Metode biologice de analiza a substantei Metode biologice de analiza a substantei medicamentoasemedicamentoase

Ministerul Sanatatii al Republicii MoldovaU.S.M.F. ,,N.Testemitanu”

Facultatea Farmacie

Catedra chimie farmaceutica si toxicologica

Au pregatit : studentele an 5

Fac.Farmacie Daranuta Nina

Spac Olga

Chisinau 2009

SterilizareSterilizare-distrugerea sau indepertarea microorganismelor vii in -distrugerea sau indepertarea microorganismelor vii in forma vegetativa sau sporulata.forma vegetativa sau sporulata.

Metoda de sterilizare se alege in functie de proprietatile fizico-chimice Metoda de sterilizare se alege in functie de proprietatile fizico-chimice ale produselor,pentru evitarea eventualelor modificari in calitatea ale produselor,pentru evitarea eventualelor modificari in calitatea acestora.Eficacitatea metodei de sterilizare depinde de natura acestora.Eficacitatea metodei de sterilizare depinde de natura produselor ,gradul si natura unei eventuale contaminari microbiene produselor ,gradul si natura unei eventuale contaminari microbiene si de conditiile in care a fost preparat produsul de sterilizat respectiv.si de conditiile in care a fost preparat produsul de sterilizat respectiv.

Sterilizarea cu vapori de apa sub presiune si sterilizarea prin caldura Sterilizarea cu vapori de apa sub presiune si sterilizarea prin caldura uscata sunt metodele cele mai sigure si trebuie folosite ori de cite ori uscata sunt metodele cele mai sigure si trebuie folosite ori de cite ori natura produsului o permite. natura produsului o permite.

Sterilizare cu vapori de apa sub presiune-Sterilizare cu vapori de apa sub presiune- se foloseste se foloseste ori de cite ori este posibil pentru preparatele ori de cite ori este posibil pentru preparatele apoase,pansamentele chirurgicale si produsele analoage ale apoase,pansamentele chirurgicale si produsele analoage ale acestora.Se efectueaza in autoclave incalzite electric sau cu acestora.Se efectueaza in autoclave incalzite electric sau cu gaz ,in care aerul a fost inlocuit cu vapori de apa sub presiune.gaz ,in care aerul a fost inlocuit cu vapori de apa sub presiune.

Sterilizarea se efectueaza la 121Sterilizarea se efectueaza la 121ºC cel putin 15 min sau la C cel putin 15 min sau la 115115ºC cel putin 30 min .Se pot folosi si alte conditii de C cel putin 30 min .Se pot folosi si alte conditii de temperatura si de timp ,a caror eficacitate este temperatura si de timp ,a caror eficacitate este dovedita ,acestea trebuie prevazute in monografiile dovedita ,acestea trebuie prevazute in monografiile respective.Temperatura si presiunea din interiorul autoclavului respective.Temperatura si presiunea din interiorul autoclavului in timpul sterilizarii trebuie masurate cu o precizie de +,- 2 C in timpul sterilizarii trebuie masurate cu o precizie de +,- 2 C si respectiv +,- 10 kPa si respectiv +,- 10 kPa

Autoclave

Sterilizare prin caldura uscataSterilizare prin caldura uscata –pentru produsele rezistente la –pentru produsele rezistente la caldura si pentru produsele neapoase ,care nu pot fi sterilizate cu caldura si pentru produsele neapoase ,care nu pot fi sterilizate cu vapori de apa sub presiune : produsele uleioase,pulberi,materiale vapori de apa sub presiune : produsele uleioase,pulberi,materiale de laborator din sticla sau portelan ,instrumentar metalic fara de laborator din sticla sau portelan ,instrumentar metalic fara suduri cu cositor .Se efectueaza in etuve incalzite electric ,prin suduri cu cositor .Se efectueaza in etuve incalzite electric ,prin care aerul incalzit circula astfel incit sa asigure o repartitie care aerul incalzit circula astfel incit sa asigure o repartitie uniforma a caldurii in tot spatiul de sterilizare.uniforma a caldurii in tot spatiul de sterilizare.

Produsele de sterilizat sint introduse in recipiente care apoi sint Produsele de sterilizat sint introduse in recipiente care apoi sint inchise pentru a impiedica o contaminare ulterioara.Temperatura inchise pentru a impiedica o contaminare ulterioara.Temperatura si timpul de sterilizare se aleg in functie de natura produsului de si timpul de sterilizare se aleg in functie de natura produsului de sterilizat.sterilizat.

Sterilizarea se efectueaza de obicei la 160Sterilizarea se efectueaza de obicei la 160ºC -3h,170C -3h,170ºC -1h,180C -1h,180ºC-C-30min30min

Etuva EC 50

Sterilizare prin filtrareSterilizare prin filtrare –in cazul solutiilor –in cazul solutiilor termolabile.In vederea indepartarii termolabile.In vederea indepartarii microorganismelor ,filtrarea se efectueaza prin filtre microorganismelor ,filtrarea se efectueaza prin filtre bacteriologice sterile sau prin membrane filtrante bacteriologice sterile sau prin membrane filtrante sterile ,respectind precautiile impuse de acest mod sterile ,respectind precautiile impuse de acest mod de lucru.Toate operatiunile se efectueaza in conditii de lucru.Toate operatiunile se efectueaza in conditii aseptice cu ustensile ,recipiente si solventi in aseptice cu ustensile ,recipiente si solventi in prealabil sterilizati .Solutiile sint prealabil sterilizati .Solutiile sint trecutetrecute prin filtre prin filtre sterile confectionate din derivati de sterile confectionate din derivati de celuloza ,materiale plastice sau din produse celuloza ,materiale plastice sau din produse sintetizate sau din combinatii corespunzatoare ale sintetizate sau din combinatii corespunzatoare ale acestora ,sau prin membrane filtrante sterile acestora ,sau prin membrane filtrante sterile confectionate din polimeri sintetici sau esteri confectionate din polimeri sintetici sau esteri celulozici.Filtrele sau membranele filtrante folosite celulozici.Filtrele sau membranele filtrante folosite nu trebuie sa cedeze din componentele lor si nu nu trebuie sa cedeze din componentele lor si nu trebuie sa interactioneze fizic sau chimic cu produsul trebuie sa interactioneze fizic sau chimic cu produsul de sterilizat.Trebuie verificata integritatea filtrelor de sterilizat.Trebuie verificata integritatea filtrelor inainte si dupa filtrare .Produsul filrat se introduce in inainte si dupa filtrare .Produsul filrat se introduce in conditii aseptice in recipiente sterilizate care apoi se conditii aseptice in recipiente sterilizate care apoi se inchid etans.inchid etans.

Sterilizare cu gazSterilizare cu gaz - pentru produsele - pentru produsele care nu rezista la temperaturile ridicate care nu rezista la temperaturile ridicate necesare sterilizarii cu vapori de apa sub necesare sterilizarii cu vapori de apa sub presiune sau sterilizarii prin caldura presiune sau sterilizarii prin caldura uscata si care sint compatibile cu gazul uscata si care sint compatibile cu gazul sterilizat .Gazul sterilizat folosit de sterilizat .Gazul sterilizat folosit de obicei este oxidul de etilen,deoarece obicei este oxidul de etilen,deoarece este inflamabil in amestec cu este inflamabil in amestec cu aerul ,acesta se foloseste diluat cu un aerul ,acesta se foloseste diluat cu un gaz inert (ex:dioxid de carbon) gaz inert (ex:dioxid de carbon)

Controlul sterilitatiiControlul sterilitatii SterilitateSterilitate - absenta microorganismelor ,in - absenta microorganismelor ,in

forma vegetativa sau sporulata capabile sa se forma vegetativa sau sporulata capabile sa se dezvolte in conditii adecvate.dezvolte in conditii adecvate.

Pentru a evita contaminarea accidentala a Pentru a evita contaminarea accidentala a produselor in timpul efectuarii controlului produselor in timpul efectuarii controlului sterilitatii ,acesta se efectueaza in conditii sterilitatii ,acesta se efectueaza in conditii aseptice.aseptice.

Controlul sterilitatii se poate efectua folosind fie Controlul sterilitatii se poate efectua folosind fie metoda filtrarii prin membrana sau metoda metoda filtrarii prin membrana sau metoda insamintarii directe in mediul de cultura .insamintarii directe in mediul de cultura .

Metoda filtrarii prin membrana permite separarea Metoda filtrarii prin membrana permite separarea posibilelor microorganisme contaminate de posibilelor microorganisme contaminate de inhibitorii cresterii lor si se foloseste in special inhibitorii cresterii lor si se foloseste in special pentru lichidele si pulberile care prezinta pentru lichidele si pulberile care prezinta activitate antimicrobiana.Metoda este adecvata si activitate antimicrobiana.Metoda este adecvata si preferabila in cazul produselor preferabila in cazul produselor uleioase ,unguentelor si cremelor care pot fi aduse uleioase ,unguentelor si cremelor care pot fi aduse in solutie cu diluanti sterili lipsiti de activitatea in solutie cu diluanti sterili lipsiti de activitatea antimicrobiana cit si in cazul lichidelor si pulberilor antimicrobiana cit si in cazul lichidelor si pulberilor lipsite de activitatea antimicrobiana lipsite de activitatea antimicrobiana

Prelevarea probelor se efectueaza in conditii aseptice .In Prelevarea probelor se efectueaza in conditii aseptice .In cazul fiolelor si flacoanelor ,suprafetele exterioare se cazul fiolelor si flacoanelor ,suprafetele exterioare se curata cu un agent dezinfectant adecvat si se patrunde curata cu un agent dezinfectant adecvat si se patrunde la continut in conditii aseptice.In cazul produselor la continut in conditii aseptice.In cazul produselor conditionate sub vid ,dupa dezinfectarea dopului de conditionate sub vid ,dupa dezinfectarea dopului de cauciuc se introduce in flacon aer steril cu ajutorul unui cauciuc se introduce in flacon aer steril cu ajutorul unui dispozitiv adaptat la o seringa sterila care contine dispozitiv adaptat la o seringa sterila care contine material de filtrare sterilizat.material de filtrare sterilizat.

Contaminarea microbianaContaminarea microbiana Controlul contaminarii microbiene urmareste Controlul contaminarii microbiene urmareste

determinarea numarului total de microorganisme determinarea numarului total de microorganisme aerobe sau lipsa unor microorganisme patogene aerobe sau lipsa unor microorganisme patogene sau conditionat patogene,prezente in produsele sau conditionat patogene,prezente in produsele farmaceutice de la materiile prime pina la formele farmaceutice de la materiile prime pina la formele finite.finite.

Prelevarea si prelucrarea probelor-controlul Prelevarea si prelucrarea probelor-controlul contaminarii microbiene se efectueaza pe 10g contaminarii microbiene se efectueaza pe 10g sau 10ml proba luata in lucru,rezultata prin sau 10ml proba luata in lucru,rezultata prin omogenizarea continutului mai multor omogenizarea continutului mai multor recipiente .In functie de natura probei de recipiente .In functie de natura probei de analizat ,proba luata in lucru se dilueaza,se analizat ,proba luata in lucru se dilueaza,se dizolva ,se suspenda sau se emulsioneaza intr-un dizolva ,se suspenda sau se emulsioneaza intr-un lichid corespunzator .Daca proba de analizat are lichid corespunzator .Daca proba de analizat are activiatae antimicrobiana aceasta trebuie activiatae antimicrobiana aceasta trebuie indepartata prin diluare,neutralizare sau indepartata prin diluare,neutralizare sau filtrare.Prelevarea si prelucrarea probelor se filtrare.Prelevarea si prelucrarea probelor se efectueaza in conditii aseptice.efectueaza in conditii aseptice.

CControlul eficacitatii conservantilor ontrolul eficacitatii conservantilor antimicrobieniantimicrobieni

CConservantii antimicrobieni se adauga unor onservantii antimicrobieni se adauga unor preparate farmaceutice sterile in scopul evitarii unei preparate farmaceutice sterile in scopul evitarii unei eventuale contaminari microbiene a acestora pe eventuale contaminari microbiene a acestora pe perioada folosirii,sau unor preparate farmaceutice perioada folosirii,sau unor preparate farmaceutice nesterile in scopul reducerii incarcaturii microbiene a nesterile in scopul reducerii incarcaturii microbiene a acestora.acestora.

Adaugarea conservantilor antimicrobieni nu exclude Adaugarea conservantilor antimicrobieni nu exclude obligativitatea respectarii regulilor de buna obligativitatea respectarii regulilor de buna fabricatie. Microorganismele–test folosite pentru fabricatie. Microorganismele–test folosite pentru controlul eficacitatii conservantilor controlul eficacitatii conservantilor antimicrobieni,prevazute in monografie , sint cele antimicrobieni,prevazute in monografie , sint cele mai fregvent intilnite in timpul procesului de mai fregvent intilnite in timpul procesului de fabricatie,pe perioada conservarii si a folosirii fabricatie,pe perioada conservarii si a folosirii produselor ,prezentind un risc crescut pentru produselor ,prezentind un risc crescut pentru contaminarea preparatelor farmaceutice ,in unele contaminarea preparatelor farmaceutice ,in unele cazuri pot fi folosite si alte microorganisme-test.cazuri pot fi folosite si alte microorganisme-test.

Pentru a evalua aficacitatea conservantilor Pentru a evalua aficacitatea conservantilor antimicrobieni folositi perioada de testare este de antimicrobieni folositi perioada de testare este de cel putin 28 zile,dupa caz se poate efectua testari cel putin 28 zile,dupa caz se poate efectua testari repetate.repetate.

Controlul eficacitatii conservantilor antimicrobieni Controlul eficacitatii conservantilor antimicrobieni se efectueaza in conditii care permit evitarea unei se efectueaza in conditii care permit evitarea unei contaminari accidentale a preparatului contaminari accidentale a preparatului farmaceutic analizat si fara a afecta farmaceutic analizat si fara a afecta microorganismele-test inoculate.microorganismele-test inoculate.

Pentru contaminarile experimentale se folosesc Pentru contaminarile experimentale se folosesc urmatoarele microorganisme-test:urmatoarele microorganisme-test:

**Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus *Escherichia coli*Escherichia coli *Pseudomonas aeruginosa *Pseudomonas aeruginosa *Candida albicans *Candida albicans *Aspargillus niger*Aspargillus niger

Activitatea microbiologica a Activitatea microbiologica a antibioticelorantibioticelor

Determinarea activitatii microbiologice a Determinarea activitatii microbiologice a antibioticelor prin metoda antibioticelor prin metoda difuzimetrica- se bazeaza pe compararea zonelor de inhibitie bazeaza pe compararea zonelor de inhibitie ale cresterii unui microorganism-ale cresterii unui microorganism-test ,produse de concentratii cunoscute test ,produse de concentratii cunoscute dintr-un antibiotic –standart,cu zonele de dintr-un antibiotic –standart,cu zonele de inhibitie produse de concentratii presupuse inhibitie produse de concentratii presupuse egale ale antibioticului de analizat.egale ale antibioticului de analizat.

Activitatea microbiologica a antibioticelor Activitatea microbiologica a antibioticelor se exprima in unitati internationale sau in se exprima in unitati internationale sau in micrograme pe mg antibiotic de analizat.micrograme pe mg antibiotic de analizat.

Preparea solutiilor-standart(stoc si dilutii de lucru) si a Preparea solutiilor-standart(stoc si dilutii de lucru) si a solutiilor proba(stoc si dilutii de lucru)solutiilor proba(stoc si dilutii de lucru)

Solutia-standart stocSolutia-standart stoc se prepara prin dizolvarea unei se prepara prin dizolvarea unei mase cunoscute de antibiotic-standart (daca e necesar mase cunoscute de antibiotic-standart (daca e necesar se usuca)in 100 ml solvent ,conform datelor din tabelul se usuca)in 100 ml solvent ,conform datelor din tabelul 11

Dilutia-standart de lucruDilutia-standart de lucru.Din solutia-standart stoc se .Din solutia-standart stoc se prepara inainte de folosire,doua dilutii standart de prepara inainte de folosire,doua dilutii standart de lucru de concentratie precazute in tabelul 1lucru de concentratie precazute in tabelul 1

Solutia-proba stocSolutia-proba stoc se prepara prin dizolvarea unei se prepara prin dizolvarea unei mase din antibioticul de analizat agala cu masa mase din antibioticul de analizat agala cu masa antibioticului standart in 100 ml de solvent,conform antibioticului standart in 100 ml de solvent,conform datelor din tabel.datelor din tabel.

Dilutii-proba de lucruDilutii-proba de lucru.Din solutia proba stoc se .Din solutia proba stoc se prepara ,inainte de folosire ,doua dilutii-proba de lucru prepara ,inainte de folosire ,doua dilutii-proba de lucru de concentratii presupuse egale cu concentratiile de concentratii presupuse egale cu concentratiile dilutiilor-standart de lucru.La preparare se folosesc dilutiilor-standart de lucru.La preparare se folosesc solventi prevazuti in tabel.solventi prevazuti in tabel.

AntibiotAntibiotic de ic de analizatanalizat

MicroorMicroorganismganism-test-test

Medii de cultura Medii de cultura pentru:-pentru:-intertinerea tulpinii intertinerea tulpinii de de microorganism-microorganism-test(A),test(A),

-obtinerea -obtinerea suspensiei-stoc suspensiei-stoc de spori(B), -de spori(B), -treceri zilnice(C),treceri zilnice(C),

Medii de Medii de cultura cultura pentru pentru determinardeterminarea ea activitatii activitatii microbiolomicrobiologice a gice a antibioticelantibioticelor:-strat or:-strat inferior(i)inferior(i)

-strat -strat superior(s)superior(s)

ConcConcentraentratia tia suspsuspensiensieide eide micr-micr-me-me-testtest

AntibiotiAntibiotic c standartstandart

Solventi Solventi pentru pentru prepararea prepararea sol-sol-stoc(standastoc(standart si proba)rt si proba)

Solventi Solventi pentru pentru preparareprepararea dilutiilor a dilutiilor de de lucru(stanlucru(standart si dart si proba)proba)

Timp de Timp de conservarconservare a sol-e a sol-stoc(stanstoc(standart si dart si proba)la 4 proba)la 4 CC

ConcentrConcentratia atia dilutiilor dilutiilor de de lucru(stanlucru(standart si dart si proba in proba in mocrogramocrograme sau me sau unitati unitati internatiointernationale pe nale pe mlml

AmpicillAmpicillinum inum natricunatricumm

AmpicillAmpicillinum inum trihdryctrihdrycumum

BenzylBenzylpenicilipenicilinum-num-natricunatricumm

MicroccMicroccocus ocus luteusluteus

MicrocoMicrococcus ccus luteusluteus

StapyloStapylococcus coccus aureusaureus

I - AI - A

I - CI - C

I - AI - A

I - CI - C

I - AI - A

I - CI - C

IV -iIV -i

XI-sXI-s

--

IV -iIV -i

V-sV-s

1010

--

AmpicilliAmpicillinum num natricunatricumm

--

BenzylpBenzylpenicilinuenicilinum-m-natricunatricumm

Tampon Tampon fosat Ph fosat Ph 7,07,0

--

--

Tampon Tampon fosat pH fosat pH 7,07,0

--

--

3 zle3 zle

--

- -

10-20mg10-20mg

--

1 U.I1 U.I

2 U.I2 U.I

Tabel 1Tabel 1

In mediul de cultura prevazut in tabel pentru a forma stratul superior al mediului de cultura folosit pentru determinarea activitatii microbiologice a antibioticelor ,topit si racit la 50 ºC .in cazul suspensiilor de microrganisme-test in forma vegetativa sau racita la 60 ºC in cazul suspensiei de microorganisme-test in forma sporulata se introduce 1 ml suspensie de microorganisme-test pentru 100 ml mediu de cultura si se amesteca pentru omogenizare.Concentratiile suspensiilor de microorganisme-test obtinute prin dilutie conform datelor anterioare necesare insamintarilor sint prevazute in tabel,5 ml mediu de cultura insamintat e aduc peste stratul inferior de mediul de cultura solidificat in placile Petri,astfel incit sa se formeze un strat superior uniform ca grosimea..Dupa solidificarea stratului superior se aseaza pe suprafata acestuia la o distanta de aproximativ 28 mm de centrul placii Petri si la o distanta egala unul fata de celalalt ,4 cilindri din otel inoxidabil sau din alt material adecvat cu diametrul interior de 7 mm si cu inaltimea de 10 mm.

Se efectueaza cite 3 cintariri atit din Se efectueaza cite 3 cintariri atit din antibioticul-standart cit si din antibioticul antibioticul-standart cit si din antibioticul de analizat.Din fiecare cintarire se prepara de analizat.Din fiecare cintarire se prepara solutie stoc (standart si proba) si dilutiile solutie stoc (standart si proba) si dilutiile de lucru.Pentru fiecare din cele 2 dilutii de lucru.Pentru fiecare din cele 2 dilutii standart de lucru si cele doua dilutii proba standart de lucru si cele doua dilutii proba de lucru efectuate din aceeasi cintarire se de lucru efectuate din aceeasi cintarire se folosesc cite 6 placi Petri .Dilutiile de lucru folosesc cite 6 placi Petri .Dilutiile de lucru (standart si proba) se introduc in cei 4 (standart si proba) se introduc in cei 4 cilindri din fiecare din placile Petri dupa cilindri din fiecare din placile Petri dupa cum urmeaza :in primele 6 placi Petri ,in 2 cum urmeaza :in primele 6 placi Petri ,in 2 din cilindri se introduc cite 0,4 ml din din cilindri se introduc cite 0,4 ml din prima dilutie standart de lucru si in ceilalti prima dilutie standart de lucru si in ceilalti doi cilindri cite 0,4 ml din prima dilutie doi cilindri cite 0,4 ml din prima dilutie proba de lucru ; in celelalte sase placi Petri proba de lucru ; in celelalte sase placi Petri se procedeaza in mod identic cu cea de-a se procedeaza in mod identic cu cea de-a doua dilutie de lucru(standart si proba) doua dilutie de lucru(standart si proba)

Interpretarea rezultatelor -se calculeaza media aritmetica a diametrelor zonelor de inhibitie pentru fiecare dilutie de lucru (standart si proba)si se procedeaza conform prevederilor de la ,,Evaluarea statistica a determinarilor biologice – Calculul activitatii biologice prin evaluarea indirecta –Metode bazate pe raspunsuri gradate”

Proba de analizat este corespunzatoare daca activitatea microbiologica a acesteia este de cel putin 90,0% si de cel mult 110,0% fata de activitatea microbiologica a antibioticului-standart.Limitele fudiciale de eroare sint cuprinse intre 80,0% si 125,0%.

Activitatea enzimatica a chimotripsineiActivitatea enzimatica a chimotripsinei

Determinarea activitatii enzimatice a chimotripsineise Determinarea activitatii enzimatice a chimotripsineise bazeaza pe hidroliza esterului etilic al clohidratului de L-bazeaza pe hidroliza esterului etilic al clohidratului de L-tiroozina de catre chimotripsina la pH 6,2-6,3 si la tiroozina de catre chimotripsina la pH 6,2-6,3 si la temperatura 25temperatura 25ºC si titrarea ionilor de hidrogen eliberati cu C si titrarea ionilor de hidrogen eliberati cu NaOH. NaOH.

Unitatea de chimotripsina Unitatea de chimotripsina - este masa enzimei care in conditii - este masa enzimei care in conditii

standart,hidrolizeaza un milimol de substrat pe minutstandart,hidrolizeaza un milimol de substrat pe minut

Prepararea substratului - Prepararea substratului - Se dizolva 0,6g ester etilic al Se dizolva 0,6g ester etilic al clorhidratului de L-tiroxina si 1,4 g NaOH 1 mol/l,se agita si se clorhidratului de L-tiroxina si 1,4 g NaOH 1 mol/l,se agita si se completeaza cu apa la 100 ml ,intr-un balon cotat .Solutia se completeaza cu apa la 100 ml ,intr-un balon cotat .Solutia se inainte de folosire.inainte de folosire.

Activitatea enzimatica a chimotripsinei se calculeaza conform Activitatea enzimatica a chimotripsinei se calculeaza conform formulei:formulei:

UCHT(TEE-Hcl)/mg UCHT(TEE-Hcl)/mg =V*n/m V*n/m unde:unde: V - volumul de NaOH 0,02 mol/l folosit pe minut la V - volumul de NaOH 0,02 mol/l folosit pe minut la

titrare,mltitrare,ml n - 0,02(cantitatea gruparilorcarboxil neutralizate de 1 ml n - 0,02(cantitatea gruparilorcarboxil neutralizate de 1 ml

NaOH 0,02 mol/l in molimoli)NaOH 0,02 mol/l in molimoli) m - masa chimotripsinei luate in lucru ,mgm - masa chimotripsinei luate in lucru ,mg

IMPURITATI HIPOTENSIVE Determinarea se bazeaza pe compararea scaderii presiunii arteriale la

animale de experienta produsa dupa administrarea unui preparat injectabil cu scaderea presiunii arteriale produsa de o solutie standard de histamina.

Solutie standard : 16.5mg diclorhidrat de histamina se dizolva in apa distilata si se completeaza cu acelasi solvent la 100ml, intrun balon cotat.

Solutie proba : se prepara conform prevederilor din monografia respectiva folosind ca solvent clorura de sodiu – solutie izotomica, daca nu sa prevede altfel.

Tehnica de lucru: se folosesc pisici adulte de ambele sexe, sanatoase, cu masa corporala de 2 – 3 kg. Animalele se anesteziaza profund cu o substanta anestezica cu efect prelungit si care nu modifica reglarea presiunii arteriale. Intimpul determinarii temperatura animalului trebuie mentinuna in limite fiziologice. Se descopera artera carotita comuna in care se introduce o canula cu solutie anticuagulanta, pusa in legatura cu un dispoyitiv care permite inscrierea presiunii arteriale. Toate solutiile se administreaza intravenos printr-o canula introdusa in vena femurala. Respiratia artificiala este facultariva

Pentru verificarea sensibilitatii animalului la histamina se injecteaja din solutia standart : 0.05;0.1; 0.15 μg histamina pe kg/ masa corporala. Daca raspunsul hipotensiei la aceste 3 doze este progresiv se mai administreaza inca de 2 ori cite 0.1 μg histamina pe kg/ masa corporala.Raspunsul la aceste 2 doze trebuie sa fie aproximativ egal 2.7 kPa.daca aceste conditii nu sunt indeplinite injecctarile se continue. Administrarile se efctueaza la intervale regulate, de la cel putin 5 ml si la cel putin 1 min,dupa ce presiunea arteriela revine la nivelul de inainte de injectarea precedenta. Solutia proba se administreaza de 2 ori succesiv fiind urmata de administrarea dozei de 0.1 μg histamina pe kg/ masa corpurala.

Interpretarea rezultatelor: proba de analizat este corespunzatoare daca media raspunsurilor obtinute cu solutia-proba este mai mica decit media raspunsurilor obtinute cu doza de 0.1 μg histamina pe kg/ masa corporala. In caz contrar se repeta pe acelasi animal seria de administrare a solutiei standard si a solutiei proba.

Proba de analizat este corespunzatoare daca media raspunsurilor obtinute cu solutia proba este mai mica decit media raspunsurilor obtinute cu solutia standard si daca nu mai mult de jumatate din raspunsurile individuale obtinute cu sol.proba depasesc media raspunsurilor obtinute cu 0.1 μg histamina pe kg/ masa corporala.

IMPUTITATI PIROGENE

Controlul impuritatilor pirogene se bazeaza pe urmarirea temperaturii rectale a iepurilor, dupa administrarea intravenoasa a solutiei de analizat, pentru decelarea prezentei unor eventuale impuritati cu efect hipertermizant.

Pentru controlul inpuritatilor pirogene se admit numai animalele care raspund la testarea reactivitatii termice cu o modificare individuala maxima de temperatura cuprinsa intre +0,75 ºC si + 1,5 ºC .

Animalele nu sunt folosite pentru controlul impuritatilor pirogene mai des decit o data la 72h.Acelasi animal nu poate fi folosit la mai mult de 8 probe de pirogenitate.

Tehnica de lucru: controlul impuritatilor pirogene se efctueaza pe trei iepuri a care temperatura sa mentinut constanta. La fiecare epure diferenta masei corporale nu trebuie sa fie nu mai mare decit 300g si diferenta intre temperaturile initiale nu trebuie sa fie mai mare de 1 ºC . Animalele se introduc in cutiele de contentie cu cel putin 1h inaintea inregistrarii primei temperaturi de control.Inaintea administrarii solutiei de analizat se iau 2 temperaturi de control: I - cu 30 – 40min inaintea administrarii, II - imediat inaintea administrarii; media lor constitue temperatura initiala. Administrarea se efectueaza intrsvenos in vena marginala a urechei, daca nu se prevede altfel. Viteza de injectare trebuie sa fie de cel mult 5 ml /min.

Dupa administrare iepurii se mentin in aceleasi conditii timp de trei ore; masurarea temperaturii se efctueaza de 4 ori, la intervale de 45 min.

Interpretarea rezultatelor: proba de analizat este considerata corespunzatoare daca suma modificarilor individuale maxime de temperatura ale celor 3 animale nu depaseste 1,15 ºC ; daca aceasta valoare depaseste

2,65 ºC ,proba este respinsa; daca valoarea este cuprinsa intre 1,15 ºC -2,65 ºC ,determinarea se repeta pe alte trei animale nelucrate care indeplinesc

conditiile pentru controlul impuritatilor pirogene,iar interpretarea rezultatelor se efectueaza conform prevederilor din tabel

Rind Rind Numar Numar

de iepuri de iepuri Proba de analizat este considerata Proba de analizat este considerata

corespunzatoare daca suma corespunzatoare daca suma cresterilor maxime de cresterilor maxime de temperatura

nu depaseste:

Proba de analizat este Proba de analizat este considerata considerata

necorespunzatoare daca necorespunzatoare daca suma cresterilor maxime suma cresterilor maxime

de de temperatura nu depaseste:

AA

BB

CC

DD

33

66

99

1212

1.15 1.15 ºC

2.80 2.80 ºC

4.45 4.45 ºC

6.60 6.60 ºC

2.65 2.65 ºC

4.30 4.30 ºC

5.95 5.95 ºC

6.60 6.60 ºC

IMPURITATI TOXICE

Determinarea impuritatilor toxice se efectueaza pe soareci albi, sanatosi, cu masa corporala de 18-22 g.

Animale de experienta: soarecii de ambele sexe sunt mentinuti 3-5 zile inaitea determinarii in incaperi cu o temperatura de 22-26 ºC si la un regim alimentar constant, echilibrat, cu acces liber la hrana si apa. Animalele sunt cintarite in fiecare din ultimele 3 zile inaintea determinarii si sunt luate in lucru numai acele animale care in acest interval nu au prezentat scaderi ale masei corporale.

Tehnica de lucru: proba luata in lucru se dizolva in apa sterila sau in solventul specificat in monografie, in concentratia prevazuta in monografia raspectiva.

Daca nu se prevede altfel, se administreaza intravenos, la 5 soareci, cite 0,5 ml solutie- proba, intrun interval de 5-10 s, cu un debit constant; animalele se tin sub observatie timp de 24 h.

Interpretarea rezultatelor: proba de analizat este corespunzatoare daca nici un animal nu prezinta fenomene toxice (convulsii, pareze) imediat dupa injectare si daca toate enimalele supravetuesc pina la sfirsitul perioadei de observatie .

Dozarea biologica a heparinei Dozarea biologica a heparinei se bazeaza pe proprietatea Dozarea biologica a heparinei se bazeaza pe proprietatea

acesteia de a prelungi “in vitro” timpul de coagulare a acesteia de a prelungi “in vitro” timpul de coagulare a singelui.singelui.

Solutie standardSolutie standard:: se cintareste in balanta analitica se cintareste in balanta analitica heparina sodica necesara obtinerii unei sol.care sa contina heparina sodica necesara obtinerii unei sol.care sa contina 10 U.I. heparina/ml in tricrezol3g/l. Se conserva la 0-510 U.I. heparina/ml in tricrezol3g/l. Se conserva la 0-5ººC C timp de cel mult 6 luni.timp de cel mult 6 luni.

Prin diluarea acestei solutii se obtin urmatoarele sol.pentru Prin diluarea acestei solutii se obtin urmatoarele sol.pentru determinare:determinare:

sol.I (S1) contine 1,28 U.I. heparina/ml;sol.I (S1) contine 1,28 U.I. heparina/ml; sol.II (S2) contine 1,60 U.I. heparina/ml;sol.II (S2) contine 1,60 U.I. heparina/ml; sol.III (S3) contine 2,00 U.I. heparina/ml;sol.III (S3) contine 2,00 U.I. heparina/ml; Solutia-probaSolutia-proba:: din proba de analizat se prepara prin din proba de analizat se prepara prin

diluare cu apa, o solutie cu o concentratie presupusa de 10 diluare cu apa, o solutie cu o concentratie presupusa de 10 U.I. heparina/ml. din aceasta sol. Se prepara, prin diluare cu U.I. heparina/ml. din aceasta sol. Se prepara, prin diluare cu apa, 3 solutii(P1, P2, P3), care trebuie sa aiba aceleasi apa, 3 solutii(P1, P2, P3), care trebuie sa aiba aceleasi concentratii cu acelea ale sol. Standard diluate.concentratii cu acelea ale sol. Standard diluate.

Recoltarea singelui:Recoltarea singelui: sese recolteaza 100ml singe recolteaza 100ml singe de bovine intr-un flacon de sticla cu git larg si dop de bovine intr-un flacon de sticla cu git larg si dop rodat care contine 25 ml sulfat de sodiu anhidru rodat care contine 25 ml sulfat de sodiu anhidru 7g/l.7g/l.

Extract de creier cu activitate Extract de creier cu activitate tromboplastinicatromboplastinica:: creierul proaspat de creierul proaspat de bovinebovine ,se,se curata de vase si tesut conjuctiv, se curata de vase si tesut conjuctiv, se taie in bucati mici, se introduce intr-un vtaie in bucati mici, se introduce intr-un vaas si se s si se adauga in volum dublu acetona. Se agita si se adauga in volum dublu acetona. Se agita si se indeparteaza acetona.Se tritureaza 30 g din indeparteaza acetona.Se tritureaza 30 g din tesutul prelucrat cu 75ml acetona, in repetate tesutul prelucrat cu 75ml acetona, in repetate rinduri, pina cind dupa filtrarea acetonei se obtine rinduri, pina cind dupa filtrarea acetonei se obtine o pulbere practic uscata. Pulberea se tine le o pulbere practic uscata. Pulberea se tine le termostat aproximativ 2 ore. La 1,5g pulbere se termostat aproximativ 2 ore. La 1,5g pulbere se adauga 60 ml apa, se incalzeste la 50 adauga 60 ml apa, se incalzeste la 50 ººC timp de C timp de 15 min.,se centrifugheaza la 1500 rot/min timp de 15 min.,se centrifugheaza la 1500 rot/min timp de 2 min si extractul se filtreza.2 min si extractul se filtreza.

Tehnica de lucru: in sase eprubete de hemoliza identice, se introduce cite 1,0 ml din sol.-standard si din sol.-proba,diluate (respectiv S1, S2, S3,P1, P2, P3). In fiecare eprubeta se adauga extract de creier ~0,2 ml, astfel incit cel mai mult timp de coagulare sa fie 9-12 min.Se adauga cite 1,0 ml singe bine omogenizat si cotinutul eprubetelor se amesteca prin usoara rasturnare evitindu-se formarea bulelor de aer. Se urmareste aparitia modificarii fluiditatii singelui, inclinind eprubeta la un unghi de 30 ºC. Pentru fiecare dilutie se stabileste timpul din momentul adaugarii singelui pina la formarea unui cheag care adera de fundul eprubetei, cind aceasta este rasturnata lent. Momentul coagularii este apreciat cu o eroare de cel mult 15s. Daca se observa ruperea cheagului la rasturnarea prematura a lui, determinarea se anuleaza

Dozarea biologica a Insulinei

Dozarea biologica a insulinei se bazeaza pe proprietatea acesteia de a provoca hipoglicemie la iepuri.

Solutie-standard: se cintareste la balanta analitica insulina necesara obtinerii unei sol.cu o concentratie de 40 U.I. insulina/ml. Se dizolva in volumul necesar de clorura de sodiu-sol.izotonica si care este ajustata la pH 2,5-3,5 cu acid clorhidric 1mol/l. Se conserva la 0-5ºC timp de cel mult 6 luni.

Prin diluarea acestei solutii se obtin urmatoarele sol.pentru determinare: sol.I (S1) contine 1 U.I. insulina/ml sol.II (S2) contine 2 U.I. insulina/ml; Solutie proba: din proba de analizat se obtine, prin diluare cu aceeasi solventi

amestec de sol.cu o concentratie presupusa de 1U.I. insulina/ml (P1) si o sol.de 2 U.I. insulina/ml (P2).

Animale de experienta: se folosesc iepuri sanatosi, de ambele sexe,din aceeasi crescatorie,cu masa corparala de 1800-3000g si care nu au prezentat in ultimele 7 zile scaderi in masa corporala.

Tehnica de lucru: cu 24h inaintea determinarii animalele primesc ratia obisnuita de hrana. Dupa 6h se ridica hrana animalelor,lasind doar apa. Nu se iau in lucru animalele care in intervalul de 6h nu au consumat ratia de hrana. In ziua testarii, animalele se pun in dispozitive de contenţie unde se tin fara hrana si apa. Pentru a se determina valoarea initiala a glicemiei, de la fiecare iepure se recolteaza de la vena marginala a urechii cite 0,1ml singe. Se iau in lucru cel putin 24 animale, a caror glicemie este cuprinsa intre 4,99-6,66mmol/l. animalele se impart in 4 loturi egale, care contin cel puti 6 animale pe lot. Se injecteaza subcutanat cele 2 doze din sol.S1 si S2,precum si P1,P2 la cele 4 loturi de iepuri. Dupa 1h si respectiv 2h si 30 min.de la injectare se preleveaza de la fiecare iepure cite 0,1ml singe si se determina glicemia dupa una dim metode:

A Metoda Hagaedorn-Jensen: se recolteaza cu o micropipeta 0,1ml singe .Virful eprubetei se sterge cu hirie de filtru si singele se introduce intro eprubeta care contine 5ml sulfat de zinc si 1ml hidroxid de sodiu 0,1mol/l. Amestecul se tine pe baia de apa timp de 3 min, se filtreaza prin hirtia de filtru spalata de citeva ori cu apa incalzita la 70 ºC si eprubeta se spala de 2 ori cu 3 ml apa incalzita la 70 ºC, care se adauga la filtrat. La sol.se adauga 2 ml hexacianoferat de potasiu 0.005mol/l, se tine in baia de apa timp de 15 min.si se raceste. Se adauga 3ml reactiv Hagaedorn-Jensen, 2ml acid acetic 30g/l, amidon 10g/l in clorura de sodiu-solutie saturata si se titreza cu tiosulfat de sodiu 0.005mol/l pina la decolorare.

In paralel , se face proba –martor,care nu contine singe. Valoarea glicemiei, corespunde numarului de mililitri de tiosulfat de sodiu, atit

pentru proba de singe cit si pentru proba-martor se citeste din tabelul corespunzator.

B. Metoda cu o-toluidina: se bazeaza pe formarea unui compus, colorat in verde- albastru, rezultat din conjugarea aldo- si ceto-hexozelor cu o-toluidina

Solutie-standart de glucoza: 0.1 g glucoza anhidra, cintarite la balanta analitica, se dizolva in 100 ml acid benzoic-solutie saturata, intr-un balon cotat. Se conserva la 0-5 ºC timp de cel mult 6 luni.

Tehnica de lucru: in 2 eprubete de centrifuga, proba si standart se introduc in urmatoarele volume

PP SAcid tricloracetic 50g/l SingeSolutie-standard de glucoza

11

0.10.1

--

1-

0.1

Se amesteca si dupa un repaus de 5 min se centrifugheza la 1500 rot/min. Din sol. Cetrifugate se introduc in alt lote 2 eprubete

urmatoarele volume (in mililitri):

p s

Supernatant-probaSupernatant-standardo-toluidina-solutie

0.4-2

-0.42

Componentele se amasteca, apoi eprubetele se tin in baia de apa timp de 8 min si se racesc imediat la un curent de apa. Dupa racire

se determina absorbanta solutiei-proba si a solutiei-standard,folosind ca lichid de compensare o sol.preparata din 0.4ml acid tricloracetic

50g/l si 2 ml o-toluidina-solutie. Glicemia se calculeaza conform formulei:

Glucoza (mmoli/1000ml singe )= Ap /As * Cs * 0.0555In care:

Ap=absorbanta solutie-proba;As=absorbanta solutiei-standard de glucoza

Cs=concentratia solutie-standard de glucoza ( % m/V ).

Calculul rezultatelor: se iau in considerare numai animalele care au putut fi folosite pina la sfirsitul experientei (se elimina animalele care fac convulsie). Determinarea este valabila daca pina la sfirsit au ramas in experiment cel putin 4 animale in fiecare lot.

Pentru fiecare animal se calculeaza o medie a glicemiei obtinute prin recotarea singelui la o ora si respectiv la 2 ore jumate. Rezultatul obtinut se scade, pentru fiecare animal in parte , din valoarea glicemiei initiale, calculindu-se astfel valoarea scaderii glicemiei.

Dozarea biologica a oxitocinei Dozarea biologica a oxitocinei se bazeaza pe proprietatea acesteia de

a contracta muschiul uterin izolat de sobolan sau de a provoca scaderea presiunii arteriale la pasari.

Dozarea biologica a oxitocinei se poate efectua prin una din urmatoarele metode:

A) Metode pe uter de sobolan: Solutie-standard: se cintareste la balanta analiticahipofiza posterioara-

pulbere necesara obtinerii unei suspensii in acid acetic 2.5 g/l, care sa contina 2 U.I. oxitocina/ml. amestecul se incalzeste, pe baia de apa timp de 5 minute, se raceste la un curent de apa si se filtreaza. Se conserva la 0-5 ºC timp de cel mult 3 luni.

Solutie-proba: din proba de analizat se prepara, prin diluare cu solutie izotonica pentru baia de organ izolat, imediat inainte de folosire o solutie cu concentratia de 0,2 U.I. oxitocina/ml.

Solutie-izotonica pentru baia de organ izolat: Clorura de sodiu (R) 9 g

Clorura de potasiu (R) 0.42 g Clorura de calciu (R) 0.16 g Clorura de magneziu (R) 5.3 mg Hidrogenocarbonat de sodiu (R) 0.5 g Glucoza anhidra (R) 0.5 g Apa pina la 1000 ml

Clorurile se dizolva in 500 ml apa, se adauga Hidrogenocarbonatul de sodiu dizolvat in 100 ml apa, apoi glucoza anhidra si se completeaza cu apa la 1000 ml, intr-un balon cotat.

Tehnica de lucru: Se foloseste un sobolan femel, in diestru, cu masa corporala de 180-220 g, care se sacrifica prin singerare. Din unul din coarnele uterine se sectioneaza un fragment de 1-2 cm lungime, care se suspenda in solutie izotonica pentru baia de organ izolat incalzita la 32 ºC. Fragmentul uterin nu trebuie sa prezinte contractii spontane, dar sensibilitatea acestuia trebuie sa fie pastrata. In solutia din baia se barboteaza un amestec de 95% oxigen (R) si 5% dioxid de carbon (R), cu un debit constant, in bule mici. Contractiile musculare se inscriu pe un kimograf, prin intermediul unei pirghii foarte sensibile. Inainte de determinare, organul se lasa in repaus in baie pina la relaxare completa. Dupa fiecare administrare, organul se spala din momentul inceperii relaxarii pina la relaxare completa. Sensibilitatea organului se controleaza cu doze diferite din solutia-standard, urmarind obtinerea de contractii submaximale. Dupa administrari repetate ale unor doze egale din solutia-standard trebuie sa se obtina contractii de amplitudine egala. In caz contrar, se inlocuieste fragmentul uterin; aceste se mai inlocuieste si in cazul in care prezinta contractii spontane repetate.

Se stabilesc doua doze din solutia-standard care produc efecte sub maximale net deosebite intre ele, cu amplitutinea cuprinsa intre 30% si 70% din contractia maximala.

Proba trebuie astfel diluata incit cele doua doze din solutia-proba sa determine raspunsuri similare cu cele obtinute cu solutia-standard. Raportul dintre dozele solutiei-standard si dozele solutie-proba trebuie sa fie constant pe toata perioada determinarii. Timpul de lucru pe un fragment de organ nu trebuie sa depaseasca 2 h de la montarea acestuia in baie. Dupa stabilirea dozelor, se procedeaza la determinarea propriu-zisa, administrind cele doua doze din solutia-standard si doua doze din solutia-proba, in cadrul unei serii de patru administrari. Se inregistreza cel putin patru serii, respectiv 16 administrari. In cadrul fiecarei serii, ordinea administrarii celor 4 doze trebuie sa fie diferita. Administrarile se efectueaza la intervale egale, de cel putin 5 min. Calculul rezultatelor. Inaltimile contractiilor uterine exprimate in milimetri sint folosite la calculul activitatii oxitocinei, conform prevederilor de la “ Evaluarea statistica a determinarilor biologice – Calculul activitatii biologice prin evaluarea indirecta – Metode bazate pe raspunsuri gradate”

B) Metoda prin inscrierea presiunii arteriale la pasare. Solutie-standard. Se prepara conform prevederilor de la metoda A. Dilutiile necesare pentru determinare se efectueaza cu clorura de

sodiu-solutie izotonica (R). Solutie-proba. Din proba de analizat se prepara prin diluarea cu

clorura de sodiu-solutie izotonica (R), inainte de folosire, o solutie cu o concentratie presupusa de 0.2 U.I. oxitocina/ml.

Tehnica de lucru: Se folosesc cocosi sau gaini de rasa Leghorn, cu masa corporala de 1.8-2.4 kg. pasarea se anesteziaza prin injectare i.m. (in muschiul pectoral) a 2 ml pe kg masa corporala dintr-o solutie care contine fenobarbital sodic (R) 75 mg/ml (anestezia se poate efectua si cu alte substante, astfel alese incit sa se obtina o anestezie prelungita si sa se mentina constanta presiunea arteriala). Pasarea se fixeaza in decubit lateral pe masa de operatie si se indeparteaza penele din zona externa a coapsei pe o suprafata de 4-5 cm. Pielea si muschiul gluteu se sectioneaza; se diseca artera poplitee in care se introduc o canula care contine citrat de sodiu (R) 100 g/l cu adaos de heparina sodica (R) 0.3 % m/V. Canula arteriala se racordeaza la un manometru cu mercur si se inregistreaza presiunea arteriala pe un kimograf. In vena crurala se introduce o canula prin care se administreaza solutia-standard si solutia-proba.

Inainte de determinare se controleaza sensibilitatea pasarii la solutia standard prin injectarea a 0.5 U.I. oxitocina/ml. Aceasta doza trebuie sa produca o scadere a presiunii arteriale de aproximativ 50 mmHg. Daca pasarea este sensibila, se aleg doua doze din solutia-standard si doua doze din solutia-proba, astfel incit doza mare sa determine o scadere de aproximativ 40mmHg, iar doza mica o scadere de cel putin 20mmHg.

Volumul injectat pentru o administrare trebuie sa fie cuprins intre 0.15 ml si 0.40 ml, iar intervalele de timp dintre administrari trebuie sa fie cuprins intre 0.15 ml si 0.40 ml, iar intervalele de timp dintre administrari trebuie sa fie constante pe toata perioada administrarii (3-10 min in functie de revenirea presiunii la nivelul initial).

Se inregistreaza cel putin cite 4 raspunsuri pentru fiecare din cele 2 doze din solutia-standard si din solutia-proba, administrate alternativ si in ordine diferita.

Calculul rezultatelor. Se masoara amplitudinea scaderii presiunii arteriale in milimetri coloana de mercur si se calculeaza activitatea probei de analizat in functie de activitatea standardului, conform prevederilor de la “Evaluarea statistica a determinarilor biologice –Calculul activitatii biologice prin evaluare indirecta –Metode bazate pe raspunsuri gradate”.

Dozarea biologica a preparatelor de digitala

Dozarea biologica a preparatelor de digitala se bazeaza pe determinarea activitatii cardiotoxice a acestora la cobai, comparativ cu activitatea cardiotoxica a unui standard.

Standard: digitala (pulbere de frunze) Solutie-standard: pentru fiecare gram de pulbere standard de

digitala, cintarit la balanta analitica imediat dupa deschiderea fiolei, se adauga 10ml alcool 80%, se agita timp de 24 h, daca temperatura este de 20-30 ºC, sau timp de 48 h, daca temperatura este sub 20 ºC, apoi se filtreaza. Solutia obtinuta se conserva in recipiente inchise etans, la intuneric si la o temperatura cuprinsa intre -5 ºC si +5 ºC, timp de cel mult 30 zile.

In ziua efectuarii determinarii, 6.0-7.5 ml solutie standard se dilueaza cu clorura de sodiu-solutie izotonica la 100 ml, intr-un balon cotat. Concentratia optima a solutiei diluate se stabileste prin incercari mentionate la “Tehnica de lucru”, sa se produca intre 20 min si 30 min.

Solutie-proba. Frunzele de digitala si comprimatele de digitala aduse la acelasi grad de pulverizare cu digitala (pulbere de frunze) si cu pulberea titrata de digitala, se prelucreaza conform prevederilor de la prelucrarea solutiei-standard, cu deosebirea ca se pot folosi, in functie de rezultatul incercarilor preliminare, mai mult de 7.5 ml solutie extractiva alcooloca pentru a obtine 100 ml solutie-proba, fara ca in aceasta solutie concentratia alcoolului sa fie mai mare de 10 % V/V.

Animale de experienta. Pentru o dozare se folosesc doua loturi de cel putin 6 cobai, de acelasi sex (femelele nu trebuie sa fie in perioada de gestatiei), cu masa corporala de 250-450 g si care nu au prezentat in ultimele 5 zile scaderi ale masei corporale. Media masei corporale a animalelor din lotul folosit pentru solutia-standart nu trebuie sa difere cu mai mult de 10% fata de aceea a animalelor din lotul folosit pentru solutia-proba; in cadrul aceluiasi lot nu trebuie sa fie difentele ale masei corporale mai mari de 50g.

Tehnica de lucru: Animalele se anesteziaza prin injectarea a 7 ml/kg masa corporala dintr-o solutie de uretan 250g/l, cu 25-30 min inainte de inceperea perfuziei. Jumatate din doza de uretan se administreaza intraperitoneal si jumatate subcutanat. Dupa instalarea anesteziei, animalul se imobilizeaza in decubit dorsal si in vena jugulara descoperita se introduce o canula care se pune in legatura cu un aparat de perfuzie cu un debit constant sau cu o microbiureta gradata in sutimi de milimetru.

Solutia-stabdard diluata si solutia-proba, incalzite la 38 ºC , trebuie administrate pe tot timpul perfuziei cuun debit de 0.65 ml± 0.05 ml pe kilogram masa corporala si pe minut. Perfuzia se opreste la incetarea contractiilor inimii, constatata cu ajutorul unui aparat care reda activitatea electrica a inimii sau prin observare directa, deschizind cutia toracica in momentul in care bataile inimii neregulate si greu perceptibile. Cind activitatea inimii a incetat timp de cel putin 30 s inima se considera oprita si se noteaza volumul solutiei perfuzate (in milimitri).

Determinarea este valabila cind moartea tuturor animalelor din lotul respectiv se produce intre 20 min si 30 min de la inceputul perfuziei. In caz contrar, concentratia solutiei de perfuzat trebuie modificata.

Calculul rezultatelor. Se efectueaza conform prevederilor de la “Evaluarea statistica a determinarilor biologice – Calculul activitatii biologice prin evaluarea directa”.

Evaluarea statistica a determinarilor biologice

determinarile biologice folosite pentru controlul medicamentelor pot fi impartite in 2 categorii:

- Determinari calitative, prin care se demonstreaza absenta unor impuritati (pirogene, toxice, hipotensive);

Determinari cantitative, care stabilesc activitatea unui preparat, in cazurile in care prin metodele chimice sau fizico-chimice nu se pot obtine informatii adecvate in aceasta directie.

Determinarile biologice cantitative se bazeaza pe dependenta raspunsului de marimea dozei aplicate. Pentru testare se folosesc animale intacte tesutului sau organe izolate, culturi de microorganisme etc.

Spre deosebire de determinarile fizico-chimice, determinarile biologice de activitate prezinta erori mult mai mari, care au cauze multiple. O parte dintre acestea, care depind de virsta, sexul, masa corporala, alimentatia, modul de intretinere al animalelor, pot fi diminuate fixind in cadrul procedeelor de fixare conditii precise pentru acesti parametri. De asemenea, pot fi micsorate erorile sistematice (de ex: dilutie, procedeu de administrare), printr-o acuratete crescuta, precum si erorile de inregistrare a rezultatelor, prin alegerea unei metode bazate pe un efect usor de masurat

Chiar dupa reducerea acestor cauze de eroare, marimea raspunsului la aceeasi doza dintr-un preparat poate diferi considerabil de la un animal la altul, datorita variabilitatii biologice individuale.

Pentru a micsora pe cit de posibil efectul variabilitatii biologice individuale orice determinare biologica a activitatii trebuie efectuata comparativ cu un standard cu activitate cunoscuta, testarea efectuindu-se pentru ambele preparate concomitent si in conditii asemanatoare. Pe baza datelor obtinute se calculeaza coeficientul de activitate (r) care este raportul dintre activitatea probei de analizat si activitatea standardului respectiv. Activitatea propriu-zisa a probei de analizat se obtine inmultind acest coeficient cu activitatea standardului. Activitatea astfel stabilita trebuie sa se incadreze in limitele de toleranta ale activitatii prevazute in monografia fiecarui preparat (de ex: pentru comprimate de digitala 0.85-1.15 U.I./comprimat).

In afara de incadrarea in limitele de toleranta ale activitatii, intereseaza si precizia cu care s-a efectuat testarea, deci este necesar sa se calculeze limitele fiduciale ale determinarii, pentru a vedea daca ele se incadreaza in prevederile metodei. In caz contrar, rezultatul obtinut nu prezinta suficienta incredere si determinarea trebuie continuata pe un numar aditional de cazuri, pina ce eroarea se situeaza in limitele admise pentru metoda respectiva.