 66,5±7,778, iar valoarea T2
pentru linia celulară 38 este 59,5±6,3634 (Figura 14).
y = 0,262x + 6,875R² = 0,961
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 20 40 60 80 100 120 140 160
cell
nu
mb
er
time (h)
18 HGG
y = 0,895x + 10,41R² = 0,877
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 20 40 60 80 100 120 140 160
cell
nu
mb
er
Time (h)
38 HGG
Figura 14. Valoarea T2 pentru liniile celulare 18 HGG şi 38 HGG
26
Efectul citotoxic indus de SAM in doua linii celulare de GB (18 si 38), a fost apoi investigat.
In urma tratamentului cu 0,1 M SAM, linia celulara 18 prezinta o usoara crestere a
viabilitatii celulare in primele 4 zile de la inceperea tratamentului, proliferarea celulara crescand
cu 7% 17 % si 5% in a doua, a treia si respectiv a patra zi de tratament. Tratamentul cu 0,1
M SAM produce inhibarea proliferarii celulare si o nesemnificativa moarte celulara a celulelor
apartinand liniei celulara 18, la 5 zile dupa tratament, acest efect persistand pana la sfarsitul
perioadei de tratament, astfel, aprox. 97% din celule au supravietuit la sfarsitul perioadei de 7
zile de tratament (Fig 33). In linia celulara 38, efectul citotoxic al tratamentului cu 0,1 M
SAM apare abia dupa 7 zile. In primele 6 zile de tratament, viabilitatea celulara creste cu 12% in
a doua zi, 19% in a treia zi, 24% in a patra zi, 27% in a cincea zi su cu 8% in a sasea zi.
Tratamentul cu 200 M SAM a produs un efect citotoxic mult mai mare in cele doua linii
celulare luate in studiu. Celulele apartinand liniei celulare 18 au supravieţuit în procent de 91%
in a doaua zi, 77% in a treia zi, 59% in a patra zi, 52% in a cincea zi, 43% in a sasea zi, iar in
utima zi a tratamentului s-a inregistrat o scadere a viabilitatii celulare cu 32%. Tratamentul cu
200 M SAM are efect citotoxic si asupra celulelor apartinand liniei celulare 38, astfel,celulele
au supravieţuit în procent de 93% in a doua zi, 85% in a treia zi, 77% in a patra zi, 70% in a
cincea zi, 59% in a sasea zi, iar numai 45% in a saptea si de tratament (Fig. 15).
TAM 0,1µM
0
20
40
60
80
100
120
140
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d
Time (days)
% o
f C
on
tro
l
18
38
TAM 200 µM
0
20
40
60
80
100
120
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d
Time (days)
% C
on
tro
l
18
38
Figura 15. Efectul tratamentului cu SAM asupra viabilităţii celulelor de glioblastom la concentraţiile extreme TAM
IGF-1R este un receptor tirozin kinazic, codat de către oncogena igf-1r, localizată pe
cromozomul 15q25-q26, promovând transformarea oncogenica, creşterea şi supravieţuirea
celulelor canceroase (Yu et al. 2000). Pentru explicarea citotoxicităţii observate în urma
tratamentelor cu diferite doze de SAM, s-a analizat posibilitatea ca efectul citotoxic indus de
SAM să fie cauzat de hipermetilarea oncogenei igf-1r şi inhibarea expresiei proteinei IGF-
27
1R.Rezultatele obtinute dupa tratamentul cu SAM au aratat, insa, ca aceata substanta nu are efect
asupra expresiei membranare a IGF-1R, in concentratia cea mai mare utilizata in studiu (200
µM), sugerand faptul ca efectul citotoxic indus de SAM nu este relationat cu modificarea
profilului de metilare ADN al genei igf-1r (Figura 16),
Figura 16. Efectul SAM asupra expresiei IGF-1R in liniile celulare 18 şi 38 Proteina β-actina a fost
utilizata drept control.
28
8. DISCUŢII
Studiul 1. Glioblastoamele sunt tumori cerebrale heterogene, caracterizate prin
celularitate intensă, activitate mitotică, necroză şi proliferări microvasculare. Datorită acestor
proliferări microvasculare accentuate ce nu apar în glioamele de grad mic, fiind specifice
glioamelor maligne şi în special glioblastomului, s-a concluzionat că procesele de angiogeneză şi
neoangiogeneză joacă un rol esenţial în creşterea şi invazia glioblastomului. În procesul de
neoangiogeneză un rol important îl joacă eliberarea şi mobilizarea celulelor progenitorii
endoteliale (CEP) circulante derivate din maduva hematogenă. Recent, CEP circulante izolate
din sângele periferic au atras atenţia ca posibile ţinte terapeutice. Date din diverse studii
experimentale şi clinice au arătat că utilizarea inhibitorilor angiogenezei reduce vascularizaţia şi
progresia tumorală. Conceptul apărut recent ar fi că celulele tumorale pot produce diverse
semnale moleculare ce pot elibera şi mobiliza CEP circulante produse de maduva hematogenă la
locul tumorii unde au ca scop stimularea neoangiogenezei.
CEP circulante au fost studiate în diverse tipuri de cancere: pulmonar, mamar, gastric,
ovarian, iar valorile acestora au fost depistate semnificativ crescute în sângele periferic faţă de
normal. De asemeni şi în cazul glioblastomului, studiile au arătat o creştere importantă a CEP
circulante faţă de indivizii normali.
În cadrul experimentelor realizate am încercat să determin şi să compar nivelurile de CEP
circulante din sângele periferic la pacienţi cu tumori cerebrale de grade diferite. Numărul de CEP
circulante a fost semnificativ mai mare la pacienţii cu tumori cerebrale înalt maligne
(glioblastom) comparativ cu pacienţii diagnosticaţi cu tumori cerebrale de grad mic, sugerând că
CEP circulante pot deveni un potenţial biomarker în glioblastom, dar şi o ţintă terapeutică pentru
viitoarele noi tratamente ale glioblastomului
Studiul 2. Ţinte terapeutice specifice în ţesuturile maligne sunt reprezentate şi de
receptorii tirozinkinazici şi receptorii tirozinkinazici constitutiv activi, deoarece aceste proteine
au o expresie înaltă la nivelul ţesutului malign. Multiple studii ştiinţifice au evidenţiat faptul că
glioblastoamele supraexprimă numeroşi receptori tirozinkinazici precum EGFR, PDGFR,
VEGFR, SCFR şi FGFR. Pornind de la acest concept, se poate spune că receptorii tirozinkinazici
sunt consideraţi ţinte terapeutice specifice în tratamentul glioblastomului.
STI571 (Imatinib mesylate) este un inhibitor cu moleculă mică, utilizat la aceasta oră ca
tratament în diferite forme de cancer. Mai multe studii de specialitate care au evaluat efectul
29
citotoxic al STI571 asupra celulelor tumorale în vitro, au demonstrat că acest inhibitor este mai
activ în absenţa nutrienţilor.
Datele obţinute în studiul actual sunt în concordanţă cu cele publicate de alte studii.
Rezultatele noastre arată că citotoxicitatea indusă de STI571 în celulele BT1GB a fost
dependentă de doza folosită. Concentraţia la care se obţine CI50 a fost de aproximativ 12,5 M.
Efectul citotoxic indus de tratamentul cu 1.25M STI571 a fost cu 35% mai mare în celulele
cultivate în mediu cu 1% FBS comparativ cu celulele de glioblastom cultivate în mediu cu 10%
FBS, putându-se observa deci efectul chiar de la cele mai mici concentraţii de STI571.
Se presupune că acţiunea antitumorală a STI571 este dată de inhibarea oncoproteinei
Bcr-Abl şi a receptorilor tirozinkinazici PDGF şi cKit, mecanismul de acţiune al acestei
molecule nu este însă complet cunoscut până în prezent. Studii clinice şi experimentale din
ultimii ani au arătat efectul citotoxic al STI571 poate fi influenţat de nivelul factorilor de
creştere. Este deja cunoscut faptul că tumorile cerebrale secretă o mare varietate de factori de
creştere care stimulează proliferarea, supravieţuirea, migrarea şi angiogeneza tumorală, printr-un
sistem de acţiune autocrin sau paracrin. Mai mult, cercetări recente au arătat ca potenţialul
citotoxic al STI571 este afectat de prezenţa unor factori de creştere. În conformitate cu
rezultatele publicate de alte grupuri de cercetare, rezultatele noastre arată că stimularea cu
factorii de creştere IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 a crescut proliferarea
celulele de glioblastom de aproximativ 0.5 ori .
Inhibitorul cu moleculă mică STI571, s-a dovedit a fi mai eficient în tratamentul
glioblastomului în absenţa nutrienţilor. Concentraţia STI571 care determină un efect citotoxic de
50% la celulele fără nutrienţi este de 4 ori mai mică (aprox. 2.5 M STI571) decât cea la care se
atinge efect citotoxic de 50% în condiţii standard (aprox 12,5 M STI571).
Prezenţa factorilor de creştere în mediu are ca efect reducerea efectului citotoxic al
tratamentului cu STI571, acesta observându-se chiar de la cele mai mici concentraţii de STI571
de 2.5 M astfel: stimularea cu IGF1 a fost redusă cu 7.4%, cea cu PDGF-BB a fost redusă cu
8.8%, stimularea cu VEGF-B a fost redusă cu 6.9%, stimularea cu SCF a fost redusă cu 12.8%,
stimularea cu EGF aa fost redusă cu 7.1%, iar stimularea cu FGF-2 a fost redusă cu 7.5%.
Studiul 3. Studii anterioare au arătat ca S-adenozil-metionina (SAM), principalul donor
de grupări metil în numeroase procese biologice, ar induce moartea celulelor canceroase prin
modificarea profilului de metilare ADN. Alte studii ştiintifice sugerează, că SAM inhibă efectul
30
mitogen al factorilor de creştere în celulele canceroase. De asemenea, studiile noastre anterioare
demonstrează importanţa IGF-1R în supravietuirea şi proliferarea celulelor de GB.
În ultima parte a studiului, am analizat efectul SAM asupra celulelor de glioblastom.
Astfel, efectul indus de SAM fost investigat în două linii celulare de GB (18 şi 38), iar rezultatele
obţinute au arăt că tratamentul cu SAM este citototxic pentru ambele linii celulare investigate.
De asemenea, SAM în concentraţia cea mai mare utilizată în studiu (200 µM), nu are efect
asupra expresiei membranare a IGF-1R.
Pentru explicarea citotoxicităţii observate în urma tratamentelor cu diferite doze de SAM,
s-a analizat posibilitatea ca efectul citotoxic indus de SAM să fie cauzat de inhibarea expresiei
proteinei IGF-1R, ca urmare a efectului de hipermetilare a genei igf-1r . Rezultatele obţinute
după tratamentul cu SAM au arătat că această substanţă nu are efect asupra expresiei
membranare a IGF-1R, în concentraţia cea mai mare utilizată în studiu (200 µM), sugerând
faptul că efectul citotoxic indus de SAM nu este relaţionat cu modificarea profilului de metilare
ADN al genei igf-1r, care ar fi trebuit să se reflecte în inhibaraea trancripţiei genei şi în final, în
diminuarea cantităţii de receptor IGF-1R produsă de celulă.
31
9. CONCLUZII
Studiul 1: 1. În cazul primului experiment realizat am încercat să determinăm şi să
comparăm nivelurile de CEP circulante din sângele periferic la pacienţi cu tumori
cerebrale de grade diferite. Rezultatele obţinute conduc la concluzia că numărul de
CEP circulante este semnificativ mai mare la pacienţii cu tumori cerebrale înalt
maligne (glioblastom) comparativ cu pacienţii diagnosticaţi cu tumori cerebrale de
grad mic. Totuşi nu au fost observate diferenţe semnificative între grupurile cu tumori
de grad mic. Aceste rezultate sugerează că CEP circulante pot deveni un potenţial
biomarker în glioblastom, de asemeni CEP pot reprezenta o ţinta terapeutică pentru
viitoarele noi tratamente ale glioblastomului.
Studiul 2: 2. În urma investigării potenţialului rol al inhibitorului STI571 în
tratamentul glioblastomului, am obţinut rezultate care arată că citotoxicitatea indusă
de STI571 în celulele BT1GB a fost dependentă de doza folosită. Concentraţia la care
se obţine CI50 a fost de aproximativ 12,5 M. Efectul citotoxic indus de tratamentul
cu 1.25M STI571 a fost cu 35% mai mare în celulele cultivate în mediu cu 1% FBS
comparativ cu celulele de glioblastom cultivate în mediu cu 10% FBS, putându-se
observa deci efectul chiar de la cele mai mici concentraţii de STI571. Înhibitorul cu
moleculă mică STI571, s-a dovedit a fi mai eficient în tratamentul glioblastomului în
absenţa nutrienţilor.
3. Analizând rezultatele obţinute din experimentul în care s-a efectuat
stimularea viabilităţii celulare cu diferiţi factori de creştere (IGF1, PDGF-BB, VEGF-
B, SCF, EGF, FGF-2), am ajuns la concluzia că prezenţa factorilor de creştere în
mediu are ca efect reducerea efectului citotoxic al tratamentului cu STI571.
Studiul 3: 4. În ultimul studiu în care am evaluat efectul agentului de metilare SAM
asupra tumorilor cerebrale de grad inalt (high grade glioma, HGG) şi a interferenţei
cu expresia IGF-1R in vitro, am ajuns la concluzia că SAM induce citotoxicitate, dar
nu afectează expresia membranară a IGF-1R, sugerând faptul că efectul citotoxic
indus de SAM nu este relaţionat cu modificarea profilului de metilare ADN al genei
igf-1r.
32
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
BeierD, HauP, Proescholdt M, Lohmeier A, Wischhusen J, Oefner PJ, Aigner L,
Brawanski A, Bogdahn U, Beier CP. (2007) CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived
cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res.
67(9):4010-5.
Carapancea M, Alexandru O, Fetea AS, Dragutescu L, Castro J, Georgescu A, Popa-
Wagner A, Bäcklund ML, Lewensohn R, Dricu A. (2009) Growth factor receptors signaling în
glioblastoma cells: therapeutic implications. J Neurooncol. 92(2):137-47. Epub 2008 Nov 30.
Carapancea M, Cosaceanu D, Budiu R, Kwiecinska A, Tataranu L, Ciubotaru
V, Alexandru O, Banita M, Pisoschi C, Bäcklund ML, Lewensohn R, Dricu A. (2007) Dual
targeting of IGF-1R and PDGFR inhibits proliferation în high-grade gliomas cells and induces
radiosensitivity în JNK-1 expressing cells. J Neurooncol. 85(3):245-54. Epub 2007 Jun 14.
Cosaceanu D, Carapancea M, Alexandru O, Budiu R, Martinsson HS, Starborg
M, Vrabete M, Kanter L, Lewensohn R, Dricu A. (2007) Comparison of three approaches for
inhibiting insulin-like growth factor I receptor and their effects on NSCLC cell lines in vitro.
Growth Factors. 25(1):1-8.
Chakravarti A, Loeffler JS, Dyson NJ. (2002) Insulin-like growth factor receptor I
mediates resistance to anti-epidermal growth factor receptor therapy în primary human
glioblastoma cells through continued activation of phosphoinositide 3-kinase signaling. Cancer
Res. 62(1):200-7.
Dricu A, Kanter L, Wang M, Nilsson G, Hjertman M, Wejde J, Larsson O. (1999)
Expression of the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) în breast cancer cells: evidence
for a regulatory role of dolichyl phosphate în the transition from an intracellular to an
extracellular IGF-1 pathway. Glycobiology. 9(6):571-9
Ekstrand AJ, James CD, Cavenee WK, Seliger B, Pettersson RF, Collins VP. (1991)
Genes for epidermal growth factor receptor, transforming growth factor alpha, and epidermal
growth factor and their expression în human gliomas in vivo. Cancer Res. 51(8):2164-72.
33
Figueroa JA, Lee AV, Jackson JG, Yee D. (1995) Proliferation of cultured human
prostate cancer cells is inhibited by insulin-like growth factor (IGF) binding protein-1: evidence
for an IGF-II autocrine growth loop. J Clin Endocrinol Metab. 80(12):3476-82.
HegiME, Diserens AC, Godard S, Dietrich PY, Regli L, Ostermann S, Otten P, Van
MelleG, de TriboletN, Stupp R.(2004) Clinical trial substantiates the predictive value of O-6-
methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation în glioblastoma patients treated
with temozolomide. Clin Cancer Res. 10(6):1871-4
Iacob G, Constantinescu AI – Conceptii actuale de tratament în tumorile cerebrale
maligne. Conferinta nationala de neurooncologie, martie 2004.
JoensuuH, Kankaanranta L, Seppälä T, Auterinen I, Kallio M, Kulvik M, Laakso
J, Vähätalo J, Kortesniemi M, Kotiluoto P, Serén T, Karila J, Brander A, Järviluoma
E, Ryynänen P, Paetau A, Ruokonen I, Minn H, Tenhunen M, Jääskeläinen J, Färkkilä
M, Savolainen S. (2003) Boron neutron capture therapy of brain tumors: clinical trials at the
finnish facility using boronophenylalanine. J Neurooncol 62(1-2):123-34
Kalka C, Masuda H, Takahashi T, Gordon R, Tepper O, Gravereaux E, Pieczek
A, Iwaguro H, Hayashi SI, Isner JM, Asahara T. (2000) Vascular endothelial growth factor(165)
gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells în human subjects. Circ
Res. 86(12):1198-202.
Kiaris H, Schally AV, Varga JL, Groot K, Armatis P. (1999) Growth hormone-releasing
hormone: an autocrine growth factor for small cell lung carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S
A. 96(26):14894-8.
LaperriereN, Zuraw L, Cairncross G; Cancer Care Ontario Practice Guidelines Initiative
Neuro-Oncology Disease Site Group. (2002) Radiotherapy for newly diagnosed malignant
glioma în adults: a systematic review. Radiother Oncol 64(3):259-73.
Lönn S, Klaeboe L, Hall P, Mathiesen T, Auvinen A, Christensen HC, Johansen
C, Salminen T, Tynes T, Feychting M. (2004) Incidence trends of adult primary intracerebral
tumors în four Nordic countries. Int J Cancer. 108(3):450-5.
Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, Scheithauer
BW, Kleihues P. (2007) The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system.
Acta Neuropathol. 114(2):97-109.
34
Louis DN, von DeimlingA. (1995) Hereditary tumor syndromes of the nervous system:
overview and rare syndromes. Brain Pathol. 5(2):145-51.
OhgakiH, Kleihues P. (2005) Epidemiology and etiology of gliomas.
ActaNeuropathol. 109(1):93-108.
OhgakiH, Kleihues P. (2007) Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma.
Am J Pathol. 170(5): 1445-53.
Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, Zhu Z, Lane WJ, Williams M, Oz MC, Hicklin
DJ, Witte L, Moore MA, Rafii S. (2000) Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating
human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors.
Blood. 95(3):952-8.
PradosMD, Wara WM, Sneed PK, McDermott M, Chang SM, Rabbitt J, Page M, Malec
M, Davis RL, Gutin PH, Lamborn K, Wilson CB, Phillips TL, Larson DA. (2001) Phase III trial
of accelerated hyperfractionation with or without difluromethylornithine (DFMO) versus
standard fractionated radiotherapy with or without DFMO for newly diagnosed patients with
glioblastoma multiforme. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 49(1):71-7.
Schulenburg A, Ulrich- PurH, Thurnher D, Erovic B, Florian S, Sperr WR, Kalhs P,
Marian B, WrbaF, Zielinski CC, Valent P. (2006) Neoplastic stem cells: a novel therapeutic
target în clinical oncology. Cancer. 107(10):2512-20.
Shinkaruk S, Bayle M, Laïn G, Déléris G. (2003) Vascular endothelial cell growth factor
(VEGF), an emerging target for cancer chemotherapy. Curr Med Chem Anticancer Agents; 3(2):
95-117
Stewart LA. (2002)Chemotherapy în adult high-grade glioma: a systematic review and
meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials. Lancet. 359(9311):1011-8.
StuppR, Pavlidis N, Jelic S. (2005) ESMO Minimum Clinical Recommendations for
diagnosis, treatment and follow-up of malignant glioma. Ann Oncol 16Suppl 1:i64-5
Xiao XY, Zhou XY, Yan G, Sun MH, Du X. (2007) Chromosomal alteration în Chinese
sporadic colorectal carcinomas detected by comparative genomic hybridization. Diagn Mol
Pathol. 16(2):96-103.
35
Xie Y, Skytting B, Nilsson G, Brodin B, Larsson O. (1999) Expression of insulin-like
growth factor-1 receptor în synovial sarcoma: association with an aggressive phenotype. Cancer
Res. 59(15):3588-91
Yu H, Rohan T. (2000) Role of the insulin-like growth factor family în cancer
development and progression. J Natl Cancer Inst. 92(18):1472-89.