disertatie oana

of 33/33

Click here to load reader

Post on 19-Jun-2015

896 views

Category:

Documents

3 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

I. Istoricul cercetrilor I.1. Cercetri pe plan mondialDrosophila melanogaster, numit popular i musculia de oet sau musculia de fructe este o insect de mici dimensiuni i aparine Ordinului Diptera. Morgan a fost primul care a introdus acest organism ca model experimental n genetic. Drosophila melanogaster s-a dovedit a fi o alegere deosebit de inspirat. Astfel, musculia de oet crete uor n condiii de laborator, pe medii ieftine, n recipiente mici, iar timpul necesar pentru o nou generaie este de circa zece zile la o temperatur de 250C. De asemenea prezint prolificitate ridicat. n plus, la nivelul esututlui din glandele salivare ale larvelor de Drosophila exist un tip special de cromozomi numii cromozomi uriai, observabili la microscopul optic. Aceast specie a fost descris la mijlocul secolului al XIX-lea sub numele de Drosophila ampelophila (iubitoare de vi de vie, - gr. Ampelos- vi de vie; philos iubitor). Ulterior i s-a dat numele de Drosophila melanogaster adica iubitoare de rou cu abdomenul negru (gr. Drosos rou; philos iubitor; melos negru; gastris stomac ). Prima meniune despre Drosohila melanogaster apare n anul 1830 n lucrarea lui Johanm Wihelm Meigen Systematic Descriptin of the know european two- winged insects. Prima persoan care a crescut indivizi de Drosopila melanogaster n laborator a fost C. W. Woodworth. T. H. Morgan a nceput s cultive aceast specie din anul 1909. Laboratorul din Universitatea Columbia, celebra Fly Room a funcionat sub conducerea lui Morgan ntre anii 1910 1926. mpreun cu Alfred Henry Sturtevant; Calvin B. Bridges i Herman Joseph Mller, Morgan a elaborat Teoria cromozomiala a ereditii (1910 1915) prezentat n lucrarea Mechanism of Mendelian Inheritance. Morgan i colaboratorii si au demonstrat experimental legtura dintre principiile stabilite de Mendel pentru motenirea caracterelor, artnd c genele, purttorii materiali ai informaiei ereditare, sunt localizate pe cromozomi ntr-o ordine liniar. Mai mult ei au demonstrat c genele plasate pe acelai cromozom au tendina de a se transmite n bloc n sucesiunea de generaii. Fenomenul a fost numit de ctre Morgan linkage. Apoi s-a dovedit c la femelele de Drosophila, linkage-ul nu este complet, n sensul c uneorinare loc schimbul de gene ntre cromozomii omologi, fenomen numit de Morgan crossingover. Prin investigaii minuioase s-a demonstrat c frecvena crossing-overului este dependentde distana din acelai grup de linkage. Cu ct distana dintre gene este mai mare cu att crete1

frecvena recombinrilor. Pe baza acestor observaii A.H. Sturtevant realizeaz prima hart cromozomial. Studiul detaliat al cromozomilor uriai din glandele salivare care prezint un model natural de benzi i interbenzi, generat de organizarea cromatinei, a permis ntocmirea primelor hri ale unui organism, de ctre Calvin Bridges. Pentru aceste descoperiri, care au revoluionat genetica, Morgan a fost rspltit n 1933 cu premiul Nobel pentru medicin i fiziologie. H. J. Mller, studiaz efectele radiaiilor Rentgen asupra musculiei de oet; n urma cercetrilor a demonstrat c aceste radiaii provoac mutaii infirmnd concepia autogenetic conform creia factorii externi nu pot modifica ereditatea organismelor. n 1928 Hanson i Heys provoaca mutaii la Drosophila melanogaster cu ajutorul radiului. n paralel cu experimentele de hibridare i mutagenez chimic au fost efectuate investigaii citologice asupra musculiei de oet. Astfel n 1908, Stevens stabilete patternul cromozomial al dar nu i pe cel al . Bridges n 1914 identific cromozomul Y la o care prezenta formula 6A+XXY. n 1935, Darlington a demonstrat linkage-ul heterosomal complet i indestructibil la masculul de Drosophila, acest lucru se datpreaz faptului c heterosomii X i Y nu sunt omologi. Cercetrile efectuate de ctre Edward B. Leeis, la nceputul anilor 1940, au condus la elaborarea aa- numitului test cis-trans pentru demonstrarea alelismului de funcie la Drosophila melanogaster. Cu ajutorul acestui test se poate afla dac dou mutaii ce afecteaz un anumit caracter sunt localizate n aceeai gen sau n gene diferite. Testul trans, numit i test de complementaritate constituie actualmente, o modalitate de definire a genei unitatea de funcie a materialului ereditar. Dup ce Drosophila melanogaster a avut un statut de vedet a geneticii odat cu intrarea n era geneticii moleculare, alte organisme au fost adoptate ca modele experimentale de mare succes, dintre acestea amintim: Escherichia coli, fungii Neurospora crassa, Sacharomyces cerevisae, precum i unele plante ca Arabidopsis thaliana. n acest rstimp, musculia de oet a intrat aparent ntr-un con de umbr, unii biologi considerau ca Drosophila melanogaster ar fi un model experimental desuet; ns unii cercettori iau continuat acivitatea avnd ca model experimental musculia de oet. n consecin, n 1995, Premiul Nobel pentru medicin a fost mprit de ctre Edward B. Lewis (SUA), Christiane Nsslein-Volhard (Germania) i Eric F. Wieschaus (SUA) pentru elucidarea la nivel molecular a mecanismelor fundamentale ale procesului de dezvoltare la Drosophila. Ulterior, s-a descoperit c2

genele implicate n acest proces au corespondeni omologi n aproape ntreaga seria animal, inclusiv la om i c n esen omologia nu este doar la nivel de secven de nucleotide ci i la nivel funcional. A fost o demonstraie strlucit a conservrii evolutive a mecanismelor moleclare de baz care susin procesul de dezvoltare n seria animal. Actualmente, modelul experimental repreentat de Drosophila melanogaster triete o a doua tineree, att n genetic ct i n biologia molecular i medicin. Cercetrile efectuate asupra Drosophila melanogaster au contribuit la elucidarea a numeroase fenomene de nivel individual i populaional. Actualmente, studiile asupra musculiei de oet se nscriu n sfera geneticii dezvoltrii, ramur a geneticii care ncurc s elucideze mecanismele complexe ale reglajului genetic la eucariote, mecanismele direct implicate n procesele de difereniere i metamorfoz. I.2. Cercetri efectuate n Romnia n 1936, la iniiativa lui G. Marinescu ia natere Societatea de genetic din Romnia care a contribuit la dezvoltarea cercetrilor de genetic i la schimbil de idei ntre oamenii de tiin din acest domeniu. Tot n 1936 a avut loc prima comunicare din Romnia privind mutantele de Drosophila melanogaster, lucrarea fiind elaborat de G. K. Constantinescu i Veturia Derlogea. G.K. Constantinescu a solicitat n 1941 Departamentului de genetic de la Carnegie Institute of Washington, sue de Drosophila melanogaster cu mutaii pe anumii cromozomi, fapt ce a permis ulteior o analiz sistematic a mutaiilor ce se obineau n laborator cu precizarea locusului n care se aflau. La noarcerea din Germania, unde a fost trimis pentru specializare, Gh. Radu a adus numeroase cri de genetic i toate mutantele de Drosophila n numr de 400. Primele cercetri genetice pe Drosophila melanogaster realizate de un romn, au fost efectuate de Gh. Radu n Germania (1943). ntr-o suit de apte lucrri experimentale a studiat inducerea cu ajutorul razelor X mutaiilor n gameii de Drosophila. Utiliznd diferite doze de radiaii Rentgen a evideniat, ndeosebi, rata translocaiilor ntre cromozomii perechilor II i III. Gh. Radu n colaborare cu Kanelli continu seria de stuii abordnd n cadrul a trei lucrri, studiul citogenetic al cromozomilor perechii I la Drosophila Melanogaster prin iradierea masculilor cu raze X, studiul comparativ al translocaiilor ntre cromozomii perechilor II i III precum i studiul altor aberaii cromozomiale precum inversiunile, duplicaiile i deleiile.2

Dup ce de-al II-lea rzboi mondial, cercetrile de genetic teoretic i experimental, s-au amplificat i diversificat, nfiindu-se catedre i laboratoare de cercetare n diferite instituii tiinifice. n anul 1964 s-a inut la universitatea din Bucureti primul Simpozion Naional de Genetic, unde s-au prezentat referate tiinifice i comunicri. Al II-lea Simpozion de Genetic, desfurat n 1967 la Bucureti, a avut printre participani cunoscui specialiti strini. n cadrul acestui simpozion Gh. Radu preint comunicaea Modificrile citogenetice n cromozomii de Drosophila melanogaster prin iradieri fracionate cu raze X. La facultatea de Biologie din Iai, introducerea studiilor asupra musculiei de oet este asociat cu numele Prof. Dr. Iordachi Gh. Tudose (1937-1997). Dintre lucrrile sale amintim: Modificri n desfurarea ciclului vital la Drosophila melanogaster sub influena efedrinei i aciunea acestei substane asupra cromozomilor uriai 1969 n colaborare cu R. Brandsch; Influena genetic a cofeinei i efectul ei asupra desfurrii ciclului vital la Drosophila melanogaster 1977 n colaborare cu Alexandra Rbacov. n revistele de specialitate din Romnia sunt publicate numeroase articole care au ca subiect Drosophila melanogaster. S-au realizat numeroase experimente privind organizarea cromozomilor uriai, aciunea seleciei asupra diferitelor populaii de Drosophila, fenomenul de curtare realizat de mascul, obinerea de mutante sub aciunea unor substane chimice, fenomenul de apoptoz i rolul ei n dezvoltarea i metamorfoza Drosophilei. Laboratorul de genetica dezvoltrii din cadrul Institutului de Genetic al Universitii din Bucureti, a lansat un program de cercetare dedicat mutagenezei insertaionale, ce urmrete obinerea unor mutaii, ortoloage unor gene umane implicate n determinarea unor boli genetice. Aceste cercetri se nscriu n direcia actual a cercetrilor efectuate pe plan mondial care utilizeaz Drosophila melanogaster drept model de studiu al genetici moderne.

DROSOPHILA MELANOGASTER- CARACTERIZARE GENERAL - BIOLOGIC NCADRAREA SISTEMATIC I MORFOLOGIA SPECIEI

2

Conform

site-ului

Muzeului

de

Zoologie

al

Universitii

Michigan,

SUA,

http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Drosophila_melanogaster.html, Drosophila melanogaster este ncadrat sistematic astfel: Regnul: Animalia Filumul: Arthropoda Clasa: Insecta Diviziunea Endopterigota (Holometabola) Ordinul: Diptera Subordinul: Brachycera Familia: Drosophilidae Subfamilia: Drosophilinae Genul: Drosophila Subgenul: Sophophora Grupul de specii: grupul melanogaster Subgrupul de specii: subgrupul melanogaster Specia: D. melanogaster Insectele alctuiesc grupul cel mai divers de animale de pe planet Pmnt, arealul fiind cu precdere uscatul, existnd cu mult peste 1.000.000 milion de specii, dintre care aproximativ 925.000 au fost cercetate i descrise. Insectele pot fi gsite n aproape toate mediile de pe planet, dei numrul de specii care s-au adaptat la viaa n ocean, unde crustaceele predomin, este destul de mic. Dintre insecte, dipterele se estimeaz a fi n numr de 240 000 specii dintre care doar jumtate dintre acestea au fost descrise. Genul Drosophila face parte din subordinul Brachycera i este mprit ntr-un numr de subgenuri, i anume: Hirtodrosophila, Pholadoris, Dorsilopha, Phloridosa, Sophophora i Drosophila. Unele dintre subgenuri au fost divizate n ,,grupuri de specii". De exemplu, subgenul Sophophora cuprinde apte grupuri de specii, dintre care Saltans, Willistoni i Melanogaster, ultimului aparinndu-i Drosophila melanogaster. Numrul speciilor din genul Drosophila este de aproximativ 800, majoritatea caracterizate prin polimorfism cromosomial. O problem disputat este ncadrarea Familiei Drosophilidae ntr-un anumit subordin. Astfel, unii autori plaseaz aceast familie n Subordinul Brachycera, considernd nepotrivit crearea unui2

nou subordin - Cyclorrhapha - n cadrul Ordinului Diptera. Diferena major dintre cele dou subordine amintite (invocat de sistematicienii ce recunosc Subordinul Cyclorrhapha) este forma deschiderii prin care adultul emerge din puparium, i anume: forma literei T, la Brachycera i forma circular la Cyclorrhapha. Drosophila melanogaster (de la grecescul melas = negru; gastris = stomac) prezint doua aripi mari, mezotoracice, aripile de pe metatorace fiind transformate n haltere (organe de echilibru) caracter prezent la toate organismele dinn ordinul Diptera, ordinul mutelor. Specia este cunoscut n mod curent ca musculia de oet, i este unul dintre cele mai utilizate organisme n cercetrile biologice, incluznd studii de genetic, fiziologie, evoluia vieii. Musculia de oet prezint metamorfoz complet, ca orice membru al ordinului Diptera. Forma corpului la musculia de oet este una comun pentru speciile ordinului Diptera.

Fig. Alctuirea general a corpului unei insecte Lungimea corpului la Drosophila melanogaster, la tipul slbatic este de aproximativ 2 mm, avnd corpul de culoare gri-glbuie i doi ochi compui mari, de culoare roie-crmizie. n regiunea capului mai prezint trei ochi simpli numii oceli i dou antene mici, aristate, formate din cte trei segmente, cu arista plasat pe cel de-al treilea segment antenal. Aparatul bucal este adaptat pentru lins i supt, Drosophila consumnd hran lichid sau lichefiat n prealabil cu ajutorul secreiei glandelor salivare. Pe fiecare segment toracic se afl cte o pereche de picioare adaptate la mers.

3

Numrul segmentelor abdominale vizibile este diferit la cele dou sexe apte la femel i cinci-ase la mascul. Acest numr mic de segmente la masculi este consecina fenomenului de telescopare a ultimelor segmente abdominale. Adulii de Drosophila melanogaster prezint dimorfism sexual, manifestat att prin diferene dimensionale (femela are n jur de 2,5 mm lungime iar masculul este puin mai mic), ct i morfologice. Femelele sunt mai mari dect masculii. Au abdomenul oval cu extremitatea posterioar puin ascuit. La masculi vrful abdomenului este rotunjit i colorat n maron-negru. Masculii prezint aa numitul ,,pieptene sexual care servete la imobilizarea femelei n timpul acuplrii. Acesta este format din zece periori negri, chitinoi, ce se gsesc pe primul articol tarsal al picioarelor anterioare (perechea I), aa cum se vede i din figura de mai jos, n apropierea articulaiei dintre tibie i tars. Evident c diferenele cele mai nsemnate dintre mascul i femel in de organizarea intern, mai ales de anatomia sistemului reproductor.

Fig. D. melanogaster - pieptene sexual pe primul articol tarsal, perechea I de picioare, la mascul Numrul de omatidii ce intr n alctuirea ochiului complex este diferit la cele dou sexe, i anume: 780 la femel, respectiv, 740 la mascul. Fiecare omatidie este acoperit de o cornee. ntre omatidii se afl fire de pr. Acestea au rol de senzori mecanici. O omatidie conine un grup de 7- 8 celule fotoreceptoare, cunoscute sub numele de rhabdomere. Fiecare receptor are capacitatea de a absorbi diferite lungimi de und din din domeniul UV (345 nm- 375 nm), albastru (437nm and 480nm) i verde (508nm).

1

Fig. Ochii la Drosophila melanogaster: a. Vedere anterioar a capului; b. Vedere de detaliu a unui ochi compus (de pe: www.optics.rochester.edu/.../kevin/index.html) Sexul larvelor se determin innd cont de poziia i mrimea gonadelor. Acestea sunt localizate n partea postero-lateral a larvei, n corpii grai. Testiculele sunt mult mai mari dect ovarele (de trei ori mai mari) i au o form oval. Ele pot fi observate cu ochiul liber datorit transparenei tegumentului larvei.

Fig. Oul la D. melanogaster

CICLUL DE VIA

Ca toate dipterele, Drosophila melanogaster prezint metamorfoza. complet (este o insect holometabolic), ciclul su vital parcurgnd stadiile de ou, larv, pup i adult. Durata ontogeniei variaz n funcie de temperatur, umiditate, compoziia mediului nutritiv etc.3

Fig. Ciclul de via la Drosophila melanogaster Pentru parcurgerea complet a acestor stadii sunt necesare 10 zile dac temperatura este de 25 C (temperatura optim) i respectiv 15 zile la 20 C. Expunerea la temperaturi de circa 30 C a culturilor de D. melanogaster determin sterilitatea n special n rndul masculilor i moartea culturii respective, iar temperaturile de 10 C prelungesc foarte mult ciclul vital (cca 57 de zile) i reduc viabilitatea (Cmpeanu, 2002). Oul este de culoare alb, are 0,5 mm i este depus de femele dup aproximativ dou zile de la ieirea din pup, n cazul n care au avut parteneri pentru mperechere. Oul este de tip centrolecit, are o lungime de 0,5 mm i form oval, cu partea dorsal mai bombat dect cea ventral, aplatizat.3

Membrana extern, numit i chorion, este groas, opac i prezint un model de semne hexagonale. n partea anterioar i dorsal oul prezint o pereche de filamente (apofize), acestora fiindu-le atribuit rolul de a mpiedica scufundarea sa n mediul lichid. Dezvoltarea embrionar se realizeaz foarte rapid, dup o zi la 25 C, de la momentul depunerii, din ou ieind o larv. Larva de Drosophila melanogaster este de culoare alb, are corpul segmentat i se deplaseaz prin trre. Stadiile larvare la Drosophila melanogaster sunt n numr de trei, fiind separate ntre ele prin dou nprliri. Larva de stadiu I prsete oul prin micropil, este mic, foarte mobil i se hrnete cu mare repeziciune. Este o larv de tip apod (fr apendici), acefal (capsula cefalic este infundat complet n torace). Aparatul bucal de tip primitiv (adaptat pentru rupt i mestecat) prezint mandibule puternice, ca nite crlige, cu ajutorul crora larva ptrunde n materialul nutitiv. Acest prim stadiu larvar dureaz aproximativ 24 ore. Pe msur ce larva crete, cuticula sa chitinoas devine nencptoare, astfel, c larva o prsete i i sintetizeaz o nou cuticul (nprlete). Larva de stadiul II apare n urma primei nprliri. Aceasta este mai mare i continu s se hrneasc timp de aproximativ 24 ore, dup care sufer nc o nprlire. Larva de stadiul III apare dup cea de-a doua nprlire (dup aproximativ ase zile de la fertilizare). Aceasta poate atinge 4,5 - 5 mm lungime, dezvoltndu-se pe parcursul a 48 ore, la 25 C. Pupa reprezint stadiul de reorganizare morfo-fiziologic din ciclul vital de la D. melanogaster. Are o durat variabil, acest parametru fiind profund influenat de temperatur. La Drosophila melanogaster pupa este de tip coarctat ,,pupa butoia", o variant a pupei adectice (cu mandibule nesclerificate) de tip liber, caracterizat prin aceea c larva de stadiul III mpupeaz n interiorul ultimei exuvii larvare. La nceput, nveliul pupal chitinos este alb i moale. Odat cu scurtarea corpului larvei, el se ntrete i se nchide la culoare, fiind numit i puparium. Are form oval, msoar 2,5 - 3 mm i prezint n partea anterioar dou prelungiri ce corespund spiraculelor evaginate ale fostei larve. Stadiul de imago. n urma transformrilor ce au loc n interiorul nveliului pupal, se formeaz adultul care eclozeaz printr-o deschidere circular din regiunea anterioar a pupariumului. La nceput insecta este foarte lung, cu aripile nedesfcute, lipite de corp i are o culoare deschis. Procesul complex al dezvoltrii la musculia de oet parcurge cteva etape eseniale i anume: embriogeneza, creterea larvar, mpuparea i metamorfoza.4

n timpul oogenezei, punile citoplasmatice numite "canale inelare" conecteaz oocitele n formare cu celulele mam. Nutrienii i moleculele pentru controlul dezvoltrii sunt transferate din celulele mam n oocite. Dezvoltarea embrionar are loc consecutiv fecundaiei i se desfoar n interiorul membranei oului. Dezvoltarea embrionar ncepe cu stabilirea polaritii oului, de-a lungul axelor antero-posterioar i dorso-ventral datorit interaciunilor transcripionale i proteice coordonate de reeua de gene. Acest proces prezint o importan major, fiind demonstrat faptul c, mutaiile care afecteaz polaritatea sunt cauza dezvoltrii structurilor anterioare n regiunea posterioar, respectiv a celor dorsale n partea ventral a oului.

Fig. Ovarul cu oocite n formare la Drosophila melanogaster (sursa: octomilka-obecna.navajo.cz)

Oul nefecundat, format n ovarul femelei, este expulzat n uter, unde are loc fecundaia. Stadiul iniial al dezvoltrii embrionare const n formarea primilor doi nuclei prin diviziunea mitotic a nucleului zigotic, aceasta avnd loc imediat dup fertilizare.

1

Fig. Dezvoltarea embrionar la Drosophila melanogaster (sursa: biology.kenyon.edu/.../Chap13/droslifecycle.jpg) Timpul necesar pentru un ciclu de replicare a ADN i o mitoz este de aproximativ 10 min. Dup dou diviziuni sincrone cei 512 nuclei rezultai migreaz spre suprafaa extern a oului (cortex), formnd aa numitul blastoderm sinciial. Aproximativ 40 de nuclei migreaz, n schimb, la polul posterior al oului, unde vor da natere celulelor polare. Nucleii din cortex continu s se divid, se nconjoar cu citoplasma i se nchid n membran, formnd ceea ce se numete blastoderm celular.Acest stadiu apare la aproximativ 2,5 ore de la fertilizare i se prezint sub forma unui singur strat de celule, situat la exteriorul embrionului. Trebuie precizat c n stadiul de blastoderm, soarta fiecarei regiuni a oului este deja stabilit. Cercetrile au dovedit c trsturile majore ale planului corpului larvei i adultului, sunt prezente nc din acest stadiu timpuriu al embriogenezei. Proieciile bidimensionale ale organelor externe ale adultului pe suprafaa blastodermului, sunt cunoscute sub numele de ,,fate maps" - hari ale destinului. Celulele blastodermului urmeaz dou ci posibile de dezvoltare. Astfel, majoritatea lor vor continua s se divid, se vor diferenia i vor asigura formarea embrionului. O parte dintre blastomere se vor separa de celelalte, ele constituind celulele de origine ale esuturilor viitorului adult. Aceste celule programate s genereze structuri adulte se vor organiza n aa numitele discuri imaginale. Fiecare segment al corpului organismului adult este constituit din descendenii celulelor discurilor imaginale. Exist 12 perechi de discuri bilaterale i un singur disc genital, de exemplu: o pereche pentru ochi i antene, trei perechi pentru picioare, o pereche pentru1

aripi, o pereche pentru haltere etc. Alte celule ale blastodermului vor forma structurile interne i externe ale larvei. Dei planul viitorului organism adult este prezent nc din stadiul de blastoderm, segmentele acestuia nu se disting. Segmentele sunt structuri morfologice vizibile, att la adult, ct i la larv. Embrionul de 10 ore prezint trei segmente toracice i opt abdominale, separate prin anuri, corespunznd segmentelor viitorului adult. n acest stadiu al dezvoltrii, celulele fiecrui segment sunt deja determinate s formeze fie un compartiment anterior (jumtatea anterioar a respectivului segment), fie un compartiment posterior (jumtatea posterioar a acestuia). Segmentul nu este altceva dect unitatea de structur a embrionului, n timp ce compartimentul constituie unitatea de dezvoltare format din celulele viitoarelor discuri imaginale. Descendenii acestor celule, numite i celule fondatoare, nu pot trece dintr-un compartiment n altul, astfel c la embrionul tardiv i la adult, compartimentul se distinge prin aceea c include numai celulele provenind din linia fondatoare corespunztoare. Trebuie precizat c n stadiul de blastoderm, cea mai mare parte a embrionului este divizat ntr-o serie de compartimente alternative, anterioare i posterioare. Un segment adult, ns, const dintr-un singur compartiment anterior urmat de unul posterior. La nivelul blastodermului a fost sugerat i un alt tip de segmentare, situaie n care anurile de separare sunt vizibile ntre aa numitele parasegmente. Un parasegment const din compartimentul posterior al unui segment i compartimentul anterior al segmentului urmtor. Astfel, graniele dintre segmente corespund cu centrele parasegmentelor.

Fig. 19 Etapele transformrilor care se perec la nivelul blastulei, la Drosophila melanogaster (Sursa: biology.kenyon.edu/.../Chap13/Chapter_13A.html)

2

Toate aceste procese sunt controlate de genele de segmentare, ale cror mutaii afecteaz att numrul ct i polaritatea segmentelor corpului. Regiunea posterioar a oului conine componente citoplasmatice numite granule polare, iar nucleii care migreaz n aceast regiune formeaz aa numitele celule polare care sunt precursorii celulelor germinale ale adultului. Dac regiunea posterioar a oului este distrus nainte de migrarea nucleilor, sau dac aceasta este impiedicat prin legtura embrionului, musculia adult se dezvolt, totui, dar este steril, neavnd celule germinative. Transplantul de citoplasm polar n regiunile anterioare ale oului, induce formarea celulelor polare n regiuni neobinuite. Asemenea celule polare induse pot genera celule germinale funcionale dac sunt nlturate chirurgical i injectate n regiunea posterioar a embrionilor marcai genetic. Astfel, citoplasma specific de la polul posterior al oului, propag n nucleii ce migreaz la acest pol, o stare de determinare care, conduce la o form specific, de difereniere. A fost formulat postulatul conform cruia ntr-un segment sau compartiment individual, una sau mai multe gene selectoare (deintoare de informaie poziional) determin o cale particular de dezvoltare pentru celulele din acel compartiment. Mutaiile acestui sistem de selecie, numite mutaii homeotice, modific starea de determinare a celulelor dintr-un segment sau compartiment, astfel c ele genereaz structuri ntlnite normal n alte segmente. De exemplu, mutaia ,,tumorous head" (engl. = cap tumoral) transform capul n ultimul segment abdominal i n genitalii. Pe parcursul tuturor celor trei stadii larvare, din momentul apariiei primului stadiu i pn la formarea pupariumului, celulele larvare nu se divid, dei larva crete considerabil. Aceast cretere se datoreaz exclusiv mririi taliei celulelor, care este nsoit de replicarea ADN i formarea cromosomilor politenici (politenizare). Spre deosebire de celulele larvare, cele adulte (reprezentate de celulele discurilor imaginale) se divid n timpul acestei perioade. Astfel, creterea discurilor imaginale are loc pe seama diviziunii celulelor acestora. n timpul celui de-al doilea stadiu larvar, discul imaginal al aripii este constituit din 50 de celule, la 35 de ore de la fertilizare. Dup 122 de ore, numrul celulelor respectivului disc atinge 30000. La 25 C, primul stadiu larvar dureaz 24 de ore, astfel c, prima nprlire are loc la 46 de ore de la fertilizare. Al doilea stadiu larvar este cuprins ntre cele dou nprliri (cea de-a doua nprlire larvar survine dup 70 de ore de la fertilizare) i dureaz alte 24 de ore. Ultimul stadiu larvar atinge dimensiunea maxim dupa 48 de ore de la cea de-a doua nprlire. Urmtoarea etap a dezvoltrii la Drosophila melanogaster o constituie mpuparea. Problema formrii pupei i cea a pupariumului reprezint motivul unei dispute ndelungate ntre specialitii n1

fiziologia insectelor. Este evident c cele dou procese sunt identice. n acest sens, D.B. Roberts ofer urmtoarea explicaie: - formarea pupariumului conduce la apariia stadiului de prepup i poate fi considerat prima parte a unei nprliri, epiderma fiind nc lipit de prepupariumul format n vechea cuticul a larvei de stadiu III; - finalizarea acestei nprliri i desprinderea epidermei fostei larve de puparium (ultima exuvie larvar) constituie tocmai procesul de mpupare. Formarea puparimului, a pupei i metamorfoza au fost studiate de muli cercettori, pe parcursul unei lungi perioade. Cel mai detaliat studiu la Drosophila melanogaster, realizat de ctre Bainbridge i Brown (citai de Roberts n 1986), identific 51 de stadii vizibile n timpul metamorfozei i descrie 24 de stadii utilizabile n analiza experimental. Cu opt ore nainte de a ncepe formarea prepupariumului, larva de stadiu III nu se mai hrnete, prsete mediul nutritiv, n cutarea unei suprafee relativ uscate. Aceast etap se mai numete stadiu larvar hoinar. Dup aproximativ 120 de ore de la fertilizare (la 25 C), ncepe procesul de formare a prepupariumului odat cu apariia unei prepupe de culoare alb i care prezint anterior spiraculele evertate, ea ncepnd s se mite (timpul zero). Prepupa (i ulterior pupa) rmne fixat pe substrat prin intermediul unei proteine lipicioase secretate de glandele salivare ale larvei. n decursul a 20 min. - o or, culoarea prepupei devine maro. Dup patru ore de la apariia prepupei, n abdomenul acesteia se formeaz o bul de aer, astfel c organismul respectiv capt proprietatea de flotabilitate. Imediat dup acest eveniment ncepe formarea pupei propriu-zise, stadiu care atinge forma complet la aproximativ 12 ore de la momentul zero - nceperea formrii prepupariumului. Fig. Dezvoltarea sistemelor de organe n timpul embriogenezei la Drosophila melanogaster (rou- mezoderm, verde- amnioserosa, galbensistem digestiv, albastru- sistem nervos, gri- vitelus, alb- epiderma, negru- esut embrionar) (Sursa http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch02/)

2

Ciclul de dezvoltare continu cu metamorfoza, etap n care au loc intense procese de histoliz i histogenez. Majoritatea celulelor larvare sufer autoliza, cu excepia tuburilor Malpighi i a unor celule nervoase. esuturile adulte iau natere din celulele discurilor imaginale. Acestea pot fi grupate n dou categorii i anume: discuri ale cror celule au suferit diviziuni n timpul vieii larvare, dar au ncetat s se divid n timpul mpuprii i celule imaginale care se divid n perioada timpurie a metamorfozei, cum sunt histoblastele abdominale.

Fig. Comparaie ntre poziia unor organe la larva i la adultul de Drosophila melanogaster (Sursa: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch02/fig2_34.jpg)

Mesoderm

Mezectoderm

Endoderm

Ectoderm

Fig. Stadiile dezvoltrii celor trei foie embrionare la Drosophila melanogaster

2

Celulele discurilor imaginale cresc, sufer micri morfogenetice i se difereniaz, conducnd la constituirea adultului de Drosophila melanogaster. Precizm faptul c gonadele adultului se difereniaz pornind de la gonadele larvare (care, la rndul lor i au originea n celulele polare), diviziunea reducional i formarea gameilor avnd loc n timpul metamorfozei. Astfel, adulii sunt api de mperechere, n medie, dup 220 de ore (la 25 C) de la fertilizare.

RSPNDIRE I ECOLOGIE Habitatul natural i condiiile de laborator Drosophila melanogaster a fost introdus pe fiecare continent din lume cu excepia Antarcticii. Pe celelalte continente rspndirea ei este limitat doar de regiunile montane, deerturi i altitudinile mari. (Demerec 1950). Drosophila melanogaster triete att n regiuni tropicale ct i n cele temperate. Numele tiinific al musculiei de oet, Drosophila, nseamn "iubitoare de rou", ceea ce indic faptul c specia are nevoie de un mediu umed. Dezvoltarea speciei este dependent de temperatur, adulii nu pot suporta temperaturile sczute, nlimile mari i latitudinile mari. n climatele reci, Drosophila melanogaster nu poate supravieui. n regiunile temperate unde prin activitatea uman a fost introdus Drosophila melanogaster, musculiele i caut adpost n lunile reci de iarn. Indivizii speciei Drosophila melanogaster sunt frecvent ntlnii n natur, pe fructe care au nceput s fermenteze (mere, pere, prune, struguri, etc.). Vara o ntlnim n vii, grdini, livezi sau n magazii, beciuri cu fructe i legume (mai ales dac acestea sunt alterate), n depozite, pe tescovina aruncat i, n general, n locuri insalubre. (Demerec, 1950) Aceast specie nu prezint diapauz, iernnd n magazii, depozite, beciuri, etc. n laborator, musculia de oet poate fi cultivat pe medii sintetice, care conin zahr i drojdie - componente ce mijlocesc procesul de fermentaie. Compoziia mediului are influene asupra ciclulului vital, viabilitii i prolificitii insectei. D.B. Roberts (1986) mparte mediile nutritive n cinci categorii, n funcie de scopul n care sunt folosite: a) mediile standard, utilizate n orice scop - meninerea culturilor, pregtirea ncrucirilor etc; b) mediile imbogite, folosite cu scopul de a obine larve mari necesare pentru studiul cromosomilor politenici i pentru studii biochimice;3

c) mediile ,,instant", disponibile n comer, uor de preparat n caz de urgen; d) mediile axenice, pentru creterea musculielor n condiii sterile; e) mediile sintetice definite, pentru studii biochimice. Temperatura - factor fizic ce influeniaz dezvoltarea Drosophilei melanogaster Temperatura optim pentru dezvoltarea indivizilor de Drosophila melanogaster este de +24 - +25C, la aceast temperatur ciclul vital dureaz 10 zile (stadiului de ou i revin 24 ore, celui de larv - 4 zile, i pupei tot 4 zile). Astfel, ntr-un an se pot obine 40 de generaii. Temperaturile mai mari de +31C, femela devine, parial sau chiar total steril. n regiunile cu umiditate sporit, musculia de oet poate tolera temperaturi mai ridicate ale aerului. La temperaturi mai mici, ciclul de dezvolatre al insectei se lungete. Astfel, la +20C, ciclul vital se prelungete pn la 16 zile (larva - 8 zile, pupa - 6-7 zile), pe cnd la +10C durata ontogeniei ajunge la 75 de zile (larva 57 zile, pupa - 13-14 zile). Drosophila melanogaster prezint mai multe ,,tulpini" termosensibile. n majoritatea cazurilor temperatura permisiv este +18C sau +20C, iar temperatura restrictiv este +29C Umiditatea Umiditatea optim necesar dezvoltrii normale pentru Drosophila este de 75-85%. n unele cazuri, acest parametru poate deveni o problem serioas. Un nivel al umiditaii sub 70% afecteaz profund fertilitatea i viabilitatea insectelor. PROLIFICITATEA n cursul vieii, o femel de Drosophila melanogaster depune cteva sute de ou. n majoritatea cazurilor numrul oulor depuse este de 200-300. Ameliorarea condiiilor de viaa determin o cretere a numrului de ou depuse, uneori acesta ajungnd pn la 2000. n medie o pereche de insecte d natere aproximativ la 170 descendeni.

LONGEVITATEA

4

Adulii de Drosophila melanogaster, n condiii de laborator, triesc aproximativ 3-4 sptmni. Longevitatea depinde de condiiile n care sunt crescute insectele i anume: temperatura, umiditatea, compoziia mediului nutritiv, densitatea populaiei, prezena n mediu a paraziilor, etc. n condiii optime, indivizii de Drosophila pot supravieui chiar 22 de sptmni (153 de zile). Exist unele mutante care au o viabilitate mult mai mare dect a Wild type (tipul normal sau slbatic), ns, de obicei, mutantele i liniile sunt mai puin viabile comparativ cu tipul normal. COMPORTAMENTUL Comportamentul Drosofilei melanogaster este simplu. Indivizii sunt atrai de mirosul oricrei surse de hran, i se mperecheaz aproape fr discriminri cu indivizi de sex opus. Masculii prezint aa numitul pieptene sexual. S-a speculat c, aceti piepteni sunt folosii pentru imobilizarea femelei n timpul acuplrii. Indivizii au periori pe spate i sunt sensibili la curenii de aer. Ochii musculiei de fructe sunt sensibili chiar la diferene mici ale intensitii luminii. De aceea aproape instinctual zboar dac intensitatea luminii scade sau percep micare n apropiere. Drosophila melanogaster are, de asemenea, tendina de a zbura ctre lumin. n vasele de cultur se observ ca musculiele migreaz spre zona cea mai luminoas. FORMULA CROMOSOMIAL LA DROSOPHILA MELANOGASTER

Celulele somatice de Drosophila melanogaster conin 2n = 8 cromosomi, acetia fiind grupai n patru perechi la femel i trei perechi plus X i Y la mascul. Intregul set cromosomial msoar 7,5 m. Numrul mic de cromosomi i posibilitatea unei diferenieri foarte clare a acestora au constituit un argument n favoarea folosirii Drosophilei n calitate de model experimental. n urma cercetrilor citogenetice, efectuate pe ganglionii cerebroizi ai larvelor de stadiul III, a fost stabilit morfologia cromosomilor din fiecare pereche.1. Cromosomii perechii I sunt cromosomii sexului (heterosomi, losomi, gonosomi)

i difer la indivizii aparinnd celor dou sexe. Femelele au o pereche de cromosomi omologi, n form de bastonae drepte, notai XX. Aceti cromosomisunt telocentrici, avnd centromerul plasat terminal. Conin un numr5

foarte mare de gene care manifest fenomenul de sex-linkage (genele plasate pe un anuit cromosom se transmit nlnuit) i se numesc gene X-linkate.2. Cromosomii perechii a II-a sunt autosomi, avnd forma literei V la mabele sexe.

Din punc de vedere morfologic fac parte din categoria cromosomilor submetacentrici (au centromerul situat submedian).3. Cromosomii perechii a III-a sunt submetacentrici, avnd, de asemenea, forma

literei V. Sunt puin mai mari comparativ cu cei din perechea a II-a i sunt identici pentru ambele sexe.4. Cromosomii perechii a IV-a sunt de dimensiuni foarte mici, din care cauz sunt

numii punctiformi. Sunt autosomi omologi, identici la cele dou sexe. Au cenromerul plasat terminal i conin un numr mic de gene. Din punct de vedere structural, ADN-ul cromosomilor de Drosophila melanogaster este de tip liniar dublu catenar. Prin asocierea sa, n principal, cu histonele se formeaz fibra de cromatin care, n urma unor procese complexe de spiralizare i mpachetare, d natere cromosomului de tip eucariot. Materialul cromosomial a fost clasificat n eucromatin i heterocromatin. La Drosophola melanogaster, att autosomii, ct i heterosomul X, prezint blocuri mari de heterocromatin, n timp ce cromozomul Y este complet heterocromatinizant. Un tip special de cromosomi sunt cromosomii lampbrush (engl. Lamp= lamp, Brush= perie), care sunt ntlnii doar la unele tipuri de celule. Acetia nu sunt cromosomi somatici, ei fiind caracteristici oocitelor primare celule care vor da natere, n urma meiozei, ovulelelor multor specii de vertebrate i nevertebrate. La Drosophila melanogaster, cromosomii lumpbrush sunt prezeni att n nucleii oocitelor, ct i n cei ai speramatocitelor, fiind vizibili n diplotenul profazei I meiotice. Aceti cromosomi nu sunt politenici, ei reprezint cei doi omologi conjugai ntr-un singur complex. Dimensiunile lor mari se datoreaz puternicei despiralizri a romatidelor. Fiecare component al bivalentului este format din dou cromatide, astfel c ntregul ansamblu posed patru cromatide. Denumirea de lampbrush provine din faptul c, att cromosomul de origine matern, ct i cel de origine patern, au o form de perie de lamp, reprezentnd un ax central din care pornesc numeroase bucle, de diferite dimensiuni, repartizate de o parte i alta a respectivului ax. Buclele au form de elipse asimetrice i sunt mai groase n punctul iniial de ataare pe axul longitudinal, i mai subiri n partea opus acestuia. Fiecare bucl este constituit dintr-o poriune dublu helicat de ADN. Mai trebuie precizat c buclele plasate de o parte a axuli

6

longitudinal i constituite din ADN-ul unei cromatide, le corespund bucle identice ca poziie i dimensiune, dar formate prin despiralizarea celeilalte cromatide a respectivului cromosom. Studiile autoradiografice au demonstrat existena unor mari cantiti de ARN i proteine la nivelul buclelor, ceea ce sugereaz c procesul de transcripie se desfoar foarte intens n aceste regiuni ale cromosomilor lampbrush. Activitatea puternic de sintez a tuturor tipurilor de ARN i a diverselor proteine., asigur creterea oocitelor i acumularea vitelusului n citoplasma acestora. Buclele cromosomilor lampbrush sunt similare pufelor cromosomilor politenici. Se pare c i cromosomul Y de la Drosophila melanogaster adopta structur lampbrush. CROMOSOMII POLITENICI

7