I. Istoricul cercetărilorI.1. Cercetări pe plan mondial

Drosophila melanogaster, numită popular şi musculiţa de oţet sau musculiţa de fructe este o

insectă de mici dimensiuni şi aparţine Ordinului Diptera.

Morgan a fost primul care a introdus acest organism ca model experimental în genetică.

Drosophila melanogaster s-a dovedit a fi o alegere deosebit de inspirată. Astfel, musculiţa de oţet

creşte uşor în condiţii de laborator, pe medii ieftine, în recipiente mici, iar timpul necesar pentru o

nouă generaţie este de circa zece zile la o temperatură de 250C. De asemenea prezintă prolificitate

ridicată. În plus, la nivelul ţesututlui din glandele salivare ale larvelor de Drosophila există un tip

special de cromozomi numiţi cromozomi uriaşi, observabili la microscopul optic.

Această specie a fost descrisă la mijlocul secolului al XIX-lea sub numele de Drosophila

ampelophila („iubitoare de viţă de vie”, - gr. Ampelos- viţă de vie; philos – iubitor). Ulterior i s-a

dat numele de Drosophila melanogaster adica „iubitoare de rouă cu abdomenul negru” (gr. Drosos –

rouă; philos – iubitor; melos – negru; gastris – stomac ).

Prima menţiune despre Drosohila melanogaster apare în anul 1830 în lucrarea lui Johanm Wihelm

Meigen „ Systematic Descriptin of the know european two- winged insects”.

Prima persoană care a crescut indivizi de Drosopila melanogaster în laborator a fost C. W.

Woodworth.

T. H. Morgan a început să cultive această specie din anul 1909. Laboratorul din

Universitatea Columbia, celebra „Fly Room” a funcţionat sub conducerea lui Morgan între anii 1910

– 1926. Împreună cu Alfred Henry Sturtevant; Calvin B. Bridges şi Herman Joseph Müller, Morgan

a elaborat „Teoria cromozomiala a eredităţii” (1910 – 1915) prezentată în lucrarea „Mechanism of

Mendelian Inheritance”. Morgan şi colaboratorii săi au demonstrat experimental legătura dintre

principiile stabilite de Mendel pentru moştenirea caracterelor, arătând că genele, purtătorii materiali

ai informaţiei ereditare, sunt localizate pe cromozomi într-o ordine liniară. Mai mult ei au

demonstrat că genele plasate pe acelaşi cromozom au tendinţa de a se transmite în bloc în sucesiunea

de generaţii. Fenomenul a fost numit de către Morgan „linkage”.

Apoi s-a dovedit că la femelele de Drosophila, linkage-ul nu este complet, în sensul că

uneorinare loc schimbul de gene între cromozomii omologi, fenomen numit de Morgan „crossing-

over”. Prin investigaţii minuţioase s-a demonstrat că frecvenţa crossing-overului este dependentăde

1

distanţa din acelaşi grup de linkage. Cu cât distanţa dintre gene este mai mare cu atât creşte

frecvenţa recombinărilor. Pe baza acestor observaţii A.H. Sturtevant realizează prima hartă

cromozomială.

Studiul detaliat al cromozomilor uriaşi din glandele salivare care prezintă un model natural

de benzi şi interbenzi, generat de organizarea cromatinei, a permis întocmirea primelor hărţi ale unui

organism, de către Calvin Bridges.

Pentru aceste descoperiri, care au revoluţionat genetica, Morgan a fost răsplătit în 1933 cu

premiul Nobel pentru medicină şi fiziologie.

H. J. Müller, studiază efectele radiaţiilor Röentgen asupra musculiţei de oţet; în urma

cercetărilor a demonstrat că aceste radiaţii provoacă mutaţii infirmând concepţia autogenetică

conform căreia factorii externi nu pot modifica ereditatea organismelor.

În 1928 Hanson şi Heys provoaca mutaţii la Drosophila melanogaster cu ajutorul radiului.

În paralel cu experimentele de hibridare şi mutageneză chimică au fost efectuate investigaţii

citologice asupra musculiţei de oţet. Astfel în 1908, Stevens stabileşte patternul cromozomial al ♀

dar nu şi pe cel al ♂. Bridges în 1914 identifică cromozomul Y la o ♀ care prezenta formula

6A+XXY.

În 1935, Darlington a demonstrat linkage-ul heterosomal complet şi indestructibil la

masculul de Drosophila, acest lucru se datprează faptului că heterosomii X şi Y nu sunt omologi.

Cercetările efectuate de către Edward B. Leeis, la începutul anilor 1940, au condus la

elaborarea aşa- numitului test cis-trans pentru demonstrarea alelismului de funcţie la Drosophila

melanogaster. Cu ajutorul acestui test se poate afla dacă două mutaţii ce afectează un anumit

caracter sunt localizate în aceeaşi genă sau în gene diferite.

Testul trans, numit şi test de complementaritate constituie actualmente, o modalitate de

definire a genei – unitatea de funcţie a materialului ereditar.

După ce Drosophila melanogaster a avut un statut de vedetă a geneticii odată cu intrarea în

era geneticii moleculare, alte organisme au fost adoptate ca modele experimentale de mare succes,

dintre acestea amintim: Escherichia coli, fungii Neurospora crassa, Sacharomyces cerevisae, precum

şi unele plante ca Arabidopsis thaliana.

În acest răstimp, musculiţa de oţet a intrat aparent într-un con de umbră, unii biologi

considerau ca Drosophila melanogaster ar fi un model experimental desuet; însă unii cercetători şi-

au continuat acivitatea având ca model experimental musculiţa de oţet. În consecinţă, în 1995,

Premiul Nobel pentru medicină a fost împărţit de către Edward B. Lewis (SUA), Christiane

2

Nüsslein-Volhard (Germania) şi Eric F. Wieschaus (SUA) pentru elucidarea la nivel molecular a

mecanismelor fundamentale ale procesului de dezvoltare la Drosophila. Ulterior, s-a descoperit că

genele implicate în acest proces au corespondenţi omologi în aproape întreaga seria animală,

inclusiv la om şi că în esenţă omologia nu este doar la nivel de secvenţă de nucleotide ci şi la nivel

funcţional. A fost o demonstraţie strălucită a conservării evolutive a mecanismelor moleclare de

bază care susţin procesul de dezvoltare în seria animală. Actualmente, modelul experimental

repreentat de Drosophila melanogaster trăieşte o a doua tinereţe, atât în genetică cât şi în biologia

moleculară şi medicină.

Cercetările efectuate asupra Drosophila melanogaster au contribuit la elucidarea a numeroase

fenomene de nivel individual şi populaţional. Actualmente, studiile asupra musculiţei de oţet se

înscriu în sfera geneticii dezvoltării, ramură a geneticii care încurcă să elucideze mecanismele

complexe ale reglajului genetic la eucariote, mecanismele direct implicate în procesele de

diferenţiere şi metamorfoză.

I.2. Cercetări efectuate în România

În 1936, la iniţiativa lui G. Marinescu ia naştere „Societatea de genetică din România” care a

contribuit la dezvoltarea cercetărilor de genetică şi la schimbil de idei între oamenii de ştiinţă din

acest domeniu.

Tot în 1936 a avut loc prima comunicare din România privind mutantele de Drosophila

melanogaster, lucrarea fiind elaborată de G. K. Constantinescu şi Veturia Derlogea.

G.K. Constantinescu a solicitat în 1941 Departamentului de genetică de la Carnegie Institute of

Washington, suşe de Drosophila melanogaster cu mutaţii pe anumiţi cromozomi, fapt ce a permis

ulteior o analiză sistematică a mutaţiilor ce se obţineau în laborator cu precizarea locusului în care se

aflau.

La înoarcerea din Germania, unde a fost trimis pentru specializare, Gh. Radu a adus

numeroase cărţi de genetică şi toate mutantele de Drosophila în număr de 400.

Primele cercetări genetice pe Drosophila melanogaster realizate de un român, au fost

efectuate de Gh. Radu în Germania (1943). Într-o suită de şapte lucrări experimentale a studiat

inducerea cu ajutorul razelor X mutaţiilor în gameţii de Drosophila. Utilizând diferite doze de

radiaţii Röentgen a evidenţiat, îndeosebi, rata translocaţiilor între cromozomii perechilor II şi III.

3

Gh. Radu în colaborare cu Kanelli continuă seria de stuii abordând în cadrul a trei lucrări, studiul

citogenetic al cromozomilor perechii I la Drosophila Melanogaster prin iradierea masculilor cu raze

X, studiul comparativ al translocaţiilor între cromozomii perechilor II şi III precum şi studiul altor

aberaţii cromozomiale precum inversiunile, duplicaţiile şi deleţiile.

După ce de-al II-lea război mondial, cercetările de genetică teoretică şi experimentală, s-au

amplificat şi diversificat, înfiiţându-se catedre şi laboratoare de cercetare în diferite instituţii

ştiinţifice.

În anul 1964 s-a ţinut la universitatea din Bucureşti primul Simpozion Naţional de Genetică,

unde s-au prezentat referate ştiinţifice şi comunicări. Al II-lea Simpozion de Genetică, desfăşurat în

1967 la Bucureşti, a avut printre participanţi cunoscuţi specialişti străini. În cadrul acestui simpozion

Gh. Radu preintă comunicaea „Modificările citogenetice în cromozomii de Drosophila melanogaster

prin iradieri fracţionate cu raze X.

La facultatea de Biologie din Iaşi, introducerea studiilor asupra musculiţei de oţet este

asociată cu numele Prof. Dr. Iordachi Gh. Tudose (1937-1997).

Dintre lucrările sale amintim: „Modificări în desfăşurarea ciclului vital la Drosophila

melanogaster sub influenţa efedrinei şi acţiunea acestei substanţe asupra cromozomilor uriaşi” 1969

în colaborare cu R. Brandsch; „Influenţa genetică a cofeinei şi efectul ei asupra desfăşurării ciclului

vital la Drosophila melanogaster” 1977 în colaborare cu Alexandra Râbacov.

În revistele de specialitate din România sunt publicate numeroase articole care au ca subiect

Drosophila melanogaster. S-au realizat numeroase experimente privind organizarea cromozomilor

uriaşi, acţiunea selecţiei asupra diferitelor populaţii de Drosophila, fenomenul de curtare realizat de

mascul, obţinerea de mutante sub acţiunea unor substanţe chimice, fenomenul de apoptoză şi rolul ei

în dezvoltarea şi metamorfoza Drosophilei.

Laboratorul de genetica dezvoltării din cadrul Institutului de Genetică al Universităţii din

Bucureşti, a lansat un program de cercetare dedicat mutagenezei insertaţionale, ce urmăreşte

obţinerea unor mutaţii, ortoloage unor gene umane implicate în determinarea unor boli genetice.

Aceste cercetări se înscriu în direcţia actuală a cercetărilor efectuate pe plan mondial care utilizează

Drosophila melanogaster drept model de studiu al genetici moderne.

4

DROSOPHILA MELANOGASTER- CARACTERIZARE GENERAL - BIOLOGICĂ

ÎNCADRAREA SISTEMATICĂ ŞI MORFOLOGIA SPECIEI

Conform site-ului Muzeului de Zoologie al Universităţii Michigan, SUA,

http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Drosophila_melanogaster.html,

Drosophila melanogaster este încadrată sistematic astfel:

Regnul: Animalia

Filumul: Arthropoda

Clasa: Insecta

Diviziunea Endopterigota (Holometabola)

Ordinul: Diptera

Subordinul: Brachycera

Familia: Drosophilidae

Subfamilia: Drosophilinae

Genul: Drosophila

Subgenul: Sophophora

Grupul de specii: grupul melanogaster

Subgrupul de specii: subgrupul melanogaster

Specia: D. melanogaster

Insectele alcătuiesc grupul cel mai divers de animale de pe planetă Pământ, arealul fiind cu

precădere uscatul, existând cu mult peste 1.000.000 milion de specii, dintre care aproximativ

925.000 au fost cercetate şi descrise. Insectele pot fi găsite în aproape toate mediile de pe planetă,

deşi numărul de specii care s-au adaptat la viaţa în ocean, unde crustaceele predomină, este destul de

mic.

Dintre insecte, dipterele se estimează a fi în număr de 240 000 specii dintre care doar

jumătate dintre acestea au fost descrise. 

Genul Drosophila face parte din subordinul Brachycera şi este împărţit într-un număr de

subgenuri, şi anume: Hirtodrosophila, Pholadoris, Dorsilopha, Phloridosa, Sophophora şi

Drosophila. Unele dintre subgenuri au fost divizate în ,,grupuri de specii". De exemplu, subgenul

Sophophora cuprinde şapte grupuri de specii, dintre care Saltans, Willistoni şi Melanogaster,

ultimului aparţinându-i Drosophila melanogaster.

5

Numărul speciilor din genul Drosophila este de aproximativ 800, majoritatea caracterizate

prin polimorfism cromosomial.

O problemă disputată este încadrarea Familiei Drosophilidae într-un anumit subordin. Astfel,

unii autori plasează această familie în Subordinul Brachycera, considerând nepotrivită crearea unui

nou subordin - Cyclorrhapha - în cadrul Ordinului Diptera. Diferenţa majoră dintre cele două

subordine amintite (invocată de sistematicienii ce recunosc Subordinul Cyclorrhapha) este forma

deschiderii prin care adultul emerge din puparium, şi anume: forma literei T, la Brachycera şi forma

circulară la Cyclorrhapha.

Drosophila melanogaster (de la grecescul melas = negru; gastris = stomac) prezintă doua

aripi mari, mezotoracice, aripile de pe metatorace fiind transformate în haltere (organe de echilibru)

caracter prezent la toate organismele dinn ordinul Diptera, ordinul muştelor. Specia este cunoscută

în mod curent ca musculiţa de oţet, şi este unul dintre cele mai utilizate organisme în cercetările

biologice, incluzând studii de genetică, fiziologie, evoluţia vieţii. Musculiţa de oţet prezintă

metamorfoză completă, ca orice membru al ordinului Diptera.

Forma corpului la musculiţa de oţet este una comună pentru speciile ordinului Diptera.

Fig. Alcătuirea generală a corpului unei insecte

Lungimea corpului la Drosophila melanogaster, la tipul sălbatic este de aproximativ 2 mm,

având corpul de culoare gri-gălbuie şi doi ochi compuşi mari, de culoare roşie-cărămizie. În

regiunea capului mai prezintă trei ochi simpli numiţi oceli şi două antene mici, aristate, formate din

6

câte trei segmente, cu arista plasată pe cel de-al treilea segment antenal. Aparatul bucal este adaptat

pentru lins şi supt, Drosophila consumând hrană lichidă sau lichefiată în prealabil cu ajutorul

secreţiei glandelor salivare.

Pe fiecare segment toracic se află câte o pereche de picioare adaptate la mers.

Numărul segmentelor abdominale vizibile este diferit la cele două sexe – şapte la femelă şi

cinci-şase la mascul. Acest număr mic de segmente la masculi este consecinţa fenomenului de

telescopare a ultimelor segmente abdominale.

Adulţii de Drosophila melanogaster prezintă dimorfism sexual, manifestat atât prin diferenţe

dimensionale (femela are în jur de 2,5 mm lungime iar masculul este puţin mai mic), cât şi

morfologice. Femelele sunt mai mari decât masculii. Au abdomenul oval cu extremitatea posterioară

puţin ascuţită. La masculi vârful abdomenului este rotunjit şi colorat în maron-negru.

Masculii prezintă aşa numitul ,,pieptene sexual” care serveşte la imobilizarea femelei în

timpul acuplării. Acesta este format din zece perişori negri, chitinoşi, ce se găsesc pe primul articol

tarsal al picioarelor anterioare (perechea I), aşa cum se vede şi din figura de mai jos, în apropierea

articulaţiei dintre tibie şi tars. Evident că diferenţele cele mai însemnate dintre mascul şi femelă ţin

de organizarea internă, mai ales de anatomia sistemului reproducător.

Fig. D. melanogaster - pieptene sexual pe primul articol tarsal, perechea I de picioare, la mascul

Numărul de omatidii ce intră în alcătuirea ochiului complex este diferit la cele două sexe, şi

anume: 780 la femelă, respectiv, 740 la mascul. Fiecare omatidie este acoperită de o cornee. Între

omatidii se află fire de păr. Acestea au rol de senzori mecanici. O omatidie conţine un grup de 7- 8

celule fotoreceptoare, cunoscute sub numele de rhabdomere. Fiecare receptor are capacitatea de a

absorbi diferite lungimi de undă din din domeniul UV (345 nm- 375 nm), albastru (437nm and

480nm) şi verde (508nm).

7

           Fig. Ochii la Drosophila melanogaster: a. Vedere anterioară a capului; b. Vedere de detaliu a unui

ochi compus (de pe: www.optics.rochester.edu/.../kevin/index.html)

Sexul larvelor se determină ţinând cont de poziţia şi mărimea gonadelor. Acestea sunt localizate în

partea postero-laterală a larvei, în corpii graşi. Testiculele sunt mult mai mari decât ovarele (de trei

ori mai mari) şi au o formă ovală. Ele pot fi observate cu ochiul liber datorită transparenţei

tegumentului larvei.

Fig. Oul la D. melanogaster

CICLUL DE VIAŢĂ Ca toate dipterele, Drosophila melanogaster prezintă metamorfoza. completă (este o insectă

holometabolică), ciclul său vital parcurgând stadiile de ou, larvă, pupă şi adult. Durata ontogeniei

variază în funcţie de temperatură, umiditate, compoziţia mediului nutritiv etc.

8

Fig. Ciclul de viaţă la Drosophila melanogaster

Pentru parcurgerea completă a acestor stadii sunt necesare 10 zile dacă temperatura este de

25 °C (temperatura optimă) şi respectiv 15 zile la 20 °C. Expunerea la temperaturi de circa 30 °C a

culturilor de D. melanogaster determină sterilitatea în special în rândul masculilor şi moartea culturii

respective, iar temperaturile de 10 °C prelungesc foarte mult ciclul vital (cca 57 de zile) şi reduc

viabilitatea (Cîmpeanu, 2002).

Oul este de culoare albă, are 0,5 mm şi este depus de femele după aproximativ două zile de la

ieşirea din pupă, în cazul în care au avut parteneri pentru împerechere. Oul este de tip centrolecit, are

o lungime de 0,5 mm şi formă ovală, cu partea dorsală mai bombată decât cea ventrală, aplatizată.

9

Membrana externă, numită şi chorion, este groasă, opacă şi prezintă un model de semne hexagonale.

În partea anterioară şi dorsală oul prezintă o pereche de filamente (apofize), acestora fiindu-le

atribuit rolul de a împiedica scufundarea sa în mediul lichid.

Dezvoltarea embrionară se realizează foarte rapid, după o zi la 25 °C, de la momentul

depunerii, din ou ieşind o larvă.

Larva de Drosophila melanogaster este de culoare albă, are corpul segmentat şi se

deplasează prin târâre. Stadiile larvare la Drosophila melanogaster sunt în număr de trei, fiind

separate între ele prin două năpârliri.

Larva de stadiu I părăseşte oul prin micropil, este mică, foarte mobilă şi se hrăneşte cu mare

repeziciune. Este o larvă de tip apod (fără apendici), acefală (capsula cefalică este infundată complet

în torace). Aparatul bucal de tip primitiv (adaptat pentru rupt şi mestecat) prezintă mandibule

puternice, ca nişte cârlige, cu ajutorul cărora larva pătrunde în materialul nutitiv. Acest prim stadiu

larvar durează aproximativ 24 ore. Pe măsură ce larva creşte, cuticula sa chitinoasă devine

neîncăpătoare, astfel, că larva o părăseşte şi îşi sintetizează o nouă cuticulă (năpârleşte).

Larva de stadiul II apare în urma primei năpârliri. Aceasta este mai mare şi continuă să se

hrănească timp de aproximativ 24 ore, după care suferă încă o năpârlire.

Larva de stadiul III apare după cea de-a doua năpârlire (după aproximativ şase zile de la

fertilizare). Aceasta poate atinge 4,5 - 5 mm lungime, dezvoltându-se pe parcursul a 48 ore, la 25

°C.

Pupa reprezintă stadiul de reorganizare morfo-fiziologică din ciclul vital de la D.

melanogaster. Are o durată variabilă, acest parametru fiind profund influenţat de temperatură. La

Drosophila melanogaster pupa este de tip coarctat ,,pupa butoiaş", o variantă a pupei adectice (cu

mandibule nesclerificate) de tip liber, caracterizată prin aceea că larva de stadiul III împupează în

interiorul ultimei exuvii larvare. La început, învelişul pupal chitinos este alb şi moale. Odată cu

scurtarea corpului larvei, el se întăreşte şi se închide la culoare, fiind numit şi puparium. Are formă

ovală, măsoară 2,5 - 3 mm şi prezintă în partea anterioară două prelungiri ce corespund spiraculelor

evaginate ale fostei larve.

Stadiul de imago. În urma transformărilor ce au loc în interiorul învelişului pupal, se

formează adultul care eclozează printr-o deschidere circulară din regiunea anterioară a

pupariumului. La început insecta este foarte lungă, cu aripile nedesfăcute, lipite de corp şi are o

culoare deschisă.

10

Procesul complex al dezvoltării la musculiţa de oţet parcurge câteva etape esenţiale şi

anume: embriogeneza, creşterea larvară, împuparea şi metamorfoza.

În timpul oogenezei, punţile citoplasmatice numite "canale inelare" conectează oocitele în

formare cu celulele mamă. Nutrienţii şi moleculele pentru controlul dezvoltării sunt transferate din

celulele mamă în oocite.

Dezvoltarea embrionară are loc consecutiv fecundaţiei şi se desfăşoară în interiorul

membranei oului. Dezvoltarea embrionară începe cu stabilirea polarităţii oului, de-a lungul axelor

antero-posterioară şi dorso-ventrală datorită interacţiunilor transcripţionale şi proteice coordonate de

reţeua de gene. Acest proces prezintă o importanţă majoră, fiind demonstrat faptul că, mutaţiile care

afectează polaritatea sunt cauza dezvoltării structurilor anterioare în regiunea posterioară, respectiv a

celor dorsale în partea ventrală a oului.

Fig.  Ovarul cu oocite în formare la Drosophila melanogaster (sursa: octomilka-obecna.navajo.cz)

Oul nefecundat, format în ovarul femelei, este expulzat în uter, unde are loc fecundaţia. Stadiul iniţial

al dezvoltării embrionare constă în formarea primilor doi nuclei prin diviziunea mitotică a nucleului

zigotic, aceasta având loc imediat după fertilizare.

11

Fig. Dezvoltarea embrionară la Drosophila melanogaster

(sursa: biology.kenyon.edu/.../Chap13/droslifecycle.jpg)

Timpul necesar pentru un ciclu de replicare a ADN şi o mitoză este de aproximativ 10 min.

După două diviziuni sincrone cei 512 nuclei rezultaţi migrează spre suprafaţa externă a oului (cortex),

formând aşa numitul blastoderm sinciţial. Aproximativ 40 de nuclei migrează, în schimb, la polul

posterior al oului, unde vor da naştere celulelor polare. Nucleii din cortex continuă să se dividă, se

înconjoară cu citoplasma şi se închid în membrană, formând ceea ce se numeşte blastoderm

celular.Acest stadiu apare la aproximativ 2,5 ore de la fertilizare şi se prezintă sub forma unui singur

strat de celule, situat la exteriorul embrionului. Trebuie precizat că În stadiul de blastoderm, soarta

fiecarei regiuni a oului este deja stabilită. Cercetările au dovedit că trăsăturile majore ale planului

corpului larvei şi adultului, sunt prezente încă din acest stadiu timpuriu al embriogenezei. Proiecţiile

bidimensionale ale organelor externe ale adultului pe suprafaţa blastodermului, sunt cunoscute sub

numele de ,,fate maps" - harţi ale destinului. Celulele blastodermului urmează două căi posibile de

dezvoltare. Astfel, majoritatea lor vor continua să se dividă, se vor diferenţia şi vor asigura formarea

embrionului. O parte dintre blastomere se vor separa de celelalte, ele constituind celulele de origine

ale ţesuturilor viitorului adult. Aceste celule programate să genereze structuri adulte se vor organiza

în aşa numitele discuri imaginale. Fiecare segment al corpului organismului adult este constituit din

descendenţii celulelor discurilor imaginale. Există 12 perechi de discuri bilaterale şi un singur disc

12

genital, de exemplu: o pereche pentru ochi şi antene, trei perechi pentru picioare, o pereche pentru

aripi, o pereche pentru haltere etc. Alte celule ale blastodermului vor forma structurile interne şi

externe ale larvei. Deşi planul viitorului organism adult este prezent încă din stadiul de blastoderm,

segmentele acestuia nu se disting. Segmentele sunt structuri morfologice vizibile, atât la adult, cât şi

la larvă. Embrionul de 10 ore prezintă trei segmente toracice şi opt abdominale, separate prin şanţuri,

corespunzând segmentelor viitorului adult. În acest stadiu al dezvoltării, celulele fiecărui segment

sunt deja determinate să formeze fie un compartiment anterior (jumătatea anterioară a respectivului

segment), fie un compartiment posterior (jumătatea posterioară a acestuia). Segmentul nu este altceva

decât unitatea de structură a embrionului, în timp ce compartimentul constituie unitatea de dezvoltare

format din celulele viitoarelor discuri imaginale. Descendenţii acestor celule, numite şi celule

fondatoare, nu pot trece dintr-un compartiment în altul, astfel că la embrionul tardiv şi la adult,

compartimentul se distinge prin aceea că include numai celulele provenind din linia fondatoare

corespunzătoare. Trebuie precizat că în stadiul de blastoderm, cea mai mare parte a embrionului este

divizată într-o serie de compartimente alternative, anterioare şi posterioare. Un segment adult, însă,

constă dintr-un singur compartiment anterior urmat de unul posterior. La nivelul blastodermului a

fost sugerat şi un alt tip de segmentare, situaţie în care şanţurile de separare sunt vizibile între aşa

numitele parasegmente. Un parasegment constă din compartimentul posterior al unui segment şi

compartimentul anterior al segmentului următor. Astfel, graniţele dintre segmente corespund cu

centrele parasegmentelor.

Fig. 19 Etapele transformărilor care se perec la nivelul blastulei, la Drosophila melanogaster

(Sursa: biology.kenyon.edu/.../Chap13/Chapter_13A.html)

13

Toate aceste procese sunt controlate de genele de segmentare, ale căror mutaţii afectează atât

numărul cât şi polaritatea segmentelor corpului.

Regiunea posterioară a oului conţine componente citoplasmatice numite granule polare, iar

nucleii care migrează în această regiune formează aşa numitele celule polare care sunt precursorii

celulelor germinale ale adultului. Dacă regiunea posterioară a oului este distrusă înainte de migrarea

nucleilor, sau dacă aceasta este impiedicată prin legătura embrionului, musculiţa adultă se dezvoltă,

totuşi, dar este sterilă, neavând celule germinative. Transplantul de citoplasmă polară în regiunile

anterioare ale oului, induce formarea celulelor polare în regiuni neobişnuite. Asemenea celule polare

induse pot genera celule germinale funcţionale dacă sunt înlăturate chirurgical şi injectate în regiunea

posterioară a embrionilor marcaţi genetic. Astfel, citoplasma specifică de la polul posterior al oului,

propagă în nucleii ce migrează la acest pol, o stare de determinare care, conduce la o formă specifică,

de diferenţiere.

A fost formulat postulatul conform căruia într-un segment sau compartiment individual, una

sau mai multe gene selectoare (deţinătoare de informaţie poziţională) determină o cale particulară de

dezvoltare pentru celulele din acel compartiment.

Mutaţiile acestui sistem de selecţie, numite mutaţii homeotice, modifică starea de determinare

a celulelor dintr-un segment sau compartiment, astfel că ele generează structuri întâlnite normal în

alte segmente. De exemplu, mutaţia ,,tumorous head" (engl. = cap tumoral) transformă capul în

ultimul segment abdominal şi în genitalii.

Pe parcursul tuturor celor trei stadii larvare, din momentul apariţiei primului stadiu şi până la

formarea pupariumului, celulele larvare nu se divid, deşi larva creşte considerabil. Această creştere se

datorează exclusiv măririi taliei celulelor, care este însoţită de replicarea ADN şi formarea

cromosomilor politenici (politenizare). Spre deosebire de celulele larvare, cele adulte (reprezentate de

celulele discurilor imaginale) se divid în timpul acestei perioade. Astfel, creşterea discurilor

imaginale are loc pe seama diviziunii celulelor acestora. În timpul celui de-al doilea stadiu larvar,

discul imaginal al aripii este constituit din 50 de celule, la 35 de ore de la fertilizare. După 122 de ore,

numărul celulelor respectivului disc atinge 30000. La 25 °C, primul stadiu larvar durează 24 de ore,

astfel că, prima năpârlire are loc la 46 de ore de la fertilizare. Al doilea stadiu larvar este cuprins între

cele două năpârliri (cea de-a doua năpârlire larvară survine după 70 de ore de la fertilizare) şi durează

alte 24 de ore. Ultimul stadiu larvar atinge dimensiunea maximă dupa 48 de ore de la cea de-a doua

năpârlire.

14

Următoarea etapă a dezvoltării la Drosophila melanogaster o constituie împuparea. Problema

formării pupei şi cea a pupariumului reprezintă motivul unei dispute îndelungate între specialiştii în

fiziologia insectelor. Este evident că cele două procese sunt identice. În acest sens, D.B. Roberts

oferă următoarea explicaţie:

- formarea pupariumului conduce la apariţia stadiului de prepupă şi poate fi considerată prima parte a

unei năpârliri, epiderma fiind încă lipită de prepupariumul format în vechea cuticulă a larvei de stadiu

III;

- finalizarea acestei năpârliri şi desprinderea epidermei fostei larve de puparium (ultima exuvie

larvară) constituie tocmai procesul de împupare.

Formarea puparimului, a pupei şi metamorfoza au fost studiate de mulţi cercetători, pe

parcursul unei lungi perioade. Cel mai detaliat studiu la Drosophila melanogaster, realizat de către

Bainbridge şi Brown (citaţi de Roberts în 1986), identifică 51 de stadii vizibile în timpul

metamorfozei şi descrie 24 de stadii utilizabile în analiza experimentală.

Cu opt ore înainte de a începe formarea prepupariumului, larva de stadiu III nu se mai

hrăneşte, părăseşte mediul nutritiv, în căutarea unei suprafeţe relativ uscate. Această etapă se mai

numeşte stadiu larvar hoinar. După aproximativ 120 de ore de la fertilizare (la 25 °C), începe

procesul de formare a prepupariumului odată cu apariţia unei prepupe de culoare albă şi care prezintă

anterior spiraculele evertate, ea începând să se mişte (timpul zero). Prepupa (şi ulterior pupa) rămâne

fixată pe substrat prin intermediul unei proteine lipicioase secretate de glandele salivare ale larvei. În

decursul a 20 min. - o oră, culoarea prepupei devine maro. După patru ore de la

apariţia prepupei, în abdomenul acesteia se formează o bulă de aer, astfel că

organismul respectiv capătă proprietatea de flotabilitate. Imediat după acest

eveniment începe formarea pupei propriu-zise, stadiu care atinge forma

completă la aproximativ 12 ore de la momentul zero - începerea formării prepupariumului.

Fig. Dezvoltarea sistemelor de organe în timpul embriogenezei la Drosophila melanogaster (roşu- mezoderm, verde- amnioserosa, galben- sistem digestiv, albastru- sistem nervos, gri- vitelus, alb- epiderma, negru- ţesut embrionar) (Sursa http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch02/)

15

Ciclul de dezvoltare continuă cu metamorfoza, etapă în care au loc intense procese de

histoliză şi histogeneză. Majoritatea celulelor larvare suferă autoliza, cu excepţia tuburilor

Malpighi şi a unor celule nervoase. Ţesuturile adulte iau naştere din celulele discurilor

imaginale. Acestea pot fi grupate în două categorii şi anume: discuri ale căror celule au suferit

diviziuni în timpul vieţii larvare, dar au încetat să se dividă în timpul împupării şi celule

imaginale care se divid în perioada timpurie a metamorfozei, cum sunt histoblastele

abdominale.

Fig. Comparaţie între poziţia unor organe la larva şi la adultul de Drosophila melanogaster

(Sursa: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch02/fig2_34.jpg)

Mesoderm               Mezectoderm        Endoderm                Ectoderm

Fig. Stadiile dezvoltării celor trei foiţe embrionare la Drosophila melanogaster

16

Celulele discurilor imaginale cresc, suferă mişcări morfogenetice şi se diferenţiază,

conducând la constituirea adultului de Drosophila melanogaster. Precizăm faptul că gonadele

adultului se diferenţiază pornind de la gonadele larvare (care, la rândul lor îşi au originea în

celulele polare), diviziunea reducţională şi formarea gameţilor având loc în timpul

metamorfozei. Astfel, adulţii sunt apţi de împerechere, în medie, după 220 de ore (la 25 °C) de

la fertilizare.

RĂSPÂNDIRE ŞI ECOLOGIE

Habitatul natural şi condiţiile de laborator

Drosophila melanogaster a fost introdusă pe fiecare continent din lume cu excepţia

Antarcticii. Pe celelalte continente răspândirea ei este limitată doar de regiunile montane,

deşerturi şi altitudinile mari. (Demerec 1950).

Drosophila melanogaster trăieşte atât în regiuni tropicale cât şi în cele temperate.

Numele ştiinţific al musculiţei de oţet, Drosophila, înseamnă "iubitoare de rouă", ceea ce

indică faptul că specia are nevoie de un mediu umed.

Dezvoltarea speciei este dependentă de temperatură, adulţii nu pot suporta

temperaturile scăzute, înălţimile mari şi latitudinile mari. În climatele reci, Drosophila

melanogaster nu poate supravieţui.

În regiunile temperate unde prin activitatea umană a fost introdusă Drosophila

melanogaster, musculiţele îşi caută adăpost în lunile reci de iarnă. Indivizii speciei

Drosophila melanogaster sunt frecvent întâlniţi în natură, pe fructe care au început să

fermenteze (mere, pere, prune, struguri, etc.). Vara o întâlnim în vii, grădini, livezi sau în

magazii, beciuri cu fructe şi legume (mai ales dacă acestea sunt alterate), în depozite, pe

tescovina aruncată şi, în general, în locuri insalubre. (Demerec, 1950) Această specie nu

prezintă diapauză, iernând în magazii, depozite, beciuri, etc.

În laborator, musculiţa de oţet poate fi cultivată pe medii sintetice, care conţin zahăr şi

drojdie - componente ce mijlocesc procesul de fermentaţie. Compoziţia mediului are influenţe

asupra ciclulului vital, viabilităţii şi prolificităţii insectei.

D.B. Roberts (1986) împarte mediile nutritive în cinci categorii, în funcţie de scopul în

care sunt folosite:

a) mediile standard, utilizate în orice scop - menţinerea culturilor, pregătirea încrucişărilor etc;

17

b) mediile imbogăţite, folosite cu scopul de a obţine larve mari necesare pentru studiul

cromosomilor politenici şi pentru studii biochimice;

c) mediile ,,instant", disponibile în comerţ, uşor de preparat în caz de urgenţă;

d) mediile axenice, pentru creşterea musculiţelor în condiţii sterile;

e) mediile sintetice definite, pentru studii biochimice.

Temperatura - factor fizic ce influenţiază dezvoltarea Drosophilei melanogaster

Temperatura optimă pentru dezvoltarea indivizilor de Drosophila melanogaster este

de +24 - +25°C, la această temperatură ciclul vital durează 10 zile (stadiului de ou îi revin 24

ore, celui de larvă - 4 zile, şi pupei tot 4 zile). Astfel, într-un an se pot obţine 40 de generaţii.

Temperaturile mai mari de +31°C, femela devine, parţial sau chiar total sterilă. În

regiunile cu umiditate sporită, musculiţa de oţet poate tolera temperaturi mai ridicate ale

aerului.

La temperaturi mai mici, ciclul de dezvolatre al insectei se lungeşte. Astfel, la +20°C,

ciclul vital se prelungeşte până la 16 zile (larva - 8 zile, pupa - 6-7 zile), pe când la +10°C

durata ontogeniei ajunge la 75 de zile (larva 57 zile, pupa - 13-14 zile).

Drosophila melanogaster prezintă mai multe ,,tulpini" termosensibile. În majoritatea

cazurilor temperatura permisivă este +18°C sau +20°C, iar temperatura restrictivă este +29°C

Umiditatea

Umiditatea optimă necesară dezvoltării normale pentru Drosophila este de 75-85%. În

unele cazuri, acest parametru poate deveni o problemă serioasă. Un nivel al umiditaţii sub

70% afectează profund fertilitatea şi viabilitatea insectelor.

PROLIFICITATEA

În cursul vieţii, o femelă de Drosophila melanogaster depune câteva sute de ouă. În

majoritatea cazurilor numărul ouălor depuse este de 200-300. Ameliorarea condiţiilor de viaţa

determină o creştere a numărului de ouă depuse, uneori acesta ajungând până la 2000. În

medie o pereche de insecte dă naştere aproximativ la 170 descendenţi.

18

LONGEVITATEA

Adulţii de Drosophila melanogaster, în condiţii de laborator, trăiesc aproximativ 3-4

săptămâni. Longevitatea depinde de condiţiile în care sunt crescute insectele şi anume:

temperatura, umiditatea, compoziţia mediului nutritiv, densitatea populaţiei, prezenţa în

mediu a paraziţilor, etc.

În condiţii optime, indivizii de Drosophila pot supravieţui chiar 22 de săptămâni (153

de zile). Există unele mutante care au o viabilitate mult mai mare decât a Wild type (tipul

normal sau sălbatic), însă, de obicei, mutantele şi liniile sunt mai puţin viabile comparativ cu

tipul normal.

COMPORTAMENTUL

Comportamentul Drosofilei melanogaster este simplu. Indivizii sunt atraşi de mirosul

oricărei surse de hrană, şi se împerechează aproape fără discriminări cu indivizi de sex opus.

Masculii prezintă aşa numitul „pieptene sexual”. S-a speculat că, aceşti piepteni sunt folosiţi

pentru imobilizarea femelei în timpul acuplării.

Indivizii au perişori pe spate şi sunt sensibili la curenţii de aer. Ochii musculiţei de

fructe sunt sensibili chiar la diferenţe mici ale intensităţii luminii. De aceea aproape

instinctual zboară dacă intensitatea luminii scade sau percep mişcare în apropiere.

Drosophila melanogaster are, de asemenea, tendinţa de a zbura către lumină. În vasele

de cultură se observă ca musculiţele migrează spre zona cea mai luminoasă.

FORMULA CROMOSOMIALĂ LA DROSOPHILA MELANOGASTER

Celulele somatice de Drosophila melanogaster conţin 2n = 8 cromosomi, aceştia fiind

grupaţi în patru perechi la femelă şi trei perechi plus X şi Y la mascul. Intregul set

cromosomial măsoară 7,5 μm. Numărul mic de cromosomi şi posibilitatea unei diferenţieri

foarte clare a acestora au constituit un argument în favoarea folosirii Drosophilei în calitate de

model experimental.

În urma cercetărilor citogenetice, efectuate pe ganglionii cerebroizi ai larvelor de

stadiul III, a fost stabilită morfologia cromosomilor din fiecare pereche.

19

1. Cromosomii perechii I sunt cromosomii sexului (heterosomi, losomi, gonosomi)

şi diferă la indivizii aparţinând celor două sexe. Femelele au o pereche de

cromosomi omologi, în formă de bastonaşe drepte, notaţi XX. Aceşti

cromosomisunt telocentrici, având centromerul plasat terminal. Conţin un număr

foarte mare de gene care manifestă fenomenul de sex-linkage (genele plasate pe un

anuit cromosom se transmit înlănţuit) şi se numesc gene X-linkate.

2. Cromosomii perechii a II-a sunt autosomi, având forma literei V la mabele sexe.

Din punc de vedere morfologic fac parte din categoria cromosomilor

submetacentrici (au centromerul situat submedian).

3. Cromosomii perechii a III-a sunt submetacentrici, având, de asemenea, forma

literei V. Sunt puţin mai mari comparativ cu cei din perechea a II-a şi sunt identici

pentru ambele sexe.

4. Cromosomii perechii a IV-a sunt de dimensiuni foarte mici, din care cauză sunt

numiţi „punctiformi”. Sunt autosomi omologi, identici la cele două sexe. Au

cenromerul plasat terminal şi conţin un număr mic de gene.

Din punct de vedere structural, ADN-ul cromosomilor de Drosophila melanogaster

este de tip liniar dublu catenar. Prin asocierea sa, în principal, cu histonele se formează fibra

de cromatină care, în urma unor procese complexe de spiralizare şi împachetare, dă naştere

cromosomului de tip eucariot.

Materialul cromosomial a fost clasificat în eucromatină şi heterocromatină. La

Drosophola melanogaster, atât autosomii, cât şi heterosomul X, prezintă blocuri mari de

heterocromatină, în timp ce cromozomul Y este complet heterocromatinizant.

Un tip special de cromosomi sunt cromosomii „lampbrush” (engl. Lamp= lampă,

Brush= perie), care sunt întâlniţi doar la unele tipuri de celule. Aceştia nu sunt cromosomi

somatici, ei fiind caracteristici oocitelor primare – celule care vor da naştere, în urma meiozei,

ovulelelor multor specii de vertebrate şi nevertebrate. La Drosophila melanogaster,

cromosomii lumpbrush sunt prezenţi atât în nucleii oocitelor, cât şi în cei ai speramatocitelor,

fiind vizibili în diplotenul profazei I meiotice.

Aceşti cromosomi nu sunt politenici, ei reprezintă cei doi omologi conjugaţi într-un

singur complex. Dimensiunile lor mari se datorează puternicei despiralizări a romatidelor.

Fiecare component al bivalentului este format din două cromatide, astfel că întregul ansamblu

posedă patru cromatide.

Denumirea de „lampbrush” provine din faptul că, atât cromosomul de origine maternă,

cât şi cel de origine paternă, au o formă de perie de lampă, reprezentând un ax central din care

20

pornesc numeroase bucle, de diferite dimensiuni, repartizate de o parte şi alta a respectivului

ax. Buclele au formă de elipse asimetrice şi sunt mai groase în punctul iniţial de ataşare pe

axul longitudinal, şi mai subţiri în partea opusă acestuia. Fiecare buclă este constituită dintr-o

porţiune dublu helicată de ADN. Mai trebuie precizat că buclele plasate de o parte a axuli

longitudinal şi constituite din ADN-ul unei cromatide, le corespund bucle identice ca poziţie

şi dimensiune, dar formate prin despiralizarea celeilalte cromatide a respectivului cromosom.

Studiile autoradiografice au demonstrat existenţa unor mari cantităţi de ARN şi

proteine la nivelul buclelor, ceea ce sugerează că procesul de transcripţie se desfăşoară foarte

intens în aceste regiuni ale cromosomilor lampbrush. Activitatea puternică de sinteză a tuturor

tipurilor de ARN şi a diverselor proteine., asigură creşterea oocitelor şi acumularea vitelusului

în citoplasma acestora. Buclele cromosomilor lampbrush sunt similare pufelor cromosomilor

politenici.

Se pare că şi cromosomul Y de la Drosophila melanogaster adopta structură

lampbrush.

CROMOSOMII POLITENICI

21