curs 1 ing metabolica
DESCRIPTION
inginerie metabolica cursTRANSCRIPT
I.ROLUL CERCETARII FUNDAMENTALE iN BIOTEHNOLOGM
Cunoaqterea qtiinlific[ qi strategia de dezvoltare economicd actual[ se bazeazdpe o nou[abordare a fenomenelor, acestea conduc6nd la o adevdratd revolulie biotehnologic5. Se apreciazd"c[ in viitor cea mai mare parte a industriei se va baza pe procedee de fermentalie, inginerie
biochimic[, biologie moleculard, aceasta din urm[ imprimdnd un salt tehnologic corespunzbtor.
Pe aceste baze, industria biotehnologic[ va lua un avint considerabil.
Ingineria geneticd este consideratd a fi tehnica ideald capabild s6 amelioreze cantitativ qicalitativ capacitatea de biosintezd, a celulelor de microorganisme, animale sau vegetale, in scopuloblinerii unor produse utile.
Natura interdisciplinard" a biotehnologiei este evidentl dacd se tine seama de etapele unuiproces biotehnologic complet. Dac[ se ia ca exemplu oblinerea unui produs nou ADN-recombinant, cum ar fi insulina, hormonul de creqtere sau interferonul, atunci, de la idee pin1la
oblinerea unui produs comercial, se parcurg mai multe faze care implic[ cunoqtin]e aparlin6nd
unor domenii gtiinlifice foarte diferite (fig. 1.1).
i ::;
*-,s. r#fu"{r
Fig. 1.1. Treptele unui proces biolehnologic complet de obf;nere a noi produse aplic6nd tehnica ADN-recombinant: 1 - substanle chimice, 2 - lesut animal; 3 - cromozom animal;4-- gend tdiati dintr-uncromozom,5-microorganism,cadeexempluE.col i ;6-plasmidd,T-plasmidisecl fonatd;g-plasmid[recombinant; 9 - introducere in microorganism; l0 - multiplicarea piasmidei gi expresia genei; ll -diviziune celulari; 12 - cultivare in laborator; 13 - bioreactor de laborator; I4"- bioreactor pilot, 15 -operare la scard industrialS; 16 - recuperarea produsului; 17- condilionare gi v6nrare.
Prima treaptd de dezvoltare a bioprocesului se refer[ la manipularea geneticE. a organismului
gazdd; in acest caz, o gend din ADN-ul animal este clonat[ intr-o celula d,e Escherichia coli.
-.1e..i.
#,.$rs#
1,t
t' "s
#f*tt !
"f.i Jdf- .,
'F**l
*#rts*e*rY-r f*lfr-\t t r , r t t ts**"-*eM H-+*,I*-q**.*/-*
'r ii
Aceste operalii apa\indnd domeniului ingineriei genetice sunt realizate in laborator de c[treoameni de gtiinld instruili in domeniul biologiei moleculare gi biochimiei. Instrumentele utilizate?n aceastd fazS constau in plici Petri, micropipete, microcentrifuge, enzime de restriclie incantiteti foarte mici (de ordinul nano- ori microgramelor), geluri de electro forezd, pentrusepararea gi identificarea ADN-ului. Parametrii cei mai importanli in acest stadiu al cercetlriifundamentale sunt: stabilitatea tulpinii recombinant ob{inute qi nivelul de expresie al produsuluidorit.
Dupd clonare, caracteristicile de cre$tere gi produclie ale celulelor trebuie m6surate in funcfiede conditiile de cultivare. Este necesar sd se aplice tehnicile de cultivare obignuite inmicrobiologie in vederea stabilirii parametrilor optimi: compozilia mediului, pH, tempe raturd,concentratie de oxigen dizolvat, astfel inc0t productivitatea in produsul urmdrit s[ fie maximb. Seporneqte prin cultivarea microorganismului la scara mici, in flacoane agitate, de 250 ml pdn[ laun litru capacitate' Performan{ele organismului sunt descrise prin calcularea ratei de creqtere,productivitatea specificd, randamentul in produs finit.
Dupi cunoagterea condiliilor de cultivare in laborator se porneqte procesul de ridicare lascard pilot gi industrial[. Prima treaptd poate fi un bioreactor de 1; 2 sau 5 I echipat cuinstrumente de mrsurd qi control al temperaturii, pH-ului, concentra{iei oxigenului dizolvat,vitezei de agitare' culturile pot fi monitorizate mai bine in bioreactor decit in flacoane agitate.
Se pot culege mult mai multe informalii referitoare la necesarul de oxigen almicroorganismului sau la caracteristicile de spumare ale mediului sau al{i parametri. Deasemenea, pot fi identificate limitdrile impuse de tipul bioreactorului. De exemplu, dacd acestanu poate asigura necesarul de oxigen, celulele sunt infometate. In mod similar, dacd, agitareamediului de culturd nu este adecvat5, aceasta poate conduce la spargerea celulelor qi deviereaprocesului de cultivare' In bioreactor se stabilesc condiliile pentru o anumitd activitate acelulelor' In aceastd fazi se calculeazd, diferili parametri cum ar fi: coeficientii de transfer demas6, timpul de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare qi mulli al1ii. Aici sedecide dac[ cultura de celule poate fi operatd cel mai bine in sistem batch, semicontinuu saucontinuu' De asemenea, pot fi incercate diferite tipuri de bioreactor. Se realizeaz|,de asemenea.un calcul economic de fezabilitate.
urmltoareatreaptd" de ridicare la scari (notatd" cu 14 in fig. l.l) este aceea de bioreactorpilot' in aceasti fazd se implicd specialiqtii instruili in ingineria bioproceselor gi in ridicarea lascar5 industtiald" a acestora. Acum se construiesc bioreactoare de 100-1000 I dup5 specificaliileprototipului de laborator' Scopul fazei pilot este acela de a exa-mina rdspunsul celulelor cultivatela o scard mai mare' in aceasti treaptd,de operare , reztltatelepot fi mai bune sau mai sc[^t e faldde cele oblinute in bioreactorul-laborator. in fun4ie de aceste rezultatese hotdrdgte daci se trece
la produclia industrial[ sau nu (treapta 15). Aceast[ parte a procesului tehnologic aparline in
intregime ingineriei bioproceselor. Acum se proiecte az6" atdt bioreactorul industrial, c6t qi
facilit5lile auxiliare: echipamente de sterilizare aer gi mediu, generator de abur, utilaje necesare
prepardrii mediilor de cultur[, sistem de apd de ricire, aparaturd de automatizare qi control. Oimportanld deosebitl se acordd faptului cd instalalia trebuie sd asigure condilii aseptice pe intreg
fluxul de produclie. O parte importantd a unui proces biotehnologic o constituie faza de
recuperare a produsului din mediul de produc{ie qi anume izolarea gi purificarea acestuia pdn[ laprodusul finit. Aceastd,fazd,este adesea foarte dificild pentru produsele ADN-recombinate, astfel
incdt costurile reprezint[ 80-90Yo din costul total al bioprocesului. Procedeul aplicat pentru
izolare gi purificare depinde de natura produsului gi cuprinde metode frzice, chimice, biologice.
Multe metode incercate in laborator qi care au dat rezultate bune nu pot fi aplicate la scar[
industrial[. In aceastd fazd,,biochimiptii, inginerii chimiqti, tehnologii au o contribulie importantd
in recuperarea gi purificarea substanlei active. Procedeele elaborate includ. filtrdri, centrifugdripentru separarea celulelor de lichid, metode mecanice de distrugere a membranei celul are, dacdprodusul este intracelular, extraclii cu solvenli, metode cromatografice, separ6ri prin membrane,
ctistalizdti qi usc[ri. Toate aceste procedee sunt testate mai intdi la scara micd gi apoi la scardpilot qi industrial.
Dupd ce produsul a fost purificat pdndla standardele cerute de normele internalionale, acestapoate fi ambalat qi vdndut (treapta l7). Pentru produsele farmaceutice noi este necesarl qi
testarea eficacit[1ii acestora, mai intii pe animale qi apoi pe oameni. Pentru produsele de uz
alimentar sunt cerute alte teste specifice.
2. CINETICA PROCESELOR DE BIOSINTEZA
2.1. Dinamica multiplicirii bacteriilor. Curba de crestere
Procesul de creqtere a microorganismelor se desftqoar[ prin sintezaspecific[ echilibrat[ a
constituenlilor celulari, pornind de la substanle nutritive simple aflate in mediul de culturi.
Procesul de creqtere a microorganismelor este controlat genetic. Pe de altl parte, acestadepinde in evolulia sa qi de natura qi concentralia substanlelor nutritive in mediu, precum qi deasigurarea cu energia necesar[ reacliilor de sintez[. Creqterea bacteriilor se realizeaz6 prin
depunerea uni- sau tridimensional[ de substan
Activitatea normal[ a microorganismelorraport intre volumul celulei qi suprafala ei, prineliminarea catabolililor. In cursul cregterii celulei,faptului c5, in timp ce suprafala creqte cu o relaliecubici, ceea ce determind o diminuare relativbschimbul de substanfe gi, atunci c6nd dispropo4iapunct critic, se produce diviziunea celulard.
In cadrul proceselor biotehnologice, studiul creqterii gi multiplicrrii microorganismelorproduc5toare are o importanld deosebitr pentru eficienfa tehnologiilor industriale. Spre deosebirede organismele pluricelulare, la care multiplicarea celulelor duce la m[rirea taliei individuale, latoate celelalte organisme unicelulate, ea are ca rezultatcre$terea numSrului de indivizi . yiteza demultiplicare a bacteriilor este exceplional de mare. Durata unei generalii - interval de timp dintredoud diviziuni succesive - este tipicr pentru fiecare specie, dar poate varia laaceeaqi specie infunclie de condiliile de mediu, fiind, in general, cuprinsr intre 20 qi 30 de minute. procesulmultiplicdrii populaliilor bacteriene este bine cunoscut. Acesta cuprinde mai multe faze (frg.2.1), care sunt descrise in continuare.
Fig' 2'1' curba de creqtere a unei populafli bacteriene: ,4 - inocular e; A-B - faza de tag; B-c - faza deaccelerare a ritnului de cregteref c-o - ta1agmultiplicare logaritmici; D-E - fazede incetinire aritmului de cregtere; ! F ;faza stafionar{ F-G - faziintermediari ae aec6ru c -fr - rurude declin;num'r de.celule viabile (UFC
_- unitili formatoare de col0nii);_numdr total de celule din mediul de cuiturd.
Faza de laten{i sau lag' Este cuprins6 intre momentul introducerii microorganismului ?nmediul de culturr (inoculare) 9i momentul in care celulele acestuia incep s[ se multiplice Inaceastd fazd' numdntl bacteriilor din inocul rrmane neschimbat sau chiar scade temporar. culturanu este viztbllL macroscopic' Aceast[ fazd, dureazii ?n medie cateva ore. Faza de latenfd apare cao perioadi de adaptate in noile condili de cultivare. in aceastd perioadd bacteriile viabile dininocul iqi acumuleazdincelul5 metaboli{ii esenliali qi sistemele enzimatice necesare creqterii.
Lattansvazarea inoculului ?ntr-un mediu nutritiv, se intalnesc, in principal, doud situafii:
este condilionatd de existenla unui anumitcare se face absorb{ia substanlei nutritive qiraportul suprafall/volum se modificd datoritlpdtratic6,, volumul ei se modificd cu o relaliea suprafelei celulare, fapt ce ingreuneazddintre suprafali qi volum atinge un anumit
l-&6
s t$gi i *
* l , }ir>
L<5rif,
$*4*6q?
:4*;$t f . i t3 14
- dacd inoculul bacterian provine dintr-o culturd aflatd in curs de multiplicare gi setransvazeazd intr-un mediu nutritiv cu aceeagi compozilie, multiplicarea bacteriilor igi menline incontinuare ritmul rapid - este cazul transvazdrii inoculului in intermediar, operalie efectuatlnumai pentru oblinerea de cantitdli mai mari de inocul necesare fazei urmdtoare de biosintez[numitd: fazdderegim;
- daci bacteriile provin dintr-o culturl tot in fazd exponenfialS de multiplicare dar setransvazeaz[ un mediu nutritiv cu altd compozilie, atunci ele au o perioad[ de adaptare, cre$terealor nefiind evidenliatI de la inceput.
Durata perioadei de latenld variazd, deci, in func1ie de noile condilii de mediu pe caremicroorganismele le gdsesc la transvazare. Cu cdt aceste condilii noi (mediu nutritiv,temperatur4 pH, aw, aeralie) sunt mai apropiate de cele anterioare, cu at6t perioada de lag estemai scurtS.
Faza de multiplicare exponen{iali sau de cregtere logaritmicl. Aceasti fazd" esteprecedatd de o perioadd scurtd (cea 2 h) de accel erare aritmului de creqtere, in care multiplicarease produce cu o vitezd" progresivd mdrit6. Dupi aceasti perioadi, diviziunile sunt binesincronizate, astfel incdt numdrul celulelor viabile se dubleazd brusc qi la intervale regulate dup6o progresie geometric[ 2o ,21 , 2' , 2t .. . 2" , adicd are loc o creqtere exponenfiald.
Capacitatea de cregtere exponenliall se manifestd ca atare numai o scurtd perioadd detimp (2-3 ore). In continuare, tendinla de multiplicare rapidd scade progresiv, datorit[ epuizdriisubstanlelor nutritive din mediu qi acumulSrii in el a produselor de catabolism in concentratii cuefect inhibitor.
In faza de multiplicare exponenlial5, celulele considerate a fi de tip embrio nar avdimensiuni mai mari decdt cele specifice speciei de care apagin, citoplasma lor este omogen6, nuconline materiale de rezewd qi are o mare afinitate pentru coloranlii bazici, datoritd conlinutuluiridicat in ARN- Intrucdt aceast[ perioad[ corespunde unor transform[ri permanente, celuleleaflate in faze exponenliale de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru lucrlri de genetic6efectuate in scopul oblinerii de noi tulpini producdtoare.
Spre sfrrgitul fazei de multiplicare logaritmicd apare o aqa-numitd perioadd de postJag,in care are loc un fenomen de incetinire gi de sincronizare a cregterii populaliei bacteriene,celulele aflindu-se in stadii diferite ale ciclului lor de dezvoltare. In aceast[ perioadd culturatinde spre un echilibru intre diviziune qi mortalitate. Din aceastd, faz6 sunt amorsate biosintezelein culturi continue.
Faza sta{ionari maximall. Este faza in care numdrul celulelor viabile esterdmine constant o perioadi de timp care dureazd de la cdteva ore. la cdteva zrle- insensibilitatea bacteriilor la conditiile de mediu.
maKm ql
funclie de
Intrarea culturii in faza stalionard este determinatd, de obicei, de epuizarea substanlelornutritive din mediu sau de acumularea unor produqi toxici. In aceast6 faz6, celulele nu se maimultiplicd, iar numlrul total al indivizilor populaliei este constant qi egal cu num[ru] celulelorviabile. In aceastl fazd, cehilele bacteriene sunt considerate mature, avdnd caracteristicimorfologice specifice speciei: dimensiuni mai mici decdt in faza de creqtere exponenliali,citoplasmd mai pulin omogen[ datoritd aparitriei de incluzii qi acumuldrii unor substanle derezervd", afinitate normal[ pentru coloranti qi prezenla sporilor la speciile sporogene.
Faza de declin. Este faza corespunzltoare unei sc[deri progresive a numdrului celulelorviabile datoritl mo4ii unui num[r foarte mare de celule. Celulele din aceastd fazd sunt b6trdne,ap[rdnd fenomene de involufie: celulele mici, sferice, deformate, gigante sau ramificate, care secoloreazd slab sau capdttr afinitate fa1[ de coloranlii acizi, iar la speciile sporogene apar foartemulli spori. In unele cantri se produc fenomene de autolizl, ceea ce determini sc[dereanumdrului total de celule din mediu.
creqterea unui microorganism se poate aprecia prin mai multe metode:
- determinarea substan{ei uscate a masei celulare;
- determinarea concentraliei sursei de carbon din mediu,
- determinareanumirului total de celule, cu ajutorul celulei microscopice de numdrat;- determinatea gradului de turbiditate al suspensiei bacteriene intr-un mediu lichid, in raport cuo scard etalon sau la fotocolorimetru. De reguld, pentru fiecare bacterie se determind creqtereadensitdlii optice (D O ) pe parcursul ciclului de dezvoltare qi se reprezintd, grafic in funclie detimp. cinetica de creqtere a levurilor este similarr cu cea a bacteriilor.
2.2. lnfluenfa factorilor de mediu asupra cregterii microorganismelor
Creqterea microorganismelor este influenlatd de o serie de factori de mediu, dintre carecei mai importanli sunt: concentralia substratului; calitatea qi cantitatea inoculului; temperatura;pH-ul mediului de biosintezd,; agitarea, concentralia oxigenului dizolvat.
3. METABOLISMUL MICROBIAN
3.1. Bazele metabolismului
in celule reacliile nu decurg izolat, ci organizatin secvenle multiple form6nd aqa-numitaccrle metabolicd, in care produsul unei reaclii servegte ca substrat reacliei urmbtoare. Ca urmare,diferitele cdi se intersecteazi formdnd o retea de reac{ii biochimice integrate qi cu un scop finaldenumitl metqbolism.
Metabolismul se studiaz[ in mod obiqnuit prin examinarea componentelor acestuia.Fiecare metabolism este compus din secven{e multienzimatice qi fiecare e1u,imd,la rdndul ei,poate exercita o acliune cataliticl sau reglato are. Harta metabolicd conline c[ile centrale aleenergeticii metabolismului, redate in figura 3.1.
Fig. 3. l. Reactiile metabolismului intermediar.
Majoritatea ciilor metabolice pot fi clasificate in cdi catabolice (degradativ e) gi cdianabolice (sintetice). Reacliile catabolice degradeazd, molecule complexe ca proteine,poliglucide gi lipide, la cdteva molecule simple, de exemplu COz, NH: qi apI. Calea anaboliciformeazd produqi finali complecgi din precursori simpli.
3.1.1. Catabolismul
Reacliile catabolice au rolul de a capta energia chimic[ (sub form6 de ATp) prindegradarea moleculelor bogate in energie. Catabolismul genereazd,, de asemenea, molecule caresunt convertite in ,,cdrdmizi" de construclie, necesare sintezei de molecule complexe. Generareaenergiei prin degradarea moleculelor complexe se desftqoard in trei etape (fig. 3.2), care suntprezentate in cele ce urmeazd.
Hidroliza moleculelor complexe in molecule mai mici. Moleculele
degradate in molecule simple. De exemplu, proteinele sunt degradate
poliglucidele in monoglucide gi trigliceridele in acizi graqi liberi qi glicerol.
Conversia in intermediari simpli. in etapa urmdtoare moleculele mai mici, rezultate inprima fazd, sunt degradate in continuare la acetil CoA qi o serie de alte molecule simple. O parte
complexe sunt
in aminoacizi,
i ; r , ! ! t . j r+ i f , r 6 i ! r r : l
din energie este captati sub formd de ATP, dar cantrtatea este mici comp arativcu cea produsr intimpul celei de-a 3-a etape a catabolismului.
#,f,{s.*.in*, :r,,;\3
i : : : :,.,4,F.i1f; tlitl €#{.*. ,. . .fu
,t'*r+li"qI I.l{$dr:c'id.r,a en*l$*nl r$,trttttlrpln+.* *+l"+tiai*t+i i iii .tjr+i r,,{rgr.*t+tuxri,rJ..
$r-r$ire} Llf rtlr r{c#,t *{+,,*\r.r'..r;1 E6.;1
,ttisi*i*.lf{}.f.l.r',i{:r.ir.r.,+ orc+f $1 Ci+.rtrftYr,ft:r*Jsft.";t rr,ttt {,lfivr{ l
Ilr#Sy*rSrf+ L{Ft,*+
**-&o-* $*#*# gp****
.4nu&x {.1} A
;*u\ftHi$ *"'-'r*o
F ig. 3.2. Etapele catabolismului.
oxidarea acetil coA. ciclul acidului citric este calea comund finald, a oxid[riimoleculelor de rezerv'6. Acetil coA este oxidati la doud molecule de coz qi patru perechi deprotoni (H), care sunt transferalilacoenzimele NAD* qi FAD pentru producerea de NADH + Ffqi FADH2' Este generati qi o cantitate mare de energie din ATp, cand electronii de la NADH +H- qi FADHz sunt transferali la oxigen in fosforilarea oxidativr.
3.1.2. Anabolismul
Reacliile anabolice combind moleculele mici ca, de exemplu, aminoacizii, pentru a formamolecule complexe ca, de'exemplu, proteinele (fig. 3.3). Reacfiile anabolice necesitr energie,care este asiguratb de transformarea ATP in ADP qi pi. calea de biosintezd, pentru acestemolecule este in mod obiqnuit diferiti de calea degradativd, gi cele doui procese rdspund diferitla semnalele reglatoare. Reacfiile anabolice presupun adesea reducere chimici, asigurat' deNADPH care funclioneazd"ca donor de electroni.
j!::ri:{r}i ! ':.sytt'ir,: ri:c: gi,:r i i . i r i :1 i iRrit?ri$),it.
'fi|l(_) ?i!_r_i;.?
l:!{i!:itrIi{E:tt::..itiIut:JfiI
1tt;tt;r)-5.tlJ1.J i{l ji ji,tiiif t
ti i
{ i i )gtT f
" t t j
**tr '= I
! l
1{td
i f f Jt, xii:.:Jii4i ici:.
1}-i irr':ail:fili
tr.:dirc{t,:<irl!t:: 1.r .y+y&il
iti),ti:!dtt1:.1i
Idr.].-r, o: c
.i. it 1:-li) 6i: ::I
,r' tiJ-'zi i: i J,. r'1j-',t i.:i .,{r:rj td-i ii
Fig. 3.3. comparafe intre calea catabolica gi calea anabolicd.
in concluzie, catabolismul este un proces convergent, prin care o mare varietate demolecule sunt transformate in pufine produse finale. Din contr5, anabolismul este un proces
divergent, in care c61iva precursori de biosintezd" formeazd o largd varietate de complexepolimerice.
3.2. CAI DE DEGRADARE A SUBSTRATULUI (CATABOLISM)
Principala surs6 de carbon utilizath in procesele de biosintezd o constituie glucidele.
Microorganismele metabolizeazd glucidele in mod diferit, in funclie de specie qi de condiliilemediului exterior in care sunt obligate s6 se dezvolte.
C6ile de degradare a substratului in celulele microbiene sunt, in general, comune cu cele ce auloc in orice fel de celule vii, cu modificdrile specifice survenite pentru fiecare cazinparte.
3.2.1. Glicoliza
Glicoliza este folositd de celulele eucariote qi procariote la degradarea glucozeipentru:
- a genera energie (sub forml de ATp);
- a produce intermediari necesari altor c6i metabolice.
Glicoliza reprezintd" placa turnantd a metabolismului glucidelor, deoarece virtual toate glucidele,
indiferent de provenienla lor, in ultimb instan
ireversibil piruvatul,
acizrlor tricarb oxi I i c i
metabolitul final al glicolizei,
(TCA) qi al produgilor necesari
in acetil CoA, produs
sintezei acizilor gragi.
major pentru ciclul
Sixs*mo$€a .#fu**alii+f
tssu*e*srs**F"+
Srs*t*e*-1,S",&**"S$*'**-*-
"" **mifr'"r*"
%G*If
sr6s*l*tI ***t$t?#t,&eifi.Fr,sfagli,ewrd
$t$"F.*mf*gJfue*Rt
it?"FwffiHl$e#r*t
+fFex{'s*{te{ f;lttg{ig
,+T:t Firtil#t
Fig. 3 .4. Glicoliza, una dintre ciile esenfiale ale metabolismului energetic: a - reacgiile glicolizei aerobe; b
- reacliile glicolizei anaerobe.
Carboxilarea piruvatului Ia oxaloacetat. Carboxilarea piruvatului la oxa-loacetat cu
ajutorul piruvat carboxilazei reprezint6 o reaclie dependentd de biotind (fig. 3.5). Aceastd reaclie
este importantd pentru c[ reaprovizioneazd ciclul acizilor.ricarboxilici cu intermediari qi asigur[
sub stratul pentru gluconeogenez[.
{}y.alnxtrtirt A*:efi} ( io.*\
-!I6ir!tb trf6$e :a grc:larl pr'4{rti+j-A.tilRA *e 4{6,. 3*gr<:r,i;llnoei x.irtgtlsJJfti cft.dl, !tt'r: qt. 16 h-ri <5l ut:*Kt
-P.arrJ':}'<zr+{bl,i3
taf.,l{, t,8::<1J:, }>iRt:!irT gEH{L}ROi:. fbryd-rfl. frp, i|idtrJ':rl,r!!n l>!f , fi j;t a tcr
*-r'{"-fi (t?tpr i1}sy's2-,4ii:ls d(.'>r:ei! flrri pxid::'i'(;,6, li
,i<fNd d':,r:ati 8)rr$- F-sil:: i.uje'tilrlt
Fig. 3.5. Prezentarea schematic[ a metabolismului piruvatului.
n Producereu de ATP. Sunt generate 2 molecule de ATP pentru fiecare moleculd deglucoza convertitl in lactat (fig. 3.6). Deqi glicoliza anaerobd ellbereazd numai o micd fracfiunede energie conlinutd in molecula de glucoza, aceasta este o sursd de energie valoroas6 in unelecondilii gi anume c6nd ap-ovizionarea cu oxigen este limitatd sau in fesuturi lipsite demitocondrii.
*'+.***$'*r"iLD ni'F
, t:.'hiiairti;F 4-3.*t Gl*crr:g+F
!;.\tt' --.'.**......fiUt'*'r.siC-rlii<t 3'F @ n."-
?l.{,;nr; ;fiffi::::# f 4;.:;rre_. :',;'.t o,,,' *l$'**dt1'rr'g'1$'*l:';'* * *-- : "'=* r r Llii u t- * r +
r*-.......................*r. .,*.de.x, *:-:*+t '*}
ru* Ii*Xil+I:g''f 4"1 :#.Fi:tf+gi;'rr3i,:ti t***, "**! Fr.lrtu*+r* ,.'r B
-".. tf ,.-! $. )ti :d::r4itr:err: {)
elire* st,-, ttr,pt n:v al:rtj i.l*;:::--::::-4' i.it!*-.--.-.--S f t)rt*#.ttils' [ _:-]':::"': *ffi liou,l'rxot) .--*ii. :**AtXl'r'I{'
:fiiirtr :ti,{titi f2i-j'
Fig. 3.6. Schema glicolizei anaerobe. Reacfiile implici producerea sau consumul de ATp sau NADH +
Ff. Reacgiile ireversibile ale glicolizei sunt indicate cu sigefi mari.
Producetea de NADH+ H*. In glicoliza anaerobd nu are loc o producere sau un consumnet de NADH; NADH+ H* format de gliceroaldehid-dehidro genaza este folosit delactatdehidrogenazd pentru reducerea piruvatului lalactat (fig. 3.6). Se produc 2 molecule delactat pentru fiecare moleculd de glucoza metabolizatd.
Glicoliza aerobd. Reaclia global[ este:
Glucoza + 2Pi + 2 NAD* +2 ADp -> Zpiruvat+ 2 ATp +2 NADH + Zrt + H20Formarea directd gi consumul de ATP sunt aceleaqi ca in glicoliza anaerob[, adic[ un
cdgtig net de 2ATPlmolecul5 de glucoza. Se produc, de asemenea,2 molecule de NADH + H+moleculi de glucoza. Mai mult, glicoliza aerobl necesitd oxidarea majoritdlii acestui NADH +Ff prin lanpl transportor de electroni. Produgii finali ai glicolizei, piruvatul sau lactatul, conlinincl majoritatea energiei blocate in glucoza. Ciclul acizllor tricarboxilici este necesar pentrueliberarea completd a acestei energii.
3.2.2. Calea hexozomonofosfa{ilor
Calea hexozomonofosf4ilor (Inip) - denumit[,
fosfogluconatului - este formatd din doud reactii
de asemene a, calea pentozofosfalilor sau
ireversibile, urmat[ de o serie de
l1
'J t
" r r sr i , { . r r i L
interconversiuni de intermediari fosforilali (fig. 3.7).in ciclu nu se consumd sau nu se produce
direct ATP. Carbonul I al glucozo 6-fosfatului este eliberat ca CO2 qi dou6 molecule de NADPH
+ H* pentru fiecare glucozo 6-fosfat intrat in etapa oxidativd a ciclului. Spre deosebire de
glicoliza sau ciclul acidului citric, in care direclia reacliilor este bine definitd, reacliile de
interconversiune ale ciclului HMP pot funcliona in diferite direclii. Yiteza qi direclia reacliilor in
fiecare moment dat este determinatd de asigurarea qi necesarul de intermediari din ciclu. tn
celulS HMP asigurd cantitatea necesar[ de NADPH + Ff care funclioneazd" ca un reducltor
biochimic. HMP produce, de asemenea, pentoze ribozofosfat necesare pentru biosinteza
ribozofosfat nucleotidelor qi asigurd un mecanism alternativ pentru ttilizarea surselor cu cinci
atomi de carbon atat in celula eucariot[ cit qi in celula procariot[.
cj-i? f,'lfttt$ttel
d5-P
/..i.!.*e*'s* d-F*s*ptul*z* ?-F Ftmitr:r:c &F
Er'lqrrec q.:
Glil:er:xldxhi* 3-F
Fig. 3.7 . Calea hexozomonofosfat.
3.2.3. Conexiuni intre calea glicolizei gi calea hexozomonofosfat
Transformarea gliceraldehid 3-fosfatului in piruvat. Gliceraldehid 3-fosfatul poate fi
transformat in piruvat de cltre bacterii aero-anaerobe, drojdii qi fungi dupi formula.
Glucoza + 6 NADP*-> Piruvat + 3 C02+ 6 NADPH + H*
Gliceraldehid 3-fosfatul poate fi condensat, de asemenea, cu fructozo 6-fosfatul de cdtre
gli ceraldehi d P- aldolaz a, pr ezentd, la bacterii I e aerob e dupd formula :
2 Gliceraldehid 3-fosfat -> Fructoro-6-lssfat +Pi
Conversia pentozofosfa{ilor in intermediari ai glicolizei. Celulele care realizeazd
reac{ii de reducere au mai mare nevoie de NADPH + H* decdt de ribozo 5-fosfat. In acest caz
transcetolazele qi transaldolazele transforml ribozo 5-fosfatul existent intr-un produs final al unei
reaclii oxidative, adicd in gliceraldehid 3-fosfat qi fructozo 6-fosfat, care sunt intermediari ai
glicolizei.
%%_,d-F #h***trulertr:*;6
ltib';rau 5-F
ffi.*,. ,ft'o*,, i& fuFu*** i':i li:: l*i{:lf.}- r:l -j
T2
GJtrt:ncg:lIf
Slrtc*:o S"fqrsfat' \ia.
* "" . . . . .* . . ._. . . .?
t
t"Frt
Ptu$trJgc 6.krsf:it += tI
' -**.-.. 1l t -? -.--
GNirmrpaidafrtr{ 3^fus!sttIP
Firrivat
Fig' 3.8. Prezentarea schematici a raportului dintre glicoliza qi caleahexozomonofosfat.
Formarea ribozo S-fosfatului din intermediari ai glicolizei. in conditiile in carecererea de pentoze nesesare pentru incorporarea lor in nucleotide gi acizi nucleici este mai maredecit necesarul in NADPH+ H*, reacliile nonoxidative pot s6 dea nastere la biosintezd ribozo 5_fosfatului din fructozo 6-fosfat in absenla etapelor oxidative.
3.2-4- calea Entner-Doudoroff sau calea 2-ceto-3-deoxigluconat
Calea Entner-Doudoroff (ED) a fost descoperiti prima datd in 1952 la pseudomonas
saccharopltila qi ceva mai tirziu la Escherichia coli. Deqi inilial s-a considerat a fi specific[pentru tulpinile Gram-negative, calea ED este prezentl" la cele trei ramuri filogenetice, incluz6ndqi Archaea- Ubicuitatea clii ED sugereazd importanla mult mai mare a acesteia in natur[ dec6t s-a recunoscut inilial. Studii recente asupra evoluliei c[ii glicolitice sugere azd, cd, ED a precedatcalea EMP.
Biochimia qi fiziologia metabolismului acizilor zaharici la E. coli, precum qi noi genecare codificd transportorii acizilor zaharici, proteinelor reglatoare asociate qi noua cale catabolicla acizrlor zaharici au putut fi identificate ca uffnare a ,,proiectului genomuluila Escherichia coli,,(1997). Studiile au relevat cE genele cbii ED sunt prezente, de exemplu, in genomul de Bacillussubtilis, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae etc, fiind astfel evident cd aceast6cale ar putea fi una adilional6 sau chiar noud, dupd cum relev[ analiza geneticd a genomuluimicroorganismelor citate mai sus.
Calea ED poate fi consideratl"una dintre cele trei cdi prezente la microorganisme, allturide EMP gi HMP, care se alimenteazd in a doua jum[tate a glicolizei EMp, o cale centrald inmetabolismul intermediar. Schemele generale ale cdilor ED qi EMp sunt intru totul similare:glucidele cu $ase atomi de carbon sunt fosforilate qi ulterior clivate cu ajutorul aldolazelor in doiintermediari cu trei atomi de carbon (fig. 3 9).
ttitr*e* 4-fd fai
rt''--'" *'-'r''
LV ili'3r.: -.t'+ 6i rrcorc,S Ji', / ' ! ! ' .
A':'r, ar*P i#1" 3ii)'flrptJ; t., 'atl'f .
--*':'g i:i:3:* a
"' a^ic^'1
.i- l |, 'rr*o*r€\-*-i*i1;i*1ll ' ;{; 'TfHfi i i f i r ;
i 4.1<3:JrrlrrzlJ .^.
il.,orr'l rf;t
llscrl**"{1{3
t) Firurst
It
LactBi-n;ni r,tanal
{) *rcctrinaz*
i$-i ixr',:.ttrrr,
S'F.Skrconsi{}r{}Pc}
c;'iCHO*C; r)tt.C.. {S}i
I . "V .-.,-"i 3"Fu*tii:*rrsicjoii*
i igliirrlislit
CS*t'i*.C-Cr'i3 + 3 l,?F *,..i4{it.tl
t Fris3lr.;,}
'$ tik;c+zc +.R.dr:*l.Jroger,^rlx
,Q) r,rF6 "i,;.,,,r*
Fig. 3.9. Calea Entner-Doudoroff.
Prima deosebire intre cele doud cdi const[ in natura atomului C6 a meta-bolitului care
serve;te ca substrat pentru clivarea aldalazicd. pentru ED acest intermediar este 2 ceto-3
deoxi-6-fosfogluconat (CDPG). Prima din cele doui enzime este unicd pentru calea ED, 6-
fosfogluconat dehidrataza (Edd) carc catalizeaz[ dehidratarea 6-fosfogluconat cu formare de
CDPG. Cea de-a doua enzimd a cdli ED, CDPG aldolaza (Eda), catalizeazd, o clivare aldol a
CDPG cu formare de gliceraldehid-3-fosfat. Intermediarul triozofosfat este in continuare
metabolizat pe calea glicolizei qi produce energie via fosforilarelanivel de substrat.
3.2.5. Ciclul acizilor tricarboxilici
Ciclul acidului citric denumit $i ciclul Krebs sau al acizilor tricarboxilici are roluri
diferite in metabolism. Funclia principald constd in oxidarea acetil CoA la COz qi apd. Acetil
CoA derivd din metabolismul unor molecule ca aminoacizri, acizli graqi gi glucidele (fig.
3.10). Aceastd oxidare reprezintd" aproximativ doud treimi din totalul consumului de oxigen gi
al producliei de ATP la majoritatea organismelor animale, incluz0nd gi omul. Ciclul acidului
citric participd, de asemenea, la un numdr mare de reaclii de sintezS. De exemplu, ciclul
participd,la formarea glucozei din scheletul de carbon al amino acizilor qi asigur[ ,gdrdmizi de
baz6" pentru sinteza hemului. Ciclul este caracteristic pentru o serie de microorganisme.
I4
Inilial, in ciclul acidului citric, oxalacetatul este condensat cu acetat,fiind regeneratlaincheierea ciclului. Totuqi, aceste reaclii trebuie privite nu numai ca un ciclu inchis, ci jnai degrab6" ca un ciclu de trafic prin care o serie de compugi intr[ qi ies dupi necesit6li.
( n A**tit$*A'r i -J*_
*r*fp***ret kl*et#. -'-s.fruai*t rx*'{*rer
i f* * i F**z/ {-inT,.$Bnat fl*frs{ii$tt$*rs.t
"*r srw!fr*q *u**inirofff: *
K_*-*y', _
Fig. 3.10. Ciclul acidului citric
Compexul piruvat dehidrogenaz[ este un complex multienzimatic. Converteqtepiruvatul, produsul final al glicolizei, ?n acetil CoA, substratul major pentru ciclul aciduluicitric (fig. 3.11). Ireversibilitateareac[iei impiedic5 formarea piruvatului din acetil coA qi
explicd de ce glucoza nu poate fi formatd din acetil CoA in gluconeogenezd. piruvat dehidro-genazd nu face parte propriu-zis din ciclul acidului citric, dar este o sursd important[ de acetilCo{ substrat cu doi atomi de carbon necesar ciclului.
$-"'' -'mslqA-c Iff.rul,uf q
*€dfnk{.2pcf,sss | -***ornn,
,qsl*?tt *FA-*s il ft{-t4.{t}ti **" 61,,*\**c*a
.'j f
*1Lt3*])rt+ ll'
uf..fs*e-rbr3
,il:fi,r*ati f*&
Fig. 3. 1 1. Decarboxilareaoxidativd a piruvatului.
3.3. cAr DE BrosrNTnzLA coNSTrruENTrLoR cELULART (ANAB9LT5M)
in procesele de creqtere microbianS. se evide nliazdurm[toarele fazele: lag, logaritmicl,stalionar[ qi de moarte sau declin. in procegele industriale ?n care metabolilii microbieni suntproduqii principali, se pot corela fazele de multiplicare cu etapele de biosinte z6 a metabolitilorprimari qi secundari.
15
Metaboliyii primari se formeazl, in faza de creqtere logaritmici a microorganismelor,
in timp ce metaboliyii secundari se formeazd la sfhrgitul fazei de creqtere qi, frecvent, la
inceputul sau in timpul fazei stafionare.
Deosebirea dintre metabolilii primari qi secundari este redatl,infigura3.T2.
Fig. 3.12. Diferenla dintre metabolismul primar gi secundar: a - celulele qi metabolilii sunt produgiaproximativ simultan; b - dupi formarea celulelor qi metabolitului primar, celulele transformimetabolitul primar in metabolit secundar; c - dupi dezvoltarea celulelor" substratul de cregtere rimaseste transformat in metabolit secundar.
3.3.1. Metaboli{ii microbieni primari
Procesul microbian tipic in care se formeazd un metabolit primar, in timpul fazei de
cre$tere exponenliale (og), este fermentalia al c oolicd.
Etanolul este un produs al metabolismului anaerob al drojdiilor gi al unor bacterii qi
reprezirfi.Lin acelagi timp o parte a metabolismului energetic. Deoarece creqterea poate avea
loc numai cu consum de energie, formarea etanolului decurge paralel cu cregterea. in
fermentalia alcoolic[ tipicd se formeazd biomasd qi etanol, concomitent cu consum de sursd
de carbon (glucid).
3.3.2. Metabolitii microbieni secundari
Metabolitii care se formeaz[ la inceputul sau in timpul fazei stalionare sunt denumili
metabolili secundari gi sunt cei mai comuni qi importanli metabolili de interes industrial. Cei
mai cunosculi metabolili secundari studiali intensiv sunt antibioticele.
In timp ce metabolismul primar este in general asemlnltor la toate celulele,
metabolismul secundar diferd de la un organism la altul.
Caracteristicile metabolismului secundar sunt urmdtoarele:
- fiecare metabolit secundar este sintetizat de un numdr mic de microorganisme;
- metabolitul nu pare a fi esenlial pentru creqterea qi inmullirea microorganismului;
16
- formarea metabolitului secundar este extrem de dependent[ de condiliile de
creqtere, in special de compozifia mediului. Apare frecvent fenomenul de represie a sintezei
metabolitului;
- metabolitul secundar sinteti zat de microorganism se prezintd sub forma unui
amestec de substanle cu structur[ chimicd inruditd. De exemplu, o tulpin6 a unei specii de
Streptomyces produce p0n6la 32 de antracicline inrudite;
- adesea, poate fi oblinut6 o supraproduclie de metabolit secundar, deqi metabolilii
primari, produqi de metabolismul primar, nu sunt sintetizali in cantitate mare.
17