IMOBILIZAREA BIOCATALIZATORILOR

- Celule

- Enzime

BIOCATALIZATORI NATIVI/NATURALI

BIOCATALIZATORI IMOBILIZATI

CELULE - Viabile - Uscate

ENZIME - Liofilizate - Solutii • purificate • partial purificate

SUSPENSII CELULARE

SOLUTII

AMESTECURI ETEROGENE

FAZA SOLIDA: BIOCATALIZATORUL IMOBILIZAT

FAZA LICHIDA: AMESTECUL DE COMPUSI

Avantajele biocatalizatorilor imobilizati

• Posibilitatea recuperarii/recircularii

• Simplificarea etapelor de izolare/purificare a produsului util

• Cresterea stabilitatii (mecanice, termice, operationale) a biocatalizatorului

• Posibilitatea realizarii procesului in regim continuu, deci capacitati de productie superioara

Metode de imobilizare

Istoric

1. faza iniţială (1916-1940): adsorbţia invertazei pe oxid de aluminiu şi pe cărbune activat

2. faza subdezvoltată (1950’): legarea fizică, nespecifică a unor enzime prin adsorbţie pe cărbune, bentonită sau argile si prin legături ionice specifice pe suporturi de fosfoceluloză respectiv includerea unei enzime într-o matrice formata prin tehnica solgel

3. faza în curs de dezvoltare (1960’): perfecţionarea tehnicilor de imobilizare noncovalentă, precum adsorbţia şi includerea si a biocatalizatorilor reticulati cu glutaraldehidă

4. faza dezvoltată (anii 1970): perfecţionarea tehnicilor precedente

5. faza post-dezvoltare (anii 1980): dezvoltarea tehnologiilor cu enzime imobilizate a fost accelerată de creşterea cererii de compuşi bioactivi în formă enantiopură

6. faza de proiectare raţională a preparatelor imobilizate (după 1990): preparate reticulate, coimobilizate, modificari/functionalizari specifice ale suporturilor anterior utilizate

Forme ale preparatelor imobilizate

a) imobilizate în masă: o masă omogenă macroscopic, care ia forma vasului în care s-a realizat imobilizarea; pierderi de presiune la trecerea soluţiei

b) imobilizate sub formă de bile:

- bile poroase sau compacte

- pierderi minime de presiune

A. METODE DE LEGARE PE SUPORT

- CEA MAI VECHE METODA DE IMOBILIZARE - BIOCATALIZATORUL SE LEAGA DE UN SUPORT SOLID PRIN

LEGATURI: - FIZICE/ADSORBTIE - IONICE - COVALENTE

- ACTIVITATEA DEPINDE DE

- SUPORT - Dimensiunea particulelor - Suprafata specifica - Compozitia chimica - Raportul intre gruparile hidrofobe/hidrofile

- ENZIMA - TIPUL DE LEGATURI IMPLICATE IN LEGARE

• ataşarea de un suport insolubil care va dobândi astfel funcţii catalitice. • Tăria legăturii afectează stabilitatea operaţională a preparatului

imobilizat, dar şi activitatea sa.

SUPORTURI CONDITII: - să fie inert chimic şi biochimic - Zonele de legare a biocatalizatorului trebuie să aibă o densitate superficială şi o

suprafaţă volumetrică cât mai mare.

Forma fizică a suporturilor : filme, fibre, suprafeţe plane, sfere etc.

Suporturile organice: - naturale: celuloză, agaroză, alginat, chitosan, dextran, gelatină - Sintetice: polimeri sau copolimeri ce conţin poliacrilamidă, polimetacrilamidă,

poliacetat de vinil, polistiren, poliamide, etc Suporturi anorganice: - sticla cu pori controlaţi (CPG controlled glass pores), - silicagel, - Alumina - Carbune activ

1. IMOBILIZAREA PRIN ADSORBTIE FIZICA 1. SE APLICA DOAR ENZIMELOR, proteine solubile care se

fixeaza prin legaturi slabe pe suprafata suporturilor solide/insolubile in apa

2. Legaturi slabe (H, van der Waals): modificari conformationale minime ale enzimei, deci pastrarea activitatii acesteia

3. Simpla si ieftina daca se utilizeaza suportul adecvat 4. Dezavantaje:

- legarea slaba duce la desorbtia enzimei in timpul procesului si dificultati de separare ale acesteia

- Intensitatea legarii depinde de pH, tarie ionica, temperatura

- Legarea nu este specifica: pot fi adsorbite si alte proteine prezente in solutie

5. Avantaje: nu sunt necesari reactivi suplimentari/ numar mic de etape de activare prealabila

6. SUPORTURI: compusi naturali anorganici (alumina, silicati, C activ, sticla, etc) si organici (chitozan, acrilamida, celuloza, amidon, etc)

Exemplu: adsorbtia invertazei

Suport

% legat la DEAE-

Sephadex (SDI anionic)

CM-Sephadex (SDI cationic)

pH 2.5 0 100

pH 4.7 100 75

pH 7.0 100 34

2. LEGAREA IONICA PE SUPORT

- Suporturi insolubile in apa care contin grupari ionice (polimeri naturali si sintetici functionalizati)

- polizaharide functionalizate: celuloza, chitozan, amidon, kieselgur - polistiren

- Legaturile ionice formate determina modificari ale conformatiei enzimei, deci si ale situsului activ al acesteia, ceea ce determina scaderea activitatii enzimatice

- Pierderile enzimei apar doar la variatii mari ale pH-ului sau tariei ionice - Legaturile cu suportul: LEGATURI IONICE, mult mai puternice decat la adsorbtia

fizica: - Grupari functionale de pe suprafata biocatalizatorului Cat+ sau An- - Grupari functionale ale suportului: An- sau Cat+

BIOCATALIZATOR An- Cat+ SUPORT

3. LEGAREA COVALENTA PE SUPORT

Cea mai utilizata metoda de imobilizare a enzimelor Se pot utiliza gruparile functionale neimplicate in mecanismul de actiune enzimatica Avantaje: - Legatura cea mai puternica, deci pierderi minime,

activitate constanta, productivitate stabila - Legarea la suprafata suportului permite si

interactia cu molecule mari ale substratului Dezavantaje 1. Pot sa apara reduceri semnificative ale activitatii 2. Este necesara optimizarea conditiilor de realizare

a imobilizarii

Pentru evitarea interacţiunii cu suportul, se poate intercala între biocatalizator şi suport, un aşa-numit braţ de distanţare („spacer arm”) de lungime optima

Atasarea covalenta a enzimei la suport

1 – enzima ataşată fără „spacer arm” ; interacţiuni puternice între suport, pe de o parte şi substrat şi enzimă, pe de altă parte. 2 – enzima ataşată printr-un „spacer arm” scurt. Între suport şi substrat sau enzimă pot avea loc interacţiuni care deranjează activitatea principală a enzimei. 3 – enzima ataşată printr-un „spacer arm” de lungime optimă. 4 – enzima ataşată printr-un „spacer arm” de lungime prea mare. Datorită mobilităţii „spacer arm”-ului enzima poate veni în vecinătatea suportului, cu care poate interacţiona. La fel şi substratul în curs de interacţiune cu enzima. 5. „spacer arm”-ul ataşat la distanţă maximă de situsul catalitic; activitate enzimatică maximă. 6. punctul de ataşare al „spacer arm”-ului apropiat de situsul catalitic; posibilă afectare a activităţii enzimatice. 7 - ataşarea se face în situsul catalitic. Legătura cu substratul este imposibilă.

Grupari utilizate la legarea covalenta pe suport a biocatalizatorilor

Aminoacizii cu grupari polare si reactive, situati la suprafata exterioara a moleculei proteice dizolvate in apa

Abundenta (%)

7.0

3.4

3.4

2.2

4.8

4.8

3.8

1.2

CH2

NH34

+ Lysine (Lys)

CH2SH

Cysteine (Cys)

CH2

OH Tyrosine (Tyr)

NH N

CH2

Histidine (His)

CH2C O

O

CH2

Glutamic Acid (Glu)

CH2

NH3 C NH2

NH2+

Arginine (Arg)

NH

CH2

Tryptophan (Trp)

CH2C O

O

Aspartic Acid (Asp)

Tehnici de atasare covalenta • Activarea cu bromcian a gruparilor OH din structura suportului (polizaharide,

bile de sticla) cu formarea imidocarbonatului reactiv:

• Activarea cu cloroformiat a gruparilor OH din structura suportului cu formarea carbonatilor ciclici:

Activarea sticlei cu 3-aminopropiltrietoxisilan

Activarea gruparilor amino ale suportului (poliamide) prin diazotare:

Activarea gruparilor carboxil sau amino pentru reactii de condensare cu formare de lagaturi peptidice

B. METODE DE RETICULARE Se realizeaza in prezenta sau absenta suportului. Prin reticularea enzimei, aceasta devine insolubila in apa. Reticularea se poate face si in amestec cu un suport. Prin reticularea celulelor, suspensia devine “solida”. Sunt necesari reactivi bifunctionali si grupari reactive adecvate. Activitatea scade foarte mult Stabilitatea creste foarte mult

Glutaraldehida Diizocianati Reducerea drastica a activitatii daca sunt implicate grupari functionale ale aminoacizilor implicati in actul catalitic

C. METODE DE INCLUDERE IN SUPORT

retele microcapsule

Enzima este localizata (fizic) in interiorul matricii unui gel polimeric (retea sau membrana), care permite accesul substratului fara a modifica enzima. Exemplu: poliuretani obtinuti prin policondensare in prezenta enzimei

Particule Membrane Tuburi Fibre

Imobilizarea celulelor si enzimelor in gel de alginat

Aplicaţii industriale ale enzimelor imobilizate

1. Separarea DL-aminoacizilor aminoacilaza L-specifică din Aspergillus oryzae (E.C. 3.5.1.4.)

Procesul Tanabe: aminoacilaza imobilizată DEAE-Shepadex în proces continuu. Degusa, pe de altă parte, utilizează acilază liberă într-un bioreactor membrană.

2. Tratarea laptelui - prepararea brânzeturilor cu renina microbiana imobilizata in proces continuu - stabilizarea enzimatică laptelui: tratarea laptelui cu tripsină imobilizată, fara modificari ale gustului sau oxidari timp de 2-3 saptamani - extracţia lactozei din zer cu lactaza imobilizata pentru valorificarea integrala a laptelui

3. Epurarea apelor industriale cu celule imobilizate: eliminarea ionilor metalici, inclusiv metale grele din apele industriale

Bioreactorul cu amestecare

Este foarte simplu şi uşor de utilizat Poate fi folosit pentru o gamă largă de procese: solutii sau suspensii celulare Enzima se adaugă fie în formă solubilă în amestecul de reacţie, fie în stare imobilizată, dispersată în amestec; o ală variantă o reprezintă introducerea enzimei imobilizate în dispozitive speciale, fixate pe amestecător, caz în care rezistenţa la transferul de masă scade. Poate fi utilizat atunci când apare inhibarea enzimei de către substrat, prin utilizarea unor soluţii diluate de substrat adăugate continuu Dezavantajul major al acestui tip de reactor este necesitatea golirii sale la sfârşitul procesului, ceea ce conduce la timpi morţi şi determină scăderea productivităţii reactorului.

Bioreactorul continuu cu amestecare perfectă

Reactorul se utilizează pentru concentraţii reduse ale substratului. Permite avantajul major al controlării facile şi eficiente a pH-ului şi temperaturii.

Bioreactorul cu strat fix

Ca urmare a circulaţiei ascendente în coloană, enzima situată la baza coloanei este expusă unor concentraţii mai mari de substrat, în timp ce enzima situată la partea superioară este în contact cu o soluţie concentrată în produs. Din aceste motive, reactorul nu este recomandat pentru efectuarea reacţiilor în care apare inhibiţia de substrat a enzimei. Problema majoră a reactorului o constituie menţinerea constantă a debitelor şi temperaturii.

Bioreactoarul în strat fluidizat

Sunt utilizate în special în reacţii care utilizează sau conduc la formarea unui gaz. Principalul dezavantaj al reactorului sunt dificultăţile legate de transpunerea la scară mai mare (scale-up), motiv pentru care este utilizat în special pentru cantităţi mici de produse foarte valoroase.

Au un comportament intermediar între reactorul cu strat fix şi cel continuu cu amestecare. Caracteristica sa este fluidizarea catalizatorului solid, prin alimentarea reactorului cu substratul pe la bază.

Bioreactoare cu membrană Conţin o membrană ce încorporează în structura sa enzima, de obicei sub formă de fibre (hollow fibres) cu diametru de circa 0.2 mm . Aceste tipuri de reactoare pot fi operate fie in varianta cu amestecare, fie în cea cu deplasare

Avantajul principal al acetui tip de utilaj este exploatarea lui foarte facilă şi faptul că nu implică imobilizarea suplimentară a enzimei. Se utilizează la scară mică, în special în procese ce implică sisteme multienzimatice, cum ar fi de exemplu cele care necesită regenerarea cofactorilor. Dezavantajul este preţul ridicat al membranei.