despre factorul ix si calciu

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  • 7/28/2019 Despre Factorul IX Si Calciu

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    P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 2 , p p . 3 8 7 9 - 3 8 8 3 , J u n e 1 9 8 5M e d i c a l S c i e n c e s

    I m m u n o a f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f f a c t o r I X ( C h r i s t m a s f a c t o r ) b y u s i n gc o n f o r m a t i o n - s p e c i f i c a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t t h e f a c t o rI X - m e t a l c o m p l e x *( h e m o p h i l i a / a f n i t y c h r o m a t o g r a p h y )HOWARD A . L I E B M A N , STEVEN A . L I M E N T A N I , BARBARA C . F U R I E , AN D BRUCE F U R I E

    D i v i s i o n o f H e m a t o l o g y- O n c o l o g y , D e p a r t m e n t o f M e d i c i n e , N ew E n g l a n d M e d i c a l C e n t e r a n d T u f t s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c in e , B o s t o n , MA 0 2 1 1 1C o m m u n i c a t e d b y K . M . B r i n k h o u s , F e b r u a r y 1 1 , 1 9 8 5ABSTRACT F a c t o r T X i s a v i t a m i n K - d e p e n d e n t b l o o dd o t t i n g z y m o g e n t h a t i s f u n c t i o n a l l y d e f e c t i v e o r a b s e n t i n p a -t i e n t s w i t h h e m o p h i l i a B . A m e t h o d o f i m n m u n o a f f i n i t y c h r o -m a t o g i a p h y h a s b e e n d e v e l o p e d f o r a o n e - s t e p h i g h y i e l d p u r i -f i c a t i o n o f f a c t o r I X d i r e c t l y f r o n t p l a s m a . T h e t e c h n i q u e u t i -l i z e s c o n f o r m a t i o n - s p e c i f i c a n t i b o d i e s t h a t b i n d s o l e l y t o t h em e t a l - s t a b i l i z e d f a c t o r T X c o n f o r m e r , b u t n o t t o t h e c o n f o r m e ro f f a c t o r I X f o u n d i n t h e a b s e n c e o f m e t a l i o n s . A n t i - f a c t o r I X -C a ( I I ) a n t i b o d i e s w e r e i m m o b i l i z e d o n a n a g a r o s e m a t r i x . H u -man p l a s m a i n t h e p r e s e n c e o f 7 . 5 mM M g C I 2 w a s a p p l i e d t ot h e a n t i b o d y - a g a r o s e c o l u m n . T h e f a c t o r T X t h a t b i n d s t o t h e s ea n t i b o d i e s w a s s p e c i f i c a l l y e l u t e d b y m e t a l c h e l a t i o n w i t hE D T A . T h i s i m m u n o p u r i f i c a t i o n r e s u l t e d i n a 1 0 , 0 0 0 - f o l d o n e -s t e p p u r i f i c a t i o n o f t h e f u l l y f u n c t i o n a l z y m o g e n . P u r i f i e d f a c -t o r T X y i e l d e d a s i n g l e b a n d u p o n g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n N a -D o d S O 4 a n d h a d a s p e c i f i c a c t i v i t y o f 1 2 0 - 1 5 0 u n i t s / m g . T h ep u r i f i e d f a c t o r I X w a s s e p a r a t e d f r o m o t h e r v i t a m i n K - d e p e n -d e n t b l o o d c l o t t i n g p r o t e i n s a n d h e p a t i t i s v i r u s ; no a c t i v a t e df a c t o r T X w a s d e t e c t e d . T h i s m e t h o d h a s a p p l i c a t i o n f o r t h el a r g e s c a l e p u r i f i c a t i o n o f f a c t o r T X f o r t h e t r e a t m e n t o f h e m o -p h i l i a B .F a c t o r I X , a v i t a m i n K - d e p e n d e n t p l a s m a p r o t e i n w i t h a m o -l e c u l a r w e i g h t o f 5 6 , 0 0 0 , p l a y s a c e n t r a l r o l e i n b l o o d c o a g u -l a t i o n ( 1 , 2 ) . T h i s p r o t e i n i s d e f i c i e n t o r f u n c t i o n a l l y d e f e c -t i v e i n p a t i e n t s w i t h h e m o p h i l i a B ( 3 - 5 ) . T h e v i t a m i n K - d e -p e n d e n t b l o o d c o a g u l a t i o n p r o t e i n s , i n c l u d i n g f a c t o r I X ,c o n s t i t u t e a c l a s s o f c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n s t h a t c o n t a i n ' Yc a r b o x y g l u t a m i c a c i d r e s i d u e s , w h i c h c o n f e r t h e i r m e t a l -b i n d i n g p r o p e r t i e s ( 6 , 7 ) . T h e i r i n t e r a c t i o n w i t h m e t a l i o n sr e s u l t s i n a c h a n g e i n t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e o f t h e s e p r o t e i n s ,w h i c h i s e s s e n t i a l f o r t h e i r f u n c t i o n . T h i s c o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o n h a s b e e n d e m o ns t r a t ed f o r p r o t h r o m b i n b y c i r c u -l a r d i c h r o i s m ( 8 ) , f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g ( 9 ) , a nd i m m u n o -c h e m i c a l m e t h o d s u s i n g c o n f o r m a t i o n - s p e c i f i c r a b b i t p o l y -c l o n a l ( 1 0 ) a n d m u r i n e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( 1 1 ) t h a t b i n ds o l e l y t o t h e m e t a l - s t a b i l i z e d c o n f o r m a t i o n .A l t h o u g h we h a v e u s e d t h e s e c o n f o r m a t i o n - s p e c i f i c a n t i -b o d i e s t o d e v e l o p s p e c i f i c i m m u n o a s s a y s f o r p r o t h r o m b i ns p e c i e s w i t h v a r i o u s c o n t e n t s o f y - c a r b o x y g l u t a m i c a c i d ( 1 2 ,1 3 ) , we h a v e r e c e n t l y r e c o g n i z e d t h e a d v a n t a g e s o f c o n f o r -m a t i o n - s p e c i f i c a n t i b o d i e s f o r t h e i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o -g r a p h i c p u r i f i c a t i o n o f p r o t e i n s . U n l i k e s t a n d a r d m e t h o d sf o r i m m u n o p u r i f i c a t i o n , i n w h i c h t h e h a r s h c o n d i t i o n s r e -q u i r e d f o r t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e a n t i b o d y - a n t i g e n c o m p l e xc a n l e a d t o d e n a t u r a t i o n a n d l o s s o f f u n c t i o n o f t h e p r o t e i n( 1 4 ) , t h i s m e t h o d i n v o l v e s m i l d a n d s p e c i f i c e l u t i o n c o n d i -t i o n s . A n t i b o d i e s t h a t o n l y r e c o g n i z e t h e m e t a l - s t a b i l i z e dc o n f o r m e r o f t h e p r o t e i n a r e u s e d t o t r a n s i e n t l y i m m o b i l i z et h e p r o t e i n t o a s o l i d s u p p o r t . T h e a n t i b o d y - p r o t e i n c o m p l e x

    i s d i s r u p t e d b y t h e r e m o v a l o f b o u n d m e t a l i o n s f r o m t h ep r o t e i n w it h a m e t a l c h e l a t o r . T h e g e n e r a l t e c h n i q u e , a p p l i e dt o t h e p u r i f i c a t i o n o f f a c t o r I X ( C h r i s t m a s f a c t o r ) , h a s p o t e n -t i a l a p p l i c a t i o n f o r t h e l a r g e s c a l e p u r i f i c a t i o n o f f a c t o r I Xf o r s p e c i f i c r e p l a c e m e n t t h e r a p y i n h e m o p h i l i a B .EXPERIMENTAL PROCEDURES

    P u r i f i c a t i o n o f Human F a c t o r I X , P r o t h r o m b i n , a n d F a c t o rX . P r o t h r o m b i n , f a c t o r X , a n d f a c t o r I X w e r e i s o l a t e d f r o mf r e s h f r o z e n h u m a n p l a s m a b y s e q u e n t i a l b a r i u m c i t r a t e a d -s o r p t i o n a n d e l u t i o n , D E A E - S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y ,D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y , a n d h e p a r i n - S e p h a r o s ec h r o m a t o g r a p h y ( 1 5 , 1 6 ) . Human f a c t o r X w a s f u r t h e r p u r i -f i e d o n a n a n t i- p r o t h r o m bi n - S ep h a r o s e c o l u m n . T h e p u r i f i e dp r o t e i n s e a c h m i g r a t e d a s a s i n g l e b a n d u p o n e l e c t r o p h o r e s i si n N a D o d S O 4 / p o l y a c r y l a m i d e g e l s ( 1 7 ) . I n t h e p r e s e n c e o f2 - m e r c a p t o e t h a n o l , f a c t o r X w a s c o m p l e t e l y r e d u c e d ; i t sh e a v y a n d l i g h t c h a i n s m i g r a t e d s e p a r a t e l y u p o n N a D o d -S 0 4 / P A G E . P r o t h r o m b i n a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y u s i n g ao n e - s t a g e p r o t h r o m b i n a s s a y ( 1 8 ) . F a c t o r X a c t i v i t y w a s d e -t e r m i n e d b y a m o d i f i e d R u s s e l l ' s v i p e r v e n o m c o a g u l a n t a s -s a y u s i n g f a c t o r X - d e f i c i e n t p l a s m a ( 1 9 ) . F a c t o r I X a c t i v i t yw a s d e t e r m i n e d w i t h a t w o - s t a g e a s s a y u s i n g f a c t o r I X - d e f i -c i e n t p l a s m a ( 2 0 ) .P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s o f c o m p l e x b i o l o g i c a l f l u i d s w e r ee s t i m a t e d b y a C o o m a s s i e p r o t e i n - b i n d i n g a s s a y u s i n g b o -v i n e s e r u m a l b u m i n a s a s t a n d a r d ( 2 1 ) . T h e p r o t e i n c o n c e n -t r a t i o n s o f p u r i f i e d c o a g u l a t i o n p r o t e i n s w e r e e s t i m a t e d b yu s i n g t h e f o l l o w i n g e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s : f a c t o r I X , A l %1 3 . 3 ; f a c t o r X , A 2 j 0 1 1 . 6 ; p r o t h r o m b i n , A 2 8 1 4 . 4 .P u r i f i e d f a c t o r I X w a s c o u p l e d t o c y a n o g e n b r o m i d e - a c t i -v a t e d S e p h a r o s e - 4 B a t a c o n c e n t r a t i o n o f 4 . 3 m g p e r m l o fS e p h a r o s e ( t o t a l v o l , 4 m l o f S e p h a r o s e ) ( 2 2 ) .P r e p a r a t i o n o f A n t i - F a c t o r T X - C a ( T T ) A n t i b o d i e s . N ewZ e a l a n d W h i t e r a b b i t s w e r e i m m u n i z e d w i t h f a c t o r I X . A n t i -b o d i e s s p e c i f i c f o r t h e m e t a l - s t a b i l i z e d c o n f o r m at i o n o f f a c -t o r I X [ a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) ] w e r e p u r i f i e d b y a f f i n i t y c h r o -m a t o g r a p h y o n t h e h u m a n f a c t o r I X - S e p h a r o s e c o l u m n ( 1 . 5x 3 c m ) a s a m o d i f i c a t i o n o f t h e t e c h ni q ue o f T a i e t a l . ( 1 0 ) .

    A n t i s e r u m w a s d i a l y z e d o v e r n i g h t i n 0 . 0 5 M T r i s H C l , pH7 . 4 / 0 . 1 4 M N a C l / 3 mM C a C l 2 / 0 . 0 5 % N a N 3 ( b u f f e rA / C a C l 2 ) . T h e f a c t o r I X - S e p h a r o s e c o l u m n w a s e q u i l i b r a t e dw i t h t h e s a m e b u f f e r a n d t h e a n t i s e r u m w a s a p p l i e d t o t h ec o l u m n . T h e c o l u m n w a s e x h a u s t i v e l y w a s h e d w i t h t h e b u f f -e r A / C a C l 2 t o r e m o v e u n b o u n d p r o t e i n . T h e a n t i - f a c t o r I X -C a ( I I ) a n t i b o d i e s w e r e e l u t e d w i t h b u f f e r A / 5 mM EDTA.T h e b o u n d a n t i - f a c t o r I X a n t i b o d i e s , w h i c h b i n d t o f a c t o r I Xi n t h e a bs e n c e o f m e t a l i o n s , w e r e e l u t e d w i t h 4 M g u a n i -d i n e - H C l . T h e a n t i b o d i e s e l u t e d w i t h E D T A were p o o l e d* T h i s paper was p r e s e n t e d a s a p r e l i m i n a r y c o m m u n i c a t i o n a t t h eA n n u a l M e e t i n g o f t h e A m e r i c a n S o c i e t y o f H e m a t o l o g y , Decem-b e r 1 9 8 3 , S a n F r a n c i s c o ( 3 5 ) .

    3 8 7 9

    T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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    3 8 8 0 M e d i c a l S c i e n c e s : L i e b m a n e t a La n d c o n c e n t r a t e d b y u l t r a f i l t r a t i o n , u s i n g a P M 3 0 mem-b r a n e . R a b b i t a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i b o d y wa s c o u p l e d t ocyanogen b r o m i d e - a c t i v a t e d S e p h a r o s e - 4 B a t a c o n c e n t r a -t i o n o f 3 . 3 mg per m l o f S e p h a r o s e ( t o t a l v o l , 2 m l S e p h a r o s e )( 2 2 ) .S o l i d - P h a s e E L I S A o f A n t i - F a c t o r IX. M i c r o t i t e r p l a t e s (96w e l l s ; I m m u l o n I I , D y n a t e c h , A l e x a n d r i a , VA) were c o a t e dw i t h f a c t o r IX a t 2 0 p z g / m l i n 0 . 0 5 M s o d i u m b o r a t e ( p H 8 . 5 )f o r 1 6 h r a t 4 0 C . T h e p l a t e s were w a s h e d e x h a u s t i v e l y w i t hb u f f e r A a n d 2% b o v i n e s e r u m a l b u m i n i n b u f f e r A wa s a d d -e d t o t h e w e l l s f o r 3 0 m i n a t 2 4 T C . A f t e r w a s h i n g w i t h b u f f e rA , 5 0 t 4 o f d i l u t e d a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) wa s a d d e d t o t h ep l a t e s a n d i n c u b a t e d a t 3 7 T C f o r 1 h r . T h e p l a t e s were t h e nw a s h e d w i t h 0 . 0 5 M T r i s H C l , pH 7 . 2 / 0 . 1 4 M N a C l / 1 . 5 mMM g C l 2 / 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 / 0 . 0 5 % NaN3 ( s o l u t i o n B ) .G o a t a n t i - r a b b i t a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o a l k a l i n e p h o s p h a -t a s e ( 5 0 1 d ) i n s o l u t i o n B wa s a d d e d . A f t e r t h e p l a t e s werei n c u b a t e d a t 2 4 T C f o r 2 h r , t h e y we r e w a s h e d a g a i n w i t h s o l u -t i o n B . p - N i t r o p h e n y l p h o s p h a t e ( 5 0 p1 i n 0 . 1 M g l y c i n e , pH1 0 / 1 . 5 mM M g C l 2 / 1 . 5 mM Z n C l 2 ) wa s a d d e d a n d t h e r e a c -t i o n d e v e l o p e d over 3 0 m i n a t 2 4 C . T h e r e a c t i o n wass t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 5 p1 o f 3 M NaOH. B i n d i n g o fa n t i b o d y wa s a s s e s s e d b y m o n i t o r i n g t h e a b s o r b a n c e a t 4 0 5nm o n a D y n a t e c h MR 5 0 0 M i c r o - E L I S A a u t o r e a d e r . A l l a s -says were p e r f o r m e d i n t r i p l i c a t e .

    I n c e r t a i n e x p e r i m e n t s t h a t e v a l u a t e d t h e r o l e o f m e t a li o n s i n a n t i b o d y - a n t i g e n i n t e r a c t i o n , r e a g e n t s we r e r e n d e r e dm e t a l - f r e e b y e x h a u s t i v e d i a l y s i s a g a i n s t m e t a l - f r e e w a t e r o rpassage over a C h e l e x 1 0 0 c o l u m n . M e t a l - f r e e w a t e r , p r e -p a r e d u s i n g C h e l e x 1 0 0 , was u s e d t o w a s h g l a s s w a r e a n d t oprepare a l l b u f f e r s .C o m p e t i t i o n E L I S A f o r F a c t o r I X - A n t i - F a c t o r I X B i n d i n g .T h e a n t i g e n i c s p e c i f i c i t y o f r a b b i t a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i -b o d y wa s s t u d i e d b y u s i n g a c o m p e t i t i o n ELISA s y s t e m .A n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i b o d y ( 5 x 1 0 - 8 M) was a d d e d t ov a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f c o m p e t i t o r ( p r o t h r o m b i n , f a c t o rI X , o r f a c t o r X ) , i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t 3 7 C , a n d t h e n 5 0 Awa s a d d e d t o t h e m i c r o t i t e r w e l l s . T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e nc o m p e t i t o r a n d a n t i b o d y was a s s e s s e d b y t h e i n h i b i t i o n o fa n t i b o d y b i n d i n g t o t h e f a c t o r I X b o u n d t o t h e s o l i d p h a s e .R a d i o i m m u n o a s s a y o f N a t i v e F a c t o r I X . F u l l y c a r b o x y l a t -e d ( n a t i v e ) f a c t o r I X was m e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a yu s i n g a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i b o d y a n d 1 2 5 I - l a b e l e d f a c t o rI X . F a c t o r I X was i o d i n a t e d u s i n g N a 1 2 5 I (New E n g l a n d N u -c l e a r ) w i t h t h e c h l o r a m i n e - T m e t h o d ( 2 3 ) . T h e a s s a y i s a n a l -ogous t o t h a t p r e v i o u s l y r e p o r t e d f o r n a t i v e p r o t h r o m b i n ( 1 2 ,1 3 ) . N o r m a l h u m a n p l a s m a was d e r i v e d f r o m a p o o l o f p l a s -ma d o n a t i o n s . P l a s m a f r o m a p a t i e n t w i t h h e m o p h i l i a B h a d

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    3/5

    P r o c . N a t l . Acad S c i USA 8 2 ( 1 9 8 5 )1-

    C )

    C d. 00

    . 0

    EE

    1 0 - 6 C o m p e t i t o r , MA n t i b o d y , M

    F I G . 2 . E f f e c t o f C a C 1 2 o n t h e a n t i - f a c t o r I X - C a ( I T ) a n t i b o d y -f a c t o r I X i n t e r a c t i o n . T h e b i n d i n g o f a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i b o d yt o f a c t o r I X was s t u d i e d i n t h e presence o f 3 mM C a C l 2 ( o ) o r 5 mMEDTA ( o ) b y a d i r e c t b i n d i n g ELISA s y s t e m .a n t i b o d y a n d 1 2 5 1 - l a b e l e d f a c t o r I X i s i n h i b i t e d b y n o r m a lp l a s m a . H o w e v e r , p l a s m a f r o m a p a t i e n t w i t h h e m o p h i l i a B ,l a c k i n g f a c t o r I X a n t i g e n , d i d n o t s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t a n t i -b o d y - ' 2 5 1 - l a b e l e d f a c t o r I X b i n d i n g . S i n c e t h e l e v e l s o f f a c -t o r V I I , p r o t e i n C , p r o t e i n S , f a c t o r X , a n d p r o t h r o m b i n a r en o r m a l i n h e m o p h i l i a B , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h i s a n t i -b o d y p o p u l a t i o n i s s p e c i f i c f o r f a c t o r I X .I m m u n o a f f i n i t y P u r i f i c a t i o n o f F a c t o r IX.A b a r i u m c i t r a t ee l u a t e d e r i v e d f r o m p l a s m a , e n r i c h e d i n t h e v i t a m i n K - d e -p e n d e n t b l o o d c o a g u l a t i o n p r o t e i n s , wa s a p p l i e d t o t h e a n t i -f a c t o r I X - C a ( I I ) - S e p h a r o s e c o l u m n . T h e f a c t o r I X b o u n d t ot h e c o l u m n i n t h e presence o f 7 . 5 mM M g C l 2 a n d wa s e l u t e dw i t h 1 0 mM EDTA. T h e e l u t e d f a c t o r I X h a d a s p e c i f i c a c -t i v i t y o f 1 5 1 u n i t s pe r mg o f p r o t e i n a n d c o n t a i n e d n o d e t e c t -a b l e p r o t h r o m b i n o r f a c t o r X a c t i v i t y ( T a b l e 1 ) . A 2 5 0 - f o l dp u r i f i c a t i o n over t h e b a r i u m c i t r a t e e l u a t e was r e a l i z e d , w i t ha recovery o f 77% o f t h e f a c t o r I X a c t i v i t y a p p l i e d t o t h ec o l u m n . T h e e l u t e d f a c t o r IX m i g r a t e d a s a s i n g l e b a n d u p o ne l e c t r o p h o r e s i s i n t h e presence o f NaDodSO4 ( F i g . 5 ) . How-e v e r , s e v e r a l o t h e r very f a i n t b a n d s m i g h t r e p r e s e n t a s muchas a 1% c o n t a m i n a n t o f t h e f a c t o r I X . T h e a n t i - f a c t o r I X -C a ( I I ) - S e p h a r o s e c o l u m n was t r e a t e d w i t h 4 M g u a n i d i n e -H C l , b u t n o a d d i t i o n a l p r o t e i n wa s e l u t e d .F a c t o r I X was p u r i f i e d d i r e c t l y f r o m f r e s h f r o z e n p l a s m a

    0 . 4

    0 . 3

    0 . 2

    0 . 1 F

    0 . 0 1

    ///

    0o '

    i_ _ I___I0 . 0 5 0 . 1 0 . 5 1M e t a l , mM

    F I G . 3 . M e t a l r e q u i r e m e n t s f o r t h e i n t e r a c t i o n o f f a c t o r I X w i t ha n t i - f a c t o r I X - C a ( T T ) a n t i b o d y . By u s i n g t h e ELISA s y s t e m , f a c t o rI X wa s b o u n d t o t h e m i c r o t i t e r w e l l s a n d t h e amo u nt o f a n t i b o d yt h a t b o u n d t o f a c t o r I X ( p r o p o r t i o n a l t o t h e a b s o r b a n c e a t 4 0 5 n m )wa s s t u d i e d a s a f u n c t i o n o f C a C 1 2 ( e ) , M n C l 2 ( v ) , a n d M g C l 2 ( o )c o n c e n t r a t i o n .

    c Q 8 0 - \'D 6 0 r

    c i 4 0E2 0 -

    1 0 2 4 512256 1 2 8 64 3 2 1 6 8 4 2P l a s m a d i l u t i o n - '

    F I G . 4 . A n t i g e n i c s p e c i f i c i t y o f a n t i - f a c t o r I X - C a ( I T ) a n t i b o d i e s .( A ) B in di ng o f h u m a n f a c t o r I X ( e ) , human f a c t o r X ( o ) , a n d p r o -t h r o m b i n ( A ) was e v a l u a t e d b y u s i n g a c o m p e t i t i v e ELISA system.F r o m a n i n c u b a t i o n m i x t u r e ( 2 0 0 i d ) i n c l u d i n g a n t i b o d y ( 5 x 1 0 - 8M ) a n d f a c t o r I X ( 8 x 1 0 1 0 M t o 5 x 1 0 6 M ) , f a c t o r X ( 6 x 1 0 1 0M t o 1 . 4 x 1 0 - 6 M ) , or p r o t h r o m b i n ( 4 x 1 0 - 1 0 t o 5 x 1 0 - 6 M ) , 5 0 -s a m p l e s we re p l a c e d i n m i c r o t i t e r w e l l s c o a t e d w i t h f a c t o r I X .T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c o m p e t i t o r s a n d a n t i - f a c t o r I X - C a ( H ) a n t i -b o d y wa s a s s e s s e d b y t h e c o m p e t i t o r s ' a b i l i t y t o i n h i b i t t h e b i n d i n go f t h e a n t i b o d y t o f a c t o r I X . ( B ) I n h i b i t i o n o f f a c t o r I X - a n t i - f a c t o rI X - C a ( I I ) a n t i b o d y i n t e r a c t i o n b y n o r m a l ( 0 ) a n d f a c t o r I X a n t i g e n -d e f i c i e n t h e m o p h i l i a B p l a s m a ( o ) . T h e r a d i o i m m u n o a s s a y i n c l u d e d1 2 5 I - l a b e l e d f a c t o r I X ( 1 x 1 0 - 1 0 M ) , a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i b o d y( 8 . 5 x1 0 - 1 0 M ) , a n d d i l u t i o n s o f p l a s m a , a s i n d i c a t e d . T h e a b s e n c eo f i n h i b i t i o n o f a n t i b o d y - f a c t o r I X b i n d i n g b y h e m o p h i l i a B p l a s m ai n d i c a t e s t h a t t h i s a n t i b o d y d o e s n o t b i n d t o t he v i t a m in K - d e p e n -d e n t p r o t e i n s i n b l o o d , w i t h t h e e xc e p ti o n o f f a c t o r I X .i n a s i n g l e s t e p b y t h e i m m u n o a f f i n i t y p r o c e d u r e . Humanp l a s m a , a f t e r d i a l y s i s , was a p p l i e d t o t h e a f f i n i t y c o l u m n i nt h e presence o f 7 . 5 mM M g C l 2 . A l l d e t e c t a b l e f a c t o r I X ac-t i v i t y wa s r e m o v e d f r o m t h e p l a s m a b y t h e i m m u n o a b s o r b -e n t . F a c t o r I X , e l u t e d w i t h 1 0 mM EDTA, h a d a s p e c i f i ca c t i v i t y o f 1 24 u n i t s per mg o f p r o t e i n ( T a b l e 1 ) . T h i s r e p r e -s e n t s a 1 0 , 0 0 0 - f o l d p u r i f i c a t i o n w i t h a n 81% recovery o f t h ep l a s m a f a c t o r I X a c t i v i t y . T h e e l u t e d f a c t o r I X m i g r a t e d o nNaDodSO4/PAGE as a s i n g l e b a n d ( F i g . 6 ) .T h e a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) - S e p h a r o s e c o l u m n wa s r e p e a t -e d l y u s e d f o r t h e i s o l a t i o n o f f a c t o r I X f r o m p l a s m a . T h es p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e p u r i f i e d f a c t o r I X f r o m t h e s e prepara-t i o n s r a n g e d b e t w e e n 1 1 8 a n d 1 3 8 u n i t s per m g. T h e f i n a lrecovery o f f a c t o r I X f o r t h e s e p r e p a r a t i o n s v a r i e d b e t w e e n68 % a n d 84% o f t h e f a c t o r IX a c t i v i t y i n t h e s t a r t i n g p l a s m a .S e p a r a t i o n o f F a c t o r T X f r o m H e p a t i t i s B V i r u s . P a r t i a l l yp u r i f i e d f a c t o r I X c o n c e n t r a t e s u s e d i n t h e t r e a t m e n t o f h e -m o p h i l i a B ar e a s s o c i a t e d w i t h a h i g h r i s k o f h e p a t i t i s v i r u sc o n t a m i n a t i o n . We q u e s t i o n e d w h e t h e r t h e p u r i f i e d f a c t o rI X p r e p a r e d b y i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w o u l d b ef r e e o f v i r a l c o n t a m i na n t s . A s c i te s ( 1 m l ) f r o m a p a t i e n t w i t hp r i m a r y h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a , r i c h i n h e p a t i t i s B v i r u s

    1 0 0= 8 0.0 u 6 0 -CZ0

    ._ 4 02 0

    M e d i c a l S c i e n c e s : L i e b m a n e t a L 3 8 8 1

    l o - ,

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    3 8 8 2 M e d i c a l S c i e n c e s : L i e b m a n e t a LT a b l e 1 . P u r i f i c a t i o n o f h u m a n f a c t o r I X

    V o l , T o t a l p r o t e i n , A c t i v i t y , u n i t s / m l S p e c i f i c a c t i v i t y , u n i t s / m g % y i e l dm l mg P r o t h r o m b i n F a c t o r X F a c t o r I X P r o t h r o m b i n F a c t o r X F a c t o r I X ( t o t a l f a c t o r I X )E x p e r i m e n t 1B a r i u m c i t r a t e e l u a t e 2 8 1 4 2 2 . 3 3 . 0 2 . 9 0 . 5 0 . 6 0 . 6 1 0 0E D T A e l u a t e 3 . 9 0 . 4 0 0 1 5 . 9 0 0 1 5 1 7 7E x p e r i m e n t 2

    P l a s m a 1 9 0 1 0 , 3 8 0 0 . 8 0 . 7 0 . 7 0 . 0 1 5 0 . 0 1 3 0 . 0 1 3 1 0 0E D T A e l u a t e 3 . 1 0 . 9 0 0 3 4 . 8 0 0 1 2 4 8 1a s m e a s u r e d b y t h e a s s a y o f h e p a t i t i s B s u r f a c e a n t i g e n , wa sa d d e d t o f r e s h f r o z e n p l a s m a ( 2 0 0 m l ) . T h e f a c t o r I X w a sp u r i f i e d b y i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , a s d e s c r i b e da b o v e , u s i n g a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) - S e p h a r o s e . V i r a l s u r f a c ea n t i g e n w a s m e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y i n c o l u m n f r a c -t i o n s . W i t h i n t h e l i m i t s o f d e t e c t i o n , a l l o f t h e h e p a t i t i s Bs u r f a c e a n t i g e n f a i l e d t o b i n d t o t h e a f f i n i t y m a t r i x . T h e r ew a s n o d e t e c t a b l e h e p a t i t i s v i r u s i n t h e E D T A e l u a t e c o n -t a i n i n g f a c t o r I X ( F i g . 7 ) . A f t er a 5 0 - f o l d c o n c e n t r a t i o n o f t h ef a c t o r I X f r a c t i o n s , n o h e p a t i t i s v i r u s wa s d e t e c t a b l e . W i t h i nt h e l i m i t s o f d e t e c t i o n t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t f a c t o r I X i ss e p a r a t e d f r o m h e p a t i t i s v i r u s d u r i n g i t s p u r i f i c a t i o n .

    DISCUSSIONF a c t o r I X i s a t r a c e p r o t e i n i n b l o o d t h a t h a s a c e n t r a l r o l e i nb l o o d c o a g u l a t i o n ( 1 , 2 ) . P a t i e n t s w i t h h e m o p h i l i a B , i nwhom t h i s p r o t e i n i s d e f i c i e n t o r f u n c t i o n a l l y d e f e c t i v e , h a v ea s i g n i f i c a n t b l e e d i n g t e n d e n c y . T h e s e v e r e b l e e d i n g d i s o r -d e r i n t h e s e p a t i e n t s e m p h a s i z e s t h e i m p o r t a n c e o f t h i s p r o -t e i n i n n o r m a l h e m o s t a s i s . T h e b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o ff a c t o r I X h a v e b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d . F a c t o r I X i s a c t i -v a t e d f r o m i t s z y m o g e n t o e n z y m e f o r m b y a c t i v a t e d f a c t o rX I ( 2 6 ) o r a c t i v a t e d f a c t o r V I I ( 2 7 ) i n a m e c h a n i s m t h a t i n -v o l v e s l i m i t e d p r o t e o l y s i s . S u b s e q u e n t l y a c t i v a t e d f a c t o r I X,i n c o n c e r t w i t h a c t i v a t e d f a c t o r V I I I , c a n a c t i v a t e f a c t o r X( 1 , 2 , 2 8 ) . Human f a c t o r I X h a s a l s o b e e n p u r i f i e d t o h o m o -g e n e i t y ( 2 9 ) a n d i t s a m i n o a c i d s e q u e n c e d e t e r m i n e d b y a n a l -y s i s o f t h e f a c t o r I X g e n e ( 3 0 , 3 1 ) .F o r l a b o r a t o r y u s e , f a c t o r I X h a s b e e n p u r i f i e d b y c o n v e n -t i o n a l m u l t i s t e p m e t h o d s , w h i c h i n c l u d e b a r i u m s a l t a d s o r p -t i o n , i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , g e l f i l t r a t i o n , a n d a f f i n i -A " p o

    a , .i M . ,

    i ' w

    1 2 3

    t y c h r o m a t o g r a p h y ( 1 5 , 1 6 ) . A l t h o u g h t h e s e m e t h o d s a l l o wr e c o v e r y o f h i g h q u a l i t y f a c t o r I X , t h e i r l o w o v e r a l l y i e l d ,t h e e x t e n d e d t i m e r e q u i r e d f o r p u r i f i c a t i o n , a n d p o t e n t i a lp r o b l e m s o f p y r o g e n c o n t a m i n at i o n p r e c l u d e t h e s e m e t h o d sf o r p r e p a r a t i o n o f f a c t o r I X f o r i n v i v o r e p l a c e m e n t t h e r a p y .I n p l a s m a f r a c t i o n s a v a i l a b l e f o r c l i n i c a l t r e a t m e n t o f h e m o -p h i l i a B , f a c t o r I X i s a m i n o r c o m p o n e n t . C o n t a m i n a t i o nw i t h a c t i v a t e d f a c t o r I X a n d v i r u s p a r t i c l e s c o m p l i c a t e s t h e r -a p y w i t h t h r o m b o e m b o l i c d i s o r d e r s a n d h e p a t i t i s ( 3 2 , 3 3 ) .A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n w i d e l y u s e d f o r t h eh i g h y i e l d p r e p a r a t i o n o f p l a s m a p r o t e i n s ( 1 4 ) . H o w e v e r , i m -m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , i n w h i c h a n t i b o d i e s a r e c o v a -l e n t l y l i n k e d t o s o l i d s u p p o r t , i s o f t e n c o m p l i c a t e d b y t h eh a r s h c o n d i t i o n s n e c e s s a r y t o d i s r u p t t h e a n t i b o d y - a n t i g e nc o m p l e x a n d t h e l a c k o f s p e c i f i c e l u t i o n s y s t e m s t h a t a r e o p -t i m a l f o r c o m p l e t e p u r i f i c a t i o n f r o m c r u d e p r o t e i n m i x t u r e s .T h e f o r m e r may b e a s s o c i a t e d w i t h t h e l o s s o f b i o l o g i c a l a c -t i v i t y , a n d t h e l a t t e r i n t e r f e r e s w i t h t h e r e c o v e r y o f h o m o g e -n e o u s m a t e r i a l . T h e s e p r o b l e m s a r e i l l u s t r a t e d b y G o o d a l l e ta l . ( 3 4 ) , wh o o b s e r v e d t h a t a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e da g a i n s t f a c t o r I X c o u l d r e m o v e f a c t o r I X f r o m p l a s m a ; h o w -e v e r , t h e f a c t o r I X a c t i v i t y d i d n o t s u r v i v e t h e c o n d i t i o n sn e c e s s a r y f o r t h e r e m o v a l o f f a c t o r I X f r o m t h e a n t i b o d y -a g a r o s e m a t r i x . I n t h e c u r r e n t c o m m u n i c a t i o n , we d e s c r i b e am e t h o d o f i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g c o n f o r m a -t i o n - s p e c i f i c a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t h e m e t a l - s t a b i l i z e d f o r mo f f a c t o r I X . T h i s m e t h o d , u s i n g a s p e c i f i c b i n d i n g s y s t e m o fa n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) a n t i b o d i e s a n d a s p e c i f i c e l u t i o n s y s -t e m w i t h EDTA, a l l o w s a r a p i d s i n g l e s t e p 1 0 , 0 0 0 - f o l d p u r i f i -A B' q . -gi.

    am -205_ m - 1 1 6_ m - 97

    A - 66

    _ - 45

    _ - 2 9

    2 3 4F I G . 5 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s o ft h e i m m u n o a f f i n i t y - p u r i f i e d f a c t o r I X f r o m t h e b a r i u m c i t r a t e e l u -a t e . T h e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d w i t h o u t ( A ) a n d w i t h ( B ) p r i o r r e -d u c t i o n b y 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . L a n e s : 1 , 2 0 0 g g o f b a r i u m c i t r a t ee l u a t e ; 2 , 2 0 0 M g o f b a r i um c i t r a t e e l u a t e a f t e r r e m o v a l o f f a c t o r I X ;3 , 5 0 M g o f p u r i f i e d f a c t o r I X ; 4 , p r o t e i n s t a n d a r d s ( m y o s i n , P - g a l a c -t o s i d a s e , p h o s p h o r y l a s e B , b o v i n e a l b u m i n , e g g a l b u m i n , c a r b o n i ca n h y d r a s e ) .

    F I G . 6 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o n 1 0 % o p o l y a c r y l a m i d e g e l s o fi m m u n o a f f i n i t y - p u r i f i e d f a c t o r I X f r o m p l a s m a . T h e s a m p l e s ( 5 0 P go f f a c t o r I X ) w e r e a n a l y z e d w i t h o u t ( l a n e A ) a n d w i t h ( l a n e B ) p r i o rr e d u c t i o n b y 2 - m e r c a p t o e t h a n o l .

    P r o c . N a t L Acad S c L USA 8 2 ( 1 9 8 5 )

  • 7/28/2019 Despre Factorul IX Si Calciu

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    P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 2 ( 1 9 8 5 ) 3 8 8 3

    0 . G...d n . H C I l D 'U10 50 1 0 0 1 3 0

    F r a c t i o nF I G . 7 . P u r i f i c a t i o n o f f a c t o r I X f r o m h e p a t i t i s B - c o n t a m i n a t e dp l a s m a . T h e h e p a t i t i s B - c o n t a m i n a t e d p l a s m a [ y i e l d i n g 4 3 8 0 cpm i nt h e h e p a t i t i s B s u r f a c e a n t i g e n ( H B s A g ) R I A ] was d i a l y z e d over-n i g h t i n t o 0 . 0 5 M T r i s H C I , pH 7 . 4 / 0 . 5 M N a C l / 0 . 0 2 % T w e e n2 0 / 0 . 0 5 % N a N 3 , a n d t h e n b r o u g h t t o 7 . 5 mM M g C l 2 p r i o r t o a p p l i c a -t i o n t o t h e a n t i - f a c t o r I X - C a ( T T ) c o l u m n . A f t e r t h e c o l u m n wasw a s h e d w i t h e q u i l i b r a t i o n b u f f e r , t h e b o u n d f a c t o r I X was e l u t e dw i t h e q u i l i b r a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g 1 0mM ED TA. T he column f r a c -t i o n s were a s s a y e d f o r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ( A 2 8 0 ; 0 ) a n d h e p a t i t i s

    B s u r f a c e a n t i g e n ( o ) b y c o m p e t i t i o n r a d i o i m m u n o a s s a y . T h e qu an-t i t a t i v e p r e s e n c e o f h e p a t i t i s v i r u s i s e x p r e s s e d as a n i n c r e a s e i n cpmi n t h e RIA ( n o n s p e c i f i c b i n d i n g i s 1 2 4 c p m , p o s i t i v e s a m p l e s > 2 5 0c p m ) .c a t i o n o f f a c t o r I X f r o m p l a s m a . F a c t o r I X u n d e r g o e s a m e t -a l - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l t r a n s i t i o n , a p r o p e r t y s h a r e d w i t ho t h e r v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n s t h a t c o n t a i n - c a r b o x -y g l u t a m i c a c i d . M e t a l i o n s , i n c l u d i n g C a ( I T ) a n d M g ( I T ) , s t a -b i l i z e a c o n f o r m e r o f f a c t o r I X t h a t c o n t a i n s a n a n t i g e n i cs u r f ac e l a c ki ng i n t h e m e t a l - f r e e c o n f o r m e r o f f a c t o r I X . B yt h e u s e o f a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t h e m e t a l - f a c t o r T X b i n a r yc o m p l e x , t h e f a c t o r I X - a n t i b o d y c o m p l e x may b e e a s i l y d i s -s o c i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f a c h e l a t i n g a g e n t , s u c h as EDTA,w h i c h removes bound m e t a l i o n s f r o m f a c t o r I X . T h e f a c t o rI X s t r u c t u r e r e v e r t s t o i t s m e t a l - f r e e f o r m , w i t h c o n c o m i t a n tl o s s o f t h e m e t a l - s t a b i l i z e d a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t a n d d i s s o -c i a t i o n o f t h e a n t i b o d y - f a c t o r I X c o m p l e x . T h e f a c t o r I X ,p u r i f i e d f r o m e i t h e r a b a r i u m c i t r a t e - a d s o r b e d p l a s m a f r a c -t i o n o r d i r e c t l y f r o m f r e s h f r o z e n p l a s m a , was h o m o g e n e o u sa n d h a d a h i g h s p e c i f i c c o a g u l a n t a c t i v i t y . P r o t e o l y t i c f r a g -me n t s o f f a c t o r I X were o b s e r v e d when c o m m e r c i a l f a c t o rI X concentrates were s u b j e c t e d t o i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a -t o g r a p h y , b u t t h ey were n o t o b s e r v e d w i t h t h i s o n e s t e p pro-c e d u r e ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t f a c t o r I Xp r o t e o l y s i s o c c u r s d u r i n g t h e c o m m e r c i a l f r a c t i o n a t i o n pro-c e d ur e , b ut i t can b e a v o i d ed b y t h e c u r r e n t m e t h o d . T h ed e m o n s t r a t i o n t h a t h e p a t i t i s v i r u s d o e s n o t c o p u r i f y w i t hf a c t o r I X d u r i n g i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e st h a t t h i s m a t e r i a l h a s c o n s i de r a bl e p o t e n t i a l a s a t h e r a p e u t i cr e a g e n t . A l t h o u g h n o t d i r e c t l y e v a l u a t e d , o t h e r v i r u s e s , i n -c l u d i n g t h o s e r e s p o n s i b l e f o r a c q u i r e d i m m u n e d e f i c i e n c ys y n d r o m e ( A I D S ) a n d o t h e r f o r m s o f h e p a t i t i s , a r e l i k e l y n o tt o c o p u r i f y w i t h t h i s h i g h l y p u r i f i e d f o r m o f f a c t o r I X .A l t h o u g h p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i - f a c t o r IX a n t i b o d i e s h a v eb e e n u s e d as a source o f a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I ) i n t h e s e ex-p e r i m e n t s , t h e use o f m o n o c l o n a l a n t i - f a c t o r I X - C a ( I I )would prove u s ef u l f o r l a r g e s c a l e p u r i f i c a t i o n b y t h i s proce-d u r e . We h a v e p r o d u c e d a m u r i n e m o n o c l o n a l c o n f o r m a -t i o n - s p e c i f i c a n t i b o d y t h a t b i n d s t o f a c t o r IX i n t h e pres enceb u t no t i n t h e a b s e n c e o f m e t a l i o n s ( 3 5 ) . A l t h o u g h t h i s p a r -t i c u l a r a n t i b o d y d o e s no t h a v e p r o p e r t i e s d e s i r a b l e f o r a f f i n i -t y c h r o m a t o g r a p h y , i t i s l i k e l y t h a t s u c h a r e a g e n t c o u l d b ep r e p a r e d .At present, f r e s h f r o z e n h u m a n p l a s m a r e m a i n s t h e s o u r ce

    o f f a c t o r I X f o r l a b o r a t o r y o r t h e r a p e u t i c u s e . W i t h t h e c l o n -i n g o f t h e f a c t o r I X g e n e , f a c t o r I X p r e p a r e d b y r e c o m b i n a n tg e n e t i c t e c h n i q u e s may b e a v a i l a b l e i n t h e f u t u r e . H o w e v e r ,o b s t a c l e s o f p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s , s p e c i f i c a l l yc a r b o x y l a t i o n o f c e r t a i n g l u t a m i c a c i d r e s i d u e s t o y i e l d y -c a r b o x y g l u t a m i c a c i d , n e e d t o b e o v e r c o m e . I f s o u r c e s o ff a c t o r I X o t h e r t h a n p l a s m a d o e v o l v e , t h e n t h e i m m u n o a f -f i n i t y p u r i f i c a t i o n d e s c r i b e d s h o u l d a l s o p r o v e u s e f u l i n t h ep u r i f i c a t i o n o f f a c t o r I X f r o m t h e c r u d e p r o t e i n s o l u t i o n . I m -m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g a n t i b o d i e s d i r e c t e da g a i n s t t h e m e t a l - s t a b i l i z e d c o n f o r m a t i o n o f o t h e r m e t a l -b i n d i n g p r o t e i n s may a l s o h a v e u t i l i t y i n t h e p u r i f i c a t i o n o fs u c h p r o t e i n s . T h e m e t h o d o f i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o -g r a p h i c p u r i f i c a t i o n f o r h u m a n f a c t o r I X t h a t we h a v e d e -s c r i b e d may h a v e p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n i n t h e p r e p a r a t i o n o ff a c t o r I X f o r t h e t r e a t m e n t o f h e m o p h i l i a B .We t h a n k D r . R i c h a r d L e w i s f o r m a n y h e l p f u l i d e a s a n d d i s c u s -s i o n s . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y G r a n t H L - 2 1 5 4 3 a n d H L - 1 8 8 3 4f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d b y a g r a n t f r o m S e r a g e n ,I n c . H . A . L . i s t h e r e c i p i e n t o f a n I n d i v i d u a l N a t i o n a l R e s e a r c h S e r -v i c e A w a r d f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ( F 3 2 H L 0 6 5 5 1 ) .

    1 . M a c f a r l a n e , R . G . ( 1 9 6 4 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 0 2 , 4 9 8 - 4 9 9 .2 . D a v i e , E . W . & R a t n o f f , 0 . D . ( 1 9 6 4 ) S c i e n c e 1 4 5 , 1 3 1 0 - 1 3 1 2 .3 . K a s p e r , C . K . , O s t e r u d , B . , M i n a m i , J . Y . , S h o n i c h , W . & R a p a p o r t ,S . I . ( 1 9 7 7 ) B l o o d 5 0 , 3 5 1 - 3 6 6 .4 . T h o m p s o n , A . R . ( 1 9 8 3 ) B l o o d 6 2 , 1 0 2 7 - 1 0 3 4 .5 . C h u n g , K . - S . , M a d a r , D . A . , G o l d s m i t h , J . C . , K i n g d o n , H . S . & R o b -e r t s , H . R . ( 1 9 7 8 ) J . C l i n . I n v e s t . 6 2 , 1 0 7 8 - 1 0 8 5 .6 . N e l s e s t u e n , G . L . & S u t t i e , J . W . ( 1 9 7 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 7 , 8 1 7 6 - 8 1 8 2 .7 . S p e r l i n g , R . , F u r i e , B . C . , B l u m e n s t e i n , M . , K e y t , B . & F u r i e , B . ( 1 9 7 8 )J . B i o l . C h e m . 2 5 3 , 3 8 9 8 - 3 9 0 6 .8 . B l o o m , J . W . & M a n n , K . G . ( 1 9 7 8 ) B i o c h e m i s t r y 1 7 , 4 4 3 0 - 4 4 3 8 .9 . N e l s e s t u e n , G . L . ( 1 9 7 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 5 6 4 8 - 5 6 5 6 .1 0 . T a i , M . M . , F u r i e , B . C . & F u r i e , B . ( 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 2 7 9 0 -2 7 9 5 .1 1 . L e w i s , R . M . , F u r i e , B . C . & F u r i e , B . ( 1 9 8 3 ) B i o c h e m i s t r y 2 2 , 9 4 8 - 9 5 4 .1 2 . B l a n c h a r d , R . A . , F u r i e , B . C . , J o r g e n s e n , M . , K r u g e r , S . F . & F u r i e ,B . ( 1 9 8 1 ) N . E n g l . J . M e d . 3 0 5 , 2 4 2 - 2 4 8 .1 3 . B l a n c h a r d , R . A . , F u r i e , B . C . , K r u g e r , S . F . , W a n e c k , G . , J o r g e n s e n ,M . J . & F u r i e , B . ( 1 9 8 3 ) J . L a b . C l i n . M e d . 1 0 1 , 2 4 2 - 2 5 5 .1 4 . W i l c h e k , M . , M i r o n , T . & K o h n , J . ( 1 9 8 4 ) M e t h o d s E n z y m o l . 1 0 4 , 3 - 5 5 .1 5 . R o s e n b e r g , J . S . , B e e l e r , D . L . & R o s e n b e r g , R . D . ( 1 9 7 4 ) J . B i o l .C h e m . 2 5 0 , 1 6 0 7 - 1 6 1 7 .1 6 . M i l e t i c h , J . P . , J a c k s o n , C . M . & M a j e r u s , P . W . ( 1 9 7 8 ) J . B i o l . C h e m .2 5 3 , 6 9 0 8 - 6 9 1 6 .1 7 . L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 - 6 8 5 .1 8 . D e n s o n , K . W. E . ( 1 9 6 1 ) A c t a H a e m a t o l . 3 4 , 7 2 3 - 7 3 1 .1 9 . B a c h m a n n , F . , D u c k e r t , F . & K o l i e r , F . ( 1 9 5 8 ) T h r o m b . D i a t h . H a e -m o r r h . 2 , 2 4 - 3 8 .2 0 . P r o c t o r , R . R . & R a p a p o r t , S . I . ( 1 % 1 ) Am . J . C l i n . P a t h o l . 3 6 , 2 1 2 - 2 1 9 .2 1 . B r a d f o r d , M . M . ( 1 9 7 6 ) A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4 .2 2 . C u a t r e c a s a s , P . , W i l c h e k , M . & A n f i n s e n , C . B . ( 1 9 6 9 ) P r o c . N a t ! .A c a d . S c i . US A 6 1 , 6 3 6 - 6 4 3 .2 3 . H u n t e r , W. M . & G r e e n w o o d , F . C . ( 1 9 6 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 1 9 4 , 4 9 5 -4 9 6 .2 4 . A m p h l e t t , G . W . , K i s i e l , W . & C a s t e l l i n o , F . J . ( 1 9 8 1 ) A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s . 2 0 8 , 5 7 6 - 5 8 5 .2 5 . B a j a j , S . P . ( 1 9 8 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 4 1 2 7 - 4 1 3 2 .2 6 . D i S c i p i o , R . G . , K u r a c h i , K . & D a v i e , E . W. ( 1 9 7 8 ) J . C l i n . I n v e s t . 6 1 ,1 5 2 8 - 1 5 3 4 .2 7 . O s t e r u d , B . & R a p a p o r t , S . I . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 4 ,5 2 6 0 - 5 2 6 4 .2 8 . B i g g s , R . , M a c f a r l a n e , R . G . , D e n s o n , K . W. E . & A s h , B . J . ( 1 9 6 5 ) B r .J . H a e m a t o l . 1 1 , 2 7 6 - 2 9 5 .2 9 . D i S c i p i o , R . G . , H e r m o d s o n , M . A . , Y a t e s , S . G . & D a v i e , E . W.( 1 9 7 7 ) B i o c h e m i s t r y 1 6 , 6 9 8 - 7 0 6 .3 0 . K u r a c h i , K . & D a v i e , E . W. ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t ! . A c a d . S c i . US A 7 9 ,6 4 6 1 - 6 4 6 4 .3 1 . C ho o , K . H . , G o u l d , K . G . , R e e s , D . J . G . & B r o w n l e e , G . G . ( 1 9 8 2 )N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 9 , 1 7 8 - 1 8 0 .3 2 . K a s p e r , C . K . ( 1 9 7 5 ) T h r o m b . D i a t h . H a e m o r r h . 3 3 , 6 4 0 - 6 4 4 .3 3 . S a n d l e r , S . G . , R o t h , C . E . , W i c k e r h a u s e r , M . , D o d d , R . Y . & G r e e n -w a l t , T . J . ( 1 9 7 3 ) T r a n s f u s i o n 1 3 , 2 2 1 - 2 2 4 .3 4 . G o o d a l l , A . H . , K i m b l e , G . , O ' B r i e n , D . P . , R a w l i n g s , E . , R o b t l a t , F . ,R u s s e l l , G . C . , J a n o s s y , G . & T u d d e n h a m , E . G . D . ( 1 9 8 2 ) B l o o d 5 9 ,6 6 6 7 0 .3 5 . L ie bm a n , H . A . , L i m e n t a n i , S . A . , F u r i e , B . C . & F u r i e , B . ( 1 9 8 3 )B l o o d 6 2 , 1 0 2 8 .

    M e d i c a l S c i e n c e s : L i e b m a n e t a L