Sistemul imun specific (Apărarea specifică, dobândită sau adaptativă)

Cuprinde componente mult mai specializate decât apărarea nespecifică si completează protectia exercitată de aceasta. In termenii evolutiei, apărarea specifică a apărut relativ târziu si este prezentă numai la vertebrate. Desi un individ se naste cu capacitatea de a dezvolta răspuns imun fată de un agent străin, imunitatea specifică este dobândită după contactul cu acel invadator si este specifică lui. Contactul initial cu un agent non-self (imunizarea) declansează un lant de evenimente care conduc la activarea unor anumite celule (limfocite) si la sinteza unor molecule, dintre care unele, anticorpii, interactionează specific cu agentul (antigen) declansator. Prin acest proces, individul dobândeste capacitatea de a tine piept si de a rezista la atacuri sau expuneri ulterioare la acelasi antigen.Imunoglobulinele

Una dintre functiile majore ale sistemului imun este productia de proteine solubile, care circulă liber si contribuie într-o manieră specificã la imunitate si protectie fată de structurile non-self. Ele au fost numite anticorpi si fac parte dintr-o clasă de proteine numite globuline, datorită structurii lor globulare. Initial, datoritã proprietătilor lor migratorii în câmp electric, aceste molecule au fost numite gamma-globuline, astăzi sunt cunoscute sub numele de imunoglobuline. Imunoglobulinele se găsesc sub două forme, solubilă si membranară. Imunoglobulinele solubile, numite si anticorpi, sunt secretate de plasmocite, celule ce se diferentiază din limfocitele B activate. Imunoglobulinele membranare se asociază cu un heterodimer, numit Ig-alpha/Ig-beta, exprimat in dublu exemplar, pentru a forma receptorul pentru antigen (BCR) al limfocitului B, implicat în recunoasterea specifică a antigenelor. Imunoglobulina este responsabila de recunoasterea si interactiunea cu antigenul, în timp ce heterodimerii sunt responsabili cu transmiterea intracelulara a semnalului de activare.

Imunoglobulinele sunt glicoproteine, formate din patru lanturi polipeptidice: două, identice, cu greutate moleculară mare, numite lanturi grele (sau H de la heavy) si două lanturi identice, cu greutate moleculară mai mică, numite lanturi usoare (sau L de la light), solidarizate între ele prin legături disulfidice inter-lanturi.

Digestia moleculei de anticorp cu papaină conduce la scindarea sa în două fragmente identice, monovalente, numite Fab (antigen-binding fragment) si un fragment Fc (usor cristalizabil). Digestia cu pepsină generează un fragment divalent, F(ab)2’ si mai multe peptide rezultate din digestia fragmentului Fc.

1

Studii asupra structurii imunoglobulinelor au evidenţiat existenta a 5 tipuri sau izotipuri de lanturi grele, numite , , , , si a doua tipuri sau izotipuri de lanturi usoare, numite k si . Izotipul unei molecule de imunoglobulina depinde de tipul lantului greu si de tipul lantului usor din care este alcatuita (ex. 2k2). Pentru că functiile efector ale imunoglobulinelor depind numai de tipul de lant greu, de obicei izotipurile sau clasele de imunoglobuline se descriu numai in functie de acest lant (ex. lant - IgM, lant - IgG, lant - IgD, lant - IgE, lant - IgA).

In starea nativa a moleculei de imunoglobulina (structura cuaternara), cele patru lanturi sunt organizate în domenii globulare, fiecare dintre acestea continând aproximativ 110 aminoacizi si fiind stabilizate prin legături disulfidice intra-lanturi. Domeniile globulare sunt de două feluri, variabile si constante.

Domeniile N-terminale ale lanturilor H si L sunt variabile, contin regiuni hipervariabile (CDRs- regiuni determinante ale complementaritatii) si formează împreună situsul de legare a antigenului (paratop).

Fiecare lant usor este organizat în două domenii, unul variabil (VL), spre capatul amino-terminal si unul constant (CL), spre capatul C-terminal. Fiecare lant greu este organizat în patru sau cinci (depinde de izotip) domenii, unul variabil (VH) si trei sau patru, constante (CH1, CH2, CH3 CH4). Intre domeniile CH1 si CH2 (la IgG, IgA si IgD) exista o regiune balama (hinge region), bogata in cisteina si punti disulfidice intre lanturile grele, care asigura regiunii Fab mobilitate fata de Fc.Domeniul imunoglobulinic. Este subunitatea structurala de baza a imunoglobulinelor (de fapt a mai multor tipuri de proteine, care, datorita organizarii sub forma domeniilor globulare au fost grupate intr-o superfamilie, numita superfamilia imunoglobulinelor).

Studiul prin difractie cu raze X a lanturilor imunoglobulinelor cristalizate a aratat ca un domeniu este alcatuit din 7 foi -pliate antiparalele, dispuse in doua straturi, unul cu 3, altul cu 4 foi, solidarizate printr-o punte disulfidica, intra-domeniu. Foile -pliate sunt reunite la capete prin bucle peptidice bogate in glicina (le mareste flexibilitatea).

2

Acest prototip structural este numit modelul -barrel (butoi). Toate domeniile imunoglobulinelor prezinta aceasta structura, cu mici diferente intre domeniile variabile si cele constante.

Lantul usor organizat in doua domenii, VL si CL

In cursul formarii moleculei complete, asocierea lanturilor grele si usoare presupune realizarea unui contact direct intre domeniile celor doua lanturi pereche, domeniile VH cu VL si domeniile CH1 cu CL. Alaturarea domeniilor VH si VL formeaza intre straturile un sant (un buzunar) in care se pot potrivi molecule de antigen. Acest buzunar, impreuna cu buclele de la capetele regiunii variabile formeaza situsul de combinare cu antigenul al moleculei de anticorp sau paratopul.

Pe baza diferentelor moleculare de la nivelul fragmentelor Fc ale lanturilor H, care sunt responsabile de diferitele functii biologice, caracteristice fiecărei clase, s-au descris 5 clase majore (izotipuri) de imunoglobuline, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.IgG este clasa majoră de imunoglobuline, reprezentand aproximativ 75% din totalul anticorpilor din ser, cu o concentratie de circa 1200 mg/dl (variaza intre 800 si 1600 mg/dl). Este un anticorp de mare afinitate (afinitatea reprezintă forta de legare a anticorpului cu antigenul), este capabil să activeze complementul, să neutralizeze toxine bacteriene si este singura clasă capabilă să traverseze placenta, conferind imunitate fătului. Cuprinde patru subclase, IgG1-IgG4 si predomină în răspunsul imun secundar. Functioneaza ca opsonina, fagocitele si celulele NK exprimand pe membrane receptori pentru fragmentul Fc al IgG, receptori numiti FcRI (CD64), FcγRII (CD32) si FcγRIII (CD16).

IgM reprezinta 8-10% din totalul anticorpilor din ser, cu o concentratie normala de 120 mg/dl. IgM este exprimată, sub forma monomerică, ca receptor pentru antigen, pe membrana limfocitului B. Forma circulanta se prezinta sub forma de polimer (cel mai frecvent pentamer), solidarizarea monomerilor identici de IgM in molecula de pentamer realizandu-se cu ajutorul unui lant polipeptidic,

3

numit lant J. Anticorpii IgM au afinitate relativ scazuta pentru antigen, compensata insa de aviditatea respectabila pe care o au pentamerii pentru antigenele multivalente.

Este clasa cea mai eficientă în activarea sistemului complement si se sintetizează în răspunsul imun primar (este prima clasa de imunoglobuline pe care o produce un plasmocit diferentiat din limfocitul B activat specific de catre antigen).IgA este prezentă sub doua forme: serica si secretorie.IgA serica reprezinta 15-20% din totalul anticorpilor serici, cu o concentratie normala de aproximativ 200 mg/dl. Peste 80% din IgA serica exista în formă monomerică, restul se prezinta ca polimeri, în special dimeri, formati prin solidarizarea a doua molecule identice de IgA cu ajutorul lantului polipeptidic J.IgA secretorie este imunoglobulina ce predomina in secretii (saliva, lacrimi, colostru, transpiratie, secretii bronsice, intestinale, genitourinare) si asigură protectia mucoaselor. IgA secretorie este un dimer, la care se ataseaza un alt polipeptid, numit componenta secretorie, cu rol de a proteja imunoglobulina de actiunea proteazelor din secretii. IgA secretorie protejeaza mucoasele, impiedicand aderarea patogenilor la celulele epiteliale. Functioneaza ca opsonine, neutrofilele avand pe membrane receptori pentru fragmentul Fcα (FcαR).

IgD reprezinta mai putin de 1% din totalul anticorpilor, concentratia serica fiind de 3-5 mg/dl. Este exprimată, ca monomer, împreună cu IgM, pe membrana limfocitelor B naive (limfocite B mature, dar care nu au întâlnit antigenul pentru care exprimă receptor specific), unde functioneaza ca receptor pentru antigen. Nu se cunosc in totalitate functiile acestei clase de imunoglobuline.

IgE reprezinta 0,004% din totalul anticorpilor serici, avand o concentratie de aproximativ 0,05 mg/dl. Se prezinta numai sub forma de monomer si este asociata cu reactiile de hipersensibilitate imediata (atopia si anafilaxia). IgE este homocitotropica, adica are afinitate pentru celulele speciei gazdei in care a fost produsa. Fragmentul Fc interactionează cu receptori specifici exprimati pe mastocite si bazofile (FcR), activând aceste celule si declansând degranularea lor si eliberarea de substante biologic active ce mediază reactiile de hipersensibilitate de tip I (alergii). IgE este, de asemenea, implicată în imunitatea anti-parazitară. Opsonizeaza parazitii, facilitand uciderea acestora de catre celulele efector ce exprima receptori Fcε.

4

Genetica imunoglobulinelor si generarea diversitatii anticorpilor.Virtual, sistemul imun trebuie sa fie capabil sa recunoasca orice patogen existent sau care ar putea apare la un moment dat. Acest aspect implica generarea de milioane de anticorpi cu specificitati diferite (repertoriul imunologic a fost stabilit la aproximativ 1015-1018). Daca fiecare anticorp ar fi codat de o gena (conform dogmei genetice, o gena=o proteina), atunci numai genele necesare anticorpilor ar depasi numarul total de gene din genom.

Descoperirea regiunilor variabile si constante ale imunglobulinelor a condus la ipoteza mai multe gene=un lant polipeptidic. Genele din linia germinala se organizeaza, in celulele somatice, printr-un proces numit recombinare somatica, pentru a forma o gena pentru regiunea variabila. Urmeaza apoi asocierea genelor pentru regiunea variabila cu o gena pentru regiunea constanta, cu formarea unui exon final, care contine informatia genetica necesara sintezei unui lant al imunoglobulinei. Un lant greu este codat de asocierea a 4 gene, numite generic V-D-J-C. (genele V, D si J codeaza regiunea variabila, iar gena C codeaza regiunea constanta). Un lant usor este codat de un exon format din genele V-J-C.

Receptorul pentru antigen al limfocitului T (TCR)Descoperirea faptului ca foarte putine limfocite T pot reactiona cu un anumit antigen a

condus, la sfarsitul anilor ’70, la concluzia ca limfocitele T, ca si limfocitele B, exprima receptori unici si specifici pentru un anumit antigen. Aceste structuri au fost numite TCR (T-cell receptor).

TCR este un heterodimer, compus din doua lanturi glicoproteice. Exista doua tipuri de TCR, fiecare asociat cu linii celulare T distincte:TCR-1, heterodimer , este primul care apare in ontogenie si este exprimat pe membrana unui numar limitat de limfocite T (<5% din totalul limfocitelor T);TCR-2, heterodimer , este exprimat de majoritatea limfocitelor (95%) in viata adulta.Ca si receptorul pentru antigen al limfocitelor B (BCR), TCR este distribuit clonal, adica fiecare clona de limfocite exprima un receptor unic si specific, diferit de al altor clone.

Structura TCR . Ca si limfocitele B, limfocitele T recunosc antigenul intr-o maniera specifica. Spre deosebire, insa, de limfocitele B care, prin imunoglobulinele membranare, recunosc si interactioneaza cu antigenul liber, limfocitele T recunosc antigenul pe suprafete celulare, ca peptide scurte si numai asociate cu moleculele MHC self, fenomen numit restrictie MHC.

TCR este alcatuit din doua lanturi glicoproteice, si , fiecare dintre ele ancorat in membrana limfocitului. Regiunea extracelulara a ambelor lanturi este organizata in cate doua domenii globulare, asemanatoare domeniilor imunoglobulinelor (TCR este membru al superfamiliei

5

imunoglobulinelor). Fiecare domeniu este alcatuit din aproximativ 110 aminoacizi si prezinta o punte disulfidica ce inchide o bucla de aproximativ 65 de aminoacizi.

Lantul este organizat in doua domenii, 1 si 2. Domeniul 1, dinspre capatul N-terminal este variabil, iar domeniul 2 este constant. Lantul este organizat si el in doua domenii: 1, variabil si 2, constant. Impreuna, cele doua domenii variabile formeaza situsul de legare a antigenului sau paratopul. Spre deosebire de molecula de imunoglobulina, care este divalenta, TCR este monovalent. Juxtamembranar, adica in apropierea membranei limfocitului T in care sunt ancorate, lanturile si sunt unite printr-o legatura disulfidica.

Portiunile transmembranare ale celor doua lanturi contin reziduuri bazice (arginina, lizina), incarcate pozitiv, necesare interactiunii cu moleculele CD3. Cozile intracitoplasmatice ale celor doua lanturi sunt scurte, ceea ce impiedica transmiterea in interiorul celulei a semnalelor ce iau nastere in urma interactiunii TCR cu complexul Ag/MHC. In consecinta, pe suprafata limfocitelor T, moleculele TCR sunt asociate stabil cu un complex de molecule invariabile, numit CD3. Acesta este alcatuit din 6 lanturi , , 2, 2, (sau , sau ) (lanturile si din alcatuirea complexului CD3 nu sunt aceleasi cu cele din care este alcatuit TCR). Lanturile , si din complexul CD3 prezinta fiecare in regiunea extracelulara cate un domeniu globular asemanator imunoglobulinelor (sunt membri ai superfamiliei imunoglobulinelor), cu o legatura disulfidica intradomeniu.

Lanturile si nu sunt organizate in domenii, prezinta o portiune extracelulara foarte scurta (9 aa), sunt solidarizate juxtamembranar de o punte disulfidica si pot forma homodimeri ( sau ), sau heterodimeri (). Cele doua lanturi prezinta, in schimb, cozi intracitoplasmatice foarte lungi (113 aa pentru lantul si 155 aa pentru lantul ), avand rol in transmiterea semnalului de activare in interiorul celulei. Lanturile si au importanta particulara in transmiterea intracelulara a semnalului de activare, cozile lor intracitoplasmatice prezentand secvente de aminoacizi ce formeaza motive de activare (ITAM – immunoreceptor tyrosine-based activation motif) la nivelul carora actioneaza tirozin-kinaze.

Asocierea complexului CD3 cu TCR se realizeaza datorita faptului ca in regiunile transmembranare, lanturile CD3 contin aminoacizi cu sarcini negative (reziduuri de acid aspartic), care interactioneaza cu cei cu sarcini pozitive de la nivelul lanturilor TCR. Complexul CD3 este exprimat de timpuriu, in ontogenie, de catre timocite si proteinele componente par sa fie esentiale pentru expresia pe membrana a TCR. Indivizii deficienti in anumite lanturi ale CD3 (in special si ) prezinta nivele scazute de expresie a TCR.Genele si generarea diversitatii TCR. TCR este o molecula responsabila de recunoasterea specifica a complexului peptid antigenic/MHC (complex Ag/MHC). Diversitatea imensa, necesara pentru recunoasterea antigenelor de catre limfocitele T, este asigurata de aceleasi mecanisme ce functioneaza si in cazul imunoglobulinelor (cu cateva exceptii). Exonii ce codeaza lanturile TCR sunt formati prin recombinari somatice aleatorii a mai multor gene. Lanturile sunt codate de asocierea a 4 gene (VDJC) iar lanturile sunt codate de asocierea a 3 gene (VJC). La acest mecanism de recombinare la intamplare a mai multor gene se mai adauga si altele, la fel de importante, care cresc si mai mult diversitatea acestor receptori (1015-1018).

Indivizii speciei umane prezinta apoximativ 5% limfocite T ce exprima TCRγδ si acestea sunt cantonate si predomina in cateva tesuturi din organism, cum sunt pielea, epiteliul intestinal si cel

6

pulmonar, etc. Receptorul prezinta o variabilitate mult mai redusa decat cea a TCRαβ si cele mai multe limfocite T pozitive pentru acest tip de receptor nu exprima co-receptorii CD4 si CD8, ceea ce a dus la speculatii privind faptul ca aceste limfocite nu sunt MHC-restrictate si ca au capacitatea de a recunoaste Ag direct, neprocesat si neprezentat in asociere cu proteinele MHC.Moleculele co-receptor CD4 si CD8. Limfocitele T se impart in doua clase majore, in functie de expresia a doua molecule membranare, numite CD4, respectiv CD8, care vor determina clasa de molecule MHC cu care limfocitul va interactiona.

Limfocitele T CD4+ recunosc si reactioneaza cu complexe formate din peptidul antigenic si molecule MHC clasa II (complex Ag/MHC II). Cele mai multe limfocite T CD4+, MHC II-restrictate, sunt limfocite T helper, producatoare de citokine si reprezinta 50-60% din totalul limfocitelor T.

Limfocitele T CD8+ recunosc si interactioneaza cu peptide antigenice asociate numai moleculelor MHC clasa I (complexe Ag/MHC I). Cele mai multe limfocite T CD8+, MHC I-restrictate, sunt limfocite T citotoxice (CTL – cytotoxic T lymphocyte).

Molecula CD4 este o glicoproteina de 55 kDa exprimata ca monomer. Este membra a superfamiliei imunoglobulinelor, organizandu-si regiunea extracelulara in 4 domenii globulare. Coada intracitoplasmatica este lunga si contine 3 reziduuri de serina, ce pot fi fosforilate. Molecula CD8 este o glicoproteina care se exprima pe membrana celulara ca un dimer alcatuit din doua lanturi fie diferite (heterodimer αβ), fie identice (homodimer αα), solidarizate printr-o legatura disulfidica si avand greutati moleculare de 30, respectiv, 38 kDa. Fiecare lant prezinta cate un domeniu globular extracelular (sunt membri ai superfamiliei imunoglobulinelor), o regiune transmembranara si o coada intracitoplasmatica cu reziduuri de aminoacizi ce pot fi fosforilate.

Moleculele CD4 si CD8 prezinta niste caracteristici si abilitati importante care au facut ca ele sa fie considerate co-receptori. Pe de o parte, intervin in interactiunea dintre TCR si complexele Ag/MHC, in sensul ca domeniile lor extracelulare se leaga de domeniile constante ale moleculelor MHC. Molecula CD4 se leaga de domeniul β2 al MHC II, in timp ce molecula CD8 interactioneaza cu domeniul α3 al MHC I. Pe de alta parte, cele doua glicoproteine intervin atat in cresterea fortei de interactiune dintre limfocitele T si APC-uri sau LyT/celule tinta, cat si in transmiterea semnalului de activare, aceasta functie fiind mediata de regiunile lor citoplasmatice, ce se asociaza cu kinaze din familia src.

O caracteristica unica a moleculei CD4 este cea de interactiune cu HIV (virusul imunodeficientei umane dobandite), fenomen ce mediaza parazitarea de către virus a limfocitelor T helper.

7