CAP. I Introducere n lumea viului

1.1. Structura celular- unitatea de baz a viului

Marea diversitate a formelor de via de pe pmnt presupune totui multe trsturi comune. n mod fundamental toate organismele vii au anumite caracteristici care le difereniaz de lucrurile nevii. Merit evideniate dou:

- organismele vii au abilitatea de a se reproduce;

- organismele vii au abilitatea de a-i extrage energia necesar din mediul n care triesc.

Toate organismele vii utilizeaz acelai principiu organizaional de baz i anume constituirea din uniti de mici dimensiuni. Fiecare unitate de via, care servete ca baz fundamental a viului, este o entitate n sine i poart numele de celul. n forma cea mai simpl, organizarea unei celule const dintr-un nveli exterior numit membran celular ce nconjoar un mediu intern denumit citoplasm. n interiorul celulelor au loc toate reaciile chimice care servesc procurrii energiei din mediul nconjurtor, ca i procesele care asigur creterea organismului, micarea, reproducerea sau alte funcii. Cum biotehnologiile se bazeaz n mod fundamental pe procesele ce au loc in nteriorul celulelor este necesar ca structura i organizarea celular sa fie elemente bine cunoscute.

1.1.1. Organizarea celulelor

Sunt astzi cunoscute foarte multe tipuri de organisme constituite din diferite tipuri de celule, dar n ceea ce privete structura celular de baz sunt cunoscute doar dou tipuri diferite de celule:

- procariote (fig.1);

- eucariote (fig. 2).

Singurele organisme ce conin celule procariote sunt bacteriile, organisme unicelulare rspndite n mediile cele mai diferite. Toate celelalte organisme chiar i cele unicelulare, cum sunt levurile sau algele sunt eucariote. Diferena esenial ntre cele dou tipuri de celule, procariote i eucariote, este modul diferit de organizare interioar.

Fiecare din cele dou tipuri de celule are la exterior o membran, care ndeplinete diferite roluri, unul din cele mai importante fiind de barier selectiv ntre interior i mediul exterior. Celulele procariote au un singur compartiment intern citoplasm spre deosebire de cele eucariote care prezint mai multe compartimente, fiecare dintre acestea fiind delimitat de o membran proprie.

Stocarea informaiilor genetice se face la celulele procariote ntr-o regiune a citoplasmei denumit nucleoid, spre deosebire de cele eucariote care prezint un nucleu bine individualizat de ctre o membran nuclear.

Fig. 1. Celula procariot. Se observ inexistena compartimentrilor interne iar AND-ul ocup o regiune a citoplasmei denumit nucleoid.

Fig. 2. Celula eucariot (celul vegetal tipic)

Celulele eucariote i cele procariote se deosebesc i prin dimensiunile acestora, primele fiind cu mult mai mari, avnd diametre de pn la zece ori mai mari ca cele din urm. De asemenea, celulele eucariote se dezvolt mai ncet, se reproduc cu o frecven mult mai mic fa de cele procariote i au funcii specifice cum ar fi transportul oxigenului, transmiterea impulsurilor nervoase i multe altele. Datorit acestor funcii specifice celulele sunt organizate n organismele vii, n uniti funcionale denumite esuturi.

1.2. Biomolecule

Moleculele reprezint din punct de vedere chimic entiti care n condiii normale nu pot fi divizate n uniti cu dimensiuni inferioare meninnd caracteristicile originale. Moleculele care intr n componena celulelor sunt denumite de literatur biomolecule, iar n prezent datorit studiilor de biochimie, structura i proprietile compuilor moleculari ce intr n componena organismelor vii sunt bine cunoscute. nainte de a detalia trebuie precizat ca biomoleculele au i caracteristici comune dintre care merit reinut structura polimeric (fig.3) preponderent liniar.

Fig. 3. Polimeri biologici (ansamblu format din unitati individuale denumite monomeri)

1.2.1. Lipide

Lipidele, numite i grsimi, constituie rezerva de energie cea mai concentrat a organismelor vegetale i animale. Prezente n toate celulele (n concentraii variabile n limite largi) ele intervin n reglarea permeabilitii membranelor celulare, n absorbia i transportul vitaminelor liposolubile, unii acizi grasi avnd chiar aciune vitaminica (vitamine F).

Lipidele formeaz o clas heterogen de substane, caracterizate n primul rnd prin anumite proprieti comune: insolubilitate n ap, solubilitate n solveni organici (cloroform, tetraclorur de carbon, eter etilic, etc.).

Grsimile propriu-zise se clasific n simple i complexe. Grsimile simple sunt substane ternare (C, H, O), esteri ai acizilor grai cu alcooli neazotati (glicerol, alcooli monovalenti superiori etc.). Alcoolul este un alcool monooxidrilat superior n cazul cerurilor; glicerol n cazul gliceridelor (grsimilor neutre); un acid gras hidroxilat n cazul etolidelor i un sterol la steride. n grsimile complexe un ester de acid gras este combinat cu alte substane care conin grupri funcionale variate. Ele sunt substane cvaternare sau mai complexe i conin C, H, O, P, sau C, H, O, P, N etc. Lipidele propriu-zise se pot scinda n componente prin hidroliz: ele sunt saponificabile. Sunt nesaponificabile substanele clasificate n clasa lipide numai pe baza proprietilor lor fizice: sterolii, lipocromii, etc. Lipidele complexe i cele nesaponificabile se mai numesc i lipoide.

1.2.2. Protide

Protidele sunt componente structurale i funcionale de insemnatate primordial ale materiei vii. Stiinta modern a confirmat pe deplin teza lui Engels, care caracterizeaz substanele proteice ca purttoare ale vieii, iar metabolismul ca funciunea lor esential, din care decurg toate celelalte caractere generale ale materiei vii.

n compoziia elementar a protidelor sunt nelipsite elementele chimice: C, O, H, N i (cu puine excepii) S, coninute ntre urmtoarele limite procentuale: C= 50,6-54,5 %; O = 21,5-23,5 % ; H = 6,5-7,3 %; N = 15,0-17,6 %; S = 0,32-2,5 %. n protide au mai fost identificate P i elemente minerale, ca: Fe, Cu, Zn, Co, Mg.

Protidele se gsesc n proporie mult mai mare n celulele animale dect n cele vegetale. Protidele constituie 45% din masa uscat a corpului omenesc i numai 1,6% din boabele de orez.

Protidele sunt produi macromoleculari avnd ca elemente structurale fundamentale aminoacizii. n grupa protidelor intr aminoacizii (monopeptide) precum i toi compuii chimici care prin hidroliz elibereaz aminoacizi (peptide i proteide). Proteidele se mpart in holoproteide (sau proteine) i heteroproteide (dac alturi de aminoacizi mai conin i componente de alt natur).

Rolul fiziologic al protidelor este foarte variat i important. n mod concret:

sunt cele mai importante constituente plastice ale materiei vii;

contribuie cu 16 % la acoperirea necesarului energetic al organismului;

extrem de important este rolul lor biocatalitic; ele constituie molecula proteohormonilor si proteoenzimelor i o serie de factori regulatori sau stimulatori ai proceselor metabolice;

formeaz sisteme tampon foarte sensibile i eficace;

au rol de anticorpi n reaciile imunologice;

prin presiunea lor osmotic-oncotic, contribuie la meninerea echilibrului hidric al organismului;

au rol de coloizi protectori, stabiliznd suspensiile i emulsiile substanelor greu solubile;

proteinele plasmatice (n special globulinele) au rol n transportul substanelor cu curentul sangvin;

prin modificrile lor fizico-chimice intervin n exercitarea unor importante funciuni fiziologice: contracia muscular, transportul de oxigen,etc.;

nucleoproteidele au rol important n autoreproducerea materiei vii.

1.2.3. Acizi nucleici

La fel ca protidele, acizii nucleici sunt componente de nsemntate fundamental ale materiei vii. Prezeni n toate celulele vii (animale, vegetale, bacteriene) i n toate virusurile, aceti compui au rol hotrtor n momentele eseniale ale autoreproducerii materiei vii: pstrarea, transmiterea la descendeni i exprimarea caracterelor ereditare. Cercetrile efectuate asupra acestor compui au relevat c cele dou tipuri distincte de acizi nucleici acizi ribonucleici (ARN) i acizi dezoxiribonucleici (ADN) sunt prezeni n orice celul vie: ADN preferenial (dar nu exclusiv) n nucleu (i n cloroplastele plantelor), ARN masiv n citoplasm (dar i n nucleu).

Funcia esential a ADN cromozomial este dirijarea genetic a biosintezei proteinelor n citoplasma celulei. Dar aceasta, nu o fac direct, ci conlucrnd cu cele trei tipuri de ARN. Informaia ereditar este transmis de un ARN mesager de la ADN la organele proteosintezei: ribozomii citoplasmatici, la care aminoacizii proteoformatori sunt adui de nite ARN transportori. Constituienii nelipsii ai ribozomilor sunt acizii ribonucleici ribozomali.

Componente structurale ale acizilor nucleici. Prin hidroliz, acizii nucleici sunt descompui n nucleotide. Fiecare nucleotid este constituit dintr-o baz azotat, o pentoz (alctuind mpreun un nucleozid) i o molecul de acid fosforic.Bazele azotate pot fi pirimidinice sau purinice. n afar de cele cinci baze principale, componente normale ale tuturor acizilor nucleici, se cunosc i numeroase baze minore prezente ca elemente structurale rare n molecula unora dintre ei. Caracterul bazic manifestat n soluie apoas de aceste substane, este consecin a faptului, c ele conin n molecul atomi de azot cu electroni neparticipani. Dintre bazele azotate principale, citozina, adenina i guanina fac parte din constituia tuturor acizilor nucleici. Uracilul se gsete numai n ARN, iar timina numai n ADN.

Pentoze. Constituente normale ale acizilor nucleici sunt D-riboza (n ARN) i 2-D-dezoxiriboza (n ADN). n mod excepional din hidrolizate au fost izolate i alte pentoze sau substane nrudite cu acestea.

Structura acizilor nucleici. Acizii nucleici sunt polimeri ai nucleotidelor. Indiferent de tipul de care aparin (ARN sau ADN), molecula lor este constituit din lungi lanuri polinucleotidice. n aceste lanuri, resturile de acid fosforic formeaz legaturi diesterice cu cte dou molecule de pentoz la atomul de carbon 3 din una si 5 din cealalt. Astfel iau natere catene lungi n care resturile de acid fosforic alterneaz cu resturile pentozice. Acest schelet este comun tuturor acizilor nucleici, cu deosebirea, c n acizii ribonucleici (ARN) pentoza este riboza, iar n cei dezoxiribonucleici (ADN) dezoxiriboza.

Ceea ce diferentiaz de la caz la caz structura primar a acizilor nucleici este succesiunea bazelor din nucleotide. Acestea formeaz aa ziii radicali laterali ai lanului polinucleotidic (fig.4).

Fig.4. Constituia acidului dezoxiribonucleic. Structura parial a helixului dublu, dupa Watson i Crick.

1.3.4. Glucide

Glucidele (numite i zaharide sau, cu un termen impropriu, hidrai de carbon) constituie combustibilul principal i substanele de rezerv cele mai uor disponibile ale celulelor. n plus, multe dintre ele sunt constituente ale substanelor plastice cu rol de susinere i de protecie la vegetale i la nevertebrate, respectiv componente ale unor biocatalizatori importani. Sunt substane ternare, formate din C, H, O; unele dintre ele aminozaharurile conin i azot.

Glucidele se clasific n oze i ozide (fig.5). Ozele se numesc i monoglucide, monozaharide sau zaharuri simple. Se mpart n aldoze i cetoze. n funcie de numrul atomilor de carbon din scheletul moleculei (n general neramificat) se disting: bioze (C2), trioze (C3), tetroze (C4), pentoze (C5), hexoze (C6) etc. pn la (C10). Ozidele sunt produi de condensare ai monoglucidelor. Holozidele au molecula constituit numai din resturi monoglucidice, iar heterozidele (glicozidele) sunt compui ai glucidelor cu ali constituieni numii agliconi. La rndul lor holozidele se mpart n:

- oligoglucide (oligozaharide), avnd molecula constituit din dou pn la ase resturi monoglucidice condensate;

- poliglucide (polizaharide), avnd molecula format dintr-un numr mare de molecule monoglucidice condensate, identice sau diferite.

Fig. 5. Schema de clasificare a glucidelor.Glucidele prezente n compoziia bacteriilor reprezint 4-25% din masa bacteriilor uscate i pot aprea ca zaharuri simple (mono i dizaharide) i polizaharide (pentoze, hexoze). Bacteriile nu conin celuloz. Unele, cum ar fi cele din specia Acetobacter xylinum formeaz la suprafaa mediului de cultur celuloza bacterian sub form de microfibrile cu aspect de psl. n celulele de drojdii (sau levuri) glucidele au rol structural (ex. glucozamina, chitina, mananul i glucanul din peretele celular) i intr n constituia unor molecule eseniale ca ADN (dezoxiriboza) i ARN (riboza) sau sunt depozitate ca substane de rezerv (glicogen). Din grupa homopoliglucidelor, dextranii sunt sintetizai n cantiti mari (sub forma de filamente) de ctre microorganismul Leuconostoc mesenteroides i ali microbi nrudii, din glucoz sau chiar din zaharoz. Dextranii sunt polizaharide puternic dextrogire, cu mas molecular foarte variabil. n constituia lor predomin legturile 1,6-(-glicozidice, greu accesibile enzimelor de origine animal. Pentru acest fapt, dextranii, care n concentraii mai mici de 10% dau soluii apoase perfect transparente, se folosesc la nlocuirea proteinelor plasmatice n serul fiziologic administrat bolnavilor cu hemoragii.

Din grupa heteropoliglucidelor menionm galactanii care iau natere din galactoz, prin policondensare. Varietile de agar-agar, extrase din algele roii ale Mrilor Indiei i Chinei au molecula format n cea mai mare parte din catene lungi de D-galactopiranoza, legate 1,3-glicozidic. Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultur microbiene. Se folosete i ca laxativ i n industria textil.1.4. Legturi chimice implicate n structurile biomoleculare

Legturile chimice confer biomoleculelor stabilitatea stucturii acestora, determinnd n acelai timp interaciunile inter-moleculare. n marea lor majoritate biomoleculele au n componen atomi de carbon, oxigen, hidrogen, azot, sulf i fosfor a cror proprieti chimice particulare sunt binecunoscute. Acesia pot reaciona n moduri diferite rezultnd uneori forme stabile de interaciune numite legturi. Aceste legturi sunt de mai multe tipuri dar pentru sistemele biologice prezint importan doar trei: legatura ionic, legatura covalent i legatura de hidrogen.

Legatura ionic apare ntre un atom ce are capacitatea de a ceda cu usurin electroni i un altul ce poate accepta aceti electroni. Se produce astfel un transfer de electroni de la elementul puternic electronegativ, cu potenial de ionizare sczut, la elementul puternic electropozitiv, cu afinitate ridicat pentru electroni. Ionii astfel formai nu rmn izolati ci se atrag electrostatic ntre ei, pn la o distan minim permis de repulsiile ntre nveliurile lor electronice. Nu se poate vorbi n cazul combinaiilor ionice, de molecule, ci de reele ionice. Astfel, n reteaua cristalin a clorurii de sodiu fiecare ion atrage i coordineaz n jurul sau la distan minim 6 ioni de semn contrar.

Formarea combinaiilor ionice respect regulile stabilite empiric de ctre K. Fajans (1924). Un atom trece n stare ionic cu att mai uor, cu ct:

configuraia electronic realizat este mai stabil;

sarcina ionului este mai mic;

raza atomic este mai mare pentru cation i mai mic pentru anion.

Se cunoate c o legatur chimic pentru a fi stabil, trebuie s se formeze cu degajare de energie. Cu ct energia degajata la formarea legturii din atomi liberi este mai mare cu att combinaia rezultat este mai stabil. Toate combinaiile ionice cunoscute sunt combinaii exoterme. Ele nu formeaz molecule propriu-zise, deoarece cmpul electric al ionilor este uniform distribuit n toate direciile. Fiecare ion poate de aceea atrage ioni de semn opus din orice direcie sau altfel spus, legatura ionic (spre deosebire de cea covalent), nu este dirijat. Legatura ionic nefiind dirijat n spaiu i nici rigid permite dizolvarea combinaiei ionice n solveni polari (ex. apa), precum i substituirea uoar a ionilor din reea cu ali ioni.

Tria legturilor ionice trebuie considerat n contextul n care acestea se formeaz. Pentru sistemele biologice (la care practic toate componentele se gsesc imersate n ap) legatura ionic poate fi caracterizat ca o legatur relativ slab ce se formeaz ntre atomi ce pot, cu uurin, purta sarcini electrice.

Legatura covalent se realizeaz prin punerea n comun a electronilor nemperecheai ai atomilor i conduce la formarea de molecule (agregate de atomi unii prin covalente) sau reele atomice.

Covalenta, spre deosebire de legatura ionic, fiind dirijat n spatiu, atomii unei molecule ocupa poziii fixe unii fa de ceilali. Aceste poziii nu se pot schimba nici chiar prin modificarea strii de agregare, lungimea legturii i unghiurile de valen fiind caracteristice moleculelor.

n funcie de natura atomilor care particip la formarea legturii moleculei, se deosebesc dou tipuri de covalente:

covalenta nepolar stabilit ntre atomi de acelai fel i caracterizat prin apartenena perechii de electroni de legtura n mod egal la cei doi atomi legai, de exemplu formarea moleculei de hidrogen sau de clor;

covalenta polar stabilit ntre dou specii diferite de atomi, caracterizat prin deplasarea de electroni de legtura, ctre elementul cel mai electronegativ. Astfel, apar sarcini electrice pariale, negativ la atomul mai electronegativ i pozitiv la atomul mai puin electronegativ.

Covalenta polar joac un rol foarte important n stabilirea modelului sau a formelor structurale ale moleculelor biologice i chiar a funcionrii acestora. Cei mai muli aminoacizi, de exemplu, prezint catene laterale formate cu legturi polare.

n concluzie, legatura covalent are dou caracteristici eseniale care o deosebesc de alte tipuri de legturi i anume: rigiditatea i dirijarea ei n spaiul din jurul atomului.

Rigiditatea este caracteristica covalentei de a se menine neschimbat n orice condiii de existen a moleculei respective. Desfacerea covalentei duce la transformarea chimic a substanei, n timp ce desfacerea legturii ionice, de exemplu solubilizarea substanei n ap, nu duce la transformarea chimic a acesteia.

Legatura de hidrogen este un tip de legatur intermolecular care se realizeaz ntre protonii unei molecule i un atom puternic electronegativ (F, O, N, Cl, etc.) dintr-o molecul vecina, rezultnd asociaii moleculare, care pot exista n special n stare lichid i solid. Aceast asociere prin legturi de hidrogen determin o cretere a masei moleculare i deci influeneaz unele proprieti ca vscozitate, solubilitate, temperatur de fierbere i de topire, tensiune superficial, etc. Cele mai bune exemple de legturi de hidrogen intermoleculare ne sunt oferite de asociaiile moleculare ale apei n stare lichid (fig. 6) sau de ghea (H2O)n i ale acidului fluorhidric n toate strile de agregare.

Fig. 6 Legturi de hidrogen n ap. (a) Forma i polaritatea unei molecule de ap. (b) Legturi de hidrogen ntre molecule de ap. (c) Cristal de NaCl solvit n ap moleculele polare de ap nconjoara fiecare ion protejnd sarcina electric.

Exemplul din fig. 6 (c) este foarte sugestiv pentru interaciunile ce au loc ntre biomoleculele din compoziia celulelor i mediul apos n care acestea exist. Toate biomoleculele sunt practic dizolvate n ap. Un strat foarte subire de ap nconjoar fiecare biomolecul ngreunnd uneori interaciunile posibile ntre acestea.

Legturile de hidrogen sunt foarte slabe n comparaie cu legturile covalente dar chiar n aceste condiii ele sunt instrumente foarte importante care asigur meninerea unor structuri i implicit a unor funcii normale.

Fore hidrofobe. Natura interaciunilor hidrofobe poate fi uor neleas urmrind urmtorul exemplu: adugnd o molecul nepolar cum ar fi molecula unei lipide n ap, acestea din urm i modific interaciunile normale (puni de hidrogen) pentru a ngloba n sistem molecula hidrofob. Dac n acelai mediu se adaug din ce n ce mai multe molecule hidrofobe, acestea au tendina de coeziune nu datorit unei atracii ntre ele ci pentru ca astfel, puterea de dezbinare a apei este mult mai mic. Coeziunea este asigurat de fore hidrofobe, care de altfel sunt rspunzatoare i de formarea membranelor n interiorul celulelor.

Prezena fortelor hidrofobe poate fi evideniat i la alte biomolecule ca de exemplu la proteine. Este cunoscut faptul c proteinele sunt constituite din lanuri de aminoacizi n vecintatea crora se pot gsi numeroase grupri hidrofobe. Aflate ntr-un mediu apos, acestea au tendina de a se aglomera. De multe ori, lanurile proteice se pliaz nglobnd n centrul acestui edificiu gruprile hidrofobe. Pentru o mare parte din proteine, cunoscute sub denumirea de proteine globulare, lanul polipeptidic lung este fragmentat prin cotituri de 1800 n segmente paralele, dispuse pe suprafaa lateral a unui cilindru. De gruprile polare libere NH2 , -COOH ale acestora se leag peptidic segmente liniare. Structura este stabilizat prin legturi de hidrogen ntre segmentele nvecinate (fig. 7).

1.5. Reacii i procese specifice organismelor vii1.5.1. Reacii de oxido-reducere. Stocarea energiei suplimentare

Prin oxido-reducere biologic se nelege pierderea atomilor de hidrogen (respectiv a electronilor) din molecula unei substane care acioneaz ca donor de H sau electroni (D) i transferul lor la molecula unei alte substane care funcioneaz ca acceptor (A). Aceste reacii de oxido-reducere au un caracter reversibil i pot fi exprimate prin ecuaia general:

DH2 + A D + AH2 Din ecuaie rezult c oxidarea, care se realizeaz prin captarea a 2 H, este n fond o dehidrogenare. Procesul nu se realizeaz spontan, ci prin intervenia unor catalizatori specifici dehidrazele; reacia invers este cea de hidrogenare.

Procesele de oxidare sunt generatoare de energie. Pentru a obine energia necesar, celulele recurg la oxidarea substratelor ce conin atomi de carbon, cel mai adesea a zaharurilor(de la formele simple cum este glucoza pn la celuloz, amidon, etc.).

Deoarece oxidarea biologic elibereaz n final o mare cantitate de energie, folosirea acestui mecanism n condiii optime se poate asigura prin eliberarea sub form fracionat a energiei sau prin stocarea excesului de energie n vederea utilizrii ulterioare.

Eliberarea sub form fracionat a energiei este posibil ca urmare a faptului c reaciile de oxido-reducere au loc succesiv, sunt catalizate de enzime specifice iar atomii de hidrogen sunt transportai la substratul acceptor, pe calea unui ntreg lan de reacii cuplate. Aceste reacii asigur pe lng degradarea fracionat i ordonat a substanelor organice nutritive i folosirea energiei eliberate prin oxidare pentru biosintez.

Stocarea energiei suplimentare.

Energia suplimentar, eliberat din reaciile de oxido-reducere nu se pierde, ci este depozitat ntr-un produs special, din care, la nevoie, poate fi eliberat cu usurin. Acest produs este acidul adenozin trifosforic (ATP).

Compusul deriv din dou fosforilari consecutive, de la acidul adenozin monofosforic (AMP). Dac n molecula de AMP se introduce prin oxidare o molecul de fosfat anorganic (Pi), aceasta se leag de gruparea fosfat a AMP printr-o legtur macroergic i astfel rezult primul compus macroergic acidul adenozin difosforic (ADP(), care, la rndul su se poate transforma printr-o nou fosforilare oxidativ n cel de al doilea compus macroergic acidul adenozin trifosforic (ATP((). Acesta din urm posed dou legturi ( si, ca atare, nmagazineaz o i mai mare cantitate de energie. Att ATP ct i ADP pot ceda cu uurin fosforul i n acest caz, legtura macroergic ( se rupe, iar energia sa latent devine accesibil consumului pentru diferite nevoi ale celulei. Utilizarea radicalilor fosforici puternic energetici reprezint o modalitate de obinere a energiei necesare reaciilor de biosintez. ADP i ATP constituie deci inelul de legatur dintre reaciile oxidative productoare de energie i cele de sinteza care necesit energie (fig. 8).

AMP + Pi ADP

ADP ATP

Fosforilare oxidativ

Oxidri +P Sinteze care consum energie

Eliberri de energie ADP ATP Consum de P

Furnizare de P -P

Fig. 8. Rolul APT n reaciile de oxido reducere

Microorganismele chimiosintetizante i obin energia necesar producerii ATP din reaciile de oxido-reducere productoare de energie, care au loc n timpul procesului de respiraie.

n procesele metabolice de tipul fermentaiei, n care diferii compui servesc n acelai timp ca donor i ca acceptor de H n reaciile de oxido-reducere productoare de energie, mecanismul obinuit de formare a ATP este cunoscut sub denumirea de fosforilare la nivelul substratului. Are loc adiia prin aciunea enzimatic a P la o substan n curs de oxidare, cu producerea unei legturi ( n produsul oxidat. n etapa urmtoare grupul P este transferat la ADP cu formare de ATP.

Unele bacterii pot produce ATP pe seama ADP prin intervenia acetil-CoA, dup reacia:

CH3-CO-CoA + ADP + H3PO4 = CH3COOH + CoA + ATP

1.5.2. Cataliza enzimatic. Echipamentul enzimatic.

Pentru ca doi atomi sau orice ali compui s reacioneze trebuie s ndeplineasc mai nti o condiie de proximitate adic sa se gseasc la o distan suficient de mic i ntr-o poziie convenabil reaciei. Energia de activare reprezint cantitatea de energie necesar pentru a fi ndeplinite aceste condiii particulare.

Accelerarea vitezei unui proces sau reacie determinat de un catalizator, de obicei prezent n cantiti mici i care nu intervine n mersul reaciei poart numele de cataliz. Un catalizator permite reaciei s aib loc mult mai eficient micornd energia de activare (fig. 9).

Fig. 9. Energia de activare.(b) Catalizatorul care micoreaz energia de activare.

Catalizatorii proceselor biologice sunt denumii enzime. Acei compui catalizeaz orice reacie chimic ce are loc n interiorul celulelor i sunt caracterizai prin specificitatea lor fa de substrat i prin comportarea lor ca acceleratori ai unor reacii care implic formarea sau scindarea de legturi covalente.

Din acest punct de vedere enzimele pot fi:

1. oxidoreductaze

A- + B A + B-2. transferaze

A-B + C A + B-C

3. hidrolaze

A-B + H2O A-H + B-OH

4. liaze catalizeaz separarea unei grupe pentru a forma o legtura dubl sau adiia unei grupe la legatura dubl.

A B A = B + X - Y

X Y

5. izomeraze

Y X

A B A B

X Y

6. ligaze (sintaze)

A + B A B

Multe dintre enzime necesit, pentru a-i desfaura activitatea, o serie de molecule mici, numite cofactori. Cofactorii pot fi ioni anorganici simpli, cum ar fi Mg 2+ sau molecule organice complexe, cunoscute sub denumirea de coenzime. Cofactorul se leag strns la o poziie special de pe molecula enzimei. O enzim la care lipsete cofactorul esenial se numeste apoenzim, iar enzima intact, cu cofactorul legat este desemnat ca holoenzim. Dup reacie, enzima se elibereaz de substrat pentru a se adsorbi pe o nou molecul de substrat (enzima poate cataliza circa 106 reacii pe minut).

n funcie de raportul lor cu celula n care s-au format, enzimele bacteriene se mpart n dou categorii:

enzime extracelulare (exoenzime), n general hidrolaze care de obicei sunt eliberate n mediu;

enzime intracelulare (endoenzime), care rmn n celul. La rndul lor acestea se clasific n enzime solubile, localizate la nivelul structurilor de suprafa, de unde sunt eliberate uor, n urma distrugerii celulei cu ultrasunete sau materiale abrazive i enzime particulate, legate de constituienii imobili ai celulei, care rmn legate de resturile celulare dup dezintegrarea celulei.

Capacitatea celulei bacteriene de a-i elabora constituienii echipamentului enzimatic este determinat genetic. Ca urmare, numrul tipurilor de enzime pe care le poate sintetiza o bacterie este limitat de numrul determinanilor genetici inclui n genomul su, care ar fi, n medie, de aproximativ 2000. Dimensiunile mici ale celulei bacteriene limiteaz, la rndul lor, numrul total al moleculelor de enzim.

Pentru realizarea adecvat a metabolismului su, celula bacterian dispune de mecanisme de reglare, care ajusteaz n fiecare moment setul de enzime n activitate ca i cantitatea relativ din fiecare enzim, n raport cu nevoile celulei i ca rspuns la variaiile mediului extern.

1.5. 3. Reacii de anabolism i catabolism

Totalitatea reaciilor biochimice implicate n activitatea biologic a celulei bacteriene, prin intermediul crora energia i elementele biogene, ca atare sau sub forma de combinaii mai mult sau mai puin complexe, sunt preluate din mediu i utilizate att pentru biosinteza i cretere, ct i pentru alte diferite activiti biologice secundare poart numele de metabolism. Graie acestor reacii, substanele din mediu sunt transformate n constituieni celulari, energie i produi de uzur.

Reaciile metabolice sunt de dou tipuri:

reacii prin care se elibereaz energie (exergonice), care corespund catabolismului sau proceselor de dezasimilaie, prin care se elibereaz energie n urma degradrii enzimatice a unor substane nutritive din mediu;

reacii prin care se consum energie (endergonice), care corespund anabolismului, sau proceselor de asimilare, n care energia este folosit pentru sinteza constituienilor celulari.

Reaciile metabolismului (fig. 10) sunt interconectate i ndeplinesc urmtoarele funcii pentru viaa celulei:

producerea subunitilor folosite pentru construcia constituienilor celulari;

eliberarea de energie i stocarea acesteia sub forma de ATP;

formarea constituienilor celulari macromoleculari (proteine, acizi nucleici, unele polizaharide) prin polimerizarea monomerilor.

Una dintre caracteristicile distinctive ale activitilor metabolice la microorganisme este intensitatea lor excepional comparativ cu a activitilor omoloage ale organismelor superioare (ex. activitatea respiratorie a unui gram raportat la masa uscat - de bacterii aerobe este de cteva sute de ori mai intens dect cea a omului).

Intensitatea activitii biologice poate fi explicat prin suprafaa mare a celulelor microbiene n raport cu masa lor, fapt care se reflect n suprafaa de contact cu mediul nconjurtor.

CAP. II Etapele elaborrii unui proces biotehnologic

Caracteristica fundamental a unui proces biotehnologic este obinerea unui produs sau anumitor produse necesare omului prin cultivarea microorganismelor dotate genetic natural s elaboreze aceste produse.

Procesele biotehnologice sunt bazate pe fenomenul de sinergism sau antogonism al diferitelor specii de microorganisme, ceea ce determin caracteristica fundamental a procesului ce poate fi realizat n condiii septice (cnd exist simbioza) sau aseptice (cnd predomin antibioza).

n general microorganismele elaboreaz substane ce le asigur condiii de via; aceasta nseamn c elaboreaz enzime ce distrug alte specii de microorganisme din mediu, oferindu-le calea de supraveuire.

La elaborarea unui proces biotehnologic trebuie parcurse urmtoarele etape:

izolarea tulpinilor de microorganisme;

selecia microorganismelor cu maxim de eficien;

cultivarea microorganismelor pe un mediu adecvat;

izolarea produsului de biosintez;

stabilirea spectrului de utilizare a produsului obinut, a structurii i eventual a materialelor de sintez n scopul comparrii rentabilitii.

2.1. Tipuri de microorganisme utilizate n biotehnologii

Din punct de vedere chimic, microorganismele sunt foarte asemntoare celulelor animale superioare i ele pot fi gazda multor reacii biochimice de acelai fel. n general, microorganismele exist ca celule individuale sau cel mult colonii multicelulare relativ nespecializate, neavnd capacitatea s regleze temperatura celular. Microorganismele pot fi mprite n: protozoare, alge microscopice, bacterii, mucegaiuri, levuri, actinomicete, virusuri i bacteriofagi.

Pentru industria biochimic i alimentar, prezint importan bateriile, levurile i fungii, inclusiv mucegaiurile i actinomicetele (Oniscu, 1978). Pentru procesele biotehnologice din protecia mediului se utilizeaz tipurile de microorganisme enumerate mai sus la care se adaug algele i protozoarele.

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare sporulate sau nespolurate i care se inmulesc prin diviziune direct. Structura intern a celulei bacteriene, compoziia chimic (tabel 3) i metabolismul bacterian sunt noiuni relativ bine cunoscute i redate suficient de amplu de literatur (Popa si colab. 2001). Metabolismul bacterian este ns condiionat de prezena n mediul de cultur a tuturor substanelor (organice sau anorganice) necesare (att cantitativ, ct i calitativ) speciei date pentru sinteza constituienilor celulari i pentru obinerea de energie. Aceasta impune prezenta n mediul de cultur a unor surse de C, H, O, N, P, S i n cantiti mici surse de K, Mg, Mn, Ca, Fe, Cl, sulfai, fosfai i concentraii infime de oligoelemente (Zn, Cu, Mo) care sunt indispensabile pentru activitatea catalitic a enzimelor.

Peretele celular, prin structura sa poroas, favorizeaz ptrunderea substanelor nutritive din mediu, cu excepia celor insolubile sau a celor care exist sub form de particule. Acele substane care nu pot ptrunde ca atare n celul pot fi degradate n mediu extracelular sub aciunea enzimelor microbiene localizate la suprafaa celulei.

Levurile sau drojdiile reprezint un grup taxonomic eterogen de microorganisme care se prezint n mod obinuit i dominant n form unicelular i au organizarea intern de tip eucariot. Se nmulesc n mod obinuit prin nmugurire i ocazional prin diviziune simpl sau prin procese sexuale n urma crora se formeaz asce sau ascospori.

O caracteristic biochimic i biologic important a levurilor este capacitatea acestora de a produce fermentaia, ntlnit la mediile care conin hidrai de carbon. Drojdia reprezint de fapt masa enorm de celule rezultat din multiplicarea microorganismelor de fermentaie pe seama substratului nutritiv care constituie produsul fermentescibil, de unde denumirea de drojdie, echivalent aceleia de levuri.

Echipamantul enzimatic este foarte complex, ceea ce explic activitatea fiziologic intens i variat a celulelor de levuri. Folosesc ca sursa de carbon diferite zaharuri, acizi organici, glicina, intermediari ai metabolismului lipidelor, etc. iar ca sursa de azot produse rezultate din hidroliza proteinelor (peptone, aminoacizi), amoniac, uree. Levurile au nevoie i de factori de cretere ca tiamina, biotina, inositol, piridoxina i acid pantotenic. Temperatura optim de dezvoltare este cuprins ntre 20 i 300 C, pH-ul optim este 4,5 5. n anaerobioza levurile realizeaz fermentaia alcoolic a zaharurilor cu producere de CO2 i alcool etilic. Din energia eliberat prin fermentaie numai o parte este folosit pentru asimilare, iar restul este transformat n cldur.

n aerobioz levurile oxideaz complet hexozele dup ecuaia:

C6H12O6 + 6O2 6 CO2 + 6 H2O + 700 kcal

n aceste condiii o mic parte din glucidele din mediu furnizeaz energie, care este utilizat de celule pentru asimilarea restului de substrat, astfel nct, creterea substanei celulare n aceste condiii este deosebit de intens n raport cu cea realizat n anaerobioz.

Aceast comportare metabolic pregnant difereniat n funcie de prezena oxigenului este folosit n industrie unde se creeaz, dupa caz, condiii de anaerobioz atunci cnd produsul dorit este alcoolul etilic sau condiii de aerare puternic, atunci cnd este nevoie de mas celular abundent din care se prelucreaz produsul numit drojdie de bere.

Fungii sunt larg rspndii n natur n medii ambiante cu umiditate relativ mai redus dect cea care favorizeaz dezvoltarea bacteriilor. Metabolismul fungilor este n esen aerob: ei formeaz celule (hife) lungi, filomentoase cuprinznd nuclee mari de 4-20 m, care sunt foarte ramificate i care pot avea sau nu perei despritori. Fungii dispun de capaciti pronunate de degradare i de sintetizare i s-au dovedit a fi surse bogate de acizi organici de importan industrial (ex.: acid citric, acid gluconic), de numeroase antibiotice (penicilina, griseofurina) i de enzime (celuloz, proteoz, amiloz).

Ca toate ciupercile, mucegaiurile sunt plante fr clorofil, cu structur celular de tip eucariot (tabelul 1).

Tabelul 1

Caractere difereniale ale bacteriilor i fungiilor

BacteriiFungii

Tip de organizare celularProcariotEucariot

Volumul celulei1-5(3Levuri de 20-30(3; la mucegaiuri mult mai mare, greu de definit

Peretele celularAcid muramic, la care se adaug acizi teichoici i la unele grupe acid diaminopimelicGlucan, manan,chitin, glucan- i manan- protein

Membrana citoplasmaticNu conine steroli (cu excepia Mycoplasma, cultivat pe steroli)Conine steroli

NucleuNucleoid; absena membranei nucleareNucleoid; prezena membranei nucleare

CitoplasmaAbsena mitocondriilor i a reticulului endopalsmaticPrezena mitocondriilor i a reticulului endopalsmatic

MetabolismAutotrofe sau heterotrofe aerobe, obligat i facultativ anaerobeHeterotrofe; aerobe sau facultativ anaerobe

Absena autotrofilor i a anaerobiozei

Sensibilitate la frigPrezentNedemonstrat fr echivoc

DimorfismAbsentCaracteristic pentru unele specii

Sensibilitate la antibiotice i substane chimioterapiceSensibile la antibiotice antibacteriene; rezistente la antifungiceSensibile la antibiotice de tip special; rezistente la sulfamide i antibiotice antibacteriene

Mucegaiurile sunt organisme vegetale heterotrofe incapabile de fotosintez, care se dezvolt bine n medii bogate n substane organice. De obicei ele utilizeaz ca surs de carbon diferite zaharuri, alcooli i acizi organici, iar ca surs de azot compui organici (peptone, aminoacizi) i uneori sruri de amoniu i nitrai.

Mucegaiurile cresc bine n atmosfer umed iar pH-ul optim este 5-6 (variaiile tolerate fiind de pH 2 i pH 9,6). Unele specii cresc n acid acetic 1 N sau acid sulfuric 2 N, hrnindu-se pe seama impuritilor din soluie. Ele au capaciti foarte mari i variate de sintez i pot forma n cursul metabolismului lor polizaharide, lipide, acizi organici, pigmeni, substane antibiotice i substane celulare cu nalt valoare nutritiv, care rmn localizate n miceliu sau sunt eliminate n mediu. Temperatura lor optim de dezvoltare este de 22-320C, cea minim 5-100C i cea maxim de 30-400C. Aproape toi reprezentanii grupului sunt aerobi i ca atare au nevoie de prezena unei concentraii ridicate de oxigen.

Actinomicete reprezint o grup de microorganisme cu proprieti intermediare ntre cele ale bacteriilor i fungilor. Formeaz hife lungi, foarte ramificate, lipsite de perei desparitori; sporii nmuguresc din vrful hifelor aeriene. Celulele sunt mai mici, avnd un ordin de marime de numai 0,5 1,4 m semnnd cu bacteriile.

Protozoarele sunt larg rspndite n apa dulce i sarat, n sol i chiar in organismele animale, fiind cunoscute pentru rolul lor foarte important n ndeprtarea bacteriilor din apele reziduale, n biofiltre i n instalaiile de nmol activ.

Tabelul 2Constituienti ai celulelor unor microorganisme

MicroorganismeConstituienti ai celulelor

ProteineAcizi nucleici

bacterii50 60 %20 %

levuri40 50 %10 %

fungi20 % (cea mai mare parte de natur enzimatic)3 %

virusuri50 %

Microorganismele se mai deosebesc n ceea ce privete necesarul de oxigen. Fungi, algele i cteva bacterii sunt aerobe alte cteva bacteriii sunt strict anaerobe, pe cnd levurile i multe bacterii se pot dezvolta n ambele situaii (facultativ aerobe). Microorganismele anaerobe i facultativ anaerobe pot fi cultivate n vase foarte mari, prevzute cu dispozitive corespunztoare pentru amestecarea substanelor nutritive cu microorganismele. Microorganismele aerobe sau facultativ aerobe, necesit instalaii mult mai complexe.

2.2. Izolarea i selecia microorganismului capabil s produc componenta util necesar elaborrii produsului.

Izolarea microorganismului productor se realizeaz de pe medii foarte diferite cum ar fi fructe, plante, sol, aer, diferite incinte. Microorganismul separat se cultiv pe un mediu minimal ntrit cu agar, gelatin, pectin, CMC sau gel de silice (acesta din urm n cazul microorganismelor autotrofe care sunt inhibate de substanele organice). Tehnica de lucru este cea folosit n microbiologie pentru izolarea microorganismelor n cultura pur.

Tot n aceast etap se urmrete evoluia microorganismelor i reaciile ce au avut loc n acest microorganism.

Selecia microorganismelor.

n selecia microorganismelor, n funcie de natura componentului ce urmeaz a fi transformat se folosesc patru metode de baz:

1. selecia natural a formelor cu importan practic;

2. selecia artificial a formelor care apar prin mutaie natural;

3. selecia artificial a formelor care apar prin mutaie indus cu ajutorul mutagenilor;

4. obinerea de forme folositoare prin hibridare /17/.

Selecia natural la microorganisme.

Principiul acestei metode const n faptul c se ncearc obinerea unei forme a microorganismului care, n diferite condiii de mediu, este mult mai productiv n comparaie cu forma iniial. n acest caz, trebuie create acele condiii de cultur n care s se limiteze numrul formelor iniiale n populaii.

Prin urmare, testarea nsuirii microorganismelor are loc pe cale natural, fr intervenia celui care efectueaz selecia. Aceast metod necesit un volum mai redus de lucru i se folosete cu succes atunci cnd trebuie s se obin diferite variante, care s creasc pe un mediu de cultur nou, obinndu-se astfel tulpini de microorganisme mult mai rezistente fa de factorii nefavorabili, adaptate la schimbarea temperaturii de cultivare etc.

Practic, pe un mediu de cultur oarecare i n anumite condiii de temperatur, pH, etc. se dezvolt bine i repede numai un numr mic de microorganisme i anume cele care sunt cel mai bine adaptate la substrat i la parametrii mediului. Prin trecerea microflorei iniiale la intervale scurte de timp pe medii proaspete i sterile, numrul speciilor se reduce i dup un anumit timp se ajunge chiar la culturi care s cuprind microorganisme de aceeai specie. Trecerile de pe un mediu pe altul trebuie s se fac de ndat ce s-a observat o uoara dezvoltare a culturii. Astfel, speciile mai puin adaptate se elimin prin diluare. n faza final de selecie natural se trece la izolarea n cultura pur a speciilor existente. n timpul trecerilor repetate pot s apar mutani i mai bine adaptai condiiilor de mediu, dect specia natural. Dup izolarea n cultura pur urmeaz faza de stabilire a condiiilor fizico-chimice optime de mediu pentru stimularea produciei de enzime i eventual de obinerea de mutani mai productivi.

Metoda seleciei naturale este mult utilizat, dar prezint urmtoarele dezavantaje:

nu ntotdeauna microorganismul care se dezvolt cel mai repede este si cel mai productiv;

prin selecie natural se elimin microorganismele care, dei s-ar dezvolta bine pe mediu, sunt impiedicate s se dezvolte de ctre microorganismele care secret substane antagoniste.

Selecia artificial fr folosirea factorilor mutageni (adaptarea).

Se tie c n funcie de substratul metabolizabil prezent ntr-un mediu de cultur, microorganismele produc enzime ce pot fi clasificai n dou grupe: enzime constitutive i enzime adaptive /18/.

Enzimele constitutive se gsesc totdeauna n celule i concentraia lor nu este influenat de prezena sau absena din mediul de cultur a substraturilor pe care ele le metabolizeaz.

n ceea ce privete enzimele adaptive se deosebesc:

- Enzime net adaptive care nu sunt elaborate de celul dect n prezena substratului. Formarea acestor enzime are loc la scurt timp dup contactul celulelor cu substratul specific. Perioada de inducie este de obicei de ordinul orelor.

- Enzime adaptive, care se pot identifica n celul n lipsa substratului specific, ns n concentraie mic fa de cea pe care o au n prezena substratului. n majoritatea cazurilor concentraia acestor enzime crete de cteva zeci de ori n prezena substratului. Prin urmare, aceste enzime ar fi constitutive, biosinteza lor fiind stimulat considirabil de prezena substratului.

- Enzime adaptive care se formeaz dup o lung perioad de adaptare a microorganismului la substrat prin treceri repetate pe acelai mediu. Formarea acestor enzime se datorete apariiei de mutani ai microorganismului. Deoarece noiunea de adaptare n microbiologie are un sens diferit de cel folosit n cazul enzimelor adaptive, s-a propus s se utilizeze noiunea de enzime induse pentru biocatalizatorii din primele dou categorii. Enzimile din a treia categorie i datoresc formarea apariiei mutanilor, deci a modificrii eriditii microorganismului datorit unui inductor specific; prin urmare acestea ar putea fi enzime adaptive reale.

Selecia artificial prin folosirea factorilor mutageni.

Dat fiind c selecia fr folosirea factorilor mutageni nu este de cele mai multe ori eficient, n ultimul timp se apeleaz tot mai des la utilizarea diferiilor factori care s grbeasc i s sporeasc variabilitatea mutaional pe baza creia s se efectueze selecia formelor dorite.

Factorii mutageni provoac mutaii, care apar foarte rar n condiii naturale ; mutaiile induse au un caracter de evantai, conducnd la forme cu nsuiri att n plus ct i n minus fa de cele ale microorganismului inial.

Mutaiile reprezint modificri spontane, cu caracter nedirecional, care survin la nivel molecular n structura unor determinani genetici ai caracterelor eriditare i care, afectnd astfel o parte din informaia genetic a organismului, duc la construirea unui mutant, diferit de cel normal. n funcie de modul de apariie exist dou feluri de mutaii:

1 - mutaii spontane, care apar n natur datorit unor cauze necunoscute, n condiii obinuite de mediu i fr intervenia vreunui factor decelabil;

2 - mutaii induse care se produc sub aciunea unor factori de mediu ce funcioneaz ca ageni mutageni (de natur fizic sau chimic), n sensul c mresc ritmul sau viteza de apariie a unor mutaii, care oricum s-ar fi produs spontan, dar la intervale mai mari de timp /19/.

Folosirea hibridrii pentru separarea formelor de microorganisme utile.

Hibridarea se folosete relativ rar n selecia microorganismelor, deoarece obinerea mutaiilor induse este destul de eficient, iar operaia de hibridare este posibil numai la cteva specii cu importan practic /17/. Atunci cnd se folosete, hibridarea are drept scop unirea caracterelor utile de la dou tulpini, sau de a obine hibrizi cu o exprimare mai activ a caracterului util, comparativ cu cel al ambelor forme printeti.

Unirea ntr-un microorganism a nsuirilor celor doi prini se poate face pe dou ci:

n primul rnd prin apariia la hibrid a tuturor caracterelor de la cele dou forme, ceea ce este pe deplin posibil, datorit faptului c majoritatea microorganismelor se pot nmuli vegetativ, nmulire care frecvent se poate prelungi timp nedefinit.

n al doilea rnd, mpreunarea caracterelor printeti se poate efectua datorit recombinrii, spre care duce meioza sau segregarea mitotic (separarea cromozomilor la diviziunea nucleului). Recombinatele dup dou caractere se vor evedenia dac acestea sunt determinate de gene care sunt localizate n cromozomi diferii.

Astfel, se poate aprecia c n dezvoltarea biotehnologiei un rol deosebit va reveni geneticii care dispune, aa dup cum rezult din sumarele informaii prezentate, de mijloace pentru a influena un microorganism s realizeze predominant o anumit transformare.

2.3. Cultivarea microorganismelor

2.3.1. Medii de cultura. Compoziie i rolul principalelor componente

Mediile de cultur sunt soluii sau amestecuri complexe apoase ce conin substanele necesare creterii microorganismului i elaborrii produsului dorit. n funcie de natura componenilor lor, mediile de cultur sunt:

sintetice;

semisintetice;

organice.

Indiferent de mediul utilizat, microorganismelor trebuie s li se asigure surse de energie (hidrai de carbon), surse de azot, fosfor, sruri minerale cu diferite coninuturi de microelemente.

Hidraii de carbon. Constituie sursa de energie n toate procesele de fermentaie. Prin oxidarea biochimic a glucozei de exemplu, se degaj o mare cantitate de energie, din care, o parte este nmagazinat n legturile macroergice ale adenozintrifosfatului, iar restul este preluat de mediul de cultur.

Reaciile chimice de la nivel celular care duc la creterea celulelor si la biosinteza produsului dorit se realizeaz prin utilizarea energiei eliberate de legturile ATP-ului. Restul de energie, preluat de mediul de cultur sub forma de cldur, este transferat agenilor de rcire.

Poate cea mai utilizat surs de carbon n mediile de cultur este glucoza. Dac analizm degradarea aerob i cea anaerob a glucozei :

1) Glucoza (C6O6H12) glicoliz 2 moli acid piruvic + 2 moli ATP

proces anaerob

2) Glucoza(C6O6H12) respiraie 6 moli CO2 + 6 moli H2O + 38 moli ATP

proces anaerob

38 moli ATP = 1112 Kj = 40%

se constat c 40% din energia furnizat n procesul de degradare aerob a glucozei este utilizat n proces, restul de 60% fiind preluat de agentul termic.

Lactoza este utilizat de microorganisme mult mai lent dect glucoza, furniznd mai puin energie mediului extern. Este de asemenea ntlnit n reetele de obinere a multor medii de cultur.

Surse de azot. Azotul, fie de natur oranic, fie mineral din sruri de amoniu este utilizat de microorganisme pentru formarea grupelor aminice i implicit a aminoacizilor, deci a proteinelor, substane de baz pentru procesul de cretere a microorganismelor, deoarece intr n structura peretelui celular.

Fosforul. Se ntlnete mai ales sub form de grupri fosfat i intr n structurile macroergice ale metabolismului celular (AMP, ADP, ATP), fiind compus esenial n transferul de energie la nivel celular.

Substane minerale (sodiu, potasiu, mangan, magneziu, zinc). Prezena substanelor minerale n compoziia unui mediu de cultur este indespensibil pentru creterea celulei deoarece afecteaz direct permeabilitatea membranei i echilibrul ionic, activeaz unele sisteme enzimatice celulare i intr n compoziia altor sisteme enzimatice.

Antispumanii utilizai frecvent n compoziia mediilor de cultur sunt uleuri sau substane tensioactive care pot constitui totodat i surse de lipide.

Precursorii sunt substane care conin n structura lor, sau reprezint ele nsele, o poriune cea definitorie a compusului ce se dorete biosintetizat. Altfel spus, prin prezena lor dirijeaz procesul de biosintez ctre produsul dorit. De exemplu, penicilina G are drept precursor fenilacetamida, iar penicilina V acidul fenoxiacetic. Precursorii se adaug n poriuni, astfel nct s nu se depeasc concentraia de 0,1 - 0,2 %, limita peste care pot deveni toxici pentru microorganisme.

Factori de cretere. Unele microorganisme au nevoie nu numai de surse de energie, de C, de N, ci i de anumite substane organice oligodinamice eseniale pentru metabolismul lor, numite factori de cretere. Aciunea acestora fiind asemntoare aceleia exercitate de vitamine n metabolismul animalelor superioare, ele au mai fost numite prin analogie i vitamine microbiene. Factorii de cretere ai unui anumit microorganism sunt acele substane pe care microorganismul dat este incapabil s le sintetizeze n cursul metabolismului sau i n absena crora multiplicarea este imposibil.

La unele microorganisme factorii de cretere sunt de origine endogen fiind elaborai prin biosinteza n cursul metabolismului celular, astfel nct prezena lor n mediu ca substane preformate nu este necesar. n schimb, microorganismele care nu au capacitatea de a sintetiza aceti metabolii eseniali, nu pot tri dect dac mediul lor este suplimentat cu factori de cretere, pentru a cror sintez facultile lor metabolice sunt deficitare.

Aciunea factorilor de cretere se exercit n concentraii extrem de mici: de exemplu 10-4 M n cazul aminoacizilor i 10-6 10-10 n cazul vitaminelor grupului B.

Factori stimulatori de cretere sunt substane care, fr a fi eseniale pentru supravieuirea i multiplicarea unor microorganisme, le accelereaz sau amelioreaz dezvoltarea atunci cnd sunt adugate n mediu (de ex. biotina pentru S. cerevisiae). Efectul stimulator al mbogirii mediului de cultur cu aceti factori se datorete faptului ca dei microorganismele i sintetizeaz, biosinteza lor se face ntr-un ritm prea lent i n cantiti care nu pot satisface integral exigenele unei dezvoltri abundente a culturii.

2.3.2. Creterea i multiplicarea bacteriilor

2.3.2.1. Creterea bacteriilor

Prin cretere n sens biologic se nelege mrirea coordonat a tuturor componenilor unui organism uni- sau pluricelular, ca rezultat al adugrii de substan nou. Procesul de cretere depinde de natura i concentraia subsantelor nutritive din mediu i de aprovizionarea continu a celulei cu energia necesar reaciilor endotermice de sintez.

Creterea bacteriilor este conditionat de trei factori: existena unor membrane de suprafa cu nalt grad de organizare care prin permeabilitatea lor selectiv menine n celule o concentraie mare a moleculelor necesare n procesele metabolice;

prezena i activitatea enzimelor care catalizeaz transformarea moleculelor aliment n blocuri noi, de construcie celular;

aciunea favorabil a energiei solare, n cazul microorganismelor fotosintetizante, sau aceea a energiei eliberate prin degradarea moleculelor-aliment, asupra reaciilor de biosintez (de anabolism).

Creterea bacteriilor se realizeaz prin depunerea uni- sau tridimensional de substan nou, ceea ce determin mrirea celulei bacteriene n sensul uneia dintre dimensiunile ei sau n sensul tuturor celor trei dimensiuni lungime, lime, grosime. Mrirea volumului celular se face la bacterii nu numai prin sintez de substan organic, ci i prin sporirea accentuat a coninutului lor n ap.

Creterea bacteriilor se ntrerupe cnd se produce diviziunea celular. Se pare c activitatea normal a bacteriilor este condiionat de existena unui anumit raport ntre volumul celulei i suprafaa sa. Acest raport se modific n cursul creterii celulei bacteriene deoarece n timp ce suprafaa bacteriilor crete cu o raie ptratic, volumul ei se mrete cu o raie cubic, ceea ce determin o diminuare relativ a suprafeei celulare. Aportul de substane nutritive devine mai puin adecvat exigentelor metabolice. Pe de alt parte, cu mrirea dimensiunilor celulei, echilibrul ei chimic se altereaz. Ca urmare, atunci cnd disproporia dintre suprafa i volum atinge un punct critic, raportul lor adecvat se restabilete prin diviziunea celulei ajuns la limita ei de cretere. Astfel, diviziunea celular este o form necesar de reglare automat a activitii celulei bacteriene.

2.3.2.2. Multiplicarea bacteriilor.

Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care multiplicarea celulelor duce la mrirea taliei individului, la bacterii, ca i la alte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creterea numrului de indivizi. Acest proces se realizeaz pe dou ci, dintre care una, diviziunea simpl, direct sau binar, este practic general, iar cealalt, nmugurirea sau ramificarea este excepional, fiind caracteristic numai unui numr relativ foarte mic de specii bacteriene (figura 11).

Multiplicarea prin diviziune simpl este tipic pentru majoritatea speciilor bacteriene atunci cnd celulele se afl n condiii optime de via; diviziunea simpl const n scindarea unui individ n dou celule noi, care pot fi aproximativ egale (diviziune izomorf) sau inegale (diviziune heteromorf).

Diviziunea bacteriilor se poate face fie prin trangulare, fie prin sept transversal.

Diviziunea prin trangulare caracteristic bacteriilor n faza S se realizeaz prin ngustarea median a celulei, determinat de invaginarea membranei ei citoplasmatice, urmat de creterea spre interior, tot prin invaginare a peretelui celular. Astfel, fiecare din celulele fiice are cte un perete celular, ele putndu-se separa la sfritul procesului.

Diviziunea prin sept transversal este caracteristic bacteriilor n faza R. La nceputul procesului de diviziune, bacteria matur este deja traversat de regiunea median de un sept derivat din membrana citoplasmatic. Acest sept este apoi scindat n lungul su de un perete despritor care se formeaz pornind de pe faa intern a peretelui celular i care crete centripet, ca o diafragm. Cele dou celule fiice reunite sunt la rndul lor divizate de un sept derivat din membrana citoplasmatic, astfel nct se formeaz un grup de patru celule dispuse n mod caracteristic i ale cror septuri sunt de asemenea scindate ulterior de noi perei celulari transversali.

O alt ipotez consider c multiplicarea bacteriilor se face dup un mecansim n trei etape succesive:

Diviziunea citoplasmei prin intermediul unui sept transversal derivat din membrana citoplasmatic i dispus perpendicular sau oblic fa de axul mare al celulei;

trangularea peretelui celular, la nivelul acestui sept care formeaz la rndul su un perete transvers ptrunznd prin cretere centripet n interiorul septului citoplasmatic pe care-l separ n dou straturi subiri; celulele fiice astfel rezultate au nucleu, citoplasm i membrane citoplasmatice;

Separarea efectiv a celulelor fiice prin scindarea peretelui lor celular comun, urmat de desprirea lor sub aciunea forelor de traciune din mediu i n funcie de elasticitatea peretelui celular; n unele cazuri peretele celular transvers se formeaz incomplet, astfel nct la sfritul creterii el nu mai apare ca un disc, ci are aspectul unui inel, iar septul membranos citoplasmatic transvers rmas n regiunea sa central alctuiete o plasmodesm prin care cele dou celule rmn n continuare legate.

Multiplicarea prin ramificare sau nmugurire. La unele bacterii se formeaz o ramificaie tubular fin, ca o mic umfltur terminal, care crete i devine o nou celul ovoid, dup care n mijlocul tubului de legtur se constituie un sept transversal.

Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepional de mare i se datoreaz valorii foarte ridicate a raportului dintre suprafaa i masa lor, valoare care este de 400000 ori mai mare dect n cazul omului. Celula bacterian are o suprafa de adsorbie foarte mare, datorit creia procesele de asimilare i sintez, de cretere i reproducere se desfoar ntr-un timp foarte scurt.

Figura 11 Reprezentarea schematic a posibilitilor de multiplicare la bacterii

(a) - prin formarea unui sept transversal

(b) prin trangulare

(c) prin nmugurire lateral (A) i terminal (B)

2.3.3. Evoluia unei culturi bacteriene

Dinamica multiplicrii populaiilor bacteriene evolueaz n urmtoarele faze succesive (Fig. 12 ):

Faza de laten (lag) sau de cretere zero este cuprins ntre momentul introducerii celulelor n mediu (nsmnare) i momentul cnd ele ncep s se multiplice. n cursul acestei faze, numrul bacteriilor din inocul rmne neschimbat sau chiar scade temporar. Cultura nu este vizibil macroscopic. Aceast prim faz (dou ore) se observ atunci cnd bacteriile nsmnate provin din culturi vechi, deci sunt celule deficitare n enzime sau n produi intermediari de metabolism. Multiplicarea unor asemenea bacterii devine rapid n momentul n care aceste substane s-au acumulat prin sintez n concentraii optime. Dac inoculul este prelevat dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare n aceleai condiii de mediu ca i cele oferite noii culturi iniiate, multiplicarea bacteriilor i menine n continuare ritmul rapid. Atunci cnd bacteriile provin dintr-o cultur exponenial, dar care creteau pe alt mediu dect cel n care sunt transferate prin nsmnare, creterea lor pe noul mediu nu se evideniaz dect dup o perioad de laten necesar induciei unor enzime corespunztoare noului substrat nutritiv. Faza de laten apare ca o period de adaptare la noile condiii de cultur n care bacteriile viabile din inoculum i acumuleaz n celul metaboliii eseniali i sistemele enzimatice necesare creterii n cazul n care aceste componente biochimice le lipseau datorit condiiilor de via anterioare nsmnrii.

Figura 12 Curba de cretere a unei populaii bacteriene n raport cu timpul, exprimat prin logaritmul numrului de bacteriiA-nsmnarea; A-B - faza de lag; B-C - faza de accelerare a ritmului de cretere; C-D faza de multiplicare logaritmic; D-E - faza de ncetinire a ritmului de cretere; E-F - faza iniial de declin; F-G - faza intermediar de declin; G-H - faza final de declin

Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic este caracterizat prin aceea c dup o scurt perioad (circa dou ore) de accelerare a ritmului de cretere n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit acest ritm devine constant i caracteristic pentru un organism dat n anumite condiii de cultur, durata unei generaii fiind minim. Celulele considerate a fi de tip embrionar au dimensiuni mai mari dect cele caracteristice speciei, iar citoplasma lor este omogen, nu conine materiale de rezerv i are o mare afinitate pentru coloranii bazici datorit coninutului ei ridicat de ARN. Celulele aflate n faza exponenial de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetri de genetic i fiziologie bacterian.

n condiii ideale de cretere i multiplicare, cantitatea de materie vie crete n funcie de timp dup o progresie geometric, adic se multiplic print-un factor constant la fiecare unitate de timp. Evoluia unei culturi bacteriene ilustreaz foarte bine progresia geometric sau exponenial a numrului de indivizi n funcie de timp. Primele diviziuni dup nsmnare sunt destul de bine sincronizate i numrul celulelor viabile se dubleaz brusc la intervale regulate; dup un timp relativ scurt de timp, tendina de multiplicare rapid scade progresiv datorit epuizrii substanelor nutritive din mediu i acumulrii produselor de catabolism cu efect inhibitor. Creterea populaiei bacteriene nu se mai face sincron datorit faptului c n aceste condiii de ncetinire a ritmului de cretere apar unele diferene individuale n privina timpului de diviziune celular. Acest fenomen asigur echilibrul organismelor vii n natur.

Creterea unei populaii bacteriene se poate aprecia direct prin mai multe metode: determinarea masei uscate a celulelor, dozarea ntr-o cultur a unuia dintre constituenii bacterieni elementari (C sau N), aprecierea cantitativ a unei enzime sau a unui produs metabolic i evaluarea numrului total al celulelor bacteriene (vii i moarte) cu ajutorul celulei microscopice de numrat sau a numrului de celule viabile (capabile de multiplicare) prin nsmnare pe medii de cultur solidificate. Ca metode indirecte se folosesc aprecierea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene ntr-un mediu lichid n raport cu o scar etalon sau la fotocolorimetru, determinarea absorbiei razelor UV cu lungime de 2800 , specific pentru proteine sau 2500 , caracteristic pentru acizii nucleici.

Faza staionar maximal urmeaz unei scurte perioade (2 ore) n care multiplicarea nu se mai produce n progresie geometric, ci ntr-un ritm care scade progresiv. n acest faz, numrul celulelor viabile, este maxim i rmne constant o perioad de timp care dureaz de la cteva ore la cteva zile, n funcie de sensiblitatea bacteriilor la condiiile defavorabile de mediu. n cazul n care intrarea culturilor n faz staionar este determinat de epuizarea substanelor nutritive din mediu, celulele nu se mai multiplic, iar numrul total al indivizilor populaiei este constant i egal cu numrul celulelor viabile. Atunci cnd apare o lips parial de substane nutritive sau se acumuleaz compui toxici, multiplicarea persist n ritm ncetinit, dar este contrabalansat de o mortalitate cu ritm echivalent: numrul celulelor viabile rmne constant, n timp ce numrul total al bacteriilor din cultur (vii i moarte) crete. n aceast faz, celulele bateriene sunt considerate mature avnd morfologia descris drept caracteristic pentru fiecare specie: dimensiuni mai mici dect n faza de cretere exponenial, citoplasma mai puin omogen datorit apariiei de incluziuni i acumulrii unor substane de rezerv, afinitate moderat pentru colorani i prezena sporilor la speciile sporogene.

Faza de declin corespunde unei scderi progresive a numrului celulelor viabile, pn la sterilizarea bacteriologic a culturii; la un moment dat, numrul bacteriilor viabile scade n progresie geometric n raport cu timpul datorit morii unui numr foarte mare de celule. Celulele din acest faz, celulele btrne, au un polimorfism marcant, determinat de prezena formelor de involuie (celulele mici, sferice, umflate, deformate sau ramificate), se coloreaz foarte slab sau capt afinitate pentru coloranii acizi, iar la speciile sporogene apar n cultur foarte muli spori. n unele cazuri apar fenomeme de liz care determin scderea numrului de celule din mediu.

Moartea celulelor dintr-o populaie microbian reprezentat printr-o cultur pur este un proces care evolueaz exponenial sau logaritmic, deoarece indivizii dintr-o asemenea populaie reacioneaz identic fa de factorii letali exogeni. Spre deosebire de organismele superioare, la care abolirea pentru o perioad relativ scurt a funciilor biologice i a capacitii de reproducere a celulelor componente determin fenomene de degradare cu caracter ireversibil care produc moartea, la bacterii procesele biologice pot fi parial sau total suspendate pentru perioade foarte ndelungate, fr ca aceasta s provoace moartea celulelor. Astfel, dei n spori i n celulele congelate sau liofilizate activitatea biologic este practic oprit, capacitatea lor de a se reproduce rmne intact. n acelai timp, la bacterii este posibil i situaia invers, n care pierderea capacitii de reproducere nu este obligatoriu urmat imediat de ncetarea activitilor metabolice. De aceea este mai corect s se aprecieze viabilitatea microorganismelor n raport cu conservarea potenialului lor de reproducere.

2.3.4. Dinamica procesului de cretere la mucegaiuri.

Creterea mucegaiurilor poate fi studiat depunnd n zona central a unei plci Petri cu un mediu adecvat, civa spori sau o poriune de miceliu fungic. Creterea este limitat n mod caracteristic la extremitatea liber a hifelor. Ea poate continua prin extinderea hifelor periferice, att timp ct mediul conine substane nutritive. Procesul a fost urmrit la miceliile septate, dei acelai principiu se aplic i celor coenocitice. Dup alungirea celulei terminale i biosinteza peretelui celular, urmeaz procesul de formare a septului terminal avnd ca rezultat delimitarea a dou celule fiice. Cea apical continu ciclul de cretere i diviziune, pe cnd celula subterminal particip facultativ la cretere, numai atunci cnd produce o ramificaie lateral, dotat la rndul ei cu capacitate de cretere apical i diviziune. n unele cazuri, (la unele Basidiomycetes) un singur miceliu poate atinge pn la 15 m. Pe msur ce miceliul crete spre periferie, coninutul citoplasmei poate s dispar n partea central, cea mai veche a coloniei.

Creterea unui miceliu pornind de la un inocul de spori sau de la un fragment micelian parcurge mai multe faze:

Faza iniial de lag, care dureaz cteva ore, este caracterizat prin procese de germinare a sporilor sau regenerare a hifelor rupte i lezate care au servit ca inocul;

Faza de cretere liniar corespunde perioadei n care pe suprafaa mediului apare o colonie circular ce crete liniar n raport cu timpul. Viteza de cretere se menine constant la marginea coloniei, n timp ce n zona central creterea este mai lent sau chiar nceteaz. Creterea coloniei n suprafa nu este corelat cu creterea de mas. n medii srace n substane nutritive colonia se extinde mai repede ns sub forma unei reele fine de hife, n timp ce pe medii bogate creterea ei n diametru este mai lent dar miceliul format este mai gros.

Faza de nvechire este echivalent cu ncetinirea vitezei de cretere, pe msur ce colonia se apropie mai mult sau mai puin de bariera mecanic reprezentat de marginea plcii Petri, dar ea este de fapt determinat de efectul duntor al produilor de metabolism eliberai din colonie. La unele specii ea este nsoit de liza miceliului n centrul coloniei. ncetinirea ritmului de cretere apare mai repede cnd cultura se dezvolt n medii bogate n substane nutritive i la temperaturi optime i supraoptimale, acumularea produilor de metabolism fcndu-se mai rapid n aceste condiii. Creterea coloniilor de mucegai pe medii solide evolueaz cu o vitez variabil, n funcie de tulpin, mediul de cultur i factorii de mediu (temperatur, pH, presiune osmotic). La fungii neseptai alungirea miceliului poate ajunge la 3 mm/h la 250C, astfel c n 2-3 zile colonia poate acoperi o zon mare. n medii lichide, fungii produc o pnz micelian la suprafaa lichidului, astfel c diferitele pri ale culturii se gsesc n diferite condiii de mediu n special sub raportul gradului de aerobioz. De aceea, n procesele industriale n care se urmrete o dezvoltare abundent i egal a mucegaiului este necesar s se asigure condiii fiziologice omogene de cultivare prin agitare mecanic i aerare controlat a mediului. n acest fel se realizeaz o dispersare a miceliului nsoit de apariia unor colonii sferice. 2.4. Tehnici de nmulire a microorganismelor

Un microorganism se nmulete dac mediul n care se afl cuprinde toate substanele necesare dezvoltrii sale: surs de carbon, azot, sruri nutritive, factori de cretere i dac sunt ndeplinite i anumite condiii fizico-chimice de umiditate, pH, temperatur, tensiune de oxigen.

Aa cum s-a artat anterior, n dezvoltarea microorganismelor se deosebesc mai multe faze:

faza de inducie n care nu are loc practic nici o nmulire i n care au loc n interiorul celulei transformri metabolice care pregtesc celula pentru nmulire;

faza accelerat, n care microorganismul ncepe s se nmuleasc i viteza de nmulire este n continu cretere;

faza exponenial, n care nmulirea are loc exponenial; populaia microbian crete dup o progresie geometric, aceasta fiind starea normal de cretere a microorganismului;

faza staionar n care nmulirea este n curs de stagnare; numrul celulelor care se formeaz este n echilibru cu numrul celulelor care mor;

n practica industrial de nmulire a microorganismelor, faza de nmulire exponenial prezint un interes deosebit deoarece, conducnd bine aceast faz, creterea masei microbiene are loc rapid, cu randamente maxime. Din acest motiv aceast faz va fi discutat mai amnunit.

Timpul de generaie sau timpul unei generatii este timpul necesar ca populaia microbian actual n faz de nmulire exponenial s se dubleze; cu alte cuvinte, timpul necesar ca o celul nou format s se nmuleasc, cu formarea unei celule-fiice identice ei. Timpul de generaie este dat de durata nmulirii traportat la numrul generaiilor, n.

g = t/n

n faza de nmulire exponenial sau logaritmic, nmulirea are loc conform progresiei geometrice:

a, 2a, 22a, 23a, 24a, . . . . . 2na

n care a este numrul de celule ale microorganismului la timpul zero, n momentul nsmnrii mediului proaspt cu celule n stare de nmulire.

Dup n generaii numrul celulelor va fi 2na. Notnd cu b acest numr rezult:

b = 2na

Prin logaritmare se obine:

n = (log b-log a) / log 2

Deci,

g = t x log 2 / (log b-log a).

Relaia permite calcularea timpului de generaie pentru faza de nmulire exponenial prin determinarea numrului de celule sau a masei microbiene la nceput i dup timpul t de dezvoltare.

Pentru ca faza de nmulire a unui microorganism s fie exponenial este necesar asigurarea unor condiii constante de dezvoltare, care se refer la concentraia substanelor nutritive, condiiile fizico-chimice (temperatur, pH, tensiune de oxigen) i eliminarea metaboliilor rezultai din procesul de nmulire. Dup cantitatea de oxigen necesar dezvoltrii microorganismelor procedeele de nmulire pot fi aerobe i anaerobe. Utilajele folosite pentru nmulirea n condiii aerobe se pot folosi i pentru cele care necesit condiii anaerobe, n condiiile ndeprtrii oxigenului prin barbotare de gaze inerte sau prin folosire de substane tampon de oxido-reducere care s consume oxigenul. De aceea se vor discuta numai procedeele de cultivare a microorganismelor aerobe.

2.4.1. Tehnici de laborator

Tendinele recente n cultivarea microorganismelor sunt orientate spre experimente care s simuleze ct mai mult condiiiile din natur. De aceea, alturi de utilizarea diferitelor specii de microorganisme este necesar folosirea amestecurilor de substane nutritive i modificarea parametrilor de cultivare (durat, temperatur, pH, agitare etc.).

Aceast situaie este determinat de faptul c microorganismele care se cultiv n laborator pot folosi alte ci metabolice, comparativ cu cele care cresc n mediile naturale pentru a consuma substratul. n acest din urm caz microorganismele care se dezvolt n condiii de competiie vor recurge la ci metabolice variate pentru a metaboliza diferite substraturi. Astfel, caracteristicile unui microorganism pentru supravieuire n mediu natural contrasteaz cu cele ale celui selecionat i cultivat n laborator, ceea ce explic unele rezultate contradictorii. De aceea, suplimentarea continu a mediului de cultur cu concentraii mari ntr-un anumit substrat poate furniza dezvoltarea unui microorganism care poate utiliza mai bine acel substrat.

Metoda culturilor de suprafa. Dezvoltarea microorganismelor se realizeaz n condiii sterile, pe medii i n vase sterilizate i utiliznd pentru procesele aerobe aer tehnologic sterilizat.

Sterilizarea se poate realiza prin diferite metode, n funcie de materialul folosit (tabelul 3).

Sterilizarea pe cale termic se realizeaz timp de dou ore la 160-180oC. Aceste condiii sunt necesare pentru a distruge microorganismele, inclusiv formele vegetative i sporii. Pentru a degrada endotoxinele produse de bacteriile gram-negative, se recomand efectuarea sterilizrii pentru durate mai lungi (cel puin 4 ore).

Sterilizarea n autoclav se conduce (T aprox. 1200C) folosind abur sub presiune (15 psi).

Tabelul 3

Metode de sterilizare

MaterialMetod

HARGF

Metal***--

Sticl***--

Policarbonat-***-

Polietilen-***-

Polipropilen-***-

Polistiren--**-

Medii de cultur--*-

Soluii de sruri-**-*

H termic uscat; A- termic n autoclav; R- radiaii; G-gaze; F filtrare;

- nerecomandat; * -se poate utiliza

Sterilizarea cu radiaii recomand folosirea radiaiilor UV (2 ore, 250-270nm) sau iradierea cu radiaii (. Acestea din urm se utilizeaz pe scar larg pentru a steriliza materiale plastice i reactivii liofilizai (doza 2-3 Gy-Gray).

Sterilizarea cu gaze toxice se folosete pentru materiale plastice. n acest scop se utilizeaz oxidul de etilen. Ca durat, aceasta variaz de la 1-2 zile pn la 1 sptmn.

Sterilizarea prin filtrare reprezint o tehnic accesibil, recomandat n cazul n care componenii unei soluii sunt sensibili la tratarea termic sau cu radiaii. Pentru filtrare se impune folosirea unor membrane cu poroziti ale cror dimensiuni s exclud trecerea virusurilor (1nm-0,1(m) i microorganismelor (0,45 -10(m).

Aerisirea este asigurat n mod natural printr-un dop de vat care acoper vasul (eprubete, vase Erlenmayer, baloane cu fund plat, cutii Petri, vase Roux etc.), caz n care schimbul de gaze se realizeaz destul de lent. n cazul acestor microorganisme (bacterii acetice, mucegaiuri) se folsesc vase de sticl cu baza mare i cu un strat subire de mediu (vase conice de 500 mL care conin cte 50-100 mL mediu).

Mediile pe care are loc dezvoltarea microorganismelor aerobe pot fi lichide sau solide. Dezvoltarea pe medii lichide poate avea loc la suprafaa mediului lichid sau n interiorul su. Microorganismele care se pot dezvolta la suprafaa mediilor lichide formeaz de obicei o pelicul fin sau mai groas care cade la fund. n locul vechii pelicule se formeaz o pelicul nou care cade i ea, .a.m.d. Cu timpul se acumuleaz la fundul vasului un sediment format din celulele microorganismului. Mucegaiurile, pe medii lichide, se dezvolt la suprafa formnd un miceliu mai subire sau mai gros, dup specia de mucegai i cantitatea de substane nutritive din mediu. n interiorul mediilor de cultur se dezvolt de obicei microorganismele facultativ anaerobe (drojdiile, care formeaz de la nceput un sediment pe fundul vasului). Oxigenul necesar acestor microorganisme difuzeaz n interiorul mediului prin dizolvare. Producia microbian a culturilor aerobe pe medii lichide este influenat de raportul volum:suprafa.

Dezvoltarea microorganismelor aerobe pe medii solide n vasele de laborator menionate se realizeaz pe suprafaa acestora, n condiiile unui bun contact cu oxigenul. Ca medii de cultur solide se pot folosi medii de cultur lichide ntrite cu diferii ageni (agar, gelatin, pectin, CMC, gel de silice) sau medii solide prin natura lor, boabe de cereale, tre, pine, rdcini (morcov), cartofi etc.

Metoda culturilor submerse. Microorganismele se pot dezvolta la fel de bine i n interiorul mediilor de cultur, ca i la suprafaa lor, n condiiile asigurrii oxigenului necesar; acesta este alimentat prin agitare, ceea ce previne asocierea celulelor de drojdii i bacterii, care rmn izolate.

Metoda vaselor agitate. n vederea obinerii unei mase miceliale uniforme s-a propus folosirea unui sistem de agitare n timpul procesului de cultivare a microorganismelor care se nmulesc prin spori. Metoda se aplic la cultivarea n laborator a tuturor microorganismelor aerobe care produc antibiotice, enzime, vitamine. Agitarea vaselor se realizeaz cu agitatoare care acioneaz pe orizontal cu micare du-te - vino sau cu sisteme rotative. Acestea din urm sunt mai eficace i prezint avantajul posibilitii de modificare a turaiei i a amplitudinii de agitare.

Metoda culturilor agitate prin barbotare de aer. Bacteriile i drojdiile se pot nmuli submers i prin barbotare de aer prin mediu. Aerul barbotat asigur aerarea i agitarea mediului de cultur.

2.4.2. Procedee pilot

Studiul nmulirii microorganismelor prin metode de laborator este util pentru stabilirea condiiilor optime de dezvoltare (sursa de carbon, azot, sruri nutritive, factori de cretere, microelemente, pH, temperatur) i a condiiilor optime de producie care se ofera microorganismului. Aceste date se obin n laborator dup un mare numr de experimente i nu se poate trece direct la producia de microorganisme la nivel industrial deoarece condiiile de nmulire din instalaiile industriale difer de cele de laborator. Fa de factorii care influeneaz dezvoltarea microorganismelor n laborator prezint importan i tensiunea optim de oxigen din mediu, agitarea (n strns legatur cu primul factor) i gradul de spumare a mediului. Primii factori afecteaz durata proceselor metabolice, precum i randamentul n mas microbian i metabolii. Aceste elemente determin studierea nmulirii microorganismelor n instalaii pilot, n condiii de lucru foarte apropiate sau identice cu cele industriale.

Pe lng influena tensiunii de oxigen (microaerobioz, aerobioz la presinue atmosferic, suprapresiune) i a agitrii asupra nmulirii, n instalaia pilot se mai stabilete sensibilitatea microorganismelor la infecii. Datele obinute privind nmulirea i dezvoltarea microorganismelor n instalaia pilot permit aplicarea condiiilor optime necesare la nivel industrial.

Metoda culturilor de suprafa. Pentru dezvoltarea microorganismelor dup aceast metod se folosesc tvi de diferite dimensiuni construite din aluminiu, oel inoxidabil, tabl de oel lcuit etc. Mediul de cultur poate fi lichid sau solid; el se aeaz pe tvi n strat de grosime convenabil (1-10 cm). Tvile se aeaz pe rafturi ntr-un dulap care se poate nchide ermetic. Instalaiile pilot de acest gen se construiesc astfel nct s se poat lucra att n condiii de sterilitate, ct i de semisterilitate, deoarece primele sunt greu de realizat la nivel industrial i, n acelai timp, n asemenea instalaii nu se pot dezvolta microorganisme sensibile la infecii.

Sterilizarea instalaiei se face cu abur, mediul fiind pus pe tvi, sau fr mediu, cu introducerea ulterioar a mediului sterilizat separat. n acest din urm caz, sterilizarea tvilor i a dulapului se poate face cu antiseptice. nsmnarea se efectueaz prin tuuri speciale prin pulverizarea pe mediu a unei suspensii de microorganisme n stare vegetativ sau de spori. nsmnarea cu spori se poate realiza i prin pomparea sporilor cu ajutorul unui curent de aer steril: sporii se depun ncetul cu ncetul pe mediu i ncep s se dezvolte. Dac mediul de cultur i microorganismul nu sunt prea sensibile la infecii, nsmnarea se poate face fr prea mari precauii de meninere a sterilitii.

Aerarea culturii n timpul nmulirii se realizeaz cu aer sterilizat i condionat (temperatur i umiditate) care se sufl ncet deasupra tvilor.

Aceast metod se folosete la studiul cultivrii microorganismelor pe medii solide i pentru dezvoltarea acestora la suprafaa mediilor lichide n industriile fermentative (de ex. cultivarea bacteriei Acetobacter xylinum pentru obinerea celulozei bacteriale).

Metode submerse. Pentru nmulirea submers a microorganismelor n condiii pilot se folosesc instalaii care s semene mult ca mod de funcionare cu instalaiile industriale.

Tambure rotative. Dezvoltarea submers a microorganismelor n tambure rotative are loc prin rostogolirea mediului o dat cu rotirea tamburului. Aceste aparate permit folosirea mediilor lichide i a mediilor solide mrunite care nu se aglomereaz. Tamburul are forma de cilindru aezat orizontal i terminat cu capete semisferice. n interior are sudate de-a lungul generatoarei palete care antreneaz mediul n timpul nvrtirii i asigur o bun aerisire. Aerul steril necesar aerisirii se introduce prin ax. Aparatul se sterilizeaz cu abur i poate lucra sub presiune. Se folosete pentru studiul fermentaiei oxidative submerse i pentru cel al producerii enzimelor pe medii solide.

Fermentatoare pilot. Instalaiile pilot pentru nmulirea submers a microorganismelor prin barbotare de aer i agitare s-au perfecionat foarte mult n ultimul timp, existnd posibilitatea efecturii unor experimente identice cu cele din instalaiile industriale. Ele au caracter general, putnd fi folosite la orice fermentaie submers.Sterilizarea aerului tehnologic necesar n procesele aerobe, constitue una din problemele de importan major n biotehnologii, de rezolvarea creia depinde buna desfaurare a procesului de biosintez.

Pentru sterilizarea aerului se cunosc urmatoarele metode bazate pe distrugerea microorganismelor:

sterilizarea termica;

sterilizarea cu raze ionizate sau ultra-violete;

sterilizarea cu ageni chimici;

sterilizarea prin filtrare.

La sterilizarea aerului prin utilizarea procedeului termic, se cer temperaturi ridicate deoarece microorganismele au rezisten mare la temperaturi uscate. Astfel, dup Decker [25], sporii din aer sunt distrui n 24 secunde la 218-220C. Aceast temperatur poate fi obinut fie prin nclzirea aerului ntr-un schimbtor de cldur, fie prin comprimarea aerului n compresor adiabatic [26].

Metodele de sterilizare prin utilizarea radiaiilor catodice, gama, U.V.,cu lungime de unda cuprinse ntre 2,265 i 3,287 [27] i a agenilor chimici, printre care fenol, etilen-oxid, derivai orgalo-mercurici, nu au depit sfera de laborator.

Sterilizarea aerului prin metoda filtrrii, se realizeaz pe filtre mecanice prevzute cu un strat de material fibros. La nceput s-au folosit fibre din bumbac dar, odat cu dezvoltarea produciei industriale de antibiotice, fibrele de bumbac au fost nlocuite cu fibre de sticl.

Bazele teoretice a filtrrii aerosolilor stabilite de Chen [31] i analiza matematic a acestui proces, efectuat de Aiba [32], permit estimarea distribuiei longitudinale a bacteriilor n filtre i proiectarea filtrelor [5,33].

n prezent, cea mai larg utilizare n procesele boitehnologice o are procesul de sterilizare a aerului bazat pe principiul filtrrii combinat cu efectul termic.

Dup acest procedeu, aerul tehnologic supus procesului de sterilizare trece prin filtru cu saci pentru separarea particulelor solide, apoi este nclzit, in schimbtor de cldur sau n compresor, la 150-160C. Aerul nclzit este trecut n continuare printr-un rcitor de aer, separator de picturi, filtru principal cu material fibros (prima treapt de purificare), filtru individual cu material fibros (treapta a doua de purificare) dup care ptrunde n fermentator. Schema de principiu a liniei de purificare i sterilizare a aerului tehnologic este redat n figura 13.bioreactor

1 2 3 4 5 6

Figura 13. Procedeu pentru sterilizarea aerului tehnologicn care:1 - filtru cu saci;

2 - compresor (sau prenclzitor);

3 - rcitor;

4 - separator de picturi;

5 - filtru principal;

6 - filtru ndividual;

La nclzirea aerului prin comprimare adiabatic creterea temperaturii se determin cu ecuaia:

n care: T1= t iniial a aerului n K;

T2 = t final a aerului n K;

Dac nclzirea aerului se face n schimbtor de cldur eav n eav, temperatura final se determin din bilanul termic.

Filtrul de aer este format dintr-un strat de material filtrant plasat ntre dou plci perforate. Stratul de material filtrant, din fibra de sticl cu ( = 6-9 ( are grosimea cuprins ntre 7 10 cm. Pentru a evita antrenarea fibrelor filtrante, se monteaz ntre stratul filtrant i plci plas de srm.

n general filtrele de aer au diametrul de 360 mm. Grosimea stratului filtrant se stabilete prin calcul, iar pentru siguran n exploatare valoarea obinut se majoreaz cu 10 15 %.

1 tu ieire aer

2 plac perforat3 plas de srm4 garnitur din

cauciuc spongios

5 strat fibros

6 rama filtrului

7 tu intrare aer.

2.4.2.2. Influena strii termodinamice a aerului asupra gradului de sterilizare.

Materialul filtrant asigur gradul de sterilizare dorit numai dac se evit umezirea acestuia prin ptrunderea umiditii din aer sau a uleiului din compresor.

Sub acest aspect este necesar a se determina corect condiiile climatice iniiale - presiunea, umeditatea relativ, temperatura medie - iar funcie de ele s se stabileasc regimul de exploatare al instalaiilor de sterilizare a aerului.

Pentru a nu favoriza ptrunderea umiditi n filtrul principal i n cel individual aerul comprimat se rcete sub valoarea temperaturii punctului de rou, se ndeprteaz umiditatea separat i se nclzete pentru a depi temperatura critic. Acest procedeu, de rcire a aerului i ndeprtarea parial a umiditii este utilizat n perioada de var cnd aerul are temperatur i umeditate relativ mare.

Dac aerul are un coninut sczut n umiditate, cum este n perioada de iarn, rcirea se face pn la o temperatur superioar punctului de rou, dup care se trece prin cele dou filtre.

n industria de biosintez, presiunea aerului la ieirea din compresor este cuprins ntre 1,5 - 2,5 at., iar dup filtrul individual ntre 1-2 at. Deoarece scderea presiunii aerului determin scderea temperaturii punctului de rou, valoarea acestuia se va stabili n funcie de presiune i umeditate. Astfel pentru aerul cu o umiditate d g/kg aer uscat i presiune P cunoscute, se poate determina cu relaia (3), presiunea parial a vaporilor de ap saturai, iar funcie de aceasta se scoate din tabel temperatura punctului de rou, care se va compara cu temperatura aerului dup filtru individual.

Parametrii principali ai procesului de sterializare a aerului sunt: temperatura punctului de rou a aerului comprimat, temperatura aerului dup filtrul individual i temperatura aerului dup destinderea adiabatic la ieirea din barbotor. Valorile acestor parametri se pot stabili cu diagrame ce dau dependena dintre coninutul de umiditate i temperatura punctului de rou precum i dependena dintre temperatura aerului dup scderea presiunii i temperatura iniial.2.4.3. Procedee industriale

Elementele principale ale acestor instalaii sunt vasele de fermentaie numite i fermentatoare (figura 14). De obicei, nmulirea microorganismelor se face n mai multe etape cu un raport de nsmnare de 10%. Pentru aceasta se construiesc grupuri de fermentatoare formate din dou sau trei vase cu capaciti de 50, 500 i 5000 L.

Fermentatoarele sunt prevzute cu instalaii de insuflare a aerului i agitare, cu posibilitatea modificrii att a sistemului de aerare, ct i a turaiei agitatorului. Sterilizarea mediului se face n fermentatoare prin manta cu vapori indireci sau chiar cu vapori direci prin barbotare n mediu. Rcirea i termostatarea se efectueaz prin manta, prin circulaia apei de termostatare.

Fig. 14. Fermentator pentru dezvoltarea microorganismelor n culturi submerse; 1-aparat de inregistrat presiunea; 2-filru de aer; 3- debitmetru de aer; 4- conducta de aer; 5- agitator; 6-robinet de luat probe; 7-evacuare la canal; 8-robinet de evacuare; 9-barbotor; 10-termometru; 11-serpentina; 12-sicane; 13-gura de vizitare; 14-dispozitiv pentru spargerea spumei.

Pentru controlul temperaturii i al debitului de aer exist aparate de nregistrare a acestor parametri. Aerul este furnizat de compresoare cu piston sau turbosuflante de capaciti corespunztoare. Sterilizarea aerului se face prin filtre generale cu crbune, vat de sticl i az