deter min area vitaminei e din fitoextracte (refacut)

8/2/2019 Deter Min Area Vitaminei E Din Fitoextracte (Refacut)

1/13

INTRODUCERE

VITAMINA E

In anul 1922 Dr. Herbert McLean Evans si Katherine Scott Bishop, anatomisti si fiziopatologi Universitatea din Berkley au descoperit vitamina E. Efectuarea unor cercetari folosind o dieta semipurifica

administrata unor sobolani a determinat observarea urmatorului aspect: femelele sobolan pot ramane gestantdar fetusii mor in uter, in timp ce adaosul de salata verde proaspata sau germeni de grau la dieta semipurifica

a determinat aparitia unor pui sanatosi. In mod evident, in salata verde si in germenii de grau exista un nutrien

care nu era prezent si in dieta semi-purificata. Acest nutrient a fost denumit Factorul X , iar in 1924 numele ifost schimbat in vitamina E (tocoferolul, din grecescul toco nastere).

Vitamina E a fost izolata abia in 1936, tot de catre Dr. Evans si colaboratorii, in timp ce in 193

Dr. E Fernholz descopera structura chimica a tocoferolului.

Cercetarile sunt continuate de catre laureatul premiului Nobel pentru chimie, Paul Karrer, ca

sintetizeaza vitamina E. Abia in 1958 toti cei 8 compusi chimici care alcatuiesc familia denumita gener

vitamina E sunt descoperiti.In anul 1956 Dr. Harmann lanseaza teoria radicalilor liberi (radicalii liberi sunt produsi d

metabolism celular) care stau la baza procesului de imbatrinire. Teoria lui Harmann este simpla si elegantacesti radicali liberi reactioneaza cu ADN-ul si alti constituenti celulari, lezandu-i. Dr. Harmann a observat nutrientii antioxidanti precum vitamina C si E pot neutraliza radicalii liberi.

CE FACE?

Vitamina E este un puternic antioxidant, protejand tesuturile si grasimile din organism de actiuniradicalilor liberi. Radicalii liberi sunt incriminati in aparitia bolilor cardiovasculare si cancerului.

Joaca un rol important in functionarea adecvata a sistemului imun, repararea ADN-ului si procesul d

respiratie celulara.

Observatie: Radicalii liber lezeaza foarte usor grasimile. Membrana celulara este constituita din grasimi si esfoarte vulnerabila la actiunea oxidativa radicalilor liberi. Vitamina E are un rol cheie in interceptarea acesto

radicali liberi si impiedicarea unui intreg lant de reactii distructive pentru grasimi. Alte molecule protejate d

vitamina E sunt lipoproteinele, substante care transporta grasimile prin fluxul sanguin. Dintre acestelipoproteinele cu densitate joasa (LDL), transporta colesterolul de la ficat in restul organismului. S-a constat

ca aceste molecule pot fi oxidate de catre radicalii liberi, LDL-ul oxidat fiind unul dintre factorii mentionati

aparitia bolilor cardiovasculare.

1


2/13

SURSE NATURALEVitamina E este o vitamina liposolubila (alaturi de vitamina A, D si K) care grupeaza 8 compu

chimici: 4 tocoferoli si 4 tocotrienoli, notati in cadrul fiecarei subgrupe cu literele grecesti alfa, beta, gama delta. Acesti compusi se gasesc in diferite proportii atat in natura, cat si organismul uman, iar alfa-tocoferolul

fost cel mai intens studiat, proportia lui in organism fiind de altfel mult mai mare decat a celorlalti compusi

considerandu-se astfel forma cea mai activa a vitaminei E.Sursele naturale ale vitaminei E sunt: uleiurile vegetale (de floarea soarelui, porumb, soia

masline), nucile, alunele, migdalele, semintele de floarea soarelui, germenii de grau, legumele cu frunze ver

(broccoli, spanac). Cele mai bogate surse sunt uleiurile vegetale. Comparativ, uleiul de floarea soarelui contin55,8 mg vitamina E/100 g fata de uleiul de masline cu 12 mg/100 g sau uleiul din germeni de grau 215,4 m

100 g.

DACA LIPSESTE

Lipsa vitaminei E determina fragilitate membranara la nivelul hematiilor(celulele rosii asangelui), cu oxidarea si distrugerea hematiilor. Carenta de zinc poate determina la randul ei un nivel scazut d

vitamina E.Manifestarile deficitului de vitamina E sunt:

Tulburari neurologice la nivelul mainilor si picioarelor (durere, parestezii sau intepaturi, anestezie),

urmare a unei transmiteri defectuoase a impulsului nervos

Paloare tegumentara secundara anemiei

Tulburari de vedere, iritabilitate

Tulburari de concentrare, oboseala

Infectii mai frecvente

Ca urmare a malabsorbtiei grasimilor, pacientii prezinta scaune grasoase si diaree cronicaO serie de studii preliminare au sugerat ca vitamina E ar putea preveni sau intarzia instalar

bolilor cardiace coronariene, insa studiile controlate, pe populatii largi nu au demonstrat acest aspect. Se pa

ca aceasta lipsa a rezultatelor directe ar putea fi explicata de studierea doar anumitor forme de vitamina E (speta alfa-tocoferolul), nu toate formele prezentand acelasi rol. Studii recente indica faptul ca alfa-tocoferol

nu ar avea nici un rol in inhibarea proliferarii celuleor neoplazice prostatice, in schimb gama-tocoferolul

delta-tocoferolul au rol anti-cancerigen.Un alt studiu observational arata ca vitamina E combinata cu vitamina C a determinat o intarzier

a debutului bolii Alzheimer cu 64 78 %. Si in acest caz cercetatorii iau in considerare alte forme de tocofero

si nu alfa-tocoferolul.

2


3/13

DETERMINAREA CONTINUTULUI DE VITAMINA E.

METODA PRIN CROMATOGRAFIE DE LICHIDE

DE INALTA PERFORMANTA

NUTRETURI

Domeniu de aplicare

Acest standard international stabileste metoda de determinare a continutului de vitamina E (DL-tocoferol) din nutreturi si alimente pentru animale de casa prin cromatografie de lichide de inalta perfor-manta

Principiul metodei

Saponificarea probei cu solutie de hidroxid de potasiu si extractia vitaminei E in eter de petroIndepartarea eterului de petrol prin evaporare si dizolvarea reziduului in hexan. Determinarea concentratiei dvitamina E a extractului in hexan prin cromatografie de lichide cu faze normale, in conditii de lucru in care

separa DL--tocoferolul de ceilalti tocoferoli.

Reactivi

Se folosesc numai reactivi de puritate analitica Apa, care sa corespunda cel putin calitatii de puritate 3 conform ISO 3696.

Solutiede hidroxid de potasiu. Se dizolva 500 g hidroxid de potasiu in apa si se dilueaza la 1 litru.

Etanol, w(C2H5OH) = 95 % (raport volumetric) sau alcool industrial metilat, echivalent. Hexan, de puritate HPLC.

Eter de petrol,punct de fierbere intre 400C pana la 600C, reziduul la evaporare trebuie sa fie mai mic

de 20mg/l

Vitamina E, substanta etalon: DL--tocoferol, puritate minima 96,0 %. Puritatea etalonului se verifispectrofotometric.

1,4 Dioxan, de puritate HPLC

Sulfat de sodium (Na2SO4), anhidru.

Solutie de ascorbat de sodium, = 100g/l

Gaz inert, exemplu azot.

Faza mobila pentru cromatografia de lichide.Se amesteca 30 ml 1,4-dioxan cu 970 ml hexan. Se titreaza printr-o membrane filtranta inainte de

folosire.

Etanol, w(C2H5OH) = 96 % (raport volumetric)

Metanol (CH3OH), calitate HPLC

3


4/13

Aparatura

Aparatura obisnuita de laborator si, in special urmatoarele: Cromatograf de lichide de inalta performanta, constand in:

Pompa, fixata pentru a furniza un debit constant de eluent de 1,5 ml/min.

Dispozitiv de injectie HPLC

Coloana, lungime 250 mm, diametru interior 4,6 mm, umpluta cu faza stationara constand din

silice.

Se considera satisfacatoare coloana care are cel putin 5000 talere teoretice si o valoare k de 0,8, amblele creferire la DL- -tocoferol. Marimea particulelor nu trebuie sa fie mai mica de 5 m sau mai mare de 10 m

Pot fi folosite si alte sisteme pentru care s-a demonstrat ca realizeaza o separare satisfacatoare a vitaminei E d

alte co-extractive.

Detector permitand masurarea fluorescentei emisa la lungimea de unda de 326 nm cand eluat

coloanei este iradiat cu lumina ultravioleta la o lungime de unda de 293 nm, cu interferen

integrator/inregistrator.

Baie de apa la fierbere

Evaporator rotativ, cu baia de apa la 400C.

Aparat de extractie constand din cilindru de capacitate de 1 litru prevazut cu gat si dop rodajonctiune de sticla rodata, care sa se potriveasca la cilindru, prevazuta cu un tub ajustabil ca

trece prin centru si brat lateral.

Tubul ajustabil trebuie sa aiba capatul inferior sub forma de U si capatul opus sub forma de varf, asa incstratul de lichid superior din cilindru sa poata fi transferat intr-o palnie de separare cu capacitatea de 1 litru. P

fi folosite si alte dispozitive de extractie asa ca pahare conice si palnii de separare in locul aparaturii, c

conditia sa se obtina recuperari de vitamina E satisfacatoare.

Membrana filtranta, cu marimea porilor de 0,45 m, pentru filtrarea fazei mobile si a solutiil

proba.

Moara de laborator, care permite macinarea probei astefl incat sa treaca prin sita cu ochiuri demm.

Spectrometru UV (sau UV-VIS), capabil sa masoare absorbanta la lungimile de unda definit

prevazut cu cuva de cuart cu drum optic de 10 mm.

4


5/13

5


6/13

Mod de lucru

Din cauza sensibilatatii vitaminei E la radiatii UV si aer, toate operatiile se efectueaza in absenluminii naturale sau a lumii puternic fluorescente si cat mia repede posibil potrivit cu o executie corecta. Aco

unde este posibil se foloseste sticlarie bruna. Fiecare determinare se termina in decursul unei zile de lucru.

1. Saponificare

Se cantaresc, cu exactitate de 0,1 g, aproximativ 50 g proba pentru analiza preparata, intr-un pahconic de 1 l.

Se adauga 200 ml etanol, in timp ce se agita paharul pentru a dispersa proba. Se adauga 2 m

solutie de ascorbat de sodium, se amesteca prin agitare, apoi se adauga 50 ml solutie hidroxid de potasiu si agita din nou.

Se fixeaza refrigerentul de refluxare la pahar, si se imerseaza paharul in baia de apa la fierbere.

Se lasa continutul paharului sa firba sub reflux timp de 30 de minute, agitand ocazional.

Se raceste paharul la temperatura camerei sub jet de apa rece.

Se transfera continutul paharului in cilindrul de extractie.

2. Extractia vitaminei E

Se spala paharul de saponificare de doua ori cu cate 25 ml de etanol si se transfera acestea

cilindru.Se repeta spalarea paharului de doua ori cu cate 125 ml eter de petrol si o data cu 250 ml ap

transferand de fiecare data in cilindru.

Se astupa cilindrul si se agita energic 1 min, eliberand presiunea din cand in cand.Se raceste sub jet de apa rece, asteptand separarea celor doua faze lichide, inainte de a indepar

dopul.

Dupa ce straturile s-au separate, se scoate dopul, se spala peretii dopului cu cativa mililitrii eter dpetrol si se insereaza tubul ajustabil, pozitionand capatul deschis inferior asa incat sa fie chiar deasupinterfetei de separare.

Prin aplicarea unei presiuni usoare de gaz inert la bratul lateral, se transfera stratul superior de et

de petrol intr-o palnie de separare de 1 litru.Se adauga 125 ml eter de petrol in cilindru, se astupa si se agita energic 1 min.

Se lasa sa se separa straturile si se transfera stratul superior in palnia de separare folosind tub

ajustabil ca mai inainte.Se adauga din nou 125 ml eter de petrol in cilindru, se astupa si se agita energic 1 min.

Se lasa, din nou, sa se separa straturile si se transfera stratul superior in palnia de separare folosin

tubul ajustabil ca mai inainte.

Se spala extractele combinate de eter de petrol de patru ori cu cate 100 ml de apa, la inceput prirasturnare si agitare usoara, pentru a evita formarea emulsiei.

Se transfera extractul spalat, printr-o hartie de filtru de porozitate medie/rapida continand 30

sulfat de sodiu anhidru, intr-un balon de 1 litru al evaporatorului rotativ.Se spala palnia de separare de doua ori cu cate 20 ml eter de petrol care se adauga prin filtru

balonul evaporatorului rotativ.

Se are grija ca balonul sa fie indepartat de la evaporatorul rotativ imediat ce se atinge punctul seuscarea prelungita poate duce la pierderi de vitamina E din reziduul extractului de proba.

6


7/13


8/13

Se prepara o serie de etaloane de lucru pentru calibrare care sa contina 2 g/ml, 4 g/ml, 6 g/ml,

g/ml si 10 g/ml DL--tocoferol, prin diluarea solutiei etalon stoc cu hexan.

Solutiile etalon de lucru se prepara in ziua utilizarii.

4.2 Verificarea UV a substantei etalon de DL--tocoferol

Se cantaresc, cu exactitate de 0,1 mg, 100 mg DL--tocoferol, intr0un balon cotat de 100 ml. S

dizolva in etalon. Se aduce la semn cu acelasi solvent si se omogenizeaza.

Se dilueaza 2,0 ml din aceasta solutie la 25,0 ml cu etanol si se masoara spectrul UV al solutirezultate fata de etanol cu ajutorul spectrometrului, la lungimi de unda cuprinse intre 250 nm si 320 nm

Absorbanta maxima trebuie sa fie la 292 nm.

Exprimare rezultate

Continutul de vitamina E din proba pentru analiza se calculeaza cu ecuatia:

WE = 25 x c x 1,1 / m

wE continutul de vitamina E din proba pentru analiza, in unitati internationale pe kilogram;c concentratia de DL--tocoferol a extractului de proba, in micrograme pe mililitru;

m masa probei pentru analiza, in grame;

1,1 factor de corectie pentru DL--tocoferol

Fidelitate

Test interlaboratoare

In anexa A se dau detalii ale testului interlaboratoare privind fidelitatea metodei. Valorile rezulta

din acest test s-ar putea sa nu fie aplicabile pentru alte domenii de concentratie si alte tipuri de matrici deccele date.

Repetabilitate

Diferenta absolutadintre doua rezultate de analiza independente, folosind aceiasi metoda, pe probidentice, in acelasi laborator, de catre acelasi operator, folosind acelasi echipament, intr-un interval scurt d

timp, nu trebuie sa depaseasca in mai mult de 5 % din cazuri limita de repetabilitate mentionata sau rezulta

din tabelul 1.

Reproductibilitate

Diferenta absolutadintre doua rezultate de analiza independente, folosind aceiasi metoda, pprobe identice, in laboratoare diferite, de catre operatori diferiti, folosind echipamente diferite, nu trebuie depaseasca in mai mult de 5 % din cazuri limita de reproductibilitate mentionata sau rezultata din tabelul 1.

8


9/13

Anexa A

Rezultatele testului interlaboratoare

Fidelitatea metodei a fost stabilita printr-un test interlaboratoare efectuat conform ISO 5725 [2

Rezultatele acestui test au fost publicate. La test au participat 10 pana la 12 laboratoare si s-au investigat prob

de alimente pentru animale de companie si nutret pentru bovine, pasari si porci.

9


10/13

DETERMINAREA VITAMINEI E

PRIN METODA SPECTROMETRICA

DE ABSORBTIE IR

Domeniul infrarou (IR) al spectrului undelor electromagnetice con inradia ii cu lungimi deund cuprinse ntre 0.8 i 1000 m. Se aplic un grup de metode de analiz chimic ca valorific semnalele ob inute prin absorb ia radia iilor din acest domeniu. Domeni amintit, poate fi divizat la rndul s u n trei subdomenii: IR-apropiat (ntre 0.8 i 2.5 m IR-mediu (ntre 2.5-25 m) i IR-ndep rtat (peste 25 m). Domeniul mediu se m numete i IR fundamental. Acesta este cel mai bogat n informa ii i cel mai accesibexperimental. n vorbirea obinuit este domeniul IR care servete n mod curent atpentru analiza chimic ct i pentru recunoaterea calitativ a combina iilor anorganic

organice sau naturale dar i n determin ri de structur chimic . Absorb ia n IR se datoreaza interac iunilor dintre radia ia electromagnetic incident i anumecomponenta electric a acesteia, cu dipolii electrici ai unei molecule.

Aparatura

Spectrometre bazate pe dispersia luminii (folosind prisme sau monocromatoabazate pe difrac ie i interferen ) i care pot fi prev zute cu dou canale sa monocanal.

Spectrometre bazate pe transformanta Fourier , care permit intrarea n celul

ntregului domeniu spectral i care sesizeaz interferometric liniile caracteristicde absorb ie. Aceste instrumente, datorit unei rezolu ii mai bune i a rapidit datorate cupl rii cu calculatorul, n ultimul timp au devenit preferate.

Spectrometre bazate pe dispersie - Cu excep ia celor destinate IR - apropiat undcomponentele spectrometrului: sursa, mediul optic, celula sau detectorii suasem n toare cu cele pentru domeniul UV-VIS, n spectrometria IR apa componente din materiale diferite de primele. Deosebirea major este aceea c monocromatorul este aezat dup celulele cu probe.

Componente ale instrumenta iei n IR

Sursele de radia ie IR sunt becul cu filament de W (pentru IR apropiattuburile Nernst, l mpileGlobar i filamentele Nicrom toate trei pentru IR fundamental i l mpile cu mercur presiune ridicat pentru IR ndep rtat.

Tuburile Nernst constau din rezisten e formate din tubuoare cu diametru de 2mi 30cm lungime confec ionate din amestecuri de oxizi ai p mnturilor rare ( special Y i Er) plus ZrO2. Domeniul spectral n care lucreaz este 0.4-20 m.

10


11/13

L mpile Globar (denumire comercial - GLOBAR care s-a ncet enit) su rezisten e care constau din nite baghete de 4mm diametru avnd 50cm lungimconfec ionate din SiC. Sunt mai fragile dect tuburile Nernst.

Spiralele din srm Nicrom sunt sursele cele mai pu in preten ioase. Stabile timp, rezistente n aer acestea dau o temperatur mai sc zut i, n consecin , a

o putere de emisie mai slab . Stratul de oxizi format pe suprafa asigur emis radia iei. Servesc drept surse n aparatele mai pu in preten ioase. Monocromatoarele pentru IR sunt construite pe aceleai principii cu cele d

domeniul UV-VIS i pot fi cu prism sau re ea. Un dezavantaj al acestora es acela c nu pot fi confec ionate din acelai material pentru tot domeniul IR.

Detectorii utiliza i n spectrometria de absorb ie n IR sunt deosebi i de restul detectorilor folosi in UV-VIS. Acetia pot fi clasifica i pe baza principiului care st la baza func ion rii n dougrupuri:

Detectori cuantici baza i pe efectul fotonilor asupra materialelor; Detectori termici care se bazeaz pe modificarea propriet ilor fizice a

materialelor cu temperatura.

Schema de principiu a unui spectrometru cu re ea. S - surs , O - oglinzi, C - cuve, A - atenuatoare, F1, F2 - fante, R1,R2 - re ele, Tc - termocuplu

Dintre detectorii termici, cei mai folosi i n ultimul timp, amintim: termocupluriltermorezisten ele i detectorii pneumatici.

Termocuplurile, sunt dispozitive care se bazeaz pe generarea unei tensiuelectrice ntr-un circuit con innd dou jonc iuni identice, formate din meta diferite (prin topire local ). Cele dou jonc iuni trebuie s se afle la temperatu diferite (efect Peltier), condi ii n care apare tensiunea amintit .

11


12/13

Termorezisten ele sau bolometrele sunt alc tuite dintr-un conductor sa semiconductor care i modific rezisten a cu temperatura. Cele cu semiconducto se mai numesc i termistori.

Detectorii pneumatici sunt termometre cu gaz foarte sensibile. Un astfel ddetector const dint-o capsul metalic (cilindric ) avnd un cap t nchis cu

pl cu metalic nnegrit iar la cel lalt cu o pl cu metalic flexibil . Radia ia c znd pe partea nnegrit , nc lzind gazul din celul , provoac dilatarea acestui Ca urmare, gazul provoac o deplasare a membranei flexibile datorit m ri volumului incintei. Micarea poate fi sesizat prin includerea acestei membranflexibile ntr-un condensator care, la rndul lui, este inclus ntrun circuit dm surare a capacit ii.

Preg tirea probelor pentru analiz

Analiza prin spectrometrie de absob ie n IR se poate aplica pentru gazlichide sau solide.

Solidele se analizeaz fie n solu ii fie ca emulsii n ulei de parafin . Acest absoarbe doar n trei benzi cunoscute. Se mai pot utiliza emulsii n KBr cristalin la dilu ie de 1% (1mg substan la 99mg KBr). Pastila transparent ob inut dup m cinare i presare se fixeaz ntr-o ram potrivit se introduce n aparat n fa a fascicolului IR.

Spectru de absorbtie in IR al vitaminei E

Concluzii

Analizand cele doua metode de determinare, observam ca sunt eficiente exacte. Datorita preciziei bune asupra informatiilor obtinute de pe urma probel

12


13/13

analizate, aceste doua metode prezinta o sensibilitate ridicata a aparaturii utilizate laborator determinand astfel ca un dezavantaj costuri ridicate achizitionaechipamentului de laborator.

BIBLIOGRAFIE

SR EN ISO 6867:2001

http://www.emedonline.ro/vitamine/view.article.php?17

http://www.tratamente-naturiste.ro/multivitamine-suplimente-naturale/tocoferol.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_E

http://ro.wikipedia.org/wiki/Vitamina_E

13

deter min area vitaminei e din fitoextracte (refacut)

Documents