curs 8 virusologie refacut

81
Elemente de Elemente de virusologie virusologie

Upload: sazunax

Post on 24-Nov-2015

260 views

Category:

Documents


26 download

TRANSCRIPT

  • Elemente de virusologie

  • CUPRINSVirusurile:Caractere generaleClasificareaMorfologie StructurMultiplicarea virusurilorMetode de cultivare a virusurilor (animale de laborator, ou embrionate, culturi de celule)

  • IntroducereVirusologia medicala se ocup cu studiul virusurilor umane si animale, cu implicarea acestora in patologia infecioas corespunztoare.

    Virusurile sunt ageni infecioi cu dimensiuni foarte reduse, care prezint parazitism strict intracelular.

    Studii de dat recent au evideniat ageni subvirali cu potenial patogen pentru plante, animale si om.Viroizii sunt molecule de ARN circular, alctuit din 200-400 nucleotide, fr capsid sau anvelop, care determin boli la plante.Virusoizii (ageni satelii) au genomul alctuit din cca. 1000 nucleotide si care se pot replica n asociere cu un alt virus a crui capsida o folosesc. Exemplu: virusul hepatitei D (delta) al crui genom format din ARN se acoper cu antigenul de suprafa al virusului hepatitei B (Ag HBS).Transpozomii sunt fragmente de genom mobile, capabile s-i modifice poziia.Prionii sunt ageni infecioi neconvenionali de natur proteic(proteine infecioase) care se pot replica la nivelul sistemului nervos central, determinnd leziuni ireversibile.

  • Caractere generale

  • Caractere generaleDimensiunile sunt reduse variind ntre 10-300 nm si pot fi evideniate numai prin examinare electronooptic;

    Virusurile sunt alctuite dintr-un miez de acid nucleic fie ARN fie ADN (niciodat ambele la acelai virus), nconjurat de proteine aezate dup o anumit simetrie care alctuiesc capsida viral. Acidul nucleic viral conine ntreaga informaie genetic necesar multiplicrii i codificrii celorlalte structuri virale care alctuiesc particula infectant (virionul);Virusurile se cultiv numai pe substraturi celulare vii, ele prezentnd parazitism strict intracelular (nu se pot multiplica dect ntr-o celul vie vegetal, bacterian sau animal, folosind aparatul ribozomal al acesteia pentru programarea sintezelor proprii prin devierea metabolismului celulei parazitate);Virusurile nu sunt sensibile la antibiotice;Replicarea viral induce sinteza unor substane numite interferoni care induc n celulele nc neinfectate rezisten la infecie (aciune antiviral);Infecia viral a celulelor organismului declaneaz viroza, care evolueaz fie inaparent, fie cu manifestri fiziopatologice i clinice caracteristice;

  • Clasificarea virusurilor

  • Clasificarea virusurilorClasificarea epidemiologic este foarte util pentru clinician i se refer la calea de transmitere a virusului:virusuri enterice cu transmitere fecal-oral (ex. poliovirusurile);virusuri respiratorii cu transmitere aerian (ex. virusurile gripale);virusuri cu transmitere sexual (ex. HIV);virusuri cu transmitere prin snge (ex. virusul hepatitei B, C);virusuri cu transmitere prin artropode (ex. arbovirusurile);virusuri cu transmitere vertical, materno fetal (ex. virusul rubeolos, CMV).Clasificarea virusurilor dup dimensiuni:virusuri mici: au cuprins ntre 15-30 nmde ex. Picornavirusurile (enterovirusurile)virusuri mijlocii: au cuprins ntre 70-180 nmde ex. mixovirusurile, virusurile din grupul herpes, HIV;virusuri mari: au cuprins ntre 200-300 nm de ex. pox-virusurile.Clasificarea virusurilor dup tropism:virusuri dermotrope: de exemplu. herpesvirusurile, poxvirusurile, virusul rujeolos, virusul rubeolic;virusuri enterotrope: de exemplu. enterovirusurile, rotavirusurile;virusuri neurotrope: de exemplu. arbovirusurile, v. rabic;virusuri cu tropism pentru cile respiratorii: de ex. mixovirusurile, adenovirusurile, rinovirusurile;virusuri hepatotrope: ex. virusurile hepatitice A, B, C;virusuri limfocitotrope: ex. HIV, v. rujeolos.Clasificarea virusurilor dup acidul nucleic coninut:n funcie de tipul de acid nucleic viral, exist urmtoarele familii cu importan medical:RIBOVIRUSURI (Virusuri ARN)DEZOXIRIBOVIRUSRI (Virusuri AND)

  • Clasificarea virusurilorRIBOVIRUSURI (virusuri ARN):1. Familia PICORNAVIRIDAE are 5 genuri:Enterovirus (virusurile polio, Coxsackie, ECHO)Cardiovirus (virusul encefalomiocarditei)Rhinovirus (agenii guturaiului)Aphtovirus (virusurile febrei aftoase)Heparnavirus (virusul hepatitei A)n aceast familie virusurile sunt fr anvelop, cu diametrul de 27-30 nm, au capsida cu simetrie icosaedric, au genom ss, cu polaritate pozitiv i infecios.2. Familia CALICIVIRIDAE cuprinde virusuri fr anvelop, cu simetrie icosaedric, cu diametrul 35-40 nm. Ex. coronavirusuri, astrovirusuri, agentul Norwalk3. Familia TOGAVIRIDAE include 4 genuri:Alfavirus (virusurile encefalitelor ecvine de vest i est, de Venezuela etc.)Rubivirus (virusul rubeolos)Hepacivirus (virusul hepatitei C)Pestivirus (virusul diareei bovine)Aceste virusuri sunt anvelopate cu diametrul de 60-70 nm, cu simetrie icosaedric, au genom ss cu polaritate pozitiv, infecios.4. Familia FLAVIVIRIDAE include virusurile febrei galbene, Denga, encefalitei ruse de primvar-var etc.5. Familia ARTERIVIRIDAE cuprinde virusul arteritei ecvine.6. Familia BUNYAVIRIDAE cuprinde virusurile encefalitei de California, virusul febrei hemoragice de Crimeea etc.7. Familia ORTHOMIXOVIRIDAE include 3 tipuri de virusuri gripale Influenzavirus A, B, C. Sunt virusuri anvelopate cu simetrie helicoidal, dimensiuni de ~ 80-120 nm, genom ss, segmentat, cu polaritate negativ.8. Familia PARAMIXOVIRIDAE include genurile: Morbillivirus (virusul rujeolos)Pneumovirus (virusul respirator sinciial)Paramixovirus (paramixovirusuri i virusul urlian)Acestea sunt virusuri cu diametrul 100-150 nm cu caractere asemntoare ortomixovirusurilor, cu genom nesegmentat care i confer stabilitate antigenic. 9. Familia RHABDOVIRIDAE (ex. virusul rabic etc.) - grupeaz virusuri anvelopate cu simetrie helicoidal, cu genom ss nesegmentat cu polaritate negativ.10. Familia FILOVIRIDAE include virusuri cauzatoare de febre hemoragice (virusul Marburg, virusul Ebola).11. Familia CORONAVIRIDAE cuprinde virusuri cu genom ss cu polaritate pozitiv.12. Familia REOVIRIDAE - are ca patogeni umani genurile:Reovirus conine virusuri cu tropism respirator i intestinalOrbivirus include virusuri encefalitogeneRotavirus cuprind virusuri cauzatoare de gastroenterite la nou-nscui i copii mici13. Familia RETROVIRIDAE include subfamiliile:Oncovirinae virusuri oncogene ARN, exemplu HTLV1,2 (Human T Cell Leukemia Virus)Lentivirinae ageni ai unor boli degenerative ale SNC i HIV (agentul cauzal al bolii SIDA)Spumavirinae cauzeaz infecii cronice, asimptomaticeSunt virusuri cu: simetrie icosaedric, genom ARN ss n dou copii identice, avnd prezent o enzim cu rol n replicare = reverstranscriptaza.

  • Clasificarea virusurilorRIBOVIRUSURI (virusuri ARN):8. Familia PARAMIXOVIRIDAE include genurile: Morbillivirus (virusul rujeolos)Pneumovirus (virusul respirator sinciial)Paramixovirus (paramixovirusuri i virusul urlian)Acestea sunt virusuri cu diametrul 100-150 nm cu caractere asemntoare ortomixovirusurilor, cu genom nesegmentat care i confer stabilitate antigenic. 9. Familia RHABDOVIRIDAE (ex. virusul rabic etc.) - grupeaz virusuri anvelopate cu simetrie helicoidal, cu genom ss nesegmentat cu polaritate negativ.10. Familia FILOVIRIDAE include virusuri cauzatoare de febre hemoragice (virusul Marburg, virusul Ebola).11. Familia CORONAVIRIDAE cuprinde virusuri cu genom ss cu polaritate pozitiv.12. Familia REOVIRIDAE - are ca patogeni umani genurile:Reovirus conine virusuri cu tropism respirator i intestinalOrbivirus include virusuri encefalitogeneRotavirus cuprind virusuri cauzatoare de gastroenterite la nou-nscui i copii mici13. Familia RETROVIRIDAE include subfamiliile:Oncovirinae virusuri oncogene ARN, exemplu HTLV1,2 (Human T Cell Leukemia Virus)Lentivirinae ageni ai unor boli degenerative ale SNC i HIV (agentul cauzal al bolii SIDA)Spumavirinae cauzeaz infecii cronice, asimptomaticeSunt virusuri cu: simetrie icosaedric, genom ARN ss n dou copii identice, avnd prezent o enzim cu rol n replicare = reverstranscriptaza.

  • Clasificarea virusurilorDEZOXIRIBOVIRUSURI (Virusuri ADN):1. Familia PARVOVIRIDAE cuprinde virusuri mici (18-26 nm) fr anvelop, genom ss. Infecteaz celulele stem ale mduvei osoase hematogene determinnd boli hematologice.2. Familia PAPOVAVIRIDAE include virusuri grupate n:subfamilia Polymixovirinae care determin tumori cu multiple localizrisubfamilia Papillomavirinae ce determin veruci sau papiloame cutanateSunt virusuri cu diametrul de 40-50 nm fr anvelop, cu o capsid icosaedric i un genom ADN ds circular.3. Familia ADENOVIRIDAE cuprinde ageni virali cu tropism adeno-faringo-conjunctival. Sunt virusuri cu diametrul 65-85 nm, fr anvelop, ce au capsid icosaedric i genom ds circularizat.4. Familia HEPADNAVIRIDAE conine virusuri cu tropism hepatic (virusul hepatitei B la om) cu diametrul 42 nm, genom parial ds, aproape circular.5. Familia HERPESVIRIDAE include 8 reprezentani cu importan maxim n patologia uman: virusurile herpes simplex tip 1 i 2 (HSV 1 i 2), virusul citomegalic (CMV sau Human Herpes Virus 3 HHV-3), virusul varicelo-zosterian (HHV-4), virusul Epstein-Barr (HHV-5) i HHV 6,7,8.Sunt virusuri anvelopate cu nveliuri suplimentare pericapsidare, cu diametrul variabil ntre 120-300 nm, capsida cu simetrie icosaedric genom linear ds.6. Familia POXVIRIDAE include: virusul vaccinia, virusul variolic, virusul Molluscum contagiosum, agenii Orf (parvaccinia). Sunt virusuri mari cu diametrul 200-350 nm cu anvelop, de form paralelipipedic.

  • Morfologia virusurilor

  • Morfologia virusurilorForma virusurilorcilindric de exemplu unele virusuri vegetale de tipul virusului mozaicului tutunului;sferoidal de exemplu virusurile gripale;cristaliform (poliedric) de exemplu enterovirusurile;prism sau crmid de exemplu poxvirusurile.

  • Figure 1 An array of viruses. (a) The helical virus of rabies. (b) The segmented helical virus of influenza. (c) A bacteriophage with an icosahedral head and helical tail. (d) An enveloped icosahedral herpes simplex virus. (e) The unenveloped polio virus. (f) The icosahedral HIV with spikes on its envelop

  • MICROSCOPIA ELECTRONIC

  • MICROSCOPIA ELECTRONICVirusul rubeolicVirusul hepatitic AVirusul stomatitei veziculoaseVirusul HIV (ME prin baleiaj)Virusul Pox

  • ADN VIRUSURIParvo virusadenovirusPapillomavirusHepatitis B virusHerpesvirusMolluscum contagiosum (Pox virus)

  • ARN VIRUSURIEnterovirusInfluenza virusesParamyxovirusRotavirus

  • Morfologia virusurilorStructura viralVirionul, denumit i particul viral elementar, este alctuit dintr-un miez genomic, capsid i uneori anvelopa (peplos):a) Miezul genomic (genomul viral, nucleoidul) este alctuit din ADN sau ARN cu structur polinucleotidic. Conine informaia genetic necesar pentru multiplicarea viral i devierea metabolismului celulei gazd n sensul sintezei constituenilor virali;Genomul ADN poate fi simplu (ss) sau dublu (ds) spiralat, linear, circular sau supranfurat;Genomul ARN poate fi ss sau ds, continuu sau fragmentat. Unele virusuri cu genom ARNss pot fi cu polaritate pozitiv cnd genomul servete ca ARNm sau cu polaritate negativ cnd numai spira complementar poate s funcioneze ca ARNm .Acidul nucleic viral conine suportul infectivitii virale.b) Capsida reprezint nveliul extern al genomului viral, pe care l protejeaz. Este format din subuniti identice denumite capsomere. Din punct de vedere structural acestea sunt alctuite din: proteine simple (ex. virusul polio), hetero-proteine (ex. virusul gripal) sau glicoproteine virale (ex. HIV).Genomul viral mpreun cu capsida alctuiesc nucleocapsida. Acestea sunt elemente structurale obligatorii ale particulei virale.c) nveliul (peplos, manta, anvelop) este un element structural facultativ, fiind alctuit din subuniti denumite peplomere, de natur proteic. Este prezent la unele virusuri, de exemplu HIV, virusul gripal, etc. Proteinele componente ale nveliului extern sunt evideniate la microscopul electronic ca nite proiecii pe suprafaa virionului. Aceste proteine reprezint material viral propriu sau material celular mprumutat de la celula gazd, de exemplu lipoproteine, glicoproteine. Exemple: glicoproteinele 120, 41 ale HIV-ului i hemaglutinina, neuraminidaza prezente la virusurile gripale. nveliul viral pstreaz stabilitatea nucleocapsidei i asigur fixarea virionului pe celula gazd pe care o infecteaz.Tipu

  • Structura viralaStructura viralb) Capsida reprezint nveliul extern al genomului viral, pe care l protejeaz. Este format din subuniti identice denumite capsomere. Din punct de vedere structural acestea sunt alctuite din: proteine simple (ex. virusul polio), hetero-proteine (ex. virusul gripal) sau glicoproteine virale (ex. HIV).Genomul viral mpreun cu capsida alctuiesc nucleocapsida. Acestea sunt elemente structurale obligatorii ale particulei virale.c) nveliul (peplos, manta, anvelop) este un element structural facultativ, fiind alctuit din subuniti denumite peplomere, de natur proteic. Este prezent la unele virusuri, de exemplu HIV, virusul gripal, etc. Proteinele componente ale nveliului extern sunt evideniate la microscopul electronic ca nite proiecii pe suprafaa virionului. Aceste proteine reprezint material viral propriu sau material celular mprumutat de la celula gazd, de exemplu lipoproteine, glicoproteine. Exemple: glicoproteinele 120, 41 ale HIV-ului i hemaglutinina, neuraminidaza prezente la virusurile gripale. nveliul viral pstreaz stabilitatea nucleocapsidei i asigur fixarea virionului pe celula gazd pe care o infecteaza

  • Viral Structure

  • Viral StructureVaries in size, shape and symmetryVIP for classification3 types of capsid symmetry:Cubic (icosahedral)Has 20 faces, each an equilateral triangle. Eg. adenovirusHelical Protein binds around DNA/RNA in a helical fashion eg. CoronavirusComplexIs neither cubic nor helical eg. poxvirus

  • Basic virus structure

    Nucleoprotein:Helix: capsomers associate with helical nucleic acidIcosahedron: the capsomers form a regular solid structure enfolding the viral genome

    Each type of virus has unique arrangement of the capsid around its viral genetic material.

    Capsid is a fundamental criterion in the classification of viruses

  • Basic virus structure

  • Basic virus structure

  • Structura viralaVirus gripalVirus HIV

  • Simetrie viralaTipuri de simetrie viralCapsomerele se pot aeza spaial n trei modele de simetrie viral:simetrie helicoidal (helical): acidul nucleic este situat central rsucit ca o elice, iar capsomerele identice sunt aezate metameric. Exemple: virusul mozaicului tutunului, virusurile gripale, virusul rabic.Simetrie icosaedric (cubic): capsomerele sunt aezate dup axe de simetrie riguroase (dictate de genom), realiznd n spaiu o figur geometric denumit icosaedru (figur geometric cu 12 vrfuri, 20 de fee cu form de triunghi echilateral i 30 de muchii). Conturul nucleocapsidei privit n plan apare ca un hexagon. Exemple: enterovirusuri, adenovirusuri, herpesvirusuri.Simetrie mixt (complex) prezent la poxvirusuri.

  • Simetrie virala

  • Enveloped helical virusEnveloped icosahedral virus

  • Virusuri bacteriene-BacteriofagiiMorfologia tipic a bacteriofagilor const n prezena capului (gtului) i a cozii.CAPUL este format dintr-un miez de acid nucleic ADN sau ARN care reprezint 50 % din greutatea uscat a bacteriofagului se gsete capsida format din capsomere identice aezate sub form de prism hexagonal.GTUL face legtura dintre cap i coad.COADA este format n general din trei pri:miezul lacunar;teaca contractil;placa bazal (terminal) care poart ataate fibrele cozii.Exist i forme atipice de bacteriofagi de exemplu: bacteriofagi lipsii de coad, bacteriofagi filamentoi.

  • Virusuri bacteriene

  • DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC

  • Metode de diagnostic virusologic1. Evidenierea direct a virusurilor ME, imunofluorescen, identificarea antigenelor virale2. Izolarea virusurilor3. Diagnostic imunobiologic evidenierea rspunsului imun umoral i celular

  • Evidenierea direct a virusurilor1. Detectarea antigenelor virale: imunofluorescen, ELISA etc.

    2. Microscopia electronic: morfologia particulelor virale imuno-electrono-microscopie

    3. Microscopie optic: evidenierea incluziilor virale intracelulare

    4. Detectarea genomului viral: hibridizarea cu sonde de acizi nucleici, reacia de polimerizare n lan (PCR)

  • Microscopia electronicaPentru vizualizare e necesara o concentratie de 106 particule de virus pe ml, n mod normal se foloseste o marire de 50.000 60.000 ori. Viruii pot fi detectate n urmtoarele specimene:

    Fecalele: rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, Astrovirus, calicivirusul

    Fluid vezicular: virusul Herpes Simplex, virusul varicella-zoster

    Raclaj cutanat: papilomavirus, virusuri ORF, virusul molluscum contagiosum

  • Microscopia electronicAdenovirusRotavirusului

  • Imuno-Electrono-MicroscopiaSensibilitatea i specificitatea EM poate fi mbuntit prin imunoelectronomicroscopie. Exist dou variante:

    Microscopia clasice de electroni imunitar (IEM) - proba este tratat cu specifice anti-seruri nainte de a fi pus n EM. Particule virale prezente vor fi agglutinated i, astfel, aduna mpreun de anticorpi.

    Solid phase microscopie imunitar de electroni (SPIEM) - reea este acoperit cu specifice anti-seruri. Virus particule prezent n eantion va fi absorbit pe grila de anticorpi.

  • Dezavantaje ale microscopiei electroniceAparatura este extrem de scumpaIntretinerea aparaturii este costisitoareONU Necesita Experien personal cuAdesea sensibilitatea este slaba

  • Izolarea virusurilor

  • Metode de cultivare a virusurilor

    Izolarea pe culturi celulare

    Izolarea pe ou embrionat de gin

    Izolarea pe animale de laborator

  • Metode de cultivare a virusurilor1. Culturi celulare: linii celulare (rinichi de cine, Hibridoma) Evidenierea efectelor virus specifice: efect citopatic, efect hemadsorbant, efect transformat, efect de interferen Evidenierea virusurilor prin imunofluorescen

    2. Cultivare pe ou embrionate: moartea embrionului, leziuni aparute pe membrana corioalantoidiana, efectul hemadsorbant al lichidului amniotic/alantoidian

    3. Izolarea pe animale de laborator: apariia unor leziuni virus specifice, moartea animalului

  • Izolarea virusurilorExist 3 tipuri principale de culturi celulare:

    1. Linii celulare primare ex. Rinichi de maimu, rinichi de cine 2. Linii celulare semi-continue ex. rinichi embrionar uman, fibroblaste dermice3. Linii celulare continue ex. HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK

    Culturile celulare primare sunt cele mai bune deoarece pot servi pentru izolarea unei game largi de virusuri. ns sunt scumpe i greu de obinut n cantiti mari. Liniile celulare continue sunt uor de ntreinut, dar gama de virusuri ce pot fi izolate este destul de restrns.

  • IZOLAREA PE CULTURI CELULARE

  • Efecte virus-specifice pe culturile celulareVirusurile ce cresc pe culturile celulare pot produce:

    Efect citopatic (ECP) efect balonizant, formarea de sinciii sau moartea celulelor. Efectul citopatic poate fi specific sau nespecific.Efect hemadsorbant celulele sunt capabile s lege eritrocitele de mamifere. Ex virusurile gripale.Efect transformant celulele din cultur se malignizeaz. Ex. virusurileEfect de interferen infecia cu un virus mpiedic apariia efectului infeciei cu cel de-al doilea virus. Ex Identificarea virusului izolat se poate face prin reaciile de neutralizare, inhibare a hemaglutinrii sau imunofluorescen.

  • IZOLAREA PE CULTURI CELULARELinie celular MCF7Linie celular fibroblasti de soareceLinie celular osteosarcom

  • Incluzii viraleIncluzii nucleare n microgliiv. herpes simplex, ctomegalovirusul, v. varicella-zoster, papovavirusurile, v. rujeolos.Incluzii nucleare n infecia cu CMVCelule n ochi de bufni.Incluzii celulareV. rujeolosIncluzii celulareCorpi Negri in neuronii infectati cu v. rabic

  • Efecte virus specifice(Courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)Efect citopatic CMVEfect citopatic Virus varicelo zosterian-balonizare

  • Efectul citopaticEfectul citopatic al enterovirusului 71 i virusului herpetic balonizarea celulelor.

  • Efectul citopaticEfectul citopatic cu formare de sinciii virusul respirator sinciial VRS (sus)i virusul rujeolos (jos)

  • Efectul citopaticEfectul citopatic al enterovirusului 71 i virusului herpetic balonizarea celulelor.

  • Efectul citopaticEfectul citopatic cu formare de sinciii virusul respirator sinciial VRS (sus)i virusul rujeolos (jos)

  • Efectul hemadsorbantEfectul citopatic cu formare de sinciii produs de virusul urlian i hemadsorbia eritrocitelor pe suprafaa stratului celular.

  • Dezavantaje ale culturilor celularePerioada lung (pn la 4 sptmni) necesar pentru obinerea rezultatuluiSensibilitate slab: sensibilitatea depinde n mare msur de starea probei.Sunt susceptibile la contaminare cu bacterii.Sunt sensibile la substane toxice ce pot fi prezente n prob.Multe virusuri nu pot crete n culturi celulare ex. virusul hepatititic B, virusurile diareigene, parvovirusurile, virusurile papilomului uman (VPU/HPV)

  • Tehnici rapide de cultivareExista Tehnici de cultivare de ngrijire rapid prin care agenii virali sunt detectai n 2-4 zile de la inoculare.De exemplu prin testul CMV DEAFF:

    Cultura de celule este realizat ntr-un flacon de plastic

    Dup inoculare, flaconul este centrifugat la viteza mica timp de o or (pentru a accelera adsorbia virusului) i apoi incubat timp de 2 pn la 4 zile.

    Vasele sun scoase din incubator i examinate pentru prezena de antigene precoce CMV prin imunofluorescen.

  • Testul DEAFF pentru CMV

  • Virusuri izolate pe culturi celulare

    Virusuri izolate uor pe culturi celulareVirusuri izolate mai rarVirusul Herpes SimplexVaricela-ZosterCitomegalovirusVirusul rujeolosAdenovirusVirusul rubeolosPoliovirusuriRinovirusuriVirusurile Coxsackie AVirusurile Coxsackie AVirusurile ECHOVirusurile gripaleVirusurile paragripaleVirusul urlianVirusul respirator sinciial

  • INOCULAREA PE OU

  • INOCULAREA PE OUEmbrion viabilEmbrion mort

  • INOCULAREA PE ANIMAL

  • SymptomsHBeAganti-HBeTotal anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100Acute Hepatitis B Virus Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeks after ExposureTitre

  • FecalHAVSymptoms01234561224Hepatitis A InfectionTotal anti-HAVTitreALTIgM anti-HAVMonths after exposureTypical Serological Course

  • Complement Fixation TestComplement Fixation Test in Microtiter Plate. Rows 1 and 2 exhibit complement fixation obtained with acute and convalescent phase serum specimens, respectively. (2-fold serum dilutions were used) The observed 4-fold increase is significant and indicates recent infection.

  • ELISAMicroplate ELISA : coloured wells indicate reactivity

  • HEMAGLUTINARE PASIV

  • Western BlotHIV-1 Western BlotLane1: Positive ControlLane 2: Negative ControlSample A: NegativeSample B: IndeterminateSample C: Positive

  • Diagnostic rapid pe baza detectrii antigenelor viraleAspirat nazo-faringianRSVVirus gripal de tip A i BParainfluenzaAdenovirus

    Materii fecale:RotavirusesAdenovirusesAstrovirus

    PieleHSVVZV

    SngeCMV (Ag pp65)

  • ImunofluorescenTest pozitiv de imunofluorescen pentru antigenului virusului rabic (Sursa: CDC)

  • Testarea antigenului pp65 al CMV

  • Avantajele i dezavantajeleAvantajeleRezultatul disponibile rapid, de obicei, n cteva ore.

    Poteniale problemeDeseori, sensibilitate foarte mult redus n comparaie cu culturi de celule, poate fi la fel de mici ca 20%. Specificitatea de multe ori sraci, de asemenea.Necesit specimene bun.Procedurile implicate sunt de multe ori plictisitor si consumatoare de timp i, astfel, scumpe n termeni de timp de laborator.

  • Specimenele de rutin, teste de

    Clinical Category

    Blood

    Throat swab

    Faeces

    CSF

    Other

    1. Meningitis

    +

    +

    +

    +

    2. Encephalitis

    +

    +

    +

    +

    Brain biopsy

    3. Paralytic disease

    +

    +

    +

    +

    4. Respiratory illness

    +

    +

    Nasopharyngeal aspirate

    5. Hepatitis

    +

    6. Gastroenteritis

    +

    7. Congenital diseases

    +

    Urine, saliva

    8. Skin lesions

    +

    +

    Lesion sample e.g. vesicle fluid, skin scrapping

    9. Eye lesions

    Eye swab

    10. Myocarditis

    +

    Pericardial fluid

    11. Myositis

    +

    +

    12. Glandular fever

    +

    13. Post Mortem

    +

    Autopsy

    After use, swabs should be broken into a small bottle containing 2 ml of virus transport medium. Swabs should be sent to the laboratory as soon as possible without freezing. Faeces, CSF, biopsy or autopsy specimens should be put into a dry sterile container.

  • Metodele MolecularaMetode bazate pe detectarea genomului viral sunt, de asemenea, cunoscute ca metode moleculare. Se spune adesea c metodele molecular este direcia viitoare a diagnosticului virale.Cu toate acestea, n practic, dei utilizarea acestor metode este n cretere, ntr-adevr, rolul jucat de metode moleculare ntr-un laborator de rutin virus de diagnosticare este nc mic n comparaie cu metodele convenionale.Cert este c, dei rolul de metode moleculare va crete rapid n viitorul apropiat.

  • Classical Molecular Tehnici deDot-blot, Southern blot, in-hydridization in situ sunt exemple de tehnici clasice. Ele depind de utilizare a ADN-ului specifice / sonde de ARN-ului pentru hibridizare.

    Specificitatea reaciei depinde de condiiile de utilizat pentru hibridizare. Cu toate acestea, sensibilitatea acestor tehnici nu este mai bun dect metodele convenionale virale de diagnosticare.

    Cu toate acestea, deoarece acestea sunt de obicei mai plictisitor i mai costisitoare dect tehnici convenionale, nu au gsit de acceptare pe scar larg.

  • Reacie n lan a polimerazei (1)PCR permite amplificarea in vitro a specifice secvene ADN-int cu un factor de 106 i este, aadar, o tehnic extrem de sensibil.Ea se bazeaz pe o reacie enzimatic care implic utilizarea de oligonucleotides sintetice flanca int secvena nucleic de interes.Oligonucleotides Acestea acioneaz ca grunduri pentru polimerazei termostabil Taq. Cicluri repetate (de obicei 25 - 40) din denaturarea Template ADN-ului (la 94oC), recoacere de primeri pentru secvene complementare acestora (50oC), i extinderea primer (72oC), rezultat n producia exponenial a fragmentului int specifice.Sensibilitatea i specificitatea suplimentare pot fi obinute de ctre PCR imbricate.Detectarea i de identificare a produsului PCR este de obicei efectuat de ctre agaroz electroforez gel, hibridare cu o sond oligonucleotidului specifice, restricii enzim analiz, sau de secventiere ADN-ului.

  • De reacie n lan a polimerazei (2)Avantaje al PCR:Extrem de sensibilitate ridicat, poate detecta n jos pentru a genomului viral pe un eantion de volumUor de configuratFast timpul de rspunsDezavantaje al PCRExtrem de natur s contaminarenalt grad de calificare necesar operatoruluiNu este uor s creeze un test cantitativ.Un rezultat pozitiv poate fi dificil de interpretat, n special cu virusuri latente, cum ar fi de CMV, n cazul n care orice persoan seropozitivi vor avea prezenta virusului in sange, indiferent dac acetia au sau nu boala.Aceste probleme sunt abordate de sosirea comerciale sisteme inchise, cum ar fi Cobas Roche Amplicor care necesit manipulare minime. Utilizarea sintetice obiective interne competitive n aceste teste comerciale, a facilitat o cuantificare precis a rezultatelor. Cu toate acestea, aceste analize cantitative sunt foarte scumpe.

  • Schematic a reaciei PCRFiecare ciclu dubleaz numrul de copii al intei

  • Alte tehnici moleculare noiADN-ul ramificat este, n esen o tehnica de sensibile hydridization care implic amplificare liniar. ntruct amplificare exponenial are loc n PCR.Prin urmare, sensibilitatea de minciuni bDNA ntre tehnicilor de amplificare a clasic i PCR. De alte tehnici de Newer moleculare depinde de o anumit form de amplificare.Comerciale tehnici de proprietate, cum ar fi LCR, NASBA, TMA depinde de amplificarea exponenial a semnalului sau int.Prin urmare, aceste tehnici sunt la fel de sensibile la contaminarea ca PCR i mprtesc aceleai avantaje i dezavantaje.PCR i tehnici legate sunt obligate s joace un rol din ce n ce mai important n diagnosticul de infecii virale.Cip ADN-ul este o alt tehnologie promitoare n cazul n care ar fi posibil pentru a detecta un numr mare de virui, potenialul lor patogene, precum i sensibilitatea lor de droguri, n acelai timp.

  • Comparaie ntre PCR i alte tehnici de amplificare a acizilor nucleici

    Method

    Target

    Amplification

    Signal

    Amplification

    Thermocycling

    Sensitivity

    Commercial

    Examples

    PCR

    Exponential

    No

    Yes

    High

    Roche Amplicor

    LCR

    No

    Exponential

    Yes

    High

    Abbot LCX

    NASBA

    Exponential

    No

    No

    High

    Organon Teknika

    TMA

    Exponential

    No

    No

    High

    Genprobe

    Q-Replicase

    No

    Exponential

    No

    High

    None

    Branched DNA

    No

    Linear

    No

    Medium

    Chiron Quantiplex

    ****************************************************************30*9****************