ef lucrri dr. Irena GRIEROSUCURS BIOFIZICA4 si 5

METODE FIZICE I BIOFIZICE CU APLICAII N MEDICIN

Metode electroforeticeMetode cromatograficeMetode de difracie cu raze XMetode de microscopie electronic (de balaiaj, prin transmisie)Tipuri de MO

I-A. Electroforeza

Electroforegrama

Fe = FfZeE= 6rv

Explicarea termenilor Fe = fora electricFf = fora de frecareZe = sarcina electric a particuleiE = intensitea cmpului electric = viscositea mediuluir = raza particuleiv = viteza particulei

I-B. ElectrofocusareapH izoelectric

I-C. ImunelectroforezaReactie specifica Ag-Ac

II. CromatografiaFaz staionar- solid- lichid- amestec solid / lichid2. Faz mobil- lichid- gazSCOP = separarea componentelor unui amestec2 faze

4 tipuri de tehnici cromatografice:de adsorbieprin schimb ionicprin permeaie (n funcie de forma i marime)de afinitateCromatografie prin permeatie

Cromatografie de permeaie

Imunoabsorbant matrice solid care conine legat covalent (de obicei) un Ag.

Mixtura de Ac care urmeaz a fi separat este aplicat la captul superior i va trece prin coloana staionar. Doar Ac specifici Ag din coloana staionar for forma complexe Ag-Ac i vor fi reinui.

Se adaug o soluie tampon care conine o cantitate crescut de sruri i / sau pH sczut pentru a rupe legturile necovalente dintre Ag i Ac su specific.

Se adaug o soluie de eluie care conine Ag n exces. Aceast competiie cu imunoabsorbantul pt. Ac determin elib. Ac n faz fluid.

Ac eliberai n soluie se colecteaz ntr-un recipient.Cromatografie de afinitate

III. Difracia cu raze X2d sin = n ecuaia BraggBC + BD = nBC = BD = AB sin AB = d2d sin = nCondiia maximului de interferen se realizeaz pentru cazul n care diferena de drum a celor dou raze este un multiplu ntreg al lungimii de und, adic BC + BD = n.

J. Watson i F. Crick - premiul Nobel n Medicin i Fiziologie 1962 mpreun cu M. Wilkins: stabilirea structurii ADN-ului prin difracie cu raze X

Difracia cu raze XCristalul este rotit usor, si doar pentru anumite unghiuri se obtin maxime de difractie, care vor fi inregistrate pe filmul fotografic. Rezolutia metodei = 5 - 6 .Imaginea de difractie, inregistrata pe film, corespunde pozitiei atomilor din reteaua cristalina.

Etapele de studiu ale unei proteine:

a) difractograma (raze X)

b) harta densitatii electronice (computer)c) modelul conformational al structurii proteinei

Structura primar, secundar, teriar i cuaternar a proteinelor

Structura primarStructura secundarStructura teriarStructura cuaternar

- helix

- pliat

Trioz-fosfat-izomeraza

Funcii generale ale proteinelor

1. Enzime: catalizeaz ruptura sau formarea unor legturi covalente (mii)Ex:

- pepsina - ADN-polimeraza

2. Proteine structurale: susinerea mecanic a celulelor i a esuturilorEx: - colagenul i elastina- tubulina i actina - - keratina

Ex: - Hb. - oxigen- Transferina - fier - Albumina - lipide- Proteine de transport membranar: H2, glucoz, Ca2+3. Proteine de transport: transportul unor molecule mici sau a unor ioni

4. Proteine motrice: genereaz micare n celule i esuturiEx: miozina, kinezina, dineina

5. Proteine de stocare: a unor molecule mici sau ioniEx:

- feritina - ovalbumina

6. Proteine semnal: transmit semnale de la celul la celulEx: - hormoni - factori de cretere: NGF, EGF

7. Proteine receptoare: detecteaz semnale i le transmit mainriei celulareEx: - rodopsina- receptorul pentru acetilcolin al celulei musculare primete semnale chimice

8. Proteine reglatoare ale genelor: se leag de ADN pentru a induce sau a inhiba expresia genelor

9. Proteine cu rol particularEx: - proteinele antigel ale petilor de la polii Nord-Sud- proteine fluorescente- proteine cu funcie de adeziv

IV. Metode de microscopie electronic

Principiul fizic al microscopiei electronice

p = 1/d = n sinu /

= h/p = h/mv

undep = putere de rezoluied = distana minim ntre 2 puncte care poate fi distins separatn = indicele de refracie u = unghiul

Un fascicul de electroni accelerat:- la 10 kV, asociat este 130 nm (13 ), - la 100 kV, asociat este 30 nm (3 )Dac viteza crete, descrete, puterea de rezoluie crete:

Semnalele emise de un material supus unui bombardament electronic

MET MEBmicroscop electronic prin transmisie microscop electronic cu baleiaj

MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEIAJ

Rezoluia este mai sczut dect n MET.Imagini pseudo-3D.

Un spot de electroni baleiaz suprafaa probei. Electronii secundari de energie mic (0-50 eV), emii n urma mprtierii neelastice, sunt captai i, dup o procesare electronic, formeaz imaginea pe un ecran fluorescent, sau pe o pelicul fotografic.

Luminozitatea fiecrui punct al imaginii depinde de numrul de electroni secundari nregistrai din poziia corespunztoare a probei.

Se obin imagini ale suprafeei unei celule, a unui microorganism sau a unui esut, de unde impresia de imagine tridimensional.

Mrire maximum 200 000 x, cu o rezoluie de 3,5 nm.Tun electronic - fascicol de electroni cu diametrul de circa 50 nm.

2-3 lentile condensoare - diametrul pn la 2 nm (spot mic, deoarece seciunea sa determin pe imagine un singur punct).

O lentil condensoare care regleaz dimensiunea final a spotului i focalizeaz imaginea pe ecran.

Electronii secundari sunt captai de un detector de Al care acoper un cristal de scintilaie al unei sonde de scintilaie, semnalul obinut este amplificat electronic i formeaz imaginea pe ecranul unui tub catodic sau al unui monitor.Microscopul electronic de baleiajPrincipiu Alcatuire

Eritrocite umane mbtrniteEtapele de transformare in echinocit

?

?

?

!

ochi de musc

Contact entre un lymphocyte ( en jaune ) et une cellule dendritique prsentatrice d'antigne (en bleu ). Microscopie lectronique balayage.Contact entre un lymphocyte (immunofluorescence verte) et une cellule dendritique prsentatrice d'antigne. Microscopie contraste de phase

Pereche de cromosomi umani, X i Y, dup Nature (2003) 423: 810-812.

?

?

Fibre de sticla

Cristale componente ale ceramicii (x 4000); cu verde - particule mbogite n calciu, n albastru - particule care conin fosfor. Didier COT/IEM/CNRS

- granule de polen

MICROSCOPUL ELECTRONIC PRIN TRANSMISIE

Se folosesc electronii mprtiai neelastic transmii prin prob (preparatul de examinat).

nainte de a ajunge la preparat (prob) electronii provenii de la sursa de electroni (tunul de electroni) sunt focalizai de dou lentile condensor (electromagnetice). Ei sunt mai mult sau mai puin absorbii (spunem despre preparat c este mai mult sau mai puin dens pt. electroni).

Utilizeaz marcheri electrono-opaci.

Imaginea se formeaz n spatele preparatului pe un ecran fluorescent.

Mrirea, raportul dintre mrimea imaginii/mrimea obiectului,rezoluia, cu att mai bun cu ct este mai mic i apertura mare (care, ns, mrete aberaiile de sfericitate); la diafragme de 20-70 m rezoluia este 0,1-0,2 nm.

Luminozitatea imaginii depinde de numrul de electroni transmii, intensitatea fascicolului incident, caracteristicile probei.relatia lui de Broglie: = h/p = h/mv

MET - PMNMET - limfocit

reticul endoplasmic rugos

Limfocit - MEBMOMET

MOAFMMEBMETHematii

TIPURI DE MICROSCOAPE OPTICE

MICROSCOPUL OPTIC1Pentru a creste P (descreste ): descreste (390 - 720 nm) creste n

Cellules turgescentes-------> Cellules plasmolysesV. lucrarea practica difuziunea si osmozaLegile osmozei

MICROSCOPUL OPTICcu imersie2

Microscopul polarizantPune in evidenta fenomenul de birefringenta a unor structuri, expresie a anizotropiei acestora.3- lumina polarizata- 2 nicoli- Cruce de Malta

Ultramicroscopul (microscopul cu fond intunecat)Iluminarea este din lateral.Condensorul este de tip cardioid sau paraboloid.Se bazeaza pe fenomenul Tyndall (de difuzie a luminii).4

Fenomenul Tyndall

Microscopul cu contrast de fazaPrezinta o lama sfert de unda care transforma defazajul luminii imperceptibil ochiului uman intr-o variatie de intensitate perceptibila vizual (transforma deci un contrast de faza in contrast de amplitudine).Permite observarea celulelor necolorate.celula epiteliala5ciclul celular

Microscopul cu fluorescenta6- utilizeaz markeri fluoresceni -Principiul fenomenului de fluorescen: 1. Energia este absorbit de un atom 2. Electronul sare pe un nivel superior de energie. 3. Ulterior, electronul revine la starea initiala si emite un foton fenomenul de fluorescen

O sursa UV.Ecran filtrant care lasa sa treaca doar radiatiile UV excitatoare ale fluorescentei.

GFP - Green Fluorescent Protein 238 aa, 26.9 kDa Nobel Chemistry 2008The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".Do you remember?

Bibliografie selectiv

Aurengo A., Grmy F., Petitclerc T. - Biophysique, Mdecine-Sciences Flammarion, Paris, 1998.Dimoftache C., Herman S. Principii de Biofizic uman, Ed. Universitar Carol Davila, Bucureti, 2003.Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific Publications, The Alden Press, Oxford, 1990.Durand A., Escany J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed. Ellipses, 2004.Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.Herman S. Aparatura medical. Principiile fizice ale aparaturii medicale moderne,Ed.Teora,Bucureti, 2000.Nlting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si farmacie, Editura BIT, 2003.Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universitii Al. I. Cuza, Iai, 1988.Rusu V., Baran T., Brniteanu D. D. - Biomembrane i patologie, vol. I, Ed. Medical, Bucureti, 1988, 63-92, 286-292.Rusu V. Note de curs. 2010.Rusu V. Nobel Retrospectiv 1905 1995 Laureaii premiului pentru fiziologie i medicin, Ed. Omnia, Iai, 1996.Rusu V si colab. Lucrri practice i demonstraii de Biofizic i Fizic Medical, Ed. Gr. T. Popa Iai, 2003.Rusu V. Dicionar medical, Ed. Medical, Bucureti, ed. IV, 2011.Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes danalyse instrumentale, De Boeck Universit, Paris, 2003.tefnescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An Introduction, Ed. Tehnopress, 2008.