curs2-inginerie citotisulara

46
7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 1/46 Inginerie citotisulara si organe bioartificiale an IV - Bioinginerie

Upload: elena

Post on 19-Feb-2018

241 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 1/46

Inginerie citotisulara

si organe bioartificiale

an IV - Bioinginerie

Page 2: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 2/46

Biocompatibilitatea -interactiunea biomaterial-organism

- interactiunea cu proteinele;

-interactiunea cu enzimele;

-interactiunea cu celulele.

Page 3: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 3/46

Fenomene la interfata biomaterial-organism

Interactiunea biomaterial-organism poate fi reprezentata

schematic sub forma:

Unul dintre cele mai importante fenomene care au loc la suprafata de separatie este

fenomenul de sorbtie. Sorbtia este un fenomen fizico-chimic caracteristic

amestecurilor formate din cel putin doua faze sau doua componente, si se datorestefortelor de legatura dintre particulele chimice.

La contactul dintre doua faze se produce o concentrare a substantelor repartizate

intre aceste doua faze, la suprafata de separatie, urmata aproape intotdeauna si de o

concentrare in interiorul fazelor respective, mecanismul concentrarii fiind cel mai

adesea fizic ( adsorbtia fizica sau absorbtia) si chimic ( adsorbtie specifica,chemosorbtie).

Page 4: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 4/46

Interactiunea biomaterialelor cu proteinele

ultitudinea de proteine e!istente la nivelul corpului uman si varietatea de

structura si proprietati ale acestora, determina manifestarea unor interactiuni

comple!e cu biomaterialul, interactiuni care vor afecta si procesele biologice de la

nivelul celulelor sau ale matricii e!tracelulare.

"elatia biomaterial- component proteic 

Page 5: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 5/46

Se constata prezenta at#t a proteinelor fibrilare (colagenul, elastina, laminina), c#t si

a proteinelor globulare( albumina, imunoglobulina), deci o varietate de structuri

chimice proteice si o multitudine de tipuri de amestecuri proteice. $entru a studia , in

aceste conditii, fenomenul de adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor,

trebuie abordate procesele at#t din punct de vedere termodinamic c#t si din punct devedere cinetic.

Termodinamica proceselor de adsorbtie

%enomenologic, un sistem se afla in stare de echilibru daca in conditii de

mediu constante nu are loc nici o modificare a sistemului. La presiune si

temperatura constante, starea de echilibru a unui sistem este caracterizata de o

valoare minima a energiei totale &ibbs:

S T  H G adsadsads   ∆−∆=∆  ' variatia energiei libere &ibbs

  ' variatia entalpiei la trecerea unui mol de proteina din stare conformationala

nativa in stare perturbata nativa

  ' variatia de entropie.

rice alta stare fata de acest minim de energie este o stare de neechilibru

si se vor produce tranzitii spontane spre starea de echilibru, daca bariera

energetica de-a lungul tranzitiei nu variaza in limite foarte largi.

Gads∆

 H ads∆

S ads∆

Page 6: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 6/46

*atele de adsorbtie a proteinelor la suprafata biomaterialelor sunt, cel mai adese,

 prezentate sub forma izotermelor de adsorbtie, unde, la temperatura constanta se

inregistreaza variatia cantitatii de proteina adsorbita in functie de concentratia

acesteia in solutie.

 Izoterme de adsorbtie a proteinelor; a)izoterma de inalta afinitate; b)

izoterma la care ramura descendenta arata o mai mare afinitate intre

 proteina si suprafata sorbanta.

+ceasta deviere intre ramura ascendenta si cea descendenta a izotermei deadsorbtie poarta numele de histereza.

Page 7: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 7/46

Lu#nd in considerare caracterul adsorbtiei proteinei se poate spune ca

 procesul are loc in trei etape : transportul proteinei la limita energetica a suprafetei

  interactiunea si atasarea la suprafata ( pot aparea perturbatii in structura proteinei)rela!area proteinei adsorbite la o stare stabila din punct de vedere conformational.

 Adsorbtia proteinelor

la suprafata

biomaterialelor  

Page 8: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 8/46

Cinetica proceselor de adsorbtie a proteinelor la suprafata biomaterialelor 

+naliz#nd procesul de adsorbtie din punct de vedere cinetic, adica prin

 prisma variatiei in timp a cantitatii de proteina adsorbita pe suprafata, s-au propus

trei faze la contactul proteina- biomaterial:

tapele adsorbtiei proteinelorNucleatia

 umarul de puncte disponibile pentru legaturi monomoleculare (puncte

de nucleatie) difera de la suprafata la suprafata, dar in general este de ordinul

/01-/0/0  molecule2cm3. ste foarte dificil de masurat aceste legari initiale ca

urmare a timpului de urmarire f. redus.

Page 9: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 9/46

( ) ( )∂ 

∂ 

t   Rsk t N N  = −

ma!

( )k t kT 

t des≈ − −

e!p

 µ λ 

4iteza de nucleatie:

 5(t) ' probabilitatea de blocare a legaturii independente la punctele de legare

(ma!)

  - numarul de situri de nucleatie ocupate

λ - frecventa de coliziune cu punctele de nucleatie

∆µdes - energia de activare a unei molecule

" s - flu!ul molecular spre suprafata ( numarul de molecule care lovesc / cm3 

de suprafata in timp de / secunda) si este dependent de conditiile de difuzie

si de concentratia proteinei

Page 10: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 10/46

Cresterea

%ormarea unuia sau a mai multor agregate tridimensionale pe suprafata

se poate realiza daca energia libera de interactiune scade odata cu numarul de

molecule adsorbite. +ceasta energie va fi rezultanta intre intensitatea

interactiunilor intermoleculare proteina-proteina si interactiunile suprafata- proteina.

cuatii cinetice pentru crestere:

( )∂ 

∂ 

S t    s R f t N ≅

( ) ( ) f t t kt kt  

  t  sd des= − + −        

−λ  ρ 

 ρ  ρ    µ µ  λ /

/ e!p ∆ ∆

∆µsd - energia libera de activare pentru difuzia moleculelor la suprafata

ρ - densitatea de situri de legare independent

λ - frecventa de coliziune cu siturile de nucleatie

  Legea logistica de crestere limitata ( Smit C !

( )∂ 

∂ 

 µ S 

t  g t 

S e

des

kt ≅ − 

 

   

  

  −/

ma!

Sma! - numarul ma!im de molecule

g(t) - functie de timp si corespunde probabilitatii de interactiune favorabile intremoleculele legate si cele care difuzeaza spre suprafata

Page 11: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 11/46

"esorbtia

*ependenta de timp a desorbtiei este limitata de geometria agregatelor

in adsorbite, numarul de ciocniri ale macromoleculelor cu agregatele si densitatea

fluctuanta a moleculelor blocate la suprafata.

∂ 

∂ 

 µ S 

t   S 

kt 

n   des≅ − −

e!p

( ) ( )∂ 

∂   λ 

 µ S 

t h S S e S S  o

kt 

des

≅ − − ≤ ≤−

0 0

h(λ) - viteza de desorbtie, care depinde de frecventa de coliziune si durata de

adsorbtie

S0 - numarul de molecule la care densitatea de suprafata devine constanta

Page 12: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 12/46

4iteza de adsorbtie, tin#nd cont de nucleatie, crestere si desorbtie limitata poate fi

scrisa:

( )   ( ) ( ) ( ) ( )∂ ∂ 

  λ S t 

  R N N k t Nf t h S S   s≅ − + − −ma! 0

#dsorbtia competiti$a a proteinelor

cuatiile cinetice permit descrierea procesului de adsorbtie in cazul in

care in sistem se gaseste o singura specie proteica. Intrebarea care apare este: cese int#mpla in cazul in care in mediu se afla proteine diferite6 7um se poate

aborda problema adsorbtiei in cazul plasmei sanguine, care contine peste /00

 proteine diferite, din care cel putin /3 au o concentratie ≥/mg2ml6

Inca din anii /180 Leo 4roman, studiind adsorbtia fibrinogenului din plasma ladiferite tipuri de materiale( sticla, tantal anodizat, o!id de siliciu), pentru intervale

reduse de contact, folosind tehnici imunologice (si anume urmarind reactivitatea

fata de ser de antifibrinogen), constata ca in timp are loc o indepartate a acestei

 proteine de la suprafata.

Page 13: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 13/46

Variatia cantitatii de

fibrinogen adsorbita in timp

la suprafata%----sticlei sipoli(metilmetacrilatului!

Variatia cantitatii de

fibrinogen adsorbit din

plasma pe biomaterial infunctie de concentratia in

plasma a acestuia

Page 14: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 14/46

*eoarece tehnicile utilizate de 4roman nu erau suficient de performante, el nu

reuseste sa deceleze cauzele care determina cresterea activitatii imunologice. l

considera ca fenomenul putea fi datorat modificarilor structurale si orientationaleca urmare a imobilizarii proteinei pe suprafata solida, inlocuirii fibrinogenului de

catre alte proteine plasmatice, digestiei porteolitice a fibrinogenului adsorbit de

catre enzime sau mascarea fibrinogenului de catre proteinele adsorbite.

Ulterior, utiliz#du-setehnici avansate (fibrinogen marcat si tehnici LIS+) s-a

aratat ca fibrinogenul adsorbit este inlocuit la suprafata biomaterialelor de catre proteine plasmatice cu o afinitate mai mare la suprafata.

9otusi, ca o recunoastere in depistarea fenomenului, acest proces poarta numele de

efect 4roman;. Studiile efectuate pe alte tipuri de proteine si suprafete

( polietilena, polistiren), au aratat generalitatea efectului 4roman.

Page 15: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 15/46

*e e!emplu, pentru o suprafata hidrofoba si proteina in stare hidrofoba. +t#t

suprafata c#t si proteina vor fi incon<urare de molecule de apa aran<ate nefavorabil

dpdv energetic:

+dsorbtia si desorbtia proteinelor la suprafata biomaterialului

&ecanismul adsorbtiei competiti$e a proteinelor

Lu#nd in considerare efectul 4roman, s-a incercat elaborarea unui mecanism de

adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor, c#t mai realist. +ceasta

 presupune stabilirea influentei fortelor de interactiune care se manifesta la

interfata biomaterial = proteina si intre proteinele adsorbite si cele in curs deadsorbtie.

Page 16: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 16/46

olecula proteica se va deplasa ca urmare a agitatiei termice si se va ciocni cu

suprafata. +cesta ciocnire va avea ca rezultat indepartarea stratului de molecule de

apa dintre proteina si suprafata. *aca energia rezultata in urma acestui proces este

mai mare dec#t energia termica a moleculei proteice, aceasta va ram#ne pe

suprafata. In caz contrar se intoarce in solutie.

7ontributia interactiunilor electrostatice la mecanismul de adsorbtie, conform

estimarilor cantitative, este secundara iar fortele 4an der >aals sunt negli<abile.

7e se poate spune despre procesul de desorbtie6

+sa cum am amintit , moleculele proteice adsorbite pot fi inlocuite de alte

molecule proteice. confirmare a acestui fapt o constituie si studiile de circulatie a

unor solutii tampon peste suprafetele cu proteine adsorbite, c#nd fenomenul de

desorbtie nu se produce.

$rezenta moleculelor proteice in solutie diminueaza interactiunile dintre molecula

 proteica adsorbita si suprafata prin efecte asupra retelelor moleculelor de apa

dispuse in <urul acestora. +cesta va determina modificarea balantei dintre fortele

entropice si cele hidrofobe, produc#ndu-se desorbtia.

Page 17: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 17/46

In cazul prezentat, daca o molecula este adsorbita pe suprafata, si alte doua

molecule proteice se afla in solutie, ca urmare a interactiunilor dintre

 proteinele aflate in solutie si molecula adsorbita pot aparea doua situatii:

 intensitatea interactiunilor proteina adsorbita - proteina din solutie este mai

mare dec#t intensitatea interactiunilor proteina- suprafata '? desorbtia

 intensitatea interactiunilor proteina adsorbita - proteina din solutie este mai

mica dec#t intensitatea interactiunilor proteina- suprafata si proteina ram#ne

 pe suprafata.

Interactiunile electristatice au si ele o contributie, viteza de desorbtie fiind

dependenta de concentratia la suprafata a proteinei si concentratia totala a

amestecului proteic. 7onstanta vitezei de desorbtie va reflecta interctiunilehidrofobe, electrostatice si entropice intre molecula proteica adsorbita si

suprafata, c#nd este incon<urata de alte molecule proteice.

Page 18: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 18/46

'cuatia cinetica

  adara<ah +. propune o ecuatie semiempirica de viteza de adsorbtie

care sa ia in considerare:  influenta fortelor moleculare dintre moleculele proteice si suprafata, tin#nd

cont de chimia suprafetei si topografia sa  introducerea acestor forte intr-o ecuatie de viteza microscopica, utiliz#nd

mecanica statistica, pentru mecanismul de adsorbtie2desorbtie propus e!tinderea ecuatiei microscopice la o ecuatie de viteza macroscopica

( )d 

dt    k c k c k  i

i i i i i i i

θ 

θ φ θ θ  = − − − −−/ / 3

/

dt   k 

i

i i

φ θ =   3

θ θ = ∑   i

i

φ φ = ∑   ii

i - se refera la proteina i din amestec

ci, c - conc molare ale proteinei i si totale pentru toate proteinele din amestec

θi si φi - fractia din suprafata acoperita reversibil si ireversibil de proteina i.

Page 19: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 19/46

In momentul in care o suprafata si un amestec de proteine vin in contact, initial

toate proteinele sunt distribuite uniform in solutie. La contactul cu suprafata, proteinele se

vor adsorbi form#nd un strat proteic pe biomaterial. %ormarea mai multor straturi presupune

manifestarea unor interactiuni puternice intre proteine si este posibila in cazul proteinelor

care in solutie se afla sub forma de agregate (insulina). $roteinele cu afinitatea de suprafatacea mai mare (cel mai mare 5) se vor adsorbi preferential. 9otusi, procesul este limitat de

transportul de masa si prima proteina adsorbita va fi una cu cea mai mare viteza de

transport. ventual, proteina cu urmatoarea valoare a vitezei de difuzie isi va creste

concentratia la suprafata, dar va putea inlocui prima proteina adsorbita numai daca afinitatea

de suprafata este mai mare. $rocesul continua p#na c#nd proteina cu afinitatea cea mai mare

acopera suprafata, este adsorbita si mentine echilibrul.

+cest mecanism comple! de

adsorbtie in amestecuri de

 proteine este strict dependentde vitezele diferite de transfer

de masa ale proteinelor si

adsorbtia competitiva la

suprafata.

Page 20: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 20/46

Influenta masei moleculare medii a proteinei asupra adsorbtiei competiti$e a

proteinelor din amestecuri

$entru a e!plica influenta masei moleculare medii a proteinelor asupra adsorbtiei

competitive se considera doua proteine, +; si @;, av#nd masele moleculare medii() si coeficientii de difuzie in conditiile:

/) +A @ (masa moleculara medie a proteinei @ este de doua ori mai mare

dec#t a proteinei +)

*+?*@  (coeficientul de difuzie al proteinei + este mai mare dec#t coeficientul de

difuzie al proteinei @).

3) %iecare proteina prezinta doua stari de adsorbtie, /; si 3; cu diferite

conformatii si stari caracteristice (/- adsorbtia initiala 3-starea perturbata darstabila).

7a urmare a modificarilor conformationale, proteina poate trece din starea / in

starea 3. 7onstantele vitezelor de adsorbtie(5 ads), desorbtie(5 des), tranzitie(5 tr ) si de

inlocuire(5 d) depind de tipul centrului de adsorbtie.$rocesul poate fi schematizat:

Page 21: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 21/46

 Schema adsorbtiei competitive a

 proteinelor pe suprafata

biomaterialului 

(MM  A<MM   )

7onstantele vitezelor de tranzitie de la stadiul / la stadiul 3 se diminueaza odata cu scaderea

constantelor vitezelor de adsorbtie in timp ce constantele vitezelor de desorbtie pot sa

creasca odata cu scaderea constantelor vitezelor de adsorbtie. Un astfel de fenomen are

loc atunci cand proteina + este albumina serica umana('88000) si proteina @ esteε- globulina umana('/B0000) c#nd sunt posibile situatiile: adsorbtia preferentiala a proteinei @ cu masa moleculara mare

competitia intre moleculele + si @ pentru centrele de adsorbtie

orientarea preferentiala a proteinelor adsorbite in starea /; inlocuirea proteinei adsorbite @ in starea /; de catre proteina +(din considerente de

afinitate pentru suprafata).

Page 22: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 22/46

Interactiunea proteinelor cu substantele tensioacti$e la suprafate solide

Interactiunile intre proteine si tensioactivi( agenti de suprafata sau

surfactanti) se manifesta in diferite aplicatii care implica proteinele in contact cu

suprafete solide. +stfel, surfactanti si proteine sau peptide pot fi prezenti simultanin timpul proceselor de izolare a proteinelor si pentru minimizarea pierderilor de

substanta activa in timpul administrarii medicamentelor. +lta sfera de aplicatii a

acestor interactiuni o constituie domeniul stomatologic, unde asa numitii agenti

anti-tartru sunt utilizati pentru indepartarea placilor depuse. &radul de indepartare

a proteinei adsorbite, de catre surfactanti, poate fi de asemenea utilizat ca indicatoral modului de atasare al proteinei la suprafata, in mod particular in evidentierea

conformatiilor pe care le adopta proteina adsorbita pe o suprafata solida.

$roteina adsorbita poate e!ista sub forma mai multor fractii care difera

 prin modul de legare la suprafata. +ceste fractii pot fi diferentiate prin intensitatea

legarii, fenomen care poate fi pus in evidenta prin spalare cu solutii tampon, adaos

de surfactanti sau prin susceptibilitatea de modificare a conformatiilor.

Surfactantii au tendinta sa se adsoarba la cele mai multe suprafete,

determin#nd reducerea semnificativa a energiei suprafetei.

Page 23: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 23/46

Surfactantii sunt adesea clasificati in functie de gruparea lor de capat in:anionici,

cationici si neionici. $roprietatile partii hidrofobe, ca si gruparea de capat hidrofila

vor afecta afinitatea moleculei pentru suprafata. 7a urmare a tendintei puternice a

 partii hidrofobe de a evita contactul cu apa, are loc o autoasociere at#t in solutie c#tsi la interfata, fenomen ce va influenta caracteristicile de adsorbtie. +utoasocierea

va conduce la formarea de micele sferice, structuri lamelare sau cubice de tip

reversibil

+dsorbtia surfactantilor la suprafete solide

Page 24: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 24/46

Interactiuni proteina-surfactant in solutie

In amestecuri de proteina si surfactanti, ca urmare a interactiunilor care se

manifesta intre componente, are loc formarea de complecsi proteina-

surfactant, care au proprietati diferite de cele ale proteinelor pure. Legarea

surfactantilor de proteina, deci formarea complecsilor va reduce concentratiade molecule de surfactant liber pentru a interactiona cu proteinele la interfata

unui suport solid.

Surfactantii ionici interactioneaza cu proteinele in solutie, interactiunile fiind

mai puternice in general pentru cei anionici dec#t pentru cei cationici. +ceste

interactiuni vor fi conditionate de: natura proteinei si a tensioactivului, pC,

taria ionica.

Surfactantii neionici interactioneaza putin cu proteinele solubile. S-a observat

manifestarea a trei tipuri de interactiuni:   legarea surfactantilor prin interactiuni electrostatice sau hidrofobe la

sutusurile proteice(e!: β- lactoglobulina si albumina serica)

 adsorbtia surfactantilor la proteina fara modifcari conformationale  legarea la proteina urmata de modificari conformationale.

+ceste trei tipuri de interactiuni se pot manifesta in acelasi sistem daca

concentratia surfactantului este adecvata. odificarile conformationale

conduc la transformari in structura secundara. S-a sugerat e!istenta a c#torva

modele privind legarea surfactantilor la proteine si pentru formareacom le!elor roteina-surfactant erle modelul heli!ului fle!ibil .

Page 25: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 25/46

Interactiunea surfactantilor cu proteine adsorbiteIndepartarea proteinelor adsorbite de catre surfactanti a fost intens studiata de

Corbett ., care introduce termenul de;elutabilitate;, termen care descrie gradul

de indepartare al proteinelor de catre surfactanti.

&radul de elutabilitate este afectat de factorii care influenteaza legarea proteinelor

la suprafata: concentratia proteinei temperatura timpul de adsorbtie tipul de suprafata si tipul de surfactant.

*e asemenea, autoasocierea surfactantilor <oaca un rol ma<or, inlocuitorii

neasociativi put#nd indeparta cantitati mai mari de proteina.

Page 26: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 26/46

Influenta proprietatilor proteinelor

+sa cum s-a mentionat, interactiunile intre surfactanti si proteine pot conduce la

complecsi cu structura specifica, in special la concentratii mici de surfactant. Laconcentratii mai mari de surfactant, aceste efecte sunt mai putin pronuntate.

Studiile efectuate pe 8 proteine model(cDtocrom 7, albumina serica bovina, β-

lactoglobulina, lizozom si ovalbumina), cu acelasi tip de surfactant si aceeasi

suprafata au evidentiat faptul ca cantitatea de proteina indepartata este mai mica cu

c#t masa moleculara medie a materialului proteic este mai mare. Stabilitatea

conformationala a proteinei si cresterea temperaturii de denaturare are acelasi

efect. Se poate spune deci ca factorii care tin de stabilitatea structurala a proteinei

au o mare importanta si ca cresterea stabilitatii conduce la scaderea gradului de

indepartare.

Page 27: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 27/46

Influenta proprietatilor surfactantilor

Surfactantii pot interactiona fie cu proteina din solutie, fie cu suprafata sau cu

ambele(cel mai adesea). Se pot face urmatoarele observatii:in cazul suprafetelor

hidrofobe cantitatea de proteina indepartata este cu at#t mai mare cu c#t activitatea

fata de suprafata a surfactantului creste surfactantii neionici nu afecteaza cantitateade proteina adsorbita la suprafete hidrofile dar au un efect considerabil in cazul

suprafetelor hidrofobe lungimea catenei agentului tensioactiv influenteaza

concentratia surfactantului de la care incepe procesul de indepartare al proteinei de

asemenea, cu c#t lungimea partii hidrocarbonate este mai mica se inlocuieste mai

 putina proteina

gruparea terminala(hidrofila) influenteaza numai in cazul suprafetelor hidrofile.

Influenta proprietatilor suprafetelor

+dsorbtia si orientarea surfactantilor este dependenta de tipul de suprafata si,

natural, caracterul suprafetei va influenta modul in care sunt indepartate

 proteinele de catre surfactanti.S-a sugerat, fara a e!ista insa o aplicabilitate universala, faptul ca repulsiile

electrostatice intre surfactanti si suprafata sau interactiunile puternice(hidrofobe)

intre catena hidrocarbonata a surfactantului si suprafata pot favoriza elutia

 proteinei adsorbite.

9oate aceste observatii permit clasificarea efectelor surfactantilor asupra proteinelor in patru categorii:

Page 28: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 28/46

@) Inlocuirea proteinei de catre surfactant. +ceasta inseamna ca interactiunile dintre

surfactant si suprafata sunt mai puternice dec#t interactiunile dintre proteina sau

comple!ul surfactant-proteina si suprafata. +dsorbtia surfactantului la suprafata esteindispensabila, dar legarea surfactantului la proteina poate sa nu se produca.

7) Surfactantul poate adsorbi la suprafata si2sau la proteina dar nu are un efect net asupra

cantitatii de proteina adsorbita

*) proteina adsorbita este doar partial indepartata de surfactanti. lutabilitatea partiala a

 proteinelor indica prezenta unor stadii multiple de adsorbtie a proteinei.

+) ici o molecula de proteina nu

ramane adsorbita dupa adaos de

surfactant. In aceste conditii surfactantul

nu se adsoarbe la suprafata. 9otusi, el

interactioneaza cu proteina si formeaza

complecsi care se desorb de la suprafata

Page 29: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 29/46

ste important de notat faptul ca surfactantul poate indeparta proteina fara a se

lega la suprafata. +cest fenomen poate fi descris ca o solubilizare a

 proteinelor de catre surfactant.

!perimental, s-a aratat faptul ca prezenta de surfactanti in solutii de proteina pot

influenta cantitatea de proteina adsorbita la suprafete solide in trei moduridiferite:

 inlocuirea completa a adsorbtiei proteinei  reducerea cantitatii de proteina adsorbita fata de solutia de proteina simpla  cresterea cantitatii de proteina adsorbita.

In primul caz, completa indepartare a adsorbtiei poate fi datorata unuia dintremotivele:

- daca un comple! se formeaza cu un surfactant care nu prezinta atractie pentru

suprafata

- daca surfactantii adsorb, ca urmare a activitatii lor de suprafata si a difuzivitatii,

conduc#nd la prevenirea adsorbtiei ulterioare a proteinei sau a comple!ului

 proteina-surfactant.

In cele doua cazuri, formarea complecsilor in solutie poate conduce la cresterea

sau descresterea cantitatii de proteina adsorbita. $rezenta surfactantului

influenteaza cantitatea totala de proteina prin efecte sterice sau prin

interactiuni electrostatice intre complecsi, fata de proteina nativa. In plus,

comple!ul poate adsorbi sub diferite orientari fata de proteina pura.

Page 30: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 30/46

7a urmare a diferitelor forme ale izotermelor de adsorbtie a surfactantilor si

 proteinelor, a diferitelor tipuri de interactiuni, in amestecuri de proteine adsorbtia

va fi puternic dependenta de concentratia componentelor. 7aracterul special al

izotermelor de adsorbtie a surfactantilor si e!istenta concentratiei critice

micelare influenteaza adsorbtia proteinelor. +cest fapt si reversibilitatea cudilutia da interactiunilor surfactant-proteina importanta deosebita. 7a si in cazul

amestecurilor simple de proteina, si in prezenta surfactantilor se manifesta

efectul 4roman.

In general se poate concluziona ca surfactantii pot interactiona cuproteinele prin mecanism de solubilizare sau inlocuire in functie de

interactiunile surfactant-suprafata si legaturile surfactant-proteina.

Soluibilizarea conduce la formarea comple)ului intre proteina si surfactant

iar inlocuirea are loc ca urmare a adsorbtiei surfactantului la suprafata.

*roprietatile proteinei influenteaza gradul de elutabilitate diferentele intre

diferite situatii competiti$e si adaosul de surfactant dupa adsorbtia

proteinelor put+nd fi puse in e$identa prin compararea complecsilor

proteina-surfactant si perturbarea acestora in prezenta de alte proteine din

sistem fata de proteina pura. "iferentele intre difuzi$itatea surfactantilor si

a proteinelor afecteaza de asemenea modul de interactiune cu suprafata

componentelor.

Page 31: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 31/46

IN,'#C,IN'# BI/&#,'I#LLI C FLI"L S#N0IN

Notiuni introducti$e pri$ind functiile s+ngelui

S#ngele este un tesut lichid, eterogen, alcatuit din doua faze, una

 propriuzis lichida-plasma, care este o solutie apoasa de proteine si saruri minerale,

tamponata la pC'E.FB- si cealalta solida, corpusculara, reprezentata prin

eriltrocite, leucocite si trombocite, suspendate in partea lichida.

*ata fiind pozitia s#ngelui in ansamblul functional al sistemelor lichidedin organism- lichid interstitial, intracelular, intravascular- s#ngele are de

indeplinit c#teva roluri, care, in esenta se pot concentra in doua functii

fundamentale:

functia de transport

functia reglatoare homeostatica.

Page 32: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 32/46

Functia de transport

+ceasta consta in vehicularea, in dublu sens, intrare si iesire, a tuturor

substantelor necesare vietii celulare sau a celor rezultate din metabolismul

intermediar. *intre principalele substante transportate sunt in primul r#nd cele

legate de respiratie, o!igenul transportat de la plam#n la tesuturi si 73 in sensinvers. %iecare eritrocit contine 3Gmilioane molecule de hemoglobina, proteina

transportoare de o!igen. Urmeaza apoi substantele nutritive- aminoacizi, acizi

grasi, vitamine- provenite din tractul digestiv, precum si produsele finale ale

metabolismului intermediar( uree, acid uric) vehiculate pentru eliminare prin

rinichi, plam#n, pieele, intestin- precum si hormonii transferati de la glandeleendocrine catre tesuturi tinta. $roteinele plasmatice transportate pot lega

substante cu proprietati hidrofobe, dispun#nd de o suprafata functionala de

E00000m3.

$rin proteinele transportate si proteinele plasmatice de tipul

imunoglobulinelor si prin leucocitele sale, s#ngele ia parte la procesul de apararespecifica organismului. $rin proteinele anticorpi, limfocite, macrofage si

 plasmocite, sangele asigura desfasurarea proceselor imune fata de agenti

infectiosi- virusuri sau bacterii- sau proteine straine.

%unctia de transport are deci trei componente principale: respiratorie,

nutritiva si de aparare.

Page 33: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 33/46

Functia reglatoare omeostatica

Se realizeaza cu urmatoarele componente:

izotonie- pastrarea constanta a concentratiilor si raporturilor ionice ( cationi a H,  H,

7a3H, g3H anioni 7l-, C3$J-, C7F

-) si a echilibrului acido-bazic cu mentinerea

concentratiei ionilor de hidrogen la pC'E.FB

izotonie- mentinerea la nivel constant a presiunii osmotice a s#ngelui, proportionala

cu numarul de molecule de compusi nedisociati si cu numarul de ioni ai electrolitilor

care se gasesc in solutie, dintre care ionii de aH, 7l-, C7F-  raspund de GBK din

 presiunea osmotica totala. rice marire a presiunii osmotice intr-unul dintre sectoarelehidrice ( intramuscular, e!tracelular, intracelular) trebuie sa fie compensata, in conditii

fiziologice, prin modificari de volum hidric. Izotonia este corelata cu mentinerea

constanta a tebloului sanguin. *atorita continutului sau proteic, in special nivelul de

concentratie al albuminelor serice, s#ngele e!ercita o presiunee coloid-osmotica

datorita careia faza lichida este mentinuta in sistemul vasculat

izotermia- mentinerea constanta a tempereaturii corpului. Se realizeaza datorita fazei

lichide a s#ngelui. 7aldura specifica, foarte ridicata a apei, face posibila distribuirea in

intregul organism a caldurii ce s-ar putea produce prin reactiile e!oterme la nivelul

organelor metabolice e!trem de active, cum ar fi, de e!emplu, ficatul.

Page 34: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 34/46

'lementele s+ngelui

 !ritrocitele- formate din 80K apa si J0K substanta solida- se compune din:

componente minerale( H, aH, 7a3H)

componente organice hemoglobinicecomponente organice nehemoglobinice

enzime.

 "eucocitele- formate din:

granulocite ( neutrofile, eozinofile, bazofile)monocitul.

Trombocitele ( globulinele)

 #lasma: proteine lipide compusi anorganici enzime.

Page 35: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 35/46

*roteinele plasmatice

Sunt un amestec eterogen de aproape /00 componente cu proprietati

fizico-chimice si functii diferite. &reutatile moleculare variaza intre 80000 si

/F0000.%unctiile proteinelor plasmatice sunt:

- mentin volumul normal si prresiunea coloid-osmotica a s#ngelui, precum si

schimburile dintre capilare si tesuturi- albuminele sunt preponderent

raspunzatoare de aceasta functie

- transporta hormoni, metale, lipide, vitamine, pigmenti, coloranti, medicamente

 participa la procesele de aparare specifica si nespecifica a organismului prin:

imunoglobuline, properdina, transferina si la fenomenele de coagulare si

fibrinoliza

- participa la mentinerea echilibrului acido-bazic al s#ngelui, ca sistem tampon,

datorita caracterului lor amfoter

- influenteaza v#scozitatea si microcirculatia, contribuind la realizarea unui mediu protector pentru eritrocite, favoriz#ndu-le in acelasi timp mobilitatea

- reprezinta o rezerva proteica importanta in situatiile in care aportul proteic scade.

Page 36: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 36/46

elatia biomaterial- fluid sanguin

"elatia biomaterial- fluid sanguin urmareste, in primul r#nd, asigurarea

 biocompatibilitatii materialului cu functie de proteza sau implant.

7ontactul dintre fluidul sanguin si suprafata unui implant declanseaza in primul

r#nd adsorbtia superficiala a proteinelor serice, urmata de aderarea, deformarea sieliberarea plachetelor deci se produce coagularea s#ngelui.

Page 37: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 37/46

Fazele si factorii principali ai coagularii

In esenta, fenomenul de coagulare a s#ngelui consta in transformarea

fibrinogenului in fibrina. $articularitatile specifice procesului sunt:

- numarul mare de activatori si inhibitori care intervin

- e!istenta, ca precursori, a ma<oritatii factorilor coagularii

- preponderent, factorii coagularii sunt proteaze care rezulta in urma proteolizei

limitate din formele lor inactive

- transformarea factorilor coagularii din forme inactive in forme active se face prinautocataliza, determinata de propriile lor produse

- unii dintre factori, ca de e!emplu 7a3H au actiune multipla, intervenind aproape

in toti timpii coagularii

- procesul comple! se desfasoara in cascada. %aza de latenta este formata de o

avalansa de transformari accelerate ale factorilor coagularii, prin forme inactive siforme active.

Page 38: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 38/46

%ibrinogenul este o proteina cu forma moleculara alungita, una dintre cel mai

 putin solubila proteina a sistemului sanguine. +re o masa moleculara medie de

FF0000-FJ0000*a si un pCizoelectric de B.F. ste alcatuit din 8 lanturi peptidice, grupate c#te doua, perechile diferind intre ele prin aminoacidul -

terminal si anume: o pereche are tirozina ca aminoacid terminal, a doua are

acidul piroglutamic, iar a treia alanina.

+cest factor contine componente glucidice: he!oze, aminozaharuri, acid sialic,

o!idarea glucidelor fac#ndu-l inapt pentru fenomenul coagularii.%iziologic, transformarea fibrinogenului in fibrina se petrece in 3-F secunde sub

actiunea trombinei. 9ransformarea fibrinogenului in fibrina este un fenomen de

 proteoliza limitata, in cursul careia se formeaza doua lanturi polipeptidice

diferite: fibrinopeptidele + si @, conform reactiei:

%ibrinogen---  fibrina H fibrinopeptide + si @

Page 39: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 39/46

Transformare fibrinogenului in fibrina$olimerizarea monomerilor de fibrina se face pe doua directii:

- longitudinala- cu formarea fibrelor sau fibrilelor primare

- transversala- cu producerea fibrelor secundare de fibrina, datorita puntilor

de hidrogen ce se stabilesc intre tirozina si histidina dintre doua fibre

 primare.

Page 40: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 40/46

&ecanismul coagularii

s+ngelui

7oagularea s#ngelui se

desfasoara pe doua cai care se

deosebesc dupa originea tisulara

sau sanguinea a factorului de

declansare a procesului in

cascada.7alea e!trinsica, scurta, cu

durate de ordinul secundelor, are

doua etape importante: generarea

 protrombinazei si producerea

trombinei. 9rombina actioneazaasupra fibrinogenului

transform#ndu-l in fibrina.

%ibrina formata in aceasta faza

este foarte fragila.

Page 41: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 41/46

7alea intrinsica- pe aceasta cale, mai lenta, a carei durata este de ordinul

minutelor sunt int#lnite patru etape:

- generarea protrombinazei

- producerea trombinei

- transformarea fibrinogenului in fibrina si stabilizarea acesteia- sinereza si retractia cheagului.

In calea intrinsica sunt implicati numai factori sanguini. $rocesul este declansat

 prin activare afactorului II(factorul Cageman), ca urmare a fenomenului

de suprafata de hemosorbtie, pe care-l sufera acest factor de contact lanivelul leziunilor vasculare sau prin contact cu o suprafata straina. Legarea

factorului Cageman sau a 5ininogenului de masa moleculara mare la

suprafata unui biomaterial(si in special la suprafete incarcate negativ) face

mai usoara activarea acestuia.

%actorul Cageman si 5ininogenul de masa moleculara mare contin in catena

macromoleculara zone bogarte in aminoacidul histidina.

In aceste zone secventa de aminoacizi care se repeta este (&lD-Cis-) sau (Cis-

&lD-). +cest aminoacid cu p? /0, la valoarea de pC a fluidului sanguine

este incarcat pozitiv la .

Page 42: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 42/46

CH - CH2- C - N

HC CH

N

H

HN

OC

+H+ CH - CH

2- C - N

HC CH

N

HN

OC

H H

+

Monele incarcate pozitiv vor fi atrase de catre suprafata.

Page 43: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 43/46

+tractia si asocierea aminoacizilor cu grupele negative ale suprafetei determina

modificari conformationale ale factorului II, respective ale 5ininogenului. +stfel,

legatura peptidica din dreptul unor aminoacizi devine sensibila la actiuneahidrolitica a enzimelor. In cazul factorului Cageman, desfacrea legaturii peptidice

se realizeaza la nivelul aminoacizilor +rg FBF-4alFBJ.

C - CH - NH - C - CH - NH

CH2

CH

CH3

CH3

CH2

NH

C

NH NH2

..

OO

H - O -  Treonina

..

Serina - O - H

l i l i hid li i i f l

Page 44: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 44/46

%ragmentul proteic rezultat in urma hidrolizei reprezinta factorul Cageman

activat, proteina cu conformatie si incarcare electrica diferita de a compusului

macromolecular de plecare, si, implicit cu posibilitati de interactiune diferite cu

 proteinele plasmatice. Urmeaza o serie de pasi care conduc la formarea

 polimerului de fibrina, instabil, trecut in forma stabila sub actiunea factorului III.%ibrina devine insolubila prin constituirea unor punti disulfidice intre glicina

terminala a unui monomer si gruparea unui monomer vecin. Urmeaza apoi

sinereza cheagului prin e!pulzarea apei din ochiurile gelului, cu micsorarea

spatiilor dintre fibrile. "etractia cheagului se produce numai in prezenta

trombocitelor functional normale, care actioneaza prin intermediul factorului I plachetar. In punctele nodale ale retelei de fibrina plachetele functioneaza ca centri

mecanici.

S#ngele contine si factori inhibitori ai coagularii, care reduc viteza acestui

 proces. *in grupul antitrombinelor fac parte: fibrina, antitrombina I, heparina

sau antitrombina II si antitrombinele III, I4 si 4II. +nticoagulantele cu aplicareterapeutica mai folosite sunt heparina si antagonistii vitaminei .

C i i d i i i i hi l l d i d *

Page 45: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 45/46

Ceparina are ca unitate de repetitie cantitati echimoleculare de resturi de *-

glucozamina si acid *-glucuronic. 7ontinutul de sulfat variaza intre B si 8,B

resturi de sulfat de tetrazaharida. +re caracter acid, fiind puternic sulfatata.

Ceparina inhiba direct at#t activitatea factorului , cat si actiunea enzimatica atrombinei de<a formate. +ctiunea sa depinde de gradul de sulfatare.

Fibrinoliza

%ibrinoliza este ultima faza a hemostazei, ce are ca efect eliminarea

fragmentelor de cheag si a depozitelor de fibrina. Se realizeaza prin mecanismenzimatic fiind catalizata de plasmina sau fibrinolizina. +ceasta scindeaza

fibrina in fragmente polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele

coerente. $lasminogenul poate fi activat in sistem intra si e!travascular.

+ctivatorii se gasesc in s#nge si in toate fluidele biologice ale organismului.

Page 46: Curs2-Inginerie citotisulara

7/23/2019 Curs2-Inginerie citotisulara

http://slidepdf.com/reader/full/curs2-inginerie-citotisulara 46/46

Schema fibrinolizei

$rodusele secundare ale fibrinolizei inhiba formare trombinei si polimerizarea

monomerilor de fibrina. $lasminogenul poate fi inhibat sau activat. Strepto5inaza,

 proteina streptococcia neenzimatica formeaza cu plasminogenul un comple!, prin

interactiuni hidrofobe, care transforma moleculele de plasminogen in plasmina. In

urina se gaseste uro5inaza, activator al plasminogenului care provine din s#nge sau

tesuturi.

7a inhibitori ai procesului pot fi mentionate proteinele cu o activitate