1

CURS BIOLOGIEMOLECULARĂ

PROCESAREA ARN, Transport Nuclear

şi Control Post-Transcripţional

Prof. Dr. Marieta Costache

2

*Elongarea ARN de către ARN polimeraza

3

*Transcripţia a două gene ribozomale contigue la E. coli

4

*Micografie

electronică a

transcripţiei şi

translaţiei simultane

la E. coli

5

*Legarea actinomicinei D la

duplexul ADN

Legarea se realizează la nivelul unei

secvenţe d(GAAGCTTC)

6

Terminarea Transcripţiei

Există mai multe mecanisme care reglează

terminarea transcripţiei la bacterii şi celule eucariote

La bacterii principalele mecanisme implică ARN

polimeraza, unul dintre mecanisme necesitând şi factorul de

terminare Rho

La eucariote, mecanismele pentru terminarea

transcripţiei diferă pentru cele trei tipuri de ARN polimeraze

7

*Secvenţa ipotetică de baze care formează un

terminator eficient la E. coli

Secvenţa a fost dedusă prin analiza mai multor transcripţi

8

Terminarea Rho-independentă apare la nivelul

unor secvenţe caracteristice ale ADN din E. coli

9

Terminarea prematură prin atenuare ajută la

reglarea expresiei unor operoni bacterieni

10

Mecanismul de atenuare pentru transcripţia

operonului trp

11

Siturile pentru terminarea Rho dependentă sunt

prezente în unele gene ale fagului şi ale E. coli

Factorul Rho factor este o proteină hexameră

dispusă de-a lungul unui segment de 70 – 80 baze al

transcriptului ARN în formare

Rho alunecă apoi de-a lungul ARN în direcţia 3

până când acestă desface hibridul ARN-ADN de la nivelul

situsului activ al ARN polimerazei

Dacă transcripţia este terminătă sau dacă nu

depinde de factorul Rho, acesta se eliberează de pe ARN

polimerază

Siturile Rho dependente nu posedă secvenţe

consens clare şi mecanismul de terminare Rho dependent este

caracteristic numai câtorva operoni

12

Cele 3 ARN polimerazele folosesc diferite

mecanisme de terminare

ARN polimeraza I realizează terminarea printr-un

mecanism care necesită factori specifici de terminare care se

leagă în aval de unitatea de transcripţie

ARN polimeraza II conţine semnalul de terminare

la nivelul unei regiuni de 0.5-2 kb aparţinând situsului de

adăugare a cozii poli(A), iar terminarea este cuplată cu procesul

care clivează şi poliadenilează capătul 3 al transcriptului

Transcripţia realizată de către ARN polimeraza III

este terminată după adăugarea unei serii de resturi U

13

Secvenţe la nivelul cărora ARN polimeraza III

termină transcripţia

14

Transcripţia genomului virusului HIV este reglată

printr-un mecanism de antiterminare

15

Procesarea ARNm de la eucariote

16

*Procesarea post-transcripţională

Formarea “coifului” ARNm de la

eucariote

Acesta este cunoscut drept “Cap0”, “cap1”

sau “cap2” dacă nu există modificări

ulterioare, dacă nucleozidul din structura

transcriptului este metilat O2’ sau dacă

primele două nucleozide sunt O2’ metilate.

17

Capătul 5-cap este

adăugat moleculei în

formare după iniţierea

transcripţiei de către ARN

polimeraza II

18

Pre-ARNm este asociat cu proteine hnRNP care conţin

domenii conservate de legare a ARN

Vizualizarea particulelor de ribonucleoproteine heterogene

asociate cu transcripţii în formare

19

Interacţia unui motiv RNP la nivelul

proteinei U1A şi a ARN

20

Proteinele hnRNP pot fi implicate în procesarea şi

transportul ARNm

21

Pre-ARNm sunt scindate la situsuri specifice 3 şi rapid

poliadenilate

22

Etapa finală de maturare: intronii sunt înlăturaţi iar

exonii sunt sudaţi împreună

23

*Electrono-

micrografie care

evidenţiază

formarea hibridului

pre-ARNm/ARNm

24

Secvenţe consens la nivelul a diferite tipuri de

situsuri de “splicing”

25

“Splicing-ul” se produce la nivelul unor secvenţe

conservate, scurte

Secvenţe “consens” situate la nivelul situsurilor de “splicing”

5 şi 3 din structura ARNm de la vertebrate

Sunt indicate procentajele în care apar bazele specificate în pre-ARNm. De reţinut că

situsul de splicing 3’ este precedat de un fragment în care predomină nucleotidele

pirimidinice.

26

*Etapele procesului de producere a ARNm matur

(gena ovalbuminei de pui)

27

Analiza produşilor ARN

formaţi într-o reacţie de

“splicing” in vitro

28

Mecanismul de

“splicing” presupune

două reacţii de

transesterificare

29

*Secvenţa reacţiilor de transesterificare

implicate în unirea exonilor

30

Moleculele de “small nuclear RNAs (snRNAs)

asistă reacţia de “splicing”

31

Spliceozomul – complex ribonucleoproteic compus

din multe molecule de “snRNPs”

32

Ciclul de acţiune

la nivelul

spliceozomului

33

Auto-”splicing-ul” intonilor de grup II furnizează

indicii pentru evoluţia snRNPs

34

Secvenţele elementelor conservate în mai mulţi

introni din grupul I

35

Auto-splicing-ul intronilor de grup 1 - ARN catalitic

36

Auto-splicingul

pre-ARNr de la

Tetrahymena

37

Secvenţe consens la nivelul a diferite tipuri

de situsuri de splicing Tip de intron joncţiunea

tăieturii 5’

joncţiunea

apropiată

tăieturii

3’

joncţiunea

tăieturii 3’

pre-ARNm nuclear

(general)

CRGGUAGA

GU

A YnAGN

pre-ARNm nuclear (drojdii) GUAUGU UACUAAC YnAGN

ARNt N N N N

Grupul I (ARNr nuclear,

ARNm şi ARNr

mitocondrial)

U G

Grupul II (ARNm

mitocondrial)

GUGCG YnAU

ARNm din cloroplaste

(Euglena)

GUGCUG YnAU

C

38

Mărimea moleculelor ARN U

Mărimea în nucleotide

ARN U Drojdii Mamifere

U1 568 164

U2 1175 187

U3 - 217

U4 160 145

U5 214 116

U6 112 106

U7 - 65

U11 - 131

39

Proteine din structura snRNP de la

mamifere

Proteine ARN U conţinut în snRNP

indicate

U1 U2 U3 U5 U4/U6 Masă moleculară

(kD)

B, B’, D, D’, E, F, H + + - + + 28, 29, 16, 15, 5, 12,

11, 9

70k, A, C + 70, 34, 22

A’, B’’ + 33, 28

25K, 1BP + 25, 100 sau 70

(34K, 74K, 59K) + 34, 74, 59

30K, 13K, 125K + 30, 13, 125

40

Majoritatea transcripţiei şi procesarea ARN apare într-

un număr limitat de domenii din nucleul celulelor de

mamifere

ADN:albastru

ARN poliadenilat: roşu

Proteinele de “splicing”: verde

ARN poliadenilat: roşu

41

Concluzii

Precursorii ARNm de la eucariote sunt procesaţi prin adăugarea structurii “cap”, scindare

3’ şi poliadenilare, sudarea exonilor (splicing) şi înlăturarea intronilor înainte de transportul ARNm în

citoplasmă unde urmează a fi tradus de către ribozomi;

Structura “cap” este adăugată la capătul 5’ al pre-ARNm, în formare, de către o enzima

specifică care este asociată cu domeniul CTD fosforilat al ARN polimerazei II, la puţin timp după

iniţierea transcripţiei;

Transcripţii pre-ARNm, în formare, sunt asociaţi cu o clasă de proteine de legare a ARN

numite hnRNP;

La majoritatea genelor care codifică pentru proteine, un semnal de poliadenilare conservat

(AAUAAA) este situat la 10-30 nucleotide în amonte de situsul poli(A) unde apare clivarea şi

poliadenilarea.

Un complex multiproteic care include poli(A) polimeraza (PAP) realizează scindarea şi

poliadenilarea pre-ARNm. O proteină nucleară de legare la poli(A), PABII, stimulează adăugarea de

resturi A de către PAP şi opereşte procesul odată ce “coada” poli(A) atinge 200-250 resturi;

Splicingul ARN este realizat de către un complex ribonucleo-proteic, numit “spliceozom”,

care este asamblat prin interacţiile a cinci particule RNPsn diferite, între ele, şi de asemenea cu pre-

ARNm. Spliceozomul catalizează două reacţii de transesterificare care sudează exonii şi inlătură

intronul sub forma unei structuri in “laso”, care este ulterior degradată.

Intronii autocatalitici de grup II, care au fost evidenţiaţi în genele cloroplastelor şi

mitocondriilor de la plante şi fungi, prezintă o structură secundară înalt conservată, care este necesară

pentru auto-splicing. Se consideră că particulele RNPsn din spliceozomi că au o structură secundată

similară cu cea a intronilor de grup II;

Majoritatea transcripţiei şi procesarea ARN din nucleii celulelor eucariote se realizează la

nivelul unui număr limitat de domenii. O reţea proteică fibroasă din interiotul nulcleului formează o

matrice nucleară. Aceasta poate servi la organizarea unor centre de transcripţie şi procesare a ARN.

42

Reglarea procesării ARNm: proteina U1A inhibă

poliadenilarea propriului pre-ARNm

43

“Splicing-ul” ţesut specific controlează expresia

fibronectinelor alternative

44

Expresia proteinei Sxl 11.3 (Sex-lethal) în timpul

embriogenezei la Drosophila

45

Cascada “splicing-ului”adaptativ care

controlează diferenţierea sexuală la Drosophila

46

Mai multe izoforme proteice sunt comune

sistemului nervos al vertebratelor

“Splicing-ul” alternativ al ARNm pentru slo care codifică un canal pentru Ca2+-

K+, în celulele auditive cu perişori (auditory hair cells), contribuie la perceperea

sunetelor cu diferite frecvenţe

47

Concluzii

Expresia anumitor proteine este reglată prin controlarea procesării transcriptului

primar al genei care codifică pentru aceasta. Acest tip de reglarea genică este în special

comun pentru genele care codifică proteine importante pentru funcţionarea sistemului

nervos la vertebrate;

Poliadenilarea pre-ARNmcare codifică proteina U1A este inhibată prin chiar

legarea proteinei U1A la două situsuri identice situate foarte aproape în amonte faţă de

situsul poli(A) al pre-ARNm pentru U1A. Drept rezultat, nu se produce ARNm funcţional,

expresia proteinei U1A fiind represată. Reglarea de acest fel nu este foarte comună;

“Splicingul” alternativ al transcripţilor primari produşi din unităţi complexe este

adesea reglat. Ca rezultat, pot fi exprimate diferite tipuri de ARNm pentru aceeaşi genă în

diferite tipuri celulare sau în diferite stadii de dezvoltare;

Splicingul alternativ poate fi reglat de către proteinele care se leagă la diferite

situsuri specifice din apropierea situsului reglare a matisării din structura ARN. Se

consideră că inhibitorii de splicing acţionează pentru a bloca steric accesul acestor factori la

secvenţa ARN. Activatorii procesului pot determina splicingul prin asocierea lor cu

situsurile de reglarea a îmbinării (matisării).

48

Porii nucleari asigură transportul activ

al macromoleculelor între nucleu şi

citoplasmă Complexul porului nuclear

49

Model pentru trecerea moleculelor de “mRNP” prin

complexele porului nuclear

50

Determinarea heterocarionului evidenţiază diferenţele

dintre proteina A1 şi proteina C din “hnRNP” de la om

privind trecerea prin porii nucleari

51

Model privind exportul proteinelor nucleare cargo

purtătoarea a unui semnal de export nuclear bogat în leucină

leucine-rich nuclear-export

signal (NES)

52

Model de export nuclear al

moleculelor de ARNm

mediat de “hnRNP”

53

Proteinele purtătoare de semnale nucleare de localizare

sunt recunoscute de receptori şi transportate în nucleu

NLS = nuclear-localization signal

54 NLS = nuclear-localization signal

Model de import a

proteinelor citosolice

purtătoare de semnale

NLS

55

Proteina Rev a HIV Rev reglează transportul

moleculelor de ARNm viral ne-maturate

56

Concluzii

Anvelopa nucleară conţine numeroase complexe ale porilor nucleari (NPC), sub forma unor structuri complicate, mari, compuse din multe copii a aproximativ 50-100 proteine numite nucleoporine; Ionii, metaboliţii şi proteinele mici difuzează liber prin porii nucleari, dar macromoleculele mai mari de 60 kDa trebuie transportate activ prin procese care necesită ATP şi presupun probabil modificări conformaţionale la nivelul complexului porului nuclear; Atât în importul cât şi în exportul nuclear, proteinele care trebuie transportate conţin o secvenţă de aminoacizi specifică care funcţionează ca semnal de export nuclear (NES) sau ca semnal de localizare nucleară (NLS). Proteinele prezente numai în nucleu conţin un semnal NLS dar nu şi unul NES, în timp ce proteinele care fac transferul între nucleu şi citosol conţin ambele semnale; În concordanţă cu modelele actuale, semnalele NES şi NLS din structura unei proteine “cargo” interacţionează cu proteine receptor specifice implicate în transportul nuclear localizate în nucleu în cazul exportului în citosol sau în citosol în cazul importului. Ambele procese de transport necesită şi participarea proteinei Ran o GTP-ază care există în diferite conformaţii când leagă GTP sau GDP; O dată ce este asamblat un complex “cargo” se consideră că proteina receptor din complex are contacte multiple cu nucleoporinele, transportând astfel complexul prin porul nuclear. După ce un complex “cargo” ajunge la destinaţie (citoplasmă în timpul exportului şi nucleu în timpul importului), disociază, eliberând proteina “cargo” şi celelalte proteine. Ultimele sunt transportate prin porii nucleari în direcţie inversă pentru a participa la transportul altor molecule.

57

Concluzii

Dimensiunea unidirecţională atât a exportului cât şi a importului se consideră că

derivă din localizarea factorului RCC1 (Ran nucleotide-exchange factor) în nucleu şi a

RanGAP (Ran GTP-ase-activating protein) în citoplasmă;

În timpul exportului unei RNPm nucleare, compusă dintr-o moleculă de ARNm

matură, funcţională şi proteine hnRNP, sunt înlăturate moleculele hnRNP cu localizare

nucleară, în timp ce moleculele hnRNP purtătoare de semnale NES leagă molecula de

ARNm şi o transportă prin complexul porului nuclear. După trecerea în citosol, aceste

molecule hnRNP navetă care posedă şi semnale NLS sunt eliberate de ARNm şi

transportate înapoi în nucleu pentru a participa la altă etapă de export nuclear;

Au fost identificate multe tipuri diferite de semnale NES şi NLS. Se consideră că

fiecare clasă de semnale nucleare de transport interacţionează cu receptori proteici

specifici. Receptorii implicaţi în transportul nuclear se caracterizează prin prezenţa unor

regiuni omologe care interacţionează cu Ran şi cu anumite nucleoporine;

Moleculele pre-ARNm din structura unui “spliceozom” nu sunt exportate din

nucleu. Nu se cunoaşte mecanismul acestei inhibiţii de transport care acţionează până în

momentul procesării corecte. Sunt exportate numai moleculele de ARNm funcţionale care

pot fi traduse în citoplasmă;

Proteina Rev a virusului HIV, care conţine un semnal NES, poate anula restricţiile

privind transportul moleculelor pre-ARNm cu situsuri specifice.

58

Editarea ARN modifică secvenţele moleculelor pre-ARNm

Un exemplu de la mamifere

59

Editarea ARN la protozoare

Editarea în kinetoplastul de la Tripanosoma

60

Durata de viaţă a moleculelor de ARNm

Jumătate de viaţă ARNm

Tipul celular Timpul unei

generaţii celulare

Medie Limite cunoscute în

cazuri individuale

Escherichia Coli 20-60 minute 3-5 minute 2-10 minute

Sacharomyces

cerevisiae

3 ore 22 minute 4-40 minute

Celule umane în

cultură

16-24 ore 10 ore 30 minute sau mai

puţin(histone şi ARNm c-

myc

0,3-24 ore moleculele de

ARNm specifice celulelor

cultivate

61

Efectul destabilizator al secvenţelor AUUUA

asupra timpului de înjumătăţire al ARNm (t1/2)

62

Viteza de degradare a moleculelor de ARNm de la

eucariote este reglată

Reglarea Fe-dependentă a stabilităţii ARNm al receptorului pentru transferină

63

Translaţia unor molecule de ARNm este reglată

specific de proteine de legare

specific RNA-binding proteins = proteine specifice de legare la ARN

Reglarea Fe-dependentă a translaţiei of ARNm pentru feritină

64

ARN antisens reglează translaţia ARNm al

transpozazei la bacterii

65

Concluzii

Editarea ARN reprezintă modificarea secvenţei nucleotidice a pre-ARNm în nucleu. Cele câteva exemple de editare descoperite la vertebrate implică dezaminarea unei singure baze din secvenţa ARNm, având drept rezultat modificarea aminoacidului specificat de codonul corespunzător şi producerea unei proteine funcţionale diferite. Procese de editare mult mai ample sunt prezente la ARNm mitocondrial de la protozoare; Anumite molecule de ARNm sunt direcţionate către localizări subcelulare de către secvenţe poziţionate, de obicei, în regiunea 3’ netradusă. Se consideră că aceste secvenţe sunt ţinte pentru proteine care se leagă specific la ARNm şi care sunt asociate cu proteinele motoare. Proteinele motoare transportă apoi ARNm în poziţii specifice prin deplasarea de-a lungul filamentelor de actină ale citoscheletului sau microtubulilor; Stabilitatea diferitelor molecule de ARNm în citoplasmă variază foarte mult. Totuşi, multe molecule de ARNm de la eucariote sunt destul de stabile iar altele au durate de viaţă foarte scurte. Acestea din urmă, codifică adesea pentru proteine si, în general, posedă copiii repetitive ale secvenţei AUUUA la capătul 3’ netradus. Printr-un mecanism necunoscut aceste secvenţe bogate în AU stimulează degradarea ARNm; Celulele eucariote pot regla rata de degradare sau traducere a unor molecule de ARNm. De exemplu, interacţia unei proteine specifice de legare la ARN cu situsurile regiunii 3’ netraduse din structura ARNm pentru receptorul transferinei protejează ARNm de degradarea mediată de secvenţele bogate în AU. Aceeaşi proteină, a cărei activitate este reglată de concentraţia intracelulară de Fe, blochează translaţia mai multor tipuri de ARNm legându-se la secvenţe specifice din regiunea 5’ netradusă; La bacterii, translaţia anumitor molecule de ARNm este represată de molecule ARN antisens, care hibridizează la capătul 5’ al ARNm, prevenind astfel translaţia prin blocarea accesului subunităţii ribozomale mici la codonul de iniţiere.

66

Genele pre-ARNr sunt similare la toate eucariotele

67

Genele pre-ARNr funcţionează ca organizatori nucleolari

Introducerea unei transgene pre-ARNr induce formarea unui nucleol

68

snoRNAs (small nucleolar RNAs)

asistă procesarea ARNr şi

asamblarea subunităţilor

ribozomale

69

Moleculele de pre-ARNt suferă scindare şi modificarea

bazelor

70

“Splicing-ul” moleculelor

pre-ARNt diferă de

celelalte mecanisme de

“splicing”

71

*Organizarea transcriptului primar ARNr 45S

Structura “cap de ciocan” a unei ribozime

72

Concluzii Asemeni moleculelor pre-ARNm, transcripţii primari produşi din genele pre-

ARNr şi ARNt suferă procesări extensive;

Sinteza unui precursorului pre-ARNr (45S în eucariotele superioare) de către

ARN polimeraza I şi procesarea acestuia apare în nucleol;

Clivarea, digestia exonucleotidică, şi modificarea bazelor pre-ARNr 45S conduce

la molecule mature 28S, 18S şi 5,8S ARNr, care se asociază cu proteinele rizozomale în

subunităţile ribozomale. O serie de snoARN (small nucleolar RNA) participă la procesarea

ARNr;

ARNr 5S, care este sintetizat în nucleoplasmă de către ARN polimeraza III, nu

este produs extensiv înaintea asamblării cu alte molecule de ARNr şi proteine pentru a

forma subunitatea ribozomală;

Primele molecule de ARNr catalitic (ribozime) descoperite au fost intronii de grup

I din ARNr de la Tetrahymena. Auto-splicingul intronilor de grup I şi II, şi splicingul pre-

ARNm la nivelul spliceozomilor se realizează prin intermediul a două reacţii de

transesterificare;

Transcripţia genelor ARNt de către ARN polimeraza III şi procesarea

transcripţilor primari apare în nucleoplasmă. În toate moleculele de pre-ARNt, secvenţa

capătului 5’ este îndepărtată de RN-aza P, o ribonucleoproteină care conţin un ARN

catalitic; CCA este adăugat la capătul 3’; o serie de baze interne sunt modificate;

Unele molecule de pre-ARNt conţin un intron scurt în interiorul buclei anticodon.

Acesta este înlăturat de enzime printr-un mecanism distinct de mecanismul de splicing al

pre-ARNm şi auto-splicingul intronilor;