METODE DE STUDIUHISTOLOGIA

HISTOLOGIA - definitii• HISTOLOGIA este stiinta care se ocupa de studierea

tesuturilor din corpul uman si de conexiunile si aranjarea acestora in constituirea organelor.

• ETIMOLOGIE: histo in limba greaca se traduce atat prin termenul de tesut cat si prin cel de retea, amandoua fiind pertinente deoarece tesutul este o retea de legaturi intre filamente si fibre, atat celulare cat si noncelulare, prin conexiuni membranare.

• Histologia implica aspecte ale biologiei tisulare concentrate pe optimizarea structurii de aranjare a celulelor in vederea unei functionari optime a tesuturilor fiecarui organ.

HISTOLOGIA - matriceaComponentele interactive ale tesuturilor sunt MATRICEA celulara - MC si MATRICEA extracelulara - MEC.

Matricea Extra Celulara contine macromolecule cu structuri complexe (ex.fibre de colagen),

asigura suport pentru celule si fluidul care transporta nutrienti spre celule si de la acestea produsii de catabolism si secretiile celulare,

celulele produc MEC,interactiunea dintre celule si matrice se extinde la mai multe

componente ale matricei recunoscute si atasate de receptorii celulari de suprafata, multe proteine receptoare deschid membrana celulara si se conecteaza de componentele din interiorul celulei.

celulele si MEC pot fi privite ca o structura continua functionand si reactionand impreuna la stiumuli si inhibitori.

HISTOLOGIA - tesuturi si organe• Fiecare tesut fundamental al corpului este format din tipuri

de asociatii celulare specifice intre celule si MEC.• Exista 4 tipuri de baza de tesuturi: epitelial, conjunctiv,

muscular si nervos si ele formeaza organele.• Toate animalele detin aceste 4 tipuri de tesuturi.• Organele sunt astfel formate din diferite tesuturi care

impreuna ii asigura functionarea in sine ca organ si organismului ca un tot functional.

• Dimensiunile reduse ale celulelor si ale componentelor matriceale fac histologia dependenta de instrumente optice /microscoape si de metode moleculare.

• Studiile avansate in biochimie, biologia moleculara, fiziologie, imunologie si patologie au intregit metoda de cunoastere in biologia tesututilor

HISTOLOGIA - tesuturi si organe ex.• Tesut epitelial , tranzitional, din vezica urinara

• Tesut stratificat scuamos gura, esofag, cervix si piele -tesut epitelial-

• Alveole pulmonare in pneumonie -tesut conjunctiv

• Tesut adipos

Tesut muscular

NOTIUNI DE BIOLOGIE CELULARABiologia celulara studiaza STRUCTURA si FUNCTIA celulara.• Celula contine informatia necesara pentru a supravietui, in

materialul ei genetic – AND.• Diviziunea celulara contribuie la inmultirea celulara.• Dupa localizare si forma materialului genetic, diversitatea

organitelor si a functiilor tipurile celulare se impart in doua mari categorii : PROKARIOTE (de ex.bacterii) si EUKARIOTE – de la protozoare PLANTE

MAMIFERE• ORGANITE celulare: element intracelular caracterizat

printr-o organizare moleculara complexa si specifica care induce o morfologie si functionalitate proprie.

DIFERENTIEREA CELULARA

• Timpul dintre 2 diviziuni succesive se numeste interfaza.• In timpul vietii adulte celula isi dezvolta organitele care o

ajuta sa desfasoare anumite functii, sa se specializeze.• DIFERENTIEREA sau specializarea este un proces in care

celula adulta este influentata prin indicii semnalate de celelalte celule.

• Fiecare tip de celula diferentiata presupune modificari in morfologie care ajuta la indeplinirea unei functii specifice.

• Procesul programat de moarte celulara se numeste apoptoza.

• Unele celule raman in organismul adult in stare NEDIFERENTIATA si se numesc celule stem caracterizate prin: nediferentiere, multipotenta si grad inalt de regenerare proprie.

DIFERENTIEREA CELULARA• Tesut epitelialepiteliu columnar-tract digestiv

osteoporoza

Ulcer gastricTesut cardiac dupa infarct miocardic

CELULA EUKARIOTA• ORGANITE celulare: element intracelular

caracterizat printr-o organizare moleculara complexa si specifica care induce o morfologie si functionalitate proprie.

• Clasificarea organitelor celulare: INCERCUITE DE MEMBRANE: nucleu, reticul

endoplasmic, aparat Golgi, lizozomi, peroxizomi si mitocondeii,

FARA MEMBRANE: ribozomi, citoskeleton, proteazomi si apoptozomi.

• Corpul uman contine 200 de tipuri de celule.

METODE DE STUDIUDIMENSIUNI CELULARE

• In medie celulele au intre 20 – 30 m (10-6m)• Cea mai mare este ovocitul 200 m (10-6m)• Celulele sangelui au 7 – 8 m (10-6m)• Ochiul uman poate vedea pana la dimensiuni de

0,1 mm (10-3m)• Pentru a vedea celulele se folosesc aparate optice

care cresc capacitatea cu cel putin 103 ori a ochiului uman.

METODE DE STUDIU• Primul aparat folosit la studiul celulelor a

fost microscopul optic MO.• Detaliile despre organizarea

celulara/organite le-a dat microscopul electronic.

• La depistarea mecanismelor de functionare celulara au contribuit microscopia optica si electronica precum si cercetarile din domeniul bichimiei, biofizicii, etc.

METODE DE STUDIU• Mentinerea celulele intacte morfologic si bine

conservate se realiza printr-un tratament special care nu permitea viabilitatea. Asa au fost realizate primele microscopii.

• Includerea in parafina se practica si astazi pentru piesele studiate la microscopul optic.

• Pentru aprofundarea informatiilor aduse de preparatul analizat se realizeaza colorarea.

• Organitele celulare se observa la microscopul electronic.• Pentru obtinerea informatiilor despre compozitia

biochimica si/sau functiile tipurilor celulare se utilizeaza alte metode (ex.culturi celulare).

TIPURI DE MICROSCOAPE Microscop cu lumina artificiala Microscop cu lumina polarizata Microscop binocular in fluorescenta Microscop cu contrast de faza Microscop cu contrast de faza prin interferenta Microscop cu lumina catodica Microscop confocal cu laser (confocal laser scanning microscope) Microscop 4pi Microscop de contrast si reflexie Microscop cu imersie Micropscop roentgen Microscop electronic: cu neutroni cu unde ultrascurte

DESCRIERE TEHNICI MICROSCOPICE M.cu lumina polarizata este proiectata pentru a observa şi a fotografia

obiecte vizibile datorită caracterului lor optic anizotrop. M. cu fluorescenta analizeaza proprietatile organice sau anorganice ale

substantelor utilizand fenomenul de fluorescenta sau fosfoflourescenta in aditia fenomenelor de reflexie si absorbtie.

M. in contrast de faza se bazeaza pe tehnica conform careia mici schimburi de faza ale luminii ce strabate un obiect transparent sunt transformate in schimbari ale amplitudinii sau contrastului imaginii.

M. cu contrast de faza prin interferenta cunoscuta si ca microscopie Nomarski este o microscopie prin iluminare optica ce mareste contrastul probelor transparente necolorate.

M. 4Pi foloseste doua lentile de mare rezolutie pentru iluminarea specimenului din doua directii opuse.

M. confocala cu laser este o tehnica folosita pentru obtinerea de imagini de mare rezolutie.

M. de contrast si reflexie (RCM) utilizeaza fenomenul optic realizat prin epi-iluminarea oblica

CITOMETRIA IN FLUX Citometria in flux este o tehnica pentru masurarea

rapida, efectuata asupra particulelor sau celulelor, aflate in suspensie, si trecute, una cate una, prin dreptul unei sistem de detectie.

In forma sa cea mai simpla, un aparat de citometrie in flux este o combinatie a unui sistem fluidic de furnizare a probelor, un spectrofluorimetru si un fotometru de dispersie a luminii.

In camera de masurare celulele sunt aduse, una cate una spre un fascicul laser care stimuleaza emisia si dispersia luminii.

APLICATIILE CITOMETRIEI IN FLUX• imuno-fenotipare, utilizata pentru testele de

histocompatibilitate, • in oncologia hematologica, in diagnosticul oncologic,• prin capacitatea unor tipuri de aparate de a efectua si

sortarea celulelor (purtatoare ale unor seturi de antigene se pot obtine populatii celulare de interes terapeutic (de exemplu celule stem), tehnologie care permite varianta de autotransplant medular, la pacienti cu forme diverse de neoplazii ale tesuturilor hematopoietice,

• permite selectia exclusiva a celulelor ce poarta setul de antigene corespunzatoare celulelor stem sanatoase.

BIOLOGIE MOLECULARAPCR-polymerase chain reaction

• Reactia de polimerizare in lant a acidului dezoxiribonucleic (ADN)

• Aceasta reactie a fost descoperita in 1983 de Kary B. Mullis• Este o tehnica prin care se genereaza multiple copii

identice pornind de la o singura molecula de ADN deoarece mai multe copii sunt mai usor de detectat , analizat si prelucrat ulterior

• Practic imita in vitro procesul de replicare al ADN• Enzima cheie a reactiei este Taq-polimeraza (care la

temperaturi inalte 930C), in prezenta careia ADN-ul in mod normal dublu catenar disociaza si astfel fiecare catena poate fi copiata.

ETAPELE ANALIZEI in tehnica PCR clasic• precultivarea esantionului de proba (5-10 h)• extractia ADN-ului• verificarea ADN-ului extras spectrofotometrie electoforeza• reactia PCR• electroforeza pentru relevarea ampliconilor:

prezent/absent• timp total 24-48h

REAL TIME PCR• sau Reactia de polimerizare in lant a acidului dezoxiribonucleic

(ADN) monitorizata in timp real• In Real time PCR, produsul de amplificat este detectat prin

intermediul colorantilor fluorescenti.• In timpul reactiei sunt folosit „sonde” oligonucleotidice care intr-

o anumita etapa a amplificarii se prind specific fie de produsul amplificarii fie de fragmentul tinta ce urmeaza a fi copiat .

• Fenomenul de fluorescenta creste in intesitate pe masura ce cantitatea de produs amplificat creste.

• Monitorizarea intesitatii fluorescentei chiar in timpul reactiei PCR permite detectia si cuantificarea produsului acumulat in timp real.

• Diferenta esentiala intre PCR si Real time PCR consta in faptul ca in cazul PCR, este necesara o etapa post PCR pentru cuantificarea produsului.

TISSUE MICROARRAYSIN HISTOLOGIE

Se realizeaza printr-o metoda de relocare a tesuturilor din blocuri conventionale de parafina (pana la 1000), denumite blocuri donor pe un singur bloc denumit receptor. Aceasta se obtine punctionand blocurile donoare in zonele prestabilite si de interes si plasand continutul acului intr-un dispozitiv preformat (care poate contine pana la 1000 de orificii ) care ulterior va fi inclus in parafina ca si un bloc standard de parafina. Astfel pe o singura lama histologica se pot analiza pana la 1000 de probe diferite.

AVANTAJELE TEHNICII TISSUE ARRAYS • Dezvoltarea recenta a tehnologiei microarray-tissue face posibilă asezarea a unui numar de până la

1.000 de esantioane din tumori pe un diapozitiv de sticlă, care apoi poate fi analizată prin fluorescenţă în hibridizare in situ, a ARN-ului în hibridizare in situ, sau imunohistochimie.

• Tehnologia ţesutului microarray are potenţialul de a accelera în mod semnificativ studiile moleculare, ce caută asocierile dintre schimbările moleculare şi caracteristicile clinicopatologice ale cancerului.

• Aplicaţii potenţiale pentru tehnicile microarray- ţesuturi includ: testarea şi optimizarea probelor şi anticorpilor, organizarea arhivarii,depozitarii ţesuturilor mari şi facilitarea studiilor multicentrice.

• Pot fi utilizate în scopuri educaţionale, precum şi de îmbunătăţire a controlului calităţii şi standardizarea metodelor de colorare şi interpretare. Microarrays Tissue a devenit unul din instrumentele cele mai promiţătoare pentru patologia moleculara şi anatomica şi va avea multe aplicaţii în cercetare în domeniul cancerului.

• Identifica un număr de solutii în continuă creştere utile în clasificarea bolilor moleculare, in dezvoltarea medicamentelor, precum şi in predicţia răspunsului la tratament. Validarea ulterioara cu privire la importanţa clinică a acestor tipuri gene sau proteine necesită o analiză la scară largă a ţesuturilor umane.

• Aplicaţiile potenţiale ale tehnologiei TMA includ stabilirea unor asociaţii între schimbările moleculare şi obiectivele clinice, testarea potenţialelor ţinte terapeutice folosind probe de ţesuturi specifice de la pacienţii cu cancer, standardizarea detectarii moleculare si translatia rapidă a rezultatelor de la liniile de celule de pe modelele animale in cancer uman. Din cauza aspectelor sale benefice economice şi datorita capacitatii de a diferenţia diferenţe etnice în biologia tumorilor, cererile de TMA pot deveni deosebit de importante în ţările în curs de dezvoltare.

• In hibridizarea in situ (ISH) sau coloratiile imunohistochimice (IHC), , ţesutul trebuie să fie prelucrat nu mai mult de 48 de ore de fixare. Acest pas poate fi crucial pentru mentinerea intacta a antigenilor mRNA cu ajutorul tissue array-ului.

TISSUE MICROARRAYSIN BIOLOGIA MOLECULARA

• ADN-array-ul : aranjarea a sute de secvente reprezentative de ADN - intr-un singur experiment - pe un suport solid (lame de sticla sau material plastic).

• Metoda foloseste abilitatea ARNm de a hibridiza pana la secvente ADN cunoscut.

• ARNm este extras din celule normale sau patologice si este folosit pentru a genera fragmente de ADN complementar (ADNc) numite probe.

• In final se pun in contact probele ADNc cu secventele ADN-tinta, acestea legandu-se in cazul compatibilitatii. Cantitatea de ADN legata este cuantificata apoi.

• Selectia de gene candidate reprezinta principala aplicatie a „ADN – array”. Se compara profilul genic al tesutului neoplazic cu tesut non-neoplazic al aceluiasi organ, folosind teste statistice simple, pentru a identifica genele care predomina sau sunt exclusiv exprimate in respectiva neoplazie.

• Predictia claselor de gene - reprezinta o abordare diferita si anume a descoperii de patterne complexe ale unor expresii genice in patologii cunoscute.

• Identificarea claselor de gene- reprezinta descoperirea de patterne complexe ale unor expresii genice in patologii ce nu erau cunoscute.

• ADN-array poate fi util deasemenea in diferentierea variatelor subtipuri tumorale cu prognostice si metode terapeutice diferite.

IMUNOHISTOCHIMIA• Este o tehnică de identificare a antigenelor celulare şi tisulare, în urma unei interacţiuni

antigen-anticorp; situsul de legare a anticorpului se identifică fie prin metode directe de colorare a anticorpului, fie prin metode indirecte.

• ANTIGENELE sunt substanţe exo sau endogene capabile să declanşeze un răspuns autoimun, prezintă unul sau mai multe situsuri de legare a anticorpilor. În cazul imunocolorării se recomandă utilizarea anticorpilor de mare afinitate, deoarece aceştia vor fi rezistenţi la procedurile de spălare din timpul reacţiei şi nu vor disocia în soluţiile saline utilizate.

• GRUPELE DE ANTIGENE antigenele mezenchimale (vimentina); antigene epiteliale (citokeratinele, antigenul de membrană epitelial-EMA, desmoplakina); antigene musculare (desmina, mioglobina, actina) ; antigene vasculare (antigenul asociat factorului VIII, CD34, CD31-PECAM); antigene neurale şi markeri neuroendocrini (proteina S100, enolaza neuronal specifică –

NSE, neurofilamentele – NF, proteina glicofibrilară acidă – GFAP, proteina bazică a mielinei – PMB, TB-01, cromogranina şi sinaptofizina);

antigene leucocitare (antigen leucocitar comun – CLA, CD45, RO – limfocite T cu memorie, CD4- -limfocite T helper, CD8- limfocite T citotoxice, CD20 – limfocite B, CD68 – macrofage, CD15 şi CD45 – celule Reed Sternberg etc);

tipuri speciale de antigene (antigene tumorale histotipice, factori de proliferare, antigene de membrană bazală, receptori hormonali etc.).

ANTICORPII• Anticorpii policlonali sunt produşi de celule diferite şi

reacţionează cu epitopi diferiţi ai aceluiaşi antigen sau cu antigene diferite; se obţin din serul animalelor imunizate cu diferiţi antigeni sau determinanţi antigenici. Anticorpii policlonali pot da o coloraţie mai mare decît cei monoclonali deoarece ei pot reacţiona cu întregul spectru de antigene întâlnite la animalul imunizat.

• Anticorpii monoclonali recunosc în mod specific un singur epitop al unui antigen.

• Anticorpul policlonal are o sensibilitate mai mare, dar o specificitate mai mică în identificarea antigenului comparativ cu cel monoclonal. Datorită tehnicilor de amplificare utilizate, această diferenţă de sensibilitate devine nesemnificativă, astfel încât se preferă (datorită specificităţii net superioare) utilizarea anticorpilor monoclonali.

ENZIME, SUBSTRATURI SI CROMOGENI UTILIZATI IN REACTIILE IMUNOHISTOCHIMICE• Din anul 1969 se folosesc sisteme enzimatice în locul fluoresceinei

pentru marcarea anticorpilor; singura dificultate este reprezentată de încercarea de a lega una de alta două molecule mari, respectiv enzima şi imunoglobulina, fără ca una din ele să-şi piardă proprietăţile. Această tehnică, în care anticorpul marcat direct cu enzima se lega de substrat, a fost prima utilizată în imunohistochimie şi poartă numele de tehnică directă.

• Ulterior s-a dezvoltat tehnica indirectă, în care enzima se leagă de complexul antigen-anticorp prin intermediul celui de-al doilea anticorp, antiimunoglobulină.

• Această a doua tehnică permite amplificarea semnalului deoarece se pot utiliza mai mulţi anticorpi secundari marcaţi enzimatic, care să se lege de un singur anticorp primar; creşte astfel sensibilitatea metodei, ceea ce permite chiar utilizarea de diluţii din anticorpii primari.

CROMOGENI• AEC (3-Amino-9Ethylcarbazole) reprezinta un

cromogen foarte utilizat pentru coloratii imunohistochimice; acest reagent producand o colorare clara, uniforma si foarte intensa eliminand totodata rezidurile nedorite.

• DAB (3,3' Diaminobenzidine) reprezinta un cromogen foarte utilizat pentru coloratii imunohistochimice; fiind compus din doua componente: DAB cromogen si DAB substrat, acestea prezentand toxicitate crescuta fiind ideal pentru masinile automate de colorat.

VEGF(vascular endothelial growth factor) –pozitiv in celule tumorale din carcinom hepatocelular;

magnificatie X100, cromogen folosit AEC

CEA - pozitiv in celule tumorale, X100, cromogen folosit DAB

TEHNICA UZUALA DE PRELUCRARE A TESUTURILOR

ETAPELE PRELUCRARII HISTOLOGICE UZUALE

1. PRIMIREA SI FIXAREA PIESELOR OPERATORII

2. ORIENTAREA PIESELOR OPERATORII3. INCLUDEREA SI SECTIONAREA4. FLOTATIA5. COLORAREA

FIXAREA• ARE CA SCOP OPRIREA FENOMENELOR VITALE DIN

TESUTURI SI CELULE, PENTRU A PUTEA SURPRINDE MICROSCOPIC UN ANUMIT ASPECT HISTOFIZIOLOGIC SAU HISTOPATOLOGIC EXISTENT IN PRODUSUL RECOLTAT LA MOMENTUL RECOLTARII.

• FIXAREA IMPIEDICA ALTERARILE POST –MORTEM A STRUCTURILOR TISULARE SI CELULARE SI CRESTE CONSISTENTA PIESEI, ASFEL CA ACEASTA SA POATA FI SUPUSA PRELUCRARILOR ULTERIOARE.

• CANTITATEA DE FIXATOR TREBUIE SA FIE SUFICIENTA PENTRU CA APA DIN PIESE SA NU-I SCHIMBE CONCENTRATIA . DE OBICEI, VOLUMUL FIXATORULUI TREBUIE SA FIE DE 2 -10 ORI MAI MARE DECAT VOLUMUL PIESEI FIXATE.

• DURATA FIXĂRII VARIAZĂ CU TIPUL DE FIXATOR UTILIZAT, FIIND INTRE 3 ORE SI 24 DE ORE FIXAREA UZUALĂ SE REALIZEAZĂ CU FORMALDEHIDA LA TEMPERATURA CAMEREI.

ORIENTAREA PIESELOR• SE REALIZEAZA CU AJUTORUL UNOR INSTRUMENTE FINE SI

TĂIOASE,• SE ALEGE PIESA REPREZENTATIVA, CONŢINÂND ZONE CU

MODIFICĂRI MACROSCOPICE, PRECUM SI ŢESUTURI DE LA LIMITA LEZIUNILOR, EVITÂND ZONELE CU ŢESUTURI NECROZATE SI CU ZONE DE HEMORAGIE,

• IN TIMPUL PRELEVARII SE VA TINE CONT DE INCIDENTA SECTIUNILOR CARE SE VOR EXECUTA LA MICROTOM: PRIN ORGANELE PARENCHIMATOASE SE VOR REALIZA SECTIUNI PLANE,PARALELE SAU PERPENDICULARE CU GROSIMEA DE 3-5 MM,

• PENTRU ORGANE CAVITARE,TUBULARE SECTIUNILE VAR FI PERPENDICULARE PE LUMENUL ORGANULUI,

• PENTRU SCOARTA CEREBRALA PLANUL DE SECTIUNE VA FI PERPENDICULAR,

• PENTRU MUSCHI,MIOCARD SE POT REALIZA SECTIUNI LONGITUDINALE SI TRANSVERSALE.

IN TIMPUL ORIENTARII• Se evita trauma mecanica a tesuturilor• Se evita uscarea, incalzirea excesiva sau

afectarea chimica a tesuturilor• Se eticheteaza fiecare proba • Se evita intarzierile • Tesuturile se manipuleaza cu grija• Se taie sectiuni subtiri• Se evita traumele mecanice ale sectiunilor• Se evita supraincarcarea casetelor• Se eticheteaza in mod corespunzator

casetele

Orientarea piesei (workstation – ansamblu)

Workstation - detaliu cu masa de lucru si banc de unelte pentru orientare

INCLUDEREA SI SECTIONAREA• DUPĂ RECOLTARE SI FIXARE, SPECIMENELE FIXATE IN FORMOL SUNT SPĂLATE CU APA

CURENTA.• PENTRU A PUTEA FI INFILTRATE LA PARAFINA SPECIMENELE SUNT SUPUSE PROCEDURILOR DE

DESHIDRATARE SI CLARIFICARE. PROCESAREA TISULARA CONSTA DIN 3 TIMPI, CARE AU ROLUL DE EXTRAGERE A APEI SI DE A O ÎNLOCUI CU UN MEDIU CARE SE SOLIDIFICA SI PERMITE SECŢIONAREA.

• INCLUDEREA.• INCLUDEREA ESTE PROCESUL CARE PERMITE INFILTRAREA SPECIMENELOR CU UN MATERIAL

SEMIDUR, CU PUNCT DE TOPIRE FIX SI CARE POATE FI SECŢIONAT DUPA SOLIDIFICARE.• CEL MAI CUNOSCUT MEDIU DE INCLUDERE ESTE PARAFINA HISTOLOGICA, CU PUNCT DE

TOPIRE 56 GRADE.• SECŢIONAREA.• ESTE PROCEDURA PRIN CARE SE OBŢIN SECŢIUNILE HISTOLOGICE DE DIFERITE GROSIMI CARE

POT FI ATASATE PE LAME HISTOLOGICE IN VEDEREA COLORĂRII.• GROSIMEA NORMALA A SECŢIUNII ESTE DE 5 MICROMETRII.• Se orienteaza adecvat sectiunile in forme pentru parafina adecvate. • Se evita afectarea termica a tesuturilor.• Se verifica regulat temperatura.• Se evita supraincarcarea formelor pentru parafina. • Se folosesc lame de buna calitate.• Se seteaza corespunzator unghiul de taiere• Se evita afectarea termica a blocului de parafina.• Taierea se face evitand manevre bruste.

Procesarea tesuturilor – automatic spin tissue processor

Includerea la parafina

Aparat automat de includere la parafina cu placa de racire Termostat

Sectionarea – microtom manual rotativ cu baie de flotare

FLOTATIA• SECŢIUNILE HISTOLOGICE SE ADAUGA IN BAIA DE APA

PANA LA ÎNTINDEREA PE LAME / TOPIREA PARAFINEI.• SECŢIUNILE HISTOLOGICE SE SEPARA SI SE LIPESC PE

LAME CURATE, DEGRESATE CU ALCOOL SANITAR SI USCATE LA TERMOSTAT TIMP DE 10 MIN LA 56 GRADE C SAU 30 MINUTE LA TEMPERATURA CAMEREI.

• Se foloseste apa curata.• Ne asiguram ca sectiunile sunt curate si evitam

contaminarea acestora.• In acelasi vas de flotatie nu se pun sectiuni din mai

multe blocuri.• Se verifica temperatura apei.• Se evita supraintinderea sau suprapunerea sectiunilor• Se evita suprapunerea sectiunilor.

COLORAREA DEPARAFINARE ŞI HIDRATARE GRADUALĂ ÎN ALCOOL ŞI CU APĂ. COLORARE 5-10 MINUTE ÎN SOLUŢIE DE HEMALAUN . CLĂTIRE CU APĂ DISTILATĂ PÂNĂ CE SECŢIUNILE VIREAZĂ ÎN ALBASTRU. DIFERENŢIERE 5-10 SECUNDE ÎN SOLUŢIE ACID-ALCOOL, ÎN CAZ DE

SUPRACOLORARE A NUCLEILOR. CLĂTIRE CU APĂ DISTILATĂ PÂNĂ CE SECŢIUNILE DEVIN ALBASTRE COLORARE 10 MINUTE CU SOLUŢIA DE EOZINĂ. SPĂLARE 1-5 MINUTE CU APĂ DE ROBINET. DESHIDRATARE GRADUALĂ CU ALCOOL 96 ŞI APOI CU ALCOOL ETILIC

ABSOLUT. CLARIFICARE ÎN XILEN-ALCOOL ABSOLUT 1:1 ŞI ÎN FINAL ÎN XILEN. MONTARE ÎN BALSAM DE CANADA• Colorarea se face intr-o perioada de timp adecvata• Se monitorizeaza regulat calitatea• Se standardizeaza conditiile colorarii• Se asigura deparafinarea totala• Se hidrateaza sectiunile• se monitorizeaza continu: pH-ul eozinei, calitatea hematoxilinei• Se verifica colorarea nucleilor In albastru• Se dshidrateaza bine inaintea aplicarii lamelei• Se evita uscarea si formarea de cristale

Colorarea –autostainer liniar “robot stainer” 10 programe

simultane, capacitate ~250 lame/ zi

Montarea – automat de montat lame, capacitate ~ 400 lame / zi

Examinarea preparatului histologic